JP2003327540A

JP2003327540A - ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質

Info

Publication number: JP2003327540A
Application number: JP2003049132A
Authority: JP
Inventors: Makio Furubayashi; 万木夫古林; Hiroaki Matsushita; 裕昭松下; Ryoichi Tsukiyama; 良一築山
Original assignee: Higashimaru Shoyu Co Ltd
Current assignee: Higashimaru Shoyu Co Ltd
Priority date: 2002-03-07
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2003-11-19
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: JP4484014B2

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活
性および免疫賦活物質の提供。【解決手段】大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれら
の加工品を含有する原料の発酵分解物から得られるヒア
ルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物
質。これらの原料を、糸状菌、納豆菌またはこれらから
得られる酵素により発酵を行う。該発酵物を水、食塩水
または低濃度のアルコールで抽出または浸漬して高分子
画分として得ることができる。ヒアルロニダーゼ阻害、
抗アレルギー活性又は免疫賦活活性を利用して化粧品・
医薬及び飲食品とすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒアルロニダーゼ
阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活活性物質、その
製造法およびその用途に関する。より詳しくは、本発明
は、皮膚の潤滑性、柔軟性を保ち、老化を防ぐヒアルロ
ン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を抑制して、皮
膚の小ジワやかさつきを防ぎ、また免疫系におけるIgA
生産能を賦活化する免疫賦活活性を有する物質、その製
造法およびその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を加
水分解する酵素であり、動物組織に広く分布している。
その基質となるヒアルロン酸は、皮膚・関節液などの組
織に多く存在するムコ多糖の一種であり、例えば、皮膚
においては、細胞の保護・栄養の運搬・組織水分の保持
・柔軟性の維持等に、また、関節液として組織構造・機
能の維持および潤滑性の保持等に重要な役割を果たして
いる。

【０００３】皮膚や関節等における生体中のヒアルロン
酸量は、老化または病的状態により減少し、皮膚の乾燥
・肌荒れ・弾力性の低下、シワの増加、あるいは関節の
湿潤性悪化による関節痛等を引き起こす。このような状
態に対して、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸
の分解を抑制し、生体ヒアルロン酸量の維持に寄与す
る。

【０００４】また、ヒアルロニダーゼ阻害剤はヒアルロ
ニダーゼに起因する抗炎症・抗アレルギー剤にも利用す
ることができる。これは、ヒアルロニダーゼが炎症時に
活性化され、結合組織のマトッリクスを破壊し、炎症系
の組織への浸潤・血管の透過性を亢進すること、Ｉ型ア
レルギーにおける肥満細胞からのヒスタミンの遊離の過
程に介在している可能性が高いことによる。従って、抗
炎症剤・抗アレルギー剤であるインドメタシン、アスピ
リン、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラスト等には
高いヒアルロニダーゼ阻害活性が認められている。ヒア
ルロニダーゼ阻害剤は、近年患者数が増加しつつあり、
社会問題化しているアトピー性皮膚炎、花粉症、気管支
喘息、食物アレルギー等のアレルギー性疾患の予防や改
善効果が期待されている。

【０００５】また、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアル
ロン酸を配合した化粧料の皮膚への塗布や関節へのヒア
ルロン酸の注入等の措置による外因性ヒアルロン酸の安
定化にも利用することができる。

【０００６】これまでに、ヒアルロニダーゼ阻害活性を
有するものとしては、茶ポリフェノール類（特許文献
１）、果実ポリフェノール類（特許文献２）、水溶性プ
ロポリス（特許文献３）、生薬又は飲食物として使用さ
れているチンピ・キジツ・羅漢果の抽出物（特許文献
４）、ブナ科の植物であるウラジロガシ抽出物（特許文
献５）、カシューナッツ殻油（特許文献６）、ウルシ科
植物抽出物（特許文献７）、海藻類（特許文献８）等が
見出されているが、作用・効果が不十分な点や、活性を
保ったまま製剤に安定に配合することが困難であるとい
うような問題点が残されていた。

【０００７】一方、生体が外界と接する境界には皮膚と
粘膜があるが、粘膜面積の方がはるかに広く、その中で
も腸管粘膜表面は最も広い面積を有する。腸管粘膜は多
数のウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原や食物抗原と
接触する場所であるため、それらの異物抗原から身体を
守るための腸管免疫システムが存在する。この腸管免疫
として機能するものとしてIgAが存在し、このIgAは、細
菌やウィルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食物
抗原によるアレルギー抑制等に重要な役割を果たしてい
る。

【０００８】免疫力が低い老人や幼児あるいは体力の低
下した人は、ウィルスや病原菌などの外部からの異物に
対する抵抗力が低い事が知られており、IgAを高く保つ
作用を有する物質、あるいはIgAの生産力を高めること
ができる免疫賦活剤の開発が望まれている。

【０００９】免疫賦活活性物質としては、発酵乳製品が
古くから知られているが、嗜好的要素もあり利用範囲が
限定されること、作用・効果が不十分な点や、製剤への
配合に特殊な技術が必要なことなどの問題があった。最
近においては、エンテロコッカス属の菌体または処理物
を有効成分とするもの(特許文献９)、核酸組成物を有効
成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品（特許文献
１０）、カカオ豆から得られる抽出物を有効成分とする
免疫賦活剤（特許文献１１）等があるが、その実用性は
まだ明らかでない。

【００１０】

【特許文献１】特開平６−９９３９１号公報

【特許文献２】特開平８−２５９４５３号公報

【特許文献３】特開平１１−２９０００５号公報

【特許文献４】特開平６−８０５７６号公報

【特許文献５】特開平６−２３９７５７号公報

【特許文献６】特開平６−３２９５２６号公報

【特許文献７】特開平７−１０７６５号公報

【特許文献８】特開平９−６７２６６号公報

【特許文献９】特開平１１−９２３８９号公報

【特許文献１０】特開２００１−３１４１７２号公報

【特許文献１１】特開２０００−８６５２６号公報

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記事情に
鑑みなされたものであって、経済的、安全性に優れたヒ
アルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性ならびに免
疫賦活活性を有する物質およびその製造法を提供するこ
とを目的とする。さらに、本発明は、このような物質を
用いたヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性、
免疫賦活活性等の生理活性を有するアレルギー抑制、肌
荒れ抑制、小じわ発生の抑制、関節痛の抑制あるいは免
疫賦活作用を持つ、食品、化粧品及び医薬を提供するこ
とを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒアルロ
ニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性、免疫賦活活性を
有する物質のスクリーニングを鋭意行った。その結果、
大豆、ユズ、スダチ、ミカン等の柑橘類、およびこれら
の加工副産物である脱脂加工大豆、大豆皮、大豆粕、お
から、豆腐あるいは柑橘類の果皮、柑橘類の果汁を窄汁
した残渣等の原料を糸状菌、納豆菌および／または糸状
菌、納豆菌の酵素で処理することにより、ヒアルロニダ
ーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および免疫賦活活性が
発現することを発見し、本発明をなすに至った。

【００１３】本発明のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレル
ギー活性および免疫賦活活性を有する物質は、大豆、小
麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を原料とし、
糸状菌（麹菌）または納豆菌を利用した発酵物全般から
得ることができる。また、本発明の物質は、アルコール
不溶性、水可溶性であり、分子量12,000以上である。

【００１４】すなわち、本発明は、次のとおりのヒアル
ロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質
に関する (1) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品
を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状
菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からなる、ヒア
ルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免
疫賦活活性物質。 (2) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品
を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状
菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分子画分か
らなる、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性およ
び／または免疫賦活活性物質。 (3) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品
を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状
菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水ま
たは低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られ
る高分子画分からなるヒアルロニダーゼ阻害、抗アレル
ギー活性および／または免疫賦活活性物質。

【００１５】また、本発明は、次のとおりのヒアルロニ
ダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫活性物質の製
造法に関する。 (4) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品
を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状
菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水ま
たは低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られ
る液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を採取す
ることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれかに記載のヒ
アルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または
免疫賦活活性物質の製造方法。 (5) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品
を含有する原料を糸状菌、納豆菌および／または糸状
菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、水、食塩水
または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬し、得られ
た液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得ることを特
徴とする（1）〜（3）のいずれかに記載のヒアルロニダ
ーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質の製造
方法。

【００１６】さらに本発明は、前記物質の次のとおりの
用途に関する。 (6) (1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成
分とするヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性およ
び／または免疫賦活剤。 (7）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成
分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性
および／または免疫賦活活性を有する健康・機能性飲
料。 (8）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成
分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性
および／または免疫賦活活性を有する化粧品。 (9）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成
分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性
および／または免疫賦活活性を有する医薬品。

【００１７】次に、本発明の前記生理活性を有する高分
子物質を得る手段の一例を以下に示す。しかし、本発明
はこのような方法に特に限定されるものではない。大
豆、脱脂大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐等の大豆
加工品、あるいは、ユズ、スダチ等の柑橘類、柑橘類の
果皮、柑橘類から果汁を窄汁した残渣等の果実の加工
品、あるいは小麦を含有する原料に、水を加えるかその
ままで蒸煮あるいは焙煎する等の加熱処理を施し、これ
に、麹菌等の糸状菌や納豆菌を生育させることによっ
て、本発明に関わる活性成分を発現させる。

【００１８】これら微生物の生育を促進させるために、
各種栄養源を補給することもできる。また、通常の醤油
原料である大豆、小麦に大豆加工品や柑橘類、果実ある
いはこれらの加工品を添加して製麹することも可能であ
る。このようにして培養物中に発現した活性成分はその
ままでも利用が可能であり、水や食塩水あるいは30％
（v/v）程度未満の低濃度エタノール等のアルコールで
容易に抽出することができる。さらには、食塩水や30％
（v/v）程度未満のエタノール中で長期間発酵させても
得ることができる。

【００１９】また、大豆、脱脂大豆、大豆皮、大豆粕、
おから、豆腐等の大豆加工品、あるいはユズ、スダチ等
の柑橘類、柑橘類の果皮、柑橘類から果汁を搾汁した残
渣等の果実の加工品、あるいは小麦を含有する原料に、
麹類や納豆菌の培養物から得られる粗酵素剤を作用させ
て生成させることも可能である。この場合、上記原料を
蒸煮もしくは焙煎しておくことが望ましく、処理原料１
重量部に対して水、食塩水、30％（v/v）程度未満のエ
タノールもしくはこれらの混合液を１から10重量部程度
加え、腐敗せずに酵素による加水分解が進行する温度、
好ましくは水を加えたときは５℃以下で１〜数日間、塩
水あるいは30％（v/v）程度以下のエタノールを加えた
ときは30〜45℃程度で１日〜数週間程度処理する。

【００２０】本発明においてヒアルロニダーゼ阻害活
性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性は、
発酵分解物中に発現し、これをそのまま利用することも
可能である。さらに利用しやすくするために、以下に示
すような手段で、抽出し、あるいはその高分子画分を濃
縮することによってこれらの活性をさらに高めることも
できる。

【００２１】本発明の生理活性物質を抽出するには、大
豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品の発酵
分解物に、１から10重量部程度の水、食塩水、あるいは
30％（v/v）程度未満のエタノールを加えて攪拌をする
かしないで1時間〜数日間放置し、ろ過し、そのろ液を
使用する。本発明の生理活性を有する高分子物質を得る
には、上記分解物の抽出ろ液に、エタノールを添加して
生成する不溶性物質をろ過あるいは遠心分離で集める方
法、あるいは、これらの液体を限外ろ過膜に通すことに
よって高分子物質を含有する画分である非透過液を集め
る方法、あるいはこの非透過液にエタノールを加えて不
溶物を生成させ、それを回収する方法等が利用できる。

【００２２】本発明に係る高分子物質を採取するために
加えるエタノールの量は、高分子物質が不溶性となる濃
度であればよく、最終エタノール濃度が30％（v/v）以
上、望ましくは50％（v/v）以上になればよい。エタノ
ールに代えてメタノールや2-プロパノール等によっても
本発明の高分子物質は回収できるが、安全性の面でエタ
ノールが好ましい。

【００２３】本発明のアルコール沈殿により高分子画分
を採取した残りの液は、新たな原料から高分子物質を回
収するために利用することも可能である。また、例えば
この液は添加したエタノールとともにアミノ酸や低分子
の糖質を含有するものであり、蒸留などの操作によって
エタノールと分離する。エタノールは本発明において再
利用でき、また、不揮発成分は調味料や食品として利用
することもできる。あるいは、限外ろ過による透過液は
そのままで調味料や食品として利用することが可能であ
る。

【００２４】得られたヒアルロニダーゼ阻害活性および
／または免疫賦活活性を有する生理活性物質は、水など
に溶解した形態、粉末化した形態、あるいはそのまま利
用することが可能であり、製剤としてもよく、また飲食
品、化粧品、医薬（医薬部外品も含む）などに適宜配合
することができる。また、必要に応じて、透析、限外ろ
過あるいはゲルろ過などの方法によってさらに活性（ヒ
アルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／ま
たは免疫賦活活性）または純度の高い物質を得ることも
可能である。

【００２５】本発明の生理活性物質を製剤化するときは
温度に留意することが必要で、100℃程度の高温になる
と活性が低下する可能性がある。本発明の生理活性物質
は、上記の方法により得られた抽出物をそのまま直接使
用してもよいが、一般的には適当な液体担体に溶解する
かもしくは分散させ、または、適当な粉末担体と混合す
るかもしくはこれに吸着させ、場合によっては、さらに
これらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿
潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、散剤、
錠剤、カプセル剤、液剤等の製剤として使用する。

【００２６】本発明における生理活性物質の使用量は生
理活性物質の純度により大きく異なる。例えば大豆皮を
原料として麹菌を３日間培養して10倍量の水で２時間抽
出後得られたろ液に、２倍量のエタノールを加えて得ら
れた沈殿物を透析した後凍結乾燥した本発明の生理活性
物質の場合、成人1人あたり10〜1000mg程度が望まし
く、これは飲食品あるいは化粧品として用いたときも免
疫賦活剤として用いたときも、あるいはヒアルロニダー
ゼ阻害剤として用いたときも同様である。

【００２７】製剤として使用する場合における生理活性
物質の使用量は製剤の形態によっても異なるが、0.001
重量%以上が好ましく、安全性に全く問題がないので特
に上限は規定しない。

【００２８】本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性および
または免疫賦活活性を有する生理活性物質を飲食物に添
加して、ヒアルロニダーゼ阻害作用または免疫賦活作用
を有する飲食物を得るに当たって、その免疫賦活物質を
飲食物に添加する方法としては、通常一般的に行われて
いる方法でよいが、好ましくは、色素、香料等を添加す
るように最終工程で添加することが好ましい。

【００２９】これらの飲食物としては、チューインガ
ム，キャンディ，錠菓，グミゼリー，チョコレート，ビ
スケットまたはスナック等の菓子、アイスクリーム，シ
ャーベットまたは氷菓等の冷菓、飲料、プリン、ジャ
ム、乳製品、醤油味噌等の調味料等が挙げられ、これら
の飲食物を日常的に接種することにより免疫力を強化す
る事が可能となる。

【００３０】これらの飲食物に対する本発明の生理活性
物質の添加量としては、飲食物の形態によっても異なる
が、0.001重量%以上の添加が望ましく、嗜好性の面から
は20重量%以下が望ましい。また、カプセルや錠剤型の
健康食品、機能性食品の場合、その濃度に上限を設ける
必要はない。

【００３１】また、本発明の生理活性物質は、そのまま
化粧品に添加して使用することもできるが、公知の賦形
剤や希釈剤、あるいは他の任意の配合材料とともに混合
して顆粒、エマルジョン、溶液、懸濁液などの剤形に調
整して使用することができる。さらに、本発明の化粧品
では本発明の生理活性物質以外に、本発明の効果を損な
わない範囲で、ビタミン類、保湿剤、増粘剤、界面活性
剤、湿潤剤、香料、色素、防腐剤、紫外線吸収剤、酸化
防止剤、アミノ酸類、各種動植物抽出物、胎盤抽出物な
どの化粧品添加物として公知のものを適宜任意に組み合
わせて配合することもできる。

【００３２】具体的な化粧品の例としては、ローショ
ン、乳液、クレンジングクリーム、マッサージクリー
ム、日焼け止めクリーム等のクリーム類、パック類等の
基本化粧品、あるいはファンデーション、口紅、ほお
紅、アイシャドー、おしろい等のメークアップ化粧品を
挙げることができる。また石けん、洗顔クリーム、ボデ
ィローション、入浴剤等として調製することもできる。
このような化粧品においては、その製造工程の任意の段
階で、本発明の生理活性物質の粉末や液体など、目的に
適した剤形のものを配合することができる。

【００３３】本発明の生理活性物質の免疫賦活活性は、
医薬として免疫力の低い老人や幼児あるいは体力の低下
した人に、その免疫力を高めるために用いられる。ま
た、主にヒアルロニダーゼ阻害活性は花粉症などのアレ
ルギーを抑制するために用いられる。

【００３４】これらは、本発明の生理活性物質を含有
し、所望により、製剤学的に許容することのできる担体
を含有することができる。投与形態としては、特に限定
がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセ
ル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス
剤、若しくは丸剤などの経口剤、または注射剤、外用液
剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼
薬などの非経口剤を挙げることができる。

【００３５】これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊
剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存
剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または
酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することがで
きる。

【００３６】

【発明の実施の形態】

【実施例１】以下の方法により脱脂加工大豆と小麦、大
豆皮と小麦、大豆皮を原料とする麹を作成した。3L容三
角フラスコに脱脂大豆100gあるいは大豆皮100gを入れ、
熱水120mlを加えた後30分間放置した。続いて、割砕小
麦90gを加えよく撹拌後、121℃で45分間オートクレーブ
処理を行った。また、大豆皮100gを割砕小麦を加えるこ
となく、上記の処理を行った。放冷後、種麹（Aspergil
lus oryzae HL-15株）10gを植菌し、よく撹拌した。そ
の後、30℃に保持したウォーターバスで48時間静置培養
を行って麹とした。その間、撹拌のため2回の手入れ（2
0時間後および30時間後）を行った。

【００３７】培養したそれぞれの麹の一部（90g）に純
水150mlを加え、10,000rpmで15分間ホモジネートを行っ
た。続いて、ホモジネート液を7,000rpmで30分間遠心分
離を行い、上清を回収して各麹の水抽出液とした。

【００３８】麹の水抽出液に2倍量のエタノールを添加
し沈殿物を生成させた。続いて、7,000rpmで10分間遠心
分離を行い、沈殿物を回収し凍結乾燥して試験品１とし
た。

【００３９】また、同様に操作して得られた沈殿物を約
100mlの純水に溶解し、分画分子量12,000以上の透析チ
ューブ（和光純薬工業製、商品名Seamless cellulose t
ubing, small size 18, Wako、以下の実施例においても
同様の透析チューブを使用した）に充填し、4℃の流水
中で一夜透析した。その後、透析内液にその2倍量のエ
タノールを添加・混合し生成した沈殿物を、7,000rpmで
10分間遠心分離して回収し凍結乾燥して試験品２とし
た。

【００４０】試験品１および２を用いて次の方法でヒア
ルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定し
た。その結果を表1に示した。

【００４１】＜ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定方法＞
乾燥粉末を水に溶解した後、0.1Ｍ酢酸緩衝液（pH 4）
中に添加し、濃度の異なる水溶液を調製した。これらの
水溶液0.2mlに、ヒアルロニダーゼ（シグマ社製の牛睾
丸由来、タイプＩＶ-S）を400単位（0.1ml）添加して反
応液とした。なお、これらの反応液中の乾燥粉末の終濃
度は、0.01〜10 ｍｇ／ｍｌである。また、これらの乾
燥粉末を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対
照とした。

【００４２】上記の反応液を37℃で20分間プレインキュ
ベートした後、ヒアルロニダーゼの活性化物質であるCo
mpound48/80（シグマ社製）、塩化カルシウムおよび塩
化ナトリウムの混合液を、終濃度が0.1mg/ml、2.5mMお
よび150mMとなるように加え、さらに37℃で20分間プレ
インキュベートした。この溶液に、基質であるヒアルロ
ン酸カリウム（和光純薬製、ヒト臍帯由来）を、終濃度
が0.4mg/mlとなるように加えて、37℃で40分間インキュ
ベートして酵素反応を行った。

【００４３】その後、基質が分解されることによって遊
離したN-アセチルグルコサミンをモルガン・エルソンの
改良法（Davidson, E. A., J. Biol. Chem., 242, 437,
1967）により発色させ、分光光度計（島津製作所製 UV
-1200）を用いて585nmの吸光度を測定した。この測定結
果から、本発明品の生理活性物質を含有する反応液にお
けるヒアルロニダーゼ活性阻害率（%）を、以下に示す
計算式（１）に従って計算した。さらに、本発明品の生
理活性物質の濃度とヒアルロニダーゼ活性阻害率との関
係から、最小二乗法によって、ヒアルロニダーゼ活性を
50%阻害する場合の濃度（IC₅₀）（mg/ml）を求め、その
結果を表1に示した。阻害活性(%)＝[（対照反応液の吸光度−試料反応液の吸光度）／対照反応液の吸光度]×100 …（１）ヒアルロニダーゼ阻害については、比較試験としてヒア
ルロニダーゼ阻害剤であるクロモグリク酸ナトリウム
（DSCG）の結果を併記した。

【００４４】＜免疫賦活活性の測定方法＞BALB/cマウス
雄性７週齢（日本クレア）よりパイエル板組織を取り出
し、20%FBS（ウシ胎児血清）を含むRPMI-1690培地（Gib
co社製）に浸し、組織を押しつぶし、ナイロンメッシュ
を通して単細胞浮遊液とした。これを800rpmで5分間遠
心分離して上清を除き、20%FBSを含むRPMI培地に1×10⁷
個/mlになるように懸濁した。

【００４５】IgA誘導剤として、試験品１または２を200
μg/ml添加した96穴平底プレートに、上記懸濁液を100
μlずつ添加し、37℃、5%CO₂の存在下で３日間培養し、
培養液を3000rpmで遠心分離し、上清のIgAをELISA法に
より測定した。パイエル板細胞に何も添加せずに培養し
た対照群の値を１とした時の比活性を示した。

【００４６】

【表１】

【００４７】

【実施例２】脱脂加工大豆100gと小麦90g、大豆皮100g
と小麦90g、大豆皮100g、ユズ皮100g、スダチ皮100gを
原料として実施例１と同様の方法で麹をそれぞれ作成し
た。続いて、実施例１と同様に操作して得られた沈殿物
及び透析物を凍結乾燥して試験品３とした。実施例１に
記載の方法で、試験品３を用いてヒアルロニダーゼ阻害
活性および、免疫賦活活性を測定した結果を表２に示
す。

【００４８】

【表２】

【００４９】

【実施例３】（酵素処理による活性の発現）米と押麦を
等量混合したものを原料として麹菌（Aspergillus oryz
ae）を接種して実施例１の方法と同様に培養し麹を作成
した。得られた麹50gに200mlの0.1Mリン酸バッファー
（pH 7.0）を加え、菌体破砕のために氷中でホモジナイ
ズ(10,000rpm×15分）を行った後、遠心分離(7,000rpm
×15分）により上清を得た。メンブレンフィルター(0.4
5μm）で上清をろ過し、麹菌酵素を含む酵素液とした。
大豆皮、ユズ皮、スダチ皮（それぞれ4g）を100ml容三
角フラスコに入れ、熱水8mlを加え30分放置した後、121
℃で30分間オートクレーブした。放冷後、酵素液を20ml
加え、30℃で18時間インキュベートした。インキュベー
ト後の反応液を遠心分離(3,500rpm×10分）し、得られ
た上清に対して2倍容量のエタノールを加えて沈殿を生
じさせた。続いて、遠心分離(7,000rpm×10分）により
回収した沈殿物を凍結乾燥してヒアルロニダーゼ阻害活
性を測定した。表３に示すとおり、麹菌の酵素で処理す
ることにより活性が発現した。

【表３】＊ヒアルロニダーゼ阻害活性強度は、試料1mg/mlを添加
したときの阻害率によって下記の通り5段階に分けて表
示した。 0%：（−）、30%以下：（±）、30-60%：（＋）、60-90
%：（＋＋）、90％以上：（＋＋＋）

【００５０】

【実施例４】アレルギー反応は４つの型に分類され、そ
の中のＩ型アレルギー反応は組織中の肥満細胞や血液細
胞中の好塩基球の細胞膜上にあるFCεリセププターにIg
E抗体が結合し、その２分子の抗体が抗原で架橋される
ことにより脱顆粒現象が生じて、酵素やヒスタミン、セ
ロトニンの化学伝達物質が細胞外へ遊離する。これらの
物質により気管支喘息、アレルギー性鼻炎等のアレルギ
ー疾患が発症すると考えられている。そこで、Ｉ型アレ
ルギー反応に関与する正常好塩基球や肥満細胞と同様な
機能を有するラット好塩基球白血球細胞（RBL-2H3）を
用いて、片岡および高垣の文献（片岡正博、高垣裕：生
薬学雑誌、46(1)、25-29、1992）に従い本発明の試験品
２の脱脂加工大豆と小麦の麹の透析物について抗アレル
ギー活性を評価した。

【００５１】ラット好塩基球白血病細胞（RBL-2H3）
は、Wistar系ラットにβ-chloroethylamide を投与して
作成された Rat basophilic leukemia 細胞（RBL 細
胞）群中クローニングより得られた細胞である。RBL-2H
3 細胞はRPMI-1640培地（Sigma製）に3％ Fetal calf s
erum (HyClone 製)および0.2％ Bovine serum albumin
Fraction V（生化学工業製）を含む培養液中37℃、５％
CO₂で培養した。

【００５２】RBL-2H3 細胞液（5×10⁵ cells/ml）を24
Well（Costar 製）に0.4ml分注し、マウス抗DNPIgE抗
体を0.5μg/ml加えて、37℃、5％CO₂インキュベーター
で12時間培養し感作を行った。培養後 Well中の培養液
を吸引除去しリン酸バッファーで2回洗浄後、Releasing
medium を260μl加えた。Releasing mediumに溶解した
試験品2を添加し、10分間インキュベート後、抗原とし
て20μlのDNP-BSA（4.0μg/ml）を加え更に30分間イン
キュベートした。上清中に遊離されたヒスタミン量を E
LISA キット（SPI bio 社）を用いて測定し、ヒスタミ
ンの遊離抑制を抗アレルギー活性の指標とした。比較試
験としてフマル酸ケトチフェンの結果を併記した。表４
に示したとおり試験品２を添加した区は無添加にくらべ
てヒスタミン遊離を抑制し、抗アレルギー活性が認めら
れた。

【００５３】

【表４】

【００５４】

【実施例５】脱脂加工大豆と小麦を主原料とした生揚げ
醤油100mlにエタノール50,100,200mlをそれぞれ添加混
合し、生成した不溶物を遠心分離によって採取した。次
いで、それぞれの沈殿物を100mlの純水に溶解し、再度
エタノール50,100,200mlをそれぞれ添加混合し、生成し
た不溶物を遠心分離によって集め凍結乾燥して乾燥物を
得た。得られた乾燥物を試験品４として用いた。また、
同様に操作して得られた沈殿物を約20mlの水に溶解し、
分画分子量12000以上の透析チューブに詰め、4℃の流水
で一夜透析した。その後、透析内液にその2倍量のエタ
ノールを添加・混合し生成した沈殿物を遠心分離によっ
て集め、凍結乾燥によって乾燥した。得られた乾燥物を
試験品５とした。試験品４および５を用いて実施例１と
同様の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦
活活性を測定した。結果を表５に示した。

【００５５】

【表５】

【００５６】

【実施例６】丸大豆と小麦を主原料とした生揚げ醤油50
0mlにエタノール1000mlを添加し十分混合後一夜静置
し、上清をデカンテーションで除き、さらに66%のエタ
ノール1500mlで十分洗浄した。生成した沈殿物をデカン
テーションおよび遠心分離して集め、室温で2時間程度
エタノールを飛散させた後凍結乾燥すると凍結乾燥物25
gが得られた(以下、沈殿物という)。この乾燥物20gを約
100mlの水に溶解し、透析チューブに詰めて一夜流水中
で透析した。透析内液にその2倍量のエタノールを加え
て混合後遠心分離し、得られた沈殿物を凍結乾燥すると
凍結乾燥物2.6 gが得られた（以下、透析残存物とい
う）。それぞれについて実施例1と同様の方法で、ヒア
ルロニダーゼ阻害活性および免疫賦活活性を測定し、そ
の結果を表６に示した。免疫賦活活性についてはIgA誘
導剤としての試料添加量を200μg/mlおよび2mg/mlで行
い、また、ヒアルロニダーゼ阻害については、比較試験
としてヒアルロニダーゼ阻害剤であるクロモグリク酸ナ
トリウム（DSCG）の結果を併記した。

【００５７】

【表６】

【００５８】

【実施例７】醤油麹1kgに水2.2Lおよび防腐のためにエ
タノール500mlを加え30℃で1および4週間放置し、麹菌
酵素による分解を行った。これらの期間中麹菌、乳酸
菌、酵母等の増殖は認められなかった。これを圧搾して
ろ液を得、さらに清澄ろ過して得られたろ液500mlに、
エタノールを1L添加して混合後しばらく静置し、生成し
た沈殿物をデカンテーションおよび遠心分離して集め
た。さらに、その一部を実施例６と同様に透析、エタノ
ールによる沈殿、および凍結乾燥して透析残存物を得
た。これらについて実施例１と同様の方法でヒアルロニ
ダーゼ阻害活性ならびに免疫賦活活性を測定した。その
結果を表７に示した。

【００５９】

【表７】

【００６０】

【実施例８】生揚げ醤油6Lを限外ろ過膜（分画分子量5,
000）に通し、透過液4.8 Lと非透過液1.2 Lに分別した。また、生揚げ醤油、透過
液（低分子）、非透過液(高分子)のそれぞれの一部をと
り、95℃、5分加熱後55℃、2日保持し、発生する火入れ
おりをセライトろ過で除いて火入れろ過醤油を得た。こ
れらの150mlにエタノールを300ml添加混合後しばらく静
置したところ、透過液およびその火入れろ過液から沈殿
の発生は認められなかった。

【００６１】沈殿が生成したものについて、デカンテー
ションおよび遠心分離によって沈殿物を集めた。得られ
た沈殿物はそれぞれ150mlの水で溶解しエタノール300ml
を添加して沈殿を発生させ同様の方法で回収した。沈殿
物の1/2量は凍結乾燥し、残りの1/2量は少量の水に溶解
して透析チューブに詰め、 1夜冷流水にて透析後、透析
内液にその2倍量のエタノールを添加して生成した沈殿
物を遠心分離で採取し凍結乾燥した。それぞれについて
ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定し、表８にその結果を
示した。

【００６２】表８によると、加熱したほうがヒアルロニ
ダーゼ阻害活性は低く、生揚げ醤油から回収するほうが
有利と思われる。また、限外ろ過によって高分子画分を
濃縮してから、エタノール沈殿させると効率よく回収で
きることが示唆された。

【００６３】

【表８】

【００６４】

【実施例９】大豆または小麦を蒸煮し、これに糸状菌、
もしくは納豆菌を接種し、30℃で3日間培養後、培養物1
00gに水500mlを加えて4℃で20時間攪拌し、布ろ過およ
び遠心分離によって澄明な抽出液を得た。得られた抽出
液にその2倍量のエタノールを添加し、生じた沈殿物を
遠心分離で採取した。さらにこの沈殿物を10mlの純水に
溶解し、透析チューブに詰めて流水中で15時間透析し
た。透析内液に2倍量のエタノールを加えて発生した不
溶物を遠心分離によって集め、凍結乾燥した。この凍結
乾燥物を反応最終濃度が1mg/mlになるように調製してヒ
アルロニダーゼ阻害活性を測定した。結果は表９にしめ
した。表９から明らかなように、大豆、小麦の原料その
ものからはヒアルロニダーゼ阻害活性は得られず、麹菌
あるいは納豆菌を生育することによって強い活性物質が
得られた

【００６５】

【表９】＊ヒアルロニダーゼ活性強度は表３と同様に表した。

【００６６】

【実施例１０】大豆および小麦を原料とした市販の発酵
食品のヒアルロニダーゼ阻害活性について検討した。試
料が液体の場合は、100gにエタノールを200ml添加して
混合した。固形物試料の場合は、その200gに純水400gを
加えて10,000rpmで10分間ホモジナイズし、遠心分離に
より上清300gを採取し、エタノール600mlを加えて混合
した。それぞれ、発生した沈殿物を遠心分離により回収
し、適量の純水に溶解して透析チューブに詰め、流水で
一夜透析後、透析内液を凍結乾燥し乾燥粉末を得て阻害
活性測定用の試料とした。結果は表10に示したように、
各種発酵物からヒアルロニダーゼ阻害活性物質が得られ
た。

【００６７】

【表１０】＊ヒアルロニダーゼ活性強度は表３と同様に表した。

【００６８】

【実施例１１】大豆と小麦を原料として作成した醤油
麹、または大豆を原料として作成した納豆10gに水50ml
を加えてホモジナイズした後ろ過し、得られたろ液を凍
結乾燥して、乾燥物それぞれ0.15gと0.13gを得た。これ
を純水に10mg/mlになるよう溶解し、0.2μmのフィルタ
ーによってろ過して試料液とした。この試料液を用いて
実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ阻害活性および
免疫賦活活性を測定した。その結果を表11に示した。

【００６９】

【表１１】

【００７０】

【実施例１２】（機能性食品）実施例1と同様の方法に
よって得られた大豆皮麹1kgに15%のエタノールを3L添加
して一夜冷蔵保管し、その後ろ過して抽出液2Lを得た。
これに4Lのエタノールを加えて撹拌後1週間静置した。
生成した沈殿物をデカンテーションによって集め、これ
を40℃で減圧乾燥後、凍結乾燥によって乾燥粉末30gを
得た。 (1) 上記の凍結乾燥粉末10%、馬鈴薯澱粉20%、乳糖70%
を混合し、粉末食品を得た。 (2) 上記の凍結乾燥粉末1%、オレンジ果汁5%、異性化糖
15%、クエン酸0.1%、香料0.1%、水78.8%を混合してオレ
ンジ果汁飲料を得た。これらの粉末食品及び飲料は抗アレルギー及び免疫力向
上のために食用に供される。

【００７１】

【実施例１３】（化粧品）実施例12と同様にして得られ
た乾燥粉末10gを100mlの純水に溶解し、透析チューブに
充填し一夜流水中で透析した。その透析内液を凍結乾燥
すると淡褐色の精製粉末が得られた。下記の処方例に従
って混合してローションを得た。（処方例）ポリオキシエチレン（20E. O.）ソルビタン
モノステアレート2.0（重量%、以下同じ）、ポリオキシ
エチレン（60E. O.）硬化ヒマシ油2.0、オリーブ油0.
5、エタノール10.0、上記の精製粉末の20%水溶液10.0、
精製水75.5（合計100）

【００７２】

【実施例１４】（医薬品）実施例13の乾燥粉末50%、デ
キストリン50%を混合し、0.1gをゼラチンカプセルに充
填する。これを、花粉症の予防薬として1日3回1カプセ
ルずