JP2011036241A - アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】米糠、とりわけ低変性脱脂米糠から得られるたんぱく質を利用してＡＣＥ阻害剤を製造する方法を提供する。
【解決手段】低変性脱脂米糠から抽出して得られるたんぱく質を第１のたんぱく質分解酵素で処理し、次いで第２のたんぱく質分解酵素で処理する方法からなる。低変性脱脂米糠は、米糠をアセトン、ヘキサンおよびエタノールから選択される少なくとも１種類の抽出溶剤で抽出した抽出残渣から溶剤を除去することにより得られる。たんぱく質は、この変性脱脂米糠からアルカリ水または酸性水を用いて抽出できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、低変性脱脂米糠から抽出して得られるたんぱく質をたんぱく質分解酵素で処理することを特徴とするＡＣＥ阻害剤の製造方法、それにより得られるＡＣＥ阻害剤の用途等に関する。

近年、生活習慣病の１つである高血圧症が多くの疾患要因として問題視され、高年齢層だけでなく低年齢化が進んできていることから、社会問題となっている。高血圧症は、体内の血圧調整に関与するレニン−アンジオテンシン系のホルモンが原因と考えられている。レニン−アンジオテンシン系では、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）が血中に存在するアンジオテンシンＩに作用し、Ｃ末端からジペプチド（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を遊離させ、活性型のアンジオテンシンＩＩに変換させる。かかる変換されたアンジオテンシンＩＩは強い血管収縮作用を有し、血圧上昇を示すことから、ＡＣＥ活性を阻害することにより、アンジオテンシンＩからアンジオテンシンＩＩへの変換を抑制し、血圧上昇を抑え、血圧を下降させうることが示されてきた（特許文献１）。

一方、食品成分に関する分野の研究により、米糠がコレステロール・脂肪蓄積を抑制することや米糠から得られたペプチドが血清コレステロールを低下させるなどその有用な効果が報告されてきた（非特許文献１）。米糠には、玄米から精白米を作る際に取り除かれる果皮、種皮、糊粉層および胚芽部分が含まれる。一方、米糠の一部については、米油の生産に利用されているが、残りの米糠や米油の搾取後の残渣は、飼料や肥料などに用いられるか、または廃棄されてきた。最近、米糠を原材料として、たんぱく質の変性が非常に少ない脱脂米糠を製造する方法が開発された（特許文献２）。しかしながら、かかる脱脂米糠から得られるたんぱく質を利用してＡＣＥ活性を阻害する方法についてはいまだ知られていなかった。

特開２００２−２４７９５５号公報 特開２００７−２９０９０号公報

『産学官連携による食品産業等活性化のための新技術開発事業 成果概要報告集』築野食品工業（株）１８年度「米糠に完全可溶化を目指した機能性食品素材の製造技術の開発」

したがって、本発明の解決課題は、米糠、とりわけ低変性脱脂米糠から得られるたんぱく質を利用してＡＣＥ阻害剤を製造する方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、驚くべきことに、低変性脱脂米糠から得られるグロブリン含量の高い米糠たんぱく質をたんぱく質分解酵素で処理すると、前記処理物が極めて高いＡＣＥ阻害活性を有すること、および前記処理物の有効成分が高度に濃縮された形態で得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、
（１）低変性脱脂米糠から抽出して得られるたんぱく質を第１のたんぱく質分解酵素で処理し、次いで第２のたんぱく質分解酵素で処理することを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤の製造方法；
（２）前記低変性脱脂米糠が、１００℃未満の温度にて米糠をアセトン、ヘキサンおよびエタノールから選択される少なくとも１種類の抽出溶剤で抽出し、減圧下にて温度２０〜８０℃で抽出残渣に含まれる抽出溶剤を除去することを特徴とする方法により得られるものである、（１）記載の方法；
（３）たんぱく質の抽出がアルカリまたは酸を用いて行われる、（１）または（２）記載の方法；
（４）アルカリが苛性ソーダまたは苛性カリである、（３）記載の方法；
（５）前記たんぱく質が、グロブリン主体のものである、（１）〜（４）のいずれか１つ記載の方法；
（６）前記たんぱく質の総グロブリン含量が８０％またはそれ以上である、（１）〜（５）のいずれか１つ記載の方法；
（７）前記たんぱく質が、Tsuno-RBP^TM55 Lot No.061006（築野食品工業（株）製）である、（１）〜（６）のいずれか１つ記載の方法；
（８）第１のたんぱく質分解酵素が、スミチームＡＰ、プロテアーゼＡ「アマノＧ」およびプロテアーゼＹＰ−ＳＳからなる群から選択されるものであり、第２のたんぱく質分解酵素が、ペプチダーゼＲ、アロアーゼＡＰ−１０、アミノペプチダーゼ高生産麹菌抽出液およびメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液からなる群から選択されるものである、（１）〜（７）のいずれか１つ記載の方法；
（９）第１のたんぱく質分解酵素が、スミチームＡＰであり、第２のたんぱく質分解酵素が、メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液またはペプチダーゼＲである、（１）〜（８）のいずれか１つ記載の方法；
（１０）分子量３，０００Ｄａ以下の画分にＡＣＥ阻害活性の９０％またはそれ以上が存在する、（１）〜（９）のいずれか１つ記載の方法；
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１つ記載の方法により得られるＡＣＥ阻害剤；
（１２）（１１）記載のＡＣＥ阻害剤を含む飲食物；
（１３）（１１）記載のＡＣＥ阻害剤を含むサプリメント；
（１４）（１１）記載のＡＣＥ阻害剤を含む、高血圧の治療および／または予防のための医薬品；ならびに
（１５）（１１）記載のＡＣＥ阻害剤を含む飼料
を提供する。

本発明によれば、従来の方法で調製された米糠ペプチドよりＩＣ_５０値が４倍高いＡＣＥ阻害剤を提供することができる。また、本発明は、これまで廃棄されていた米糠を原材料とすることから経済的であり、さらに、副作用の問題もなく血圧上昇を抑制できるという利点も有する。

図１は、米糠たんぱく質および米たんぱく質におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。３０μｇと５０μｇの米たんぱく質と米糠たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた。 図２は、米糠たんぱく質を各種プロテアーゼ系酵素剤で処理した処理物および米糠ペプチドにおけるＡＣＥ阻害率（％）を示す。 図３は、米糠たんぱく質を各種プロテアーゼ系酵素剤で処理した処理物および米糠ペプチドにおけるＳＯＤ阻害率（％）を示す。 図４は、米糠たんぱく質を３種の各プロテアーゼ系酵素剤で処理し、次いで２種の各ペプチダーゼ系酵素剤または２種の各ペプチダーゼ高生産麹菌フスマ抽出液で処理した処理物ならびに米糠ペプチドにおけるＡＣＥ阻害率（％）を示す。図中、「ＡＰ」はスミチームＡＰ、「ＹＰ−ＳＳ」はプロテアーゼＹＰ−ＳＳ、「アマノＧ」はプロテアーゼＡ「アマノＧ」、「アミノペプチダーゼ」はアミノペプチダーゼ高生産麹菌抽出液、「メタロエキソペプチダーゼ」はメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液をそれぞれ意味する（以下、同一の略記は同じことを意味するものとする）。 図５は、米糠たんぱく質を３種の各プロテアーゼ系酵素剤で処理し、次いで２種の各ペプチダーゼ系酵素剤または２種の各ペプチダーゼ高生産麹菌抽出液で処理した処理物ならびに米糠ペプチドにおけるＳＯＤ阻害率（％）を示す。 図６は、米糠たんぱく質をスミチームＡＰで処理し、次いでメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液で処理した処理物および米糠ペプチドにおけるＩＣ_５０値をプロットしたグラフを示す。縦軸は、ＡＣＥ阻害率（％）を表し、横軸は、希釈倍率（倍）を表す。図中、「メタロ」はメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液を意味する。 図７は、米糠たんぱく質を酵素（スミチームＡＰおよびペプチダーゼＲ）処理した処理物におけるＡＣＥ阻害活性率（％）を示す。縦軸は、ＡＣＥ阻害活性率（％）を表し、横軸は、希釈倍率（倍）を表す。図中、Ｘ印は、ＡＣＥ活性を５０％阻害する時の希釈倍率を表す。 図８は、米たんぱく質を酵素（スミチームＡＰおよびペプチダーゼＲ）処理した処理物におけるＡＣＥ阻害活性率（％）を示す。縦軸は、ＡＣＥ阻害活性率（％）を表し、横軸は、希釈倍率（倍）を表す。図中、Ｘ印は、ＡＣＥ活性を５０％阻害する時の希釈倍率を表す。 図９は、米糠ペプチドにおけるＡＣＥ阻害活性率（％）を示す。縦軸は、ＡＣＥ阻害活性率（％）を表し、横軸は、希釈倍率（倍）を表す。図中、Ｘ印は、ＡＣＥ活性を５０％阻害する時の希釈倍率を表す。 図１０は、濃縮した胡麻麦茶におけるＡＣＥ阻害活性率（％）を示す。縦軸は、ＡＣＥ阻害活性率（％）を表し、横軸は、濃縮倍率（倍）を表す。図中、Ｘ印は、ＡＣＥ活性を５０％阻害する時の濃縮倍率を表す。 図１１は、濃縮したアミールＳにおけるＡＣＥ阻害活性率（％）を示す。縦軸は、ＡＣＥ阻害活性率（％）を表し、横軸は、濃縮倍率（倍）を表す。図中、Ｘ印は、ＡＣＥ活性を５０％阻害する時の濃縮倍率を表す。

本発明は、１の態様において、低変性脱脂米糠から抽出して得られるたんぱく質を第１のたんぱく質分解酵素で処理し、次いで第２のたんぱく質分解酵素で処理することを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤の製造方法を提供する。本発明の方法に使用する低変性脱脂米糠は、以下の工程を１００℃未満の温度にて行うことにより得ることができる：（ａ）米糠から油脂成分を有機溶剤にて抽出する工程；および（ｂ）抽出残渣に含まれる抽出溶剤を除去する工程。好ましくは、抽出残渣に含まれる抽出溶剤を除去する工程を減圧下、１００℃未満で行う。かかる工程により、熱変性が抑制された、あるいは熱変性が認められない、低変性脱脂米糠を得ることができる。このような低変性脱脂米糠の製造方法の好ましい一例としては、特開２００７−２９０９０に開示された方法が挙げられる。

上記工程（ａ）において、米糠としては、玄米を精米する過程で得られる、例えば玄米表皮や胚芽などを含む米糠が挙げられる。米糠は米糠の原料となる米の種類に特に限定はない。米の種類としては、例えば、ジャポニカ種、インディカ種、ジャワニカ種、もち米、うるち米、赤米または紫黒米などが挙げられるが、これらに限定されない。米糠は、抽出溶剤で抽出される前に、例えばエクストルーダーなどの押し出し機などを用いて押し出されることが好ましい。該押し出し機などを用いることにより、米糠に含まれる例えば玄米表皮や胚芽などの組織や細胞などが破壊され得るので、例えば米糠に含まれる油脂などの抽出溶剤で抽出され得る物質の抽出効率を高めることができる。

上記工程（ａ）において使用する抽出溶剤は、米糠中の油脂成分を抽出でき、米糠たんぱく質の変性が少ない、あるいはないものであればいずれの溶剤であってもよく、通常は、アセトン、へキサン、酢酸エチル、およびメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類から選択される１種類以上のもの（これらの混合物も含む）、好ましくは、アセトン、ヘキサン、およびエタノールから選択される少なくとも１種類の抽出溶剤（これらの混合物も含む）が用いられる。なかでもよく用いられるのはヘキサンである。米糠からの油脂成分の抽出には公知の手段・方法を用いることができる。例えば撹拌抽出や、連続向流抽出などが挙げられる。攪拌は、公知の方法で実施でき、例えば攪拌機などにより行うことができる。連続向流抽出は、例えばロートセルタイプ（回転円形セル式）の連続向流抽出機または単段もしくは多段向流抽出装置などにより行うことができる。抽出は、加温しながら行ってもよい。抽出溶剤の量は、米糠約１ｋｇに対し、抽出溶剤約１〜２０Ｌ程度、好ましくは約１〜１０Ｌ程度、さらに好ましくは約１．５〜５Ｌ程度が一般的である。抽出は、常温で行ってもよく、加温しながら行ってもよい。抽出温度としては１００℃未満であることが重要で、使用溶剤の沸点を超えてはならない。抽出温度としては、例えば約１５〜約６０℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約８０℃などが挙げられる。

上記工程（ｂ）の抽出残渣に含まれる抽出溶剤を除去する工程は、抽出残渣と抽出溶剤とを分離することを包含する。かかる分離は公知の手段・方法にて行うことができ、例えば、ろ紙、布もしくはろ過スクリーンなどによるろ過または遠心分離などにより実施できる。また、上記連続向流抽出機などで米糠の抽出を行った場合、抽出が終わった米糠は、脱液された後、自動的かつ連続的に排出され得るので、該排出された米糠をそのまま抽出残渣とすることができる。

上記の、抽出残渣に含まれる抽出溶剤を除去する工程は、１００℃未満の温度にて行うために、減圧下にて行うことが好ましい。処理温度および減圧の程度は、使用する溶剤の種類や量、抽出残渣の特性などにより、適宜決定されうるが、約９０ｋＰａ以下、好ましくは約７０ｋＰａ以下、より好ましくは約０．１〜７０ｋＰａ、さらに好ましくは約２０〜７０ｋＰａの減圧下、温度約１００℃未満、好ましくは約２０〜１００℃、さらに好ましくは約２０〜８０℃、とりわけ好ましくは約４０〜８０℃の条件下に置くことによって抽出溶剤が除去され得る。抽出溶剤の除去は、公知の手段・方法にて行うことができる。例えば、連続式あるいは回分式いずれにおいても行うことができ、これらに使用する装置も公知である。回分式は、抽出溶剤除去１回分の抽出残渣を上記条件下で抽出溶剤除去処理を行い、抽出溶剤除去終了後その全てを排出し、改めて次の１回分の抽出残渣から抽出溶剤を除去させる方式のことで、例えばロータリーエバポレータまたは真空攪拌乾燥機などにより実施できる。連続式は、例えば連続式伝導撹拌乾燥機などの装置を用いることにより実施し得る。また、抽出方法としては、抽出溶剤の除去中に抽出残渣が静止している静置式と抽出残渣が循環または攪拌されている循環式が挙げられるが循環式が好ましい。加熱方法は特に制限されないが、間接加熱が好ましい。具体的には、例えば連続式伝導伝熱乾燥機で抽出溶剤除去を行う場合、多管式加熱管内に熱媒体（例えば、スチームまたは温水など）を流し、これを回転させて、加熱管束と抽出残渣を接触させて加熱する方法などが好ましい例として挙げられる。

次いで、上記のようにして得られた低変性脱脂米糠から米糠たんぱく質を抽出する。かかる抽出工程は、一般的な手法を用いて行うことができる。当業者は、目的のたんぱく質を多く含んだ形で抽出するための条件、例えば、使用する溶媒、抽出時のｐＨ、温度、抽出時間を適宜決定することができる。本発明の方法では、グロブリンが多く含まれた米糠たんぱく質を抽出することが所望される。上記の低変性脱脂米糠中のグロブリンは、水では十分に抽出されず、アルカリまたは酸の水溶液を用いることによって十分に抽出される。本発明のこのようなアルカリ抽出に用いることができるアルカリとしては、苛性ソーダ（水酸化ナトリウム）、苛性カリ（水酸化カリウム）など、酸抽出に用いることができる酸としては、希塩酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フィチン酸などが例示されるが、これらに限定されない。アルカリ抽出に用いられる好ましいアルカリとしては、苛性ソーダ（ｐＨ７〜１０）が挙げられる。アルカリまたは酸抽出する際のｐＨ、温度、時間などの条件は、十分量のグロブリンを含む米糠たんぱく質が抽出され、その変性が少ないか、あるいはない条件が好ましい。かかる条件は当業者が容易に決定することができる。

本発明に用いられるたんぱく質は、一般的な米たんぱく質のグロブリン含量よりも多くのグロブリンを含むことが好ましい。すなわち、全たんぱく質含量中に約２７％（「米の美味しさの科学」農林水産技術情報協会、平成８年３月）以上のグロブリンを含むものが好ましく、さらに多くのグロブリンを含むものが好ましい。本発明で用いることができるたんぱく質は、全たんぱく質含量中に、好ましくは、約３０％またはそれ以上、約４０％またはそれ以上、約５０％またはそれ以上、約６０％またはそれ以上のグロブリンを含むものであり、より好ましくは約７０％またはそれ以上のグロブリンを含むものである。本発明で用いることができるたんぱく質として、最も好ましくは、全たんぱく質含量中に８０％またはそれ以上のグロブリンを含むものである。本発明の技術的特徴の１つは、より多くのグロブリンを含むたんぱく質を用いることで、より高いＡＣＥ阻害活性を得ることができることである。本発明に用いられる好ましい低変性脱脂米糠由来の高グロブリン含量のたんぱく質の一例は、特開２００７−２９０９０に記載される方法により製造され、市販されているTsuno-RBP^TM55 Lot No.061006（築野食品工業（株）製）である。

上述のごとく、本発明の方法は、上記方法で得られるたんぱく質を第１のたんぱく質分解酵素で処理し、次いで第２のたんぱく質分解酵素で処理することを特徴とする。第１のたんぱく質分解酵素としては、たんぱく質を大きく分解する活性を有するプロテアーゼまたはそれを主体とするものが好ましい。第２のたんぱく質分解酵素としては、第１のたんぱく質分解酵素により遊離したポリペプチドをさらに低分子に分解する活性を有するペプチダーゼまたはそれを主体とするものが好ましい。このように２段階にして反応させると、効率良くたんぱく質の分解が行われ、目的のＡＣＥ阻害剤を短時間で収率良く得ることができる。本明細書におけるたんぱく質分解酵素とは、たんぱく質またはポリペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する活性を有する酵素を意味する。したがって、本発明の製造方法で用いられるたんぱく質分解酵素は、ペプチド結合加水分解活性を有する酵素剤であれば、いかなる種類のものであってもよい。かかる活性を有する酵素として、一般的に市販されている酵素剤であってもよい。また、本発明で用いられるたんぱく質分解酵素を生物から抽出してもよく、たんぱく質分解酵素源としての生物は公知である。これらの生物の中から、たんぱく質を大きく分解する活性を有するプロテアーゼまたはそれを主体とするもの、および／またはポリペプチドをさらに低分子に分解する活性を有するペプチダーゼまたはそれを主体とするものをスクリーニングして用いることができる。かかるスクリーニング方法は当業者に公知である。たんぱく質分解活性の高い生物としては、木材腐朽菌や麹菌などが挙げられ、特に麹菌が好ましい。かかる生物を液体培地、あるいはフスマなどの固体培地にて培養し、培養液あるいは抽出液を本発明のたんぱく質分解酵素源として用いることができる。

本発明において、第１のたんぱく質分解酵素として用いることができる酵素剤は、上記生物から公知の手段・方法によって得てもよい。また、第１のたんぱく質分解酵素として市販酵素剤を用いてもよく、例えば、オリエンターゼ２０Ａ（エイチビィアイ（株））、オリエンターゼ９０Ｎ（エイチビィアイ（株））、ニューラーゼＦ３Ｇ（天野エンザイム（株））、スミチームＡＰ（新日本化学（株））、スミチームＦＰ（新日本化学（株））、プロテアーゼＡ「アマノＧ」（天野エンザイム（株））、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ（ヤクルト薬品工業（株））などが挙げられ、好ましくは、スミチームＡＰ、プロテアーゼＡ「アマノＧ」またはプロテアーゼＹＰ−ＳＳであり、最も好ましくは、スミチームＡＰである。本明細書において、「第１のたんぱく質分解酵素」は、「プロテアーゼ」または「プロテアーゼ系酵素剤」とも記載される。

本発明において、第２のたんぱく質分解酵素として用いることができる酵素剤は、上記生物から公知の手段・方法によって得てもよい。また、第２のたんぱく質分解酵素として市販酵素剤を用いてもよく、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム（株））またはアロアーゼＡＰ−１０（ヤクルト薬品工業（株））が挙げられる。また、本発明における第２のたんぱく質分解酵素として、アミノペプチダーゼまたはメタロエキソペプチダーゼとしての活性を有する酵素を使用することができる。かかる酵素として、市販されている酵素剤、例えば、ペプチダーゼＲなどを用いてもよいが、これらだけに限定されない。また、アミノペプチダーゼまたはメタロエキソペプチダーゼとしての活性を有する酵素として、前記ペプチダーゼの生産効率が高い麹菌を調製した抽出液（本明細書では、ペプチダーゼ高生産麹菌ともいう）を用いることができる。例えば、アミノペプチダーゼ高生産麹菌またはメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌を調製した抽出液を用いてもよい。なお、該麹菌は、金沢工業大学バイオ・化学部応用バイオ学科尾関研究室にて、ＡＯＡＰ−８（アミノペプチダーゼ高生産麹菌）およびＡＯＭＰ−１３（メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌）として維持・管理されており、分譲可能な状態となっている。本発明に用いられる第２のたんぱく質分解酵素として好ましいのは、メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液またはペプチダーゼＲである。本明細書において、「第２のたんぱく質分解酵素」は、「ペプチダーゼ」または「ペプチダーゼ系酵素剤」とも記載される。

本発明の製造方法に用いられる第１のたんぱく質分解酵素と第２のたんぱく質分解酵素の組み合わせは、上述の酵素から任意に選択された酵素剤または麹菌などの生物の培養液や抽出液を用いてもよい。好ましくは、第１のたんぱく質分解酵素として、例えば、スミチームＡＰ、プロテアーゼＡ「アマノＧ」およびプロテアーゼＹＰ−ＳＳからなる群から選択されるものを用い、第２のたんぱく質分解酵素として、例えば、ペプチダーゼＲ、アロアーゼＡＰ−１０、アミノペプチダーゼ高生産麹菌抽出液およびメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液からなる群から選択されるものを用いる。さらに好ましくは、第１のたんぱく質分解酵素として、例えばスミチームＡＰを用い、第２のたんぱく質分解酵素として、例えばメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌のフスマ抽出液またはペプチダーゼＲを用いる。

本発明の方法において酵素を用いる場合、上記たんぱく質とたんぱく質分解酵素の配合割合は当業者が容易に決定することができる。本発明の方法において生物をたんぱく質分解酵素源として用いる場合、かかる生物の抽出液を上記たんぱく質に作用させてもよく、あるいはかかる生物を上記たんぱく質を含む培地にて直接増殖させてもよい。かかる生物の抽出液を本発明の方法に用いる場合も、上記たんぱく質と抽出液の配合比率は当業者が容易に決定することができる。これらの酵素あるいは生物または抽出液と上記たんぱく質の割合、たんぱく質分解酵素での処理条件、例えば、至適ｐＨ、至適温度、処理時間などは、用いられるたんぱく質の成分、量、酵素や生物の種類などの因子に応じて当業者が適宜決定することができる。また、本発明の方法において、各たんぱく質分解酵素による処理後にたんぱく質分解酵素を失活させる工程を含んでもよい。当該たんぱく質分解活性の消失により、次に処理するたんぱく質分解酵素の競合、たんぱく質分解酵素自体の消化による活性の低下、ならびにＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの消化を防ぐことができる。酵素の失活は、次工程に用いる酵素の活性を妨げず、かつＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを失活・減少させないものであれば、一般的な処理、例えば、高温処理、酸アルカリ処理などであってもよいが、これらだけに限定されず、当業者は前記の処理条件などを適宜決定することができる。

本発明のＡＣＥ阻害剤は、上述の工程により得られたＡＣＥ阻害剤を分子量分画したものであってもよい。分子量分画することにより高いＡＣＥ阻害活性を得ることが可能となる。分子量分画は公知の方法により行うことができ、例えば、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、透析、限外濾過などにより行ってもよい。本発明のＡＣＥ阻害剤は、例えば、３，０００Ｄａ以下、５，０００Ｄａ以下または１０，０００Ｄａ以下の分子量画分などに分離されてもよい。本発明の好ましい態様において、ＡＣＥ阻害活性は、分子量３，０００Ｄａ以下の画分にＡＣＥ阻害活性の９０％またはそれ以上が存在するので、分子量３，０００Ｄａ以下の画分を本発明のＡＣＥ阻害剤としてもよい。

本発明の方法において、上述のたんぱく質分解酵素処理後または分画工程後、任意選択的に、精製の工程を含んでもよい。精製は、塩析、限外濾過、透析、各種クロマトグラフィー等を用いて行うことができる。これらは、一般に広く用いられている方法である。特に、サンプルの処理量と精製効率の点から、イオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーが有効である。かかる精製工程を行うことで、よりＡＣＥ阻害活性の高いＡＣＥ阻害剤を得ることができる。本発明の方法により、有効成分が極めて高度に濃縮された形態でＡＣＥ阻害剤を得ることができる。このため、有効成分を濃縮または精製する工程を要さず、各用途に直接使用することができる。

本発明のＡＣＥ阻害剤は、上記製造方法により得ることができるたんぱく質分解酵素による分解物そのものであってもよく、精製したものであってもよい。本発明のＡＣＥ阻害剤は、液体、半固体、固体いずれの形状であってもよい。本発明のＡＣＥ阻害剤を、液剤、懸濁、粉末、錠剤、顆粒、カプセルなどの剤形に処方してもよい。これらの剤形は、溶解、撹拌、混合、粉砕、打錠、凍結乾燥などの公知の手法を用いて製造することができる。本発明のＡＣＥ阻害剤は、それ自体サプリメントとして使用されてもよく、あるいは食品と混合して、例えば、機能性食品、特定保健用食品、飲料を含む健康食品などの飲食物の形態として使用されてもよい。また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、医薬品または飼料として用いられてもよい。本発明により得られるＡＣＥ阻害剤は、天然物由来であるので、通常の使用範囲においては毒性や副作用の問題もない。

本発明のＡＣＥ阻害剤をサプリメントや飲食物として用いる場合、通常、食品衛生上許容される種々の添加剤を配合し、各形態に製剤化してもよい。かかる添加剤として、栄養強化剤、賦形剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、保存剤、調味料、または酸化防止剤を含むことができる。また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、種々の食品に配合することができる。かかる食品としては、クッキー、ケーキ、キャンデー、チョコレート、チューインガム、和菓子のごとき菓子類；パン、麺類、ご飯、豆腐のごとき穀類やその加工品；発酵食品；発泡酒、焼酎、清酒、薬用酒のごときアルコール飲料、みりん、食酢、醤油、味噌、ドレッシングのごとき調味料、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ、マヨネーズのごとき畜農食品、スープ、味噌汁などの汁物類、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒー、ミルク、ココアのごとき飲料などを列挙できるが、これらだけに限定されない。

本発明のＡＣＥ阻害剤を、高血圧の治療および／または予防のための医薬品として用いる場合、上記ＡＣＥ阻害剤を単独で、または公知のＡＣＥ阻害剤と組み合わせて使用することができる。また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、前記有効成分以外に、担体や賦形剤などの成分を含有してもよい。本発明のＡＣＥ阻害剤は、いかなる投与経路にても投与することができる。本発明のＡＣＥ阻害剤を経口投与してもよい。非経口投与には高度に精製された形態が好ましく、注射（例えば、筋肉注射、皮内、腫瘍内、静脈内、または皮下、または直接注射）、輸液、経皮投与などを用いることができ、局所投与であっても全身投与であってもよい。本発明のＡＣＥ阻害剤を医薬品とする際に使用することができる担体や賦形剤は、投与形態および剤形に応じて当業者が適宜選択することができる。経口投与用処方には、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等を担体または賦形剤として用いてもよく、必要に応じて結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。非経口投与用処方には、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を担体または賦形剤として用いてもよく、必要に応じて殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を添加して調製してもよい。本発明のＡＣＥ阻害剤を医薬として用いる場合の剤形は、液剤、懸濁、粉末、錠剤、顆粒、カプセルなどの剤形であってもよく、これらの剤形は、溶解、撹拌、混合、粉砕、打錠、凍結乾燥などの公知の手法を用いて製造することができる。

本発明のＡＣＥ阻害剤を飼料として用いる場合、上記ＡＣＥ阻害剤をそのまま使用してもよく、または、とうもろこし、小麦、フスマ、魚粉、脱脂粉乳、大豆かすなどの一般的に用いられる飼料原料と配合してもよい。

本発明のＡＣＥ阻害剤の投与量は、含有される飲料や食品、その製剤形態、投与方法、使用目的、ならびに動物種、患者の年齢、体重、症状によって適宜決定することができる。本発明のＡＣＥ阻害剤は、上記方法により、ＡＣＥ阻害活性が高く、有効成分が高度に濃縮された形態で産生され得る。有効な摂取量は種々の条件によって変動するが、例えば、本発明のＡＣＥ阻害剤の１日の摂取量は、含有される製品（飲料、食品および製剤など）の全重量に対して０．００１〜１０質量％であってもよく、０．０１〜１０質量％であってもよく、好ましくは、０．０１〜１質量％である。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

材料
本発明において、米糠たんぱく質として市販されているTsuno-RBP^TM55 Lot No.061006（築野食品工業（株）製）を用いた。この米糠たんぱく質は、特開２００７−２９０９０に記載される方法を用いて製造され、苛性ソーダを用いて抽出されたものである。コントロールとして米たんぱく質（９０％精白米より定法の苛性ソーダ抽出で抽出したもの（築野食品工業（株）製））を用いた。米糠たんぱく質と米たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて分析すると、バンドのパターンが大きく相違することから、含有されるたんぱく質の種類が極めて異なることがわかった。さらに、プロテオーム解析からグロブリンを同定し、他のたんぱく質を合算して割合を算出すると、この米糠たんぱく質中の総グロブリン含量は８２％であり、米糠たんぱく質には、非常に多くのグロブリンが含まれることが示された（図１）。次に、米糠たんぱく質を処理するため、以下に列挙する市販のプロテアーゼ系酵素剤１０種、ペプチダーゼ系酵素剤２種、およびペプチダーゼ高生産麹菌フスマ抽出液２種を用いた。コントロールとしての米糠ペプチドには、米糠ペプチド試作品（Lot No.061020U（築野食品工業（株）製））を用いた。
（プロテアーゼ系酵素剤）
・オリエンターゼ２０Ａ（エイチビィアイ（株））
・オリエンターゼ９０Ｎ（エイチビィアイ（株））
・ニューラーゼＦ３Ｇ（天野エンザイム（株））
・スミチームＡＰ（新日本化学（株））
・スミチームＦＰ（新日本化学（株））
・スミチームＦＰ−Ｇ（新日本化学（株））
・プロテアーゼＡ「アマノＧ」（天野エンザイム（株））
・プロテアーゼＹＰ−ＳＳ（ヤクルト薬品工業（株））
・パンチダーゼＮＰ−２（ヤクルト薬品工業（株））
・ＰＲＯＴＥＸ７Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）
（ペプチダーゼ系酵素剤）
・ペプチダーゼＲ（天野エンザイム（株））
・アロアーゼＡＰ−１０（ヤクルト薬品工業（株））
（ペプチダーゼ高生産麹菌）
・アミノペプチダーゼ高生産麹菌
・メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌

ペプチダーゼ高生産麹菌の調製
上記ペプチダーゼ高生産麹菌（アミノペプチダーゼおよびメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌）２種を各々、フスマ培地（２００ｍＬの三角フラスコにフスマ１０ｇに対して６ｍＬの蒸留水を加えオートクレーブ滅菌）に植菌し、３０℃で３日間培養した（尾関ら、米ヌカ培地で高生産する麹菌遺伝子群の解析：第６回糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集、ｐ６７（２００６））。なお、該麹菌は、金沢工業大学バイオ・化学部応用バイオ学科尾関研究室にて、ＡＯＡＰ−８（アミノペプチダーゼ高生産麹菌）およびＡＯＭＰ−１３（メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌）として維持・管理されており、分譲可能な状態となっている。培養液にフスマ培地抽出液緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬを添加し、３時間放置した。その後、ナイロンメッシュフィルターを用いてろ過し、５０ｍＬファルコンチューブ中に保存した。

各酵素剤およびペプチダーゼ高生産麹菌フスマ抽出液の最適条件を下記の表１に示す。これらのｐＨおよび温度に基づいて以下の実験を行った。
（表１、各酵素剤およびペプチダーゼ高生産麹菌フスマ抽出液の最適ｐＨと温度）

１段階目の反応
米たんぱく質（１．２５ｍｇ）に、各プロテアーゼ系酵素剤（１ｍｇ）を各々添加し、表１に記載される最適ｐＨの緩衝液（ｐＨが低い場合はクエン酸緩衝液、ｐＨが高い場合はリン酸緩衝液）を５ｍｌずつ加え、最適温度で振とうウォーターバスを用いて、一晩反応させた。反応液をろ紙でろ過を行い、ＡＣＥ阻害活性およびＳＯＤ阻害率を測定した。ＡＣＥ阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣｕｃｈｍａｎの方法を用いて行った（Cheung, H.S. and Cuchman, D.W., Biochim.Biophys.Acta.,293,451-463(1973)）。ＳＯＤ阻害率の測定では、ＳＯＤ活性検出キット（和光純薬工業（株））を用い、添付の説明書に従って行った。

その結果、ＡＣＥ阻害活性に関して、米糠ペプチドより高いＡＣＥ阻害率を示した処理物に用いられたプロテアーゼ系酵素剤は、オリエンターゼ９０Ｎ、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ、スミチームＡＰ、スミチームＦＰおよびプロテアーゼＡ「アマノＧ」であった（図２）。ＳＯＤ阻害率については、ほぼ全ての酵素剤を用いた場合に米糠ペプチドより高かった（図３）。以上の結果より、１段階目の反応で米糠たんぱく質を効率良く分解した酵素剤として、スミチームＡＰ、プロテアーゼＹＰ−ＳＳおよびプロテアーゼＡ「アマノ」Ｇを選択した。

２段階目の反応
次いで、プロテアーゼ系酵素剤で分解された米糠たんぱく質をさらに低分子に分解するため、ペプチダーゼ活性の高いペプチダーゼを選択した。簡単に説明すると、上記で選択した３種類のプロテアーゼ系酵素剤（スミチームＡＰ、プロテアーゼＹＰ−ＳＳおよびプロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ）を、１段階目の反応と同様に、各酵素剤ごとに最適ｐＨに合わせて一晩反応させ、ペプチダーゼ系酵素剤（５ｍｇ）、フスマ抽出液（１５０μｌ）をそれぞれ添加し、反応させた。ペプチダーゼ系酵素として、ペプチダーゼＲ、アロアーゼＡＰ−１０、アミノペプチダーゼ高生産麹菌、メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌を用いた。これらの反応液をろ紙でろ過後、ＡＣＥ阻害活性およびＳＯＤ活性を測定し、さらに、ＩＣ_５０値を測定した。ＩＣ_５０値を、ＡＣＥ阻害活性率５０％の時の希釈率から算出した試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）とした。

その結果、ＡＣＥ阻害活性およびＳＯＤ阻害活性の両方について、全ての酵素剤の組み合わせで米糠ペプチドより高い値を示した（図４および５）。なかでも、ＡＣＥ阻害率およびＳＯＤ阻害率が最も高かった「スミチームＡＰ」と「メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌フスマ抽出液」の組み合わせを最も適切であると判断した。そこで、前記組み合わせについてＩＣ_５０値を測定すると、米糠ペプチドと比較して４倍低いことが示された（図６）。

分子量分画した各画分におけるＡＣＥ阻害活性の測定
さらに、上述のごとく酵素処理した処理物におけるＡＣＥ阻害活性の高い画分を調べるため、分子量分画を行い、各画分のＡＣＥ阻害活性を測定した。簡単に説明すると、米糠たんぱく質（タンパク質含量６５％）０．２５ｇおよび米たんぱく質（タンパク質含量３８％）０．５ｇを各々、スミチームＡＰ ２．５ｍｇ／５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）５ｍｌ中において４５℃で２４時間インキュベートした。次いで、ペプチダーゼＲ ２．５ｍｇ／ ｐＨ７．０ ５ｍｌおよび１Ｎ ＮａＯＨ ０．１ｍｌを添加し、さらに４０℃で１６時間インキュベートした。その後、９６℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。この酵素処理物を０．４５μｍのフィルターでろ過し、マイクロコン（日本ミリポア（株））を用いて分子量３，０００、１０，０００、３０，０００Ｄａごとに分画し、各画分中のＡＣＥ阻害活性を測定した。

その結果を以下の表２に示した。表中、米糠たんぱく質を酵素処理した処理物（未分画）のＡＣＥ阻害活性を１００％とすると、米たんぱく質を酵素処理した処理物（未分画）のＡＣＥ阻害活性は１０％であり、米糠ペプチド（Lot No.061020U（築野食品工業（株）））のＡＣＥ阻害活性は２５％であった（表２左欄）。これは、米たんぱく質がグルテリンを多く含むのに対して、米糠たんぱく質がグロブリンを主成分とすることによると考えられる（図１参照）。また、米糠たんぱく質を酵素処理した処理物の分子量３，０００Ｄａ以下の画分（表２中、「＜３０００」と表す）におけるＡＣＥ阻害活性は、未分画の酵素処理物と比較して９０％であり、一方で、３０００Ｄａ以下の画分（表２中、「＞３０００」と表す）におけるＡＣＥ阻害活性は、未分画の酵素処理物と比較して１０％であった（表２）。このことから、米糠たんぱく質を酵素処理した処理物は、分子量３０００Ｄａ以下の画分に高いＡＣＥ阻害活性が存在することが示された（表２）。
（表２．米糠たんぱく質を酵素処理した処理物の各分子量画分におけるＡＣＥ阻害活性の測定）
米糠たんぱく質を酵素処理した処理物（未分画）のＡＣＥ阻害活性を１００％とした。

ＡＣＥ阻害活性の測定
さらに詳細に、米糠たんぱく質を酵素処理した処理物のＡＣＥ阻害活性効果を調べた。米糠たんぱく質（Tsuno-RBP^TM Lot No.061006（築野食品工業（株）））および米たんぱく質の酵素処理物、および米糠ペプチド（Lot No.061020U（築野食品工業（株）））についてＡＣＥ阻害活性率（％）を測定し、ＩＣ_５０値を算出した。米糠たんぱく質または米たんぱく質の酵素処理においては、１段階目の反応にＡＰスミチームを用い、２段階目の反応にペプチダーゼＲを用いた。また、ＩＣ_５０値を、ＡＣＥ阻害活性率５０％の時の試料の希釈率（％）を算出し、この時の反応液中の試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）とした。ＩＣ_５０値を算出するために、以下の計算式を用いた。

＜試料量（ｍｇ）＞／＜反応液量（ｍｌ）＞×＜希釈倍率または濃縮倍率＞
＝試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）

上記測定において、試料量は、米糠たんぱく質を用いる場合に０．５ｇとし、米たんぱく質を用いる場合に１．０ｇとし、米糠ペプチドを用いる場合に０．５ｇとした。また、反応液量を５ｍｌとした。

その結果、米糠たんぱく質の酵素処理した処理物におけるＡＣＥ阻害活性率は、表３に示すように、５００倍希釈時に２５．０％、２００倍希釈時に６３．４％、および１００倍希釈時に６４．４％であった（表３）。この結果より検量線を作成すると、ＡＣＥ阻害活性が５０％となる希釈率は３３４倍であり（図７）、この時の試料濃度は０．３ｍｇ／ｍｌと算出された。
（表３．米糠たんぱく質の酵素処理物を各倍率で希釈した時のＡＣＥ阻害活性率（％）の測定結果）

また、米たんぱく質を酵素処理した処理物におけるＡＣＥ阻害活性率は、表４に示すように、１００倍希釈時に２９．５％、５０倍希釈時に４８、９％、および２０倍希釈時に９０．７％であった（表４）。この結果より検量線を作成すると、ＡＣＥ阻害活性が５０％となる希釈率は６５倍であり（図８）、この時の試料濃度は３．０ｍｇ／ｍｌと算出された。
（表４．米たんぱく質の酵素処理物を各倍率で希釈した時のＡＣＥ阻害活性率（％）の測定結果）

米糠ペプチドにおけるＡＣＥ阻害活性率は、表５に示すように、１００倍希釈時に４１．７％、５０倍希釈時に５４．４％、および１０倍希釈時に８４．３％であった（表５）。この結果より検量線を作成すると、ＡＣＥ阻害活性が５０％となる希釈率は７５倍であり（図９）、この時の試料濃度は１．３ｍｇ／ｍｌと算出された。
（表５．米糠ペプチドを各倍率で希釈した時のＡＣＥ阻害活性率（％）の測定結果）

以上より、ＩＣ_５０値を示す時の試料濃度について、米糠たんぱく質を酵素処理した処理物は０．３ｍｇ／ｍｌ、米たんぱく質の酵素処理物は３．０ｍｇ／ｍｌ、米糠ペプチドは１．３ｍｇ／ｍｌと算出されたことから、本発明である米糠たんぱく質を酵素処理した処理物は、ＡＣＥ阻害活性が米たんぱく質の酵素処理物より約１０倍高く、米糠ペプチドより約４倍高いことがわかった。

さらに、米糠たんぱく質を酵素処理した処理物の有効性を調べるために、比較対象として、市販されている胡麻麦茶（サントリー）およびアミールＳ（カルピス株式会社）のＡＣＥ阻害活性率を測定した。上記と同様の方法を実施し、胡麻麦茶およびアミールＳともに２、３、および５倍に濃縮したものを使用した。
その結果、胡麻麦茶のＡＣＥ阻害活性率は、表６に示すように、２倍濃縮時に３９．９％、３倍濃縮時に４５．０％、５倍濃縮時に５７．７％であった（表６）。この結果より検量性を作成すると、ＡＣＥ阻害活性が５０％となる濃縮率は、３．７倍であった（図１０）。米糠たんぱく質の酵素処理物と比較すると、米糠たんぱく質の酵素処理物は、胡麻麦茶より４５１倍高い（３３４倍／（３．７倍／５ｍｌ））ＡＣＥ阻害活性を有することが示された。
（表６．胡麻麦茶（サントリー）を各倍率で濃縮した時のＡＣＥ阻害活性率（％）の測定結果）

さらに、アミールＳのＡＣＥ阻害活性率は、表７に示すように、２倍濃縮時に２６．７％、３倍濃縮時に３９．０％、５倍濃縮時に５６．９％であった（表７）。この結果より検量線を作成すると、ＡＣＥ阻害活性が５０％となる濃縮率は、４．３倍であった（図１１）。米糠たんぱく質の酵素処理物と比較すると、米糠たんぱく質の酵素処理物は、アミールＳより３８８倍高い（３３４倍／（４．３倍／５ｍｌ））ＡＣＥ阻害活性を有することが示された。
（表７．アミールＳ（カルピス株式会社）を各倍率で濃縮した時のＡＣＥ阻害活性率（％）の測定結果）

以上より、本発明の方法により、ＡＣＥ阻害活性の高い有効成分を極めて高い濃度で取得できることがわかった。

本発明により、ＡＣＥ阻害剤およびその製造方法が提供されるので、血圧の上昇を抑制することに関連する分野、例えば、医療、食品などの分野において利用可能である。

Claims (15)

1. 低変性脱脂米糠から抽出して得られるたんぱく質を第１のたんぱく質分解酵素で処理し、次いで第２のたんぱく質分解酵素で処理することを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤の製造方法。
2. 前記低変性脱脂米糠が、１００℃未満の温度にて米糠をアセトン、ヘキサンおよびエタノールから選択される少なくとも１種類の抽出溶剤で抽出し、減圧下にて温度２０〜８０℃で抽出残渣に含まれる抽出溶剤を除去することを特徴とする方法により得られるものである、請求項１記載の方法。
3. たんぱく質の抽出がアルカリまたは酸を用いて行われる、請求項１または２記載の方法。
4. アルカリが苛性ソーダまたは苛性カリである、請求項３記載の方法。
5. 前記たんぱく質が、グロブリン主体のものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記たんぱく質の総グロブリン含量が８０％またはそれ以上である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記たんぱく質が、Tsuno-RBP^TM55 Lot No.061006（築野食品工業（株）製）である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 第１のたんぱく質分解酵素が、スミチームＡＰ、プロテアーゼＡ「アマノＧ」およびプロテアーゼＹＰ−ＳＳからなる群から選択されるものであり、第２のたんぱく質分解酵素が、ペプチダーゼＲ、アロアーゼＡＰ−１０、アミノペプチダーゼ高生産麹菌抽出液およびメタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液からなる群から選択されるものである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 第１のたんぱく質分解酵素が、スミチームＡＰであり、第２のたんぱく質分解酵素が、メタロエキソペプチダーゼ高生産麹菌抽出液またはペプチダーゼＲである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 分子量３，０００Ｄａ以下の画分にＡＣＥ阻害活性の９０％またはそれ以上が存在する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法により得られるＡＣＥ阻害剤。
12. 請求項１１記載のＡＣＥ阻害剤を含む飲食物。
13. 請求項１１記載のＡＣＥ阻害剤を含むサプリメント。
14. 請求項１１記載のＡＣＥ阻害剤を含む、高血圧の治療および／または予防のための医薬品。
15. 請求項１１記載のＡＣＥ阻害剤を含む飼料。