KR102302933B1

KR102302933B1 - 마늘 혼합 발효물의 제조 및 심혈관 질환에 유효한 약학 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR102302933B1
Application number: KR1020210037193A
Authority: KR
Inventors: 김해성; 이양구; 조영석
Original assignee: 주식회사 지앤에이치바이오; 동성제약 주식회사
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-09-16

Abstract

본 발명은 마늘 발효물에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효시키는 단계 및 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물 혼합하는 단계를 포함하는 마늘 혼합 발효물의 제조 및 심혈관 질환에 유효한 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

Description

마늘 혼합 발효물의 제조 및 심혈관 질환에 유효한 약학 조성물의 제조방법 {Preparation of fermented garlic mixture and manufacturing method of composition effective for cardiovascular disease}

심혈관계 질환은 초기 내피세포 기능장애를 시작으로 종래에는 심장 및 혈관계의 이상이 온 것으로서, 심장질환, 대동맥과 같은 중심혈관 및 하부 기관, 조직의 말초혈관의 질환을 포함한다. 세계보건기구(WHO) 통계에 의하면 전 세계적으로 매년 심혈관계 질환으로 인한 사망자가 가파른 증가 추세에 있으며, 한국 등 아시아 국가에서 증가율이 높은 것으로 알려져 있다. 이는 고령화 사회로의 접근 및 서구화된 식습관의 변화 등 위험 인자의 증가 때문인 것으로 추정된다.

마늘을 많이 먹는 사람들은 대장암, 방광암, 위암에 걸릴 위험이 낮은 것으로 밝혀져 암예방 효과가 있다고 인정을 받고 있다. 또한 마늘은 동맥경화를 일으키는 콜레스테롤 수치를 떨어뜨리고 혈소판 응집을 억제해 혈액순환을 원활하게 함으로써 심장병이나 중풍 예방에도 도움이 된다고 알려져 있다. 독일에서는 마늘을 주성분으로 한 건강기능식품이 콜레스테롤 저하제로 허가받아 판매되고 있다. 하지만 마늘이 피로회복이나 정력증강에도 도움이 되는지는 분명하지 않다. 마늘성분의 보충제는 하루 600 내지 1000 mg 복용이 권장되지만 우리나라 사람들은 음식으로 마늘을 충분히 섭취하고 있으므로 굳이 보충제를 복용하지 않아도 된다. 마늘을 많이 먹으면 속쓰림 같은 위장 증상을 보이긴 해도 심각한 부작용은 없는 것으로 알려져 있다.

마늘가루 효과를 분석한 연구에서는 900 mg의 마늘가루가 총콜레스테롤을 25% 감소시키고, 특히 혈관에 좋은 역할을 하는 고밀도 콜레스테롤(HDL)을 50% 상승시키는 것으로 나타났다. 이는 마늘의 알리신(Allicin) 성분이 피를 엉키게 하지 않는 항혈전 작용과 피속의 지질을 감소시키는 효과가 있기 때문으로 분석된다. 게다가 마늘이 혈당을 116%정도 감소시킨다는 보고가 있으며, 항산화 작용으로 동맥경화를 예방하는 것으로 알려져 있다. 마늘 속의 유황 화합물은 체내의 활성 산소를 제거하는 강력한 항산화작용이 있다. 피속의 활성 산소는 혈관을 손상시키거나 일부 암을 일으키는 원인이 될 수 있다. 그래서 마늘은 미국 국립 암연구소가 추천한 첫번째 항암식품이기도 하다.

마늘에는 많은 종류의 유기 및 무기화합물이 들어 있다. 그중에서 알린(alliin)이라는 황을 포함한 화합물은 그 자체만으로는 특별한 냄새가 별로 없다. 그러나 사람들이 마늘에 상처를 입히거나 균 또는 벌레의 침입을 받으면, 마늘에 포함된 효소인 알리나제(allinase)가 알린을 알리신(allicin)으로 바꾼다. 알리신은 피톤치드(phytoncide)의 일종이며, 항균, 항진균성 특성이 있다. 마늘은 다른 종류의 백합과 식물보다 alliin을 다량 함유하고 있는데, 파쇄 과정에서 마늘에 존재하는 alliin은 allinase의 작용을 받게 되어 alliin이 allicin, pyruvate 및 암모니아 상태로 분해되며, 이렇게 생성된 allicin 역시 매우 불안정한 화합물로서 여러 형태의 함황화합물로 쉽게 전환된다. 그 중 diallyl disulfide, diallyl sulfide, allyl propyl disulfide, methyl trisulfide가 주요 화합물로서 allicin과 더불어 이들 함황화합물이 마늘의 매운 맛을 나타내는 주된 화합물로서 알려져 있다.

바실러스 속 미생물은 산업적으로 중요한 종으로서, 오랜 세월 동안 식품 및 각종 발효산업에서 숙주 세포로서 널리 사용되고 있고, protease, amylase, glucanases 또는 cellulase 등의 중요한 효소 및 넓은 항균 spectrum과 다양한 구조를 지니는 peptide antibiotics를 생산하는 특징을 지니고 있다. 구체적으로, B subtilis, B megaterium, B stearothermophilus, B lichemiformis, B thuringiensis 또는 B cereus 등 다양한 바실러스 속 미생물에서 박테리오신 또는 bacteriocin-like substances(BLS)들이 발견되어 보고되었다. 프로바이오틱 생균제는 유산균을 주로 사용하여 제조되어 왔으나, 제한적 범위에서만 항균활성이 인정된다는 문제점이 제기되어 왔으여, 최근 바실러스 서브틸리스나 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 등과 같은 바실러스 속에 해당하는 미생물을 이용한 프로바이오틱 생균제에 대한 관심이 증대되고 있다. 상기 바실러스 서브틸리스나 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 등은 유산균과 같이 유용한 미생물이며, 우리나라의 청국장이나 일본의 낫또(natto)를 비롯하여 극동 아시아나 아프리카 지역의 전통음료나 알칼리-발효식품에서 매우 중요한 발효 미생물로 작용한다.

한국등록특허 제1794637호는 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 마늘 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 청국장 유래 바실러스 속 균주를 접종하여 발효한 마늘 발효물에서 혈관질환에 대한 개선효과가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1608502호는 마늘 발효물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기와 동일한 마늘 발효물의 심혈관계 질환에 대한 효과가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1609918호는 마늘 발효 조성물의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 마늘 발효 조성물에 관한 것으로, 발효균주를 혼합한 후 발효시켜 마늘의 당과 단백질을 분해 전환하는 1차 발효단계와 탄소원을 추가로 공급하는 2차 발효 단계를 포함하는 마늘 발효 조성물에 관한 내용이 개시되어 있다.

하지만, 본 발명은 마늘 발효물의 심혈관 질환 및 뇌혈관 질환에 대한 효과를 극대화하기 위한 추가적인 발효공정 및 성분을 포함하여 건강기능성이 향상된 마늘 혼합 발효물의 제조 및 심혈관 질환에 유효한 약학 조성물의 제조방법을 개발하였고, 이에 대해서는 아직까지 개시된 바 없다.

1. 한국등록특허 제1794637호 2. 한국등록특허 제1608502호 3. 한국등록특허 제1609918호

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 정제수, 다진마늘 및 발효균주를 포함하는 1차 발효단계; 백두, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물을 혼합한 배양액을 추가하는 2차 발효단계; 및 여과 추출한 2차 발효물의 액상부를 3차 발효하는 단계; 및 4차 숙성단계;를 포함하여 항산화, 항염, 항고혈압 및 항동맥경화 등과 같은 심혈관계 질환 및 뇌졸중 및 치매 등과 같은 뇌혈관 질환에 대한 생리활성이 증진된 마늘 혼합 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 정제수와 다진마늘을 10:1 내지 5:1(w/v)로 혼합하고, KCTC 12696BP 및 KCTC 12697BP의 바실러스 서브틸리스 혼합균주를 접종하여 1차 발효시키는 단계; 2) 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물을 제조하는 단계; 3) 단계 1) 및 2)에서 제조된 성분을 혼합하여 2차 발효시키는 단계; 4) 여과한 액상을 3차 발효시키는 단계; 및 5) 숙성조에서 숙성시키는 단계;를 포함하는 심혈관 질환 또는 뇌혈관 질환 개선 효과가 증진된 마늘 혼합 발효물의 제조방법을 제공한다.

바실러스 서브틸리스 혼합균주는 마늘 분쇄물 중량대비 0.01 내지 5% 접종하는 것이고, 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물은 100 내지 200 : 10 내지 50 : 3 내지 6 : 30 내지 60의 중량비로 혼합되는 것이며, 사탕수수 추출물은 열수 추출물을 포함한다.

또한 본 발명은 1) 정제수와 다진마늘을 10:1 내지 5:1(w/v)로 혼합하고, 기탁번호 KCTC 12696BP 및 KCTC 12697BP의 바실러스 서브틸리스 혼합균주를 접종하여 1차 발효시키는 단계; 2) 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물을 제조하는 단계; 3) 단계 1) 및 2)에서 제조된 성분을 혼합하여 2차 발효시키는 단계; 4) 여과한 액상을 3차 발효시키는 단계; 및 5) 숙성조에서 숙성시키는 단계;를 포함하는 심혈관 질환 또는 뇌혈관 질환 개선 효과가 증진된 마늘 혼합 발효물의 제조방법으로 제조된 마늘 혼합 발효물을 제공한다.

본 발명의 다른 예는 마늘 혼합 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강기능식품 조성물, 심혈관 질환 개선용 건강기능식품 조성물 또는 뇌혈관 질환 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 심혈관 질환은 동맥경화 또는 고혈압이거나 뇌혈관 질환은 뇌졸중 또는 치매인 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 마늘 발효물에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효시키는 단계 및 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물 혼합하는 단계를 포함하는 마늘 혼합 발효물의 제조 및 심혈관 질환에 유효한 약학 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 항산화, 심혈관 질환 개선 또는 뇌혈관 질환 개선 효과를 통해 기능성이 향상된 건강기능성 식품으로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물의 세포독성에 대한 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물의 농도별 혈관평활근 세포의 증식억제 효과를 나타내는 것이다. **P<0.01 vs. 대조군; #P<0.05 vs. PDGF-BB only; ##P<0.01 vs. PDGF-BB only
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물과 비교실시예의 혈관평활근 세포의 증식억제 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다. **P<0.01 vs. 대조군; #P<0.05 vs. 무처리; ##P<0.01 vs. 무처리
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물과 비교실시예의 혈관내피 세포의 NO 생산에 미치는 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다. *P<0.05 vs. 대조군; **P<0.01 vs. 대조군; ***P<0.01 vs. 대조군
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물과 비교실시예의 혈관평활근 세포의 증식억제 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다. **P<0.01 vs. 대조군; #P<0.05 vs. 무처리; ##P<0.01 vs. 무처리
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물의 항산화 효과를 나타내는 것이다. #P<0.05 vs. 실시예 1
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 마늘 혼합 발효물의 혈관이완 효과를 나타내는 것이다. #P<0.05 vs. 실시예 1

이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 정제수와 다진마늘을 10:1 내지 5:1(w/v)로 혼합하고, KCTC 12696BP 및 KCTC 12697BP의 바실러스 서브틸리스 혼합균주를 접종하여 1차 발효시키는 단계; 2) 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물을 제조하는 단계; 3) 단계 1) 및 2)에서 제조된 성분을 혼합하여 2차 발효시키는 단계; 4) 여과한 액상을 3차 발효시키는 단계; 및 5) 숙성조에서 숙성시키는 단계;를 포함하는 심혈관 질환 또는 뇌혈관 질환 개선 효과가 증진된 마늘 혼합 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 마늘 발효물은 한국 등록공보 제1608502호에 제시된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BBS825(수탁번호 : KCTC 12697BP) 및 BBS815(수탁번호 : KCTC 12696BP)의 혼합균주를 이용하는데, 먼저 껍질을 깐 마늘을 분쇄하고 다져 물(정제수)을 혼합한 혼합물을 만든다. 이때 마늘 분쇄물의 양은 물의 중량대비 1 내지 85 %로 하고 바람직하게는 5 내지 20 %를 첨가하는 것이 적절하다. 상기의 혼합물에 균주를 접종시키고 이때 균주 접종비는 혼합물 중량 대비 0.01 내지 5 %가 바람직하다. 이를 25 내지 40℃에서 진탕배양이나 기포주입을 하여 호기성 발효를 하고, 기포 주입시에는 필터링 방법을 하여 기타 다른 균주의 침투를 방지한다.

마늘 혼합 발효물에 포함되는 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물은 100 내지 200 : 10 내지 50 : 3 내지 6 : 30 내지 60의 중량비로 혼합되는 것이며, 사탕수수 추출물은 열수 추출물을 포함한다.

메주콩은 대두라고도 불리며, 양질의 식물성 단백질과 지방이 풍부하다. 특히 이소플라본 성분이 풍부하여 뼈의 칼슘이 빠져나가는 것을 막아주는 역할을 한다. 대두는 수분이 9.2%, 지방질 17.6%, 당질 21.6%, 단백질 41.3% 및 섬유소 4.7%로 구성된다. 그 외에도 여러 비타민과 생리활성 물질들이 포함되어 있다. 대두에 있는 다양한 생리활성 성분은 콜레스테롤과 지단백질의 농도를 감소시키는 효과가 알려져 있고, 심장병과 동맥경화증에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

쌀눈은 도정 과정 중 쌀겨(미강)에 섞여 사료 또는 유지용으로 사용되어 왔으나 쌀눈에 함유된 비타민 E를 포함하는 각종 영양성분이 확인되면서 각광받고 있다. 특히 감마오리자놀, 옥타코사놀, 피틴산 등의 성분으로 인해 항산화작용 및 동맥경화 억제가 알려지면서 다양한 건강기능성 식품의 재료로 사용되고 있다.

사탕수수 추출물에는 다량의 수용성 폴리페놀이 함유되어 있어 항산화 및 각종 혈관 질환에 대한 효과가 알려져 있다.

본 발명에서 심혈관 질환은 동맥경화, 고혈압, 고지혈, 관상동맥질환, 심장마비, 말초혈관질환, 부정맥, 심부전, 울혈성 심장질환 또는 심근질환을 포함하는 심장 또는 혈관에 이상이 발생하는 모든 포괄하는 것이고, 바람직하게는 동맥경화 또는 고혈압에 관한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 뇌혈관 질환은 뇌혈관의 이상으로 발생하는 모든 질환을 포괄하는 것으로, 바람직하게는 뇌졸중 또는 치매에 관한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 건강 기능(성) 식품 (functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나다.

본 발명에 있어서, 식품 조성물은 상기 마늘 혼합 발효물 이외에 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 마늘 혼합 발효물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 마늘 혼합 발효물의 유효성분은 전체 조성물을 기준으로 하여 000001 내지 15중량%, 바람직하게는 00001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 00001 내지 5 중량%이다. 상기 마늘 발효물의 중량이 000001 중량% 미만일 경우 혈관이완 효능이 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> 바실러스 서브틸리스 혼합 균주를 사용한 마늘 발효물 제조

1) 1차 발효통에 정제수 100 L와 다진마늘 10 kg을 혼합하여 20일간 발효시키는 단계로, 이때 정제수와 다진마늘의 비율은 10:1 내지 5:1(w/v)로 할 수 있다. 발효 균주는 바실러스 서브틸리스 균주 혼합물(바실러스 서브틸리스 BBS815, 기탁번호 KCTC 12696BP; 및 바실러스 서브틸리스 BBS825, 기탁번호 KCTC 12697BP)을 사용하였고(한국등록특허 제1608502호 및 제1794637호 참조), 다진마늘과 정제수 혼합물의 중량대비 0.05%로 넣어 접종한 후 발효조(37℃, 100 rpm, 0 bar)에서 기포주입을 하여 호기성 발효를 20일간 시켜 1차 마늘 발효물을 제조하였다.

2) 메주콩 1 내지 2 kg, 쌀눈 100 내지 500 g, 구운소금 30 내지 60 g 및 사탕수수 추출물 300 내지 600 g을 혼합하였다. 메주콩, 쌀눈 및 구운소금은 시중에 판매되는 일반적인 것을 사용하였고, 사탕수수 추출물은 사탕수수 100 중량부에 대하여 물 300 중량부를 넣고, 부피가 1/2이 될 때까지 끓여서 활성성분을 추출하며 거름종이로 여과하고 그 여액을 감압 농축 및 동결건조하여 제조한 것을 사용하였다. 이때 사탕수수 추출물은 일반적인 열수추출물 추출방법에 의해 추출된 것이 사용될 수 있다.

3) 상기 단계 1) 및 2)에서 제조된 성분을 2차 발효조에 혼합하여 40일간 2차 발효시켰다.

4) 2차 발효 후 거름종이로 여과한 액상을 3차 발효조로 이송후 30일간 3차 발효시켰다.

5) 3차 발효 후 4차 숙성조로 이송후 50 내지 80일간 숙성하였다.

<비교 실시예 1> 공지 바실러스 서브틸리스를 사용한 마늘 발효물 제조

실시예 1과 동일한 과정으로 제조하였고, 바실러스 서브틸리스의 종류만 ATCC 9372 균주를 이용하여 마늘 발효물을 제조하였다.

<비교 실시예 2> 추가 성분을 제외한 마늘 발효물 제조

실시예 1과 동일한 과정으로 제조하였고, 단계 2)에 해당하는 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 사탕수수 추출물을 포함하지 않는 마늘 발효물을 제조하였다.

<시험예 1> 혈관 평활근 세포에 대한 효과

사람 혈관 평활근 세포(human aortic smooth muscle cell)은 Clonetics로부터 구입하였고, 혈관 평활근 세포 기본 배지에 hEGF 10 mg/ml, hFGF 2 mg/ml 및 5% 우태아 혈청을 첨가하여 배양하였고, 실험에 사용한 것은 계대배양 10회 이전의 것을 사용하였다.

1. 세포독성

실시예 1에서 제조한 마늘 발효물의 세포독성 및 세포증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여, MTT 시험(Cell proliferation assay Kit, #11465007001, Roche)을 제조자의 지침에 따라 수행하였다.

도 1에 제시한 바와 같이, 본 발명의 마늘 발효물은 10 mg/mL 까지 세포독성을 나타내지 않았다.

2. 세포증식

세포증식은 대표적인 혈관평활근 세포 증식인자인 혈소판 유래 성장인자-BB (platelet-derived growth factor-BB; PDGF-BB) 10 ng/mL을 첨가하여 24시간 동안 세포 증식을 유도하였다. 통계처리는 ANOVA 후 Student's T 검정법을 사용하였고, 결과는 별도로 언급하지 않는다면 평균±표준오차로 제시하였다.

도 2에 제시한 바와 같이, 본 발명의 마늘 발효물은 용량의존적으로 PDGF-BB에 의해 유도된 혈관평활근 세포의 증식을 감소시켰다. 또한, 동일 용량(1 mg/mL)의 실시예 1의 마늘 발효물은 비교실시예 1 또는 비교 실시예 2의 마늘발효물과 비교하여 통계적으로 의미있는 혈관평활근 세포 증식 감소 효과를 나타내어 현저한 상승 효과가 나타남을 알 수 있었다(도 3).

<시험예 2> 뇌혈관 내피 세포에 대한 효과

마우스 뇌혈관 내피 세포(mouse brain endothelial cell, bEnd.3; ATCC CRL2299, Manassas, VA, USA)은 계대배양 22 내지 29회의 것을 사용하였다. 세포는 DMEM 배지에 10% FBS와 5 ㎍/mL 젠타마이신을 보충하여 사용하였다. 통계처리는 ANOVA 후 Student's T 검정법을 사용하였고, 결과는 별도로 언급하지 않는다면 평균±표준오차로 제시하였다.

1. NO(nitric oxide, 일산화 질소) 생산

실시예 1에서 제조한 마늘 발효물의 NO 생산에 미치는 효과를 알아보기 위하여, NO 표지자인 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA; Calbiochem) 5 μM을 사용하여 Ex 485 nm 및 Em 538 nm에서 형광을 측정하였다. 양성 대조군으로 500 μM L-arginine을 사용하였다.

도 4에 제시한 바와 같이, 양성 대조군인 L-arginine 보다는 작지만, 통계적으로 의미있는 NO 생산 증가를 나타내었고, 비교실시예 1 또는 비교실시예 2와 비교하더라도 의미있는 상승 효과를 나타내었다.

2. eNOS(endothelial nitric oxide synthase) 발현

eNOS 발현은 실시간 PCR 정량법으로 mRNA를 측정하였다. 전체 RNA는 Trizol 용액(Invitrogen)으로 분리하여 역전사하였고, SYBR master mix (Takara, Otsu, Shiga, Japan)을 구입하여 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 시험에 사용한 마우스 eNOS용 프라이머는 하기와 같다.

eNOS (F): TCCGGAAGGCGTTTGATC, (R): GCCAAATGTGCTGGTCACC

도 5에 제시한 바와 같이, eNOS의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 VEGF는 본 발명의 마우스 뇌혈관 내피세포 에서도 현저하게 eNOS의 mRNA 발현을 증가시켰고, 실시예 1에서 제조한 마늘 복합 발효물은 의미있게 이를 감소시켰다. 반면, 비교실시예 1 또는 비교실시예 2는 eNOS mRNA의 발현을 감소시키기는 하였으나, 실시예 1 만큼은 아니었다.

<시험예 3> 항산화 효과: DPPH radical 소거능

DPPH(1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl) 용액은 DPPH 6 mg과 메탄올 100 mL을 시험관에 넣은 후 교반하여 제조하였다. 실시예 1, 비교실시예 1 및 비교실시예 2는 각각 5 중량%를 메탄올에 혼합하여 균질화하여 준비하였다. 용매인 메탄올을 동량 첨가한 군을 (음성)대조군으로, 아스코르브산(ascrobic acid) 0.5 mg/mL을 양성대조군으로 사용하였다. 흡광도를 측정하기 위한 용기(cell)에 1 mL의 시료를 각각 첨가하고, DPPH 용액 1 mL를 첨가하여 빛이 차단된 실온에서 30분간 반응시켰다. DPPH radical 소거능은 517 nm에서 측정한 흡광도의 비율로 계산하였고, 결과는 (대조흡광도 - 시료흡광도/대조흡광도) X 100 의 3회 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.

실험 결과, 본 발명의 실시예 1 (0.5 mg/mL)의 DPPH radical 소거능이 비교실시예 1 (0.5 mg/mL) 또는 비교실시예 2 (0.5 mg/mL)와 비교하여 통계적으로 의미있게 높았고, 양성 대조군인 아스코르브산과 유사한 수준(통계적 차이 없음)으로 나타났다(도 6).

<시험예 4> 혈관이완 효과

실시예 1, 비교 실시예 1 및 비교 실시예 2에서 제조된 마늘 발효물의 관상동맥이완 및 수축능을 검정하기 위하여 관상동맥을 이용하여 등척성장력을 힘-변위변환기가 장착된 생리기록계를 이용하여 측정하였다. 돼지의 관상동맥을 적출하여 크렙스 완충용액에 넣고 주변 조직과 지방을 제거한 후 약 3mm 길이로 자른 coronary artery ring을 준비하였다. 준비된 관상동맥 중 내피세포의존성 혈관이완 효과검정을 위해 일부의 ring 은 내피세포를 제거하여 준비하였다. 준비된 coronary artery ring을 Organ bath 내의 95% O₂ 및 5% CO₂ 기체로 포화시킨 37℃의 크렙스용액에서 고정시킨 후, 등척성장력을 힘-변위 변환기가 장착된 생리기록계를 이용하여 측정하였다. Ring을 5 grm으로 안정화시킨 후 KCl 120 mM 2회 넣어 최대장력을 측정하고, 다시 안정화시킨 coronary artery ring을 혈관최대장력의 80%로 수축시킨 후 일정한 grm을 유지시키고 acetylcholine을 처리하여 내피세포의존성 혈관이완효과를 측정한 다음, 크렙스용액으로 3회 세척하였다. 시료의 혈관기능에 대한 영향평가는 먼저 안정화된 혈관을 수축시킨 후, 이어서 대상물질에 의한 이완-수축반응을 농도의존적으로 수회 처리하여 relaxation percent를 확인하였고 혈관기능에 대한 영향은 phenylephrine 10 μM의 수축에 대한 이완율로 계산하여 대조군과 비교하였다. 양성대조군으로 nitric oxide 공여자인 소듐 니트로프루시드(sodium nitroprusside, SNP) 100 μM을 사용하였다.

실시예 1에서 제조한 마늘 발효물을 이용하여 혈관 이완효능을 평가한 결과 0.5 mg/ml에서 90%에 가까운 이완효능을 나타내어 양성 대조군인 SNP와 비교하여 통계적으로 의미있는 차이를 나타내지 않았다. 반면, 동일한 농도의 비교 실시예 1 및 비교 실시예 2는 약 50%의 이완 효능만이 관찰 되었고, 이 결과는 실시예 1과 통계적으로 의미있는 차이를 나타내는 것이었다(도 7).

Claims

1) 정제수와 다진마늘을 10:1 내지 5:1(w/v)로 혼합하고, KCTC 12696BP 및 KCTC 12697BP의 바실러스 서브틸리스 혼합균주를 접종하여 1차 발효시키는 단계;
2) 메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 동결건조된 사탕수수 추출물을 제조하는 단계;
3) 단계 1) 및 2)에서 제조된 성분을 혼합하여 2차 발효시키는 단계;
4) 여과한 액상을 3차 발효시키는 단계; 및
5) 숙성조에서 숙성시키는 단계;를 포함하고,
메주콩, 쌀눈, 구운소금 및 동결건조된 사탕수수 추출물은 100 내지 200 : 10 내지 50 : 3 내지 6 : 30 내지 60의 중량비로 혼합되는 것인 심혈관 질환 또는 뇌혈관 질환 개선 효과가 증진된 마늘 혼합 발효물의 제조방법

제1항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 혼합균주는 마늘 분쇄물 중량대비 0.01 내지 5% 접종하는 것을 특징으로 하는 제조방법

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제1항에 있어서, 동결건조된 사탕수수 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 제조방법

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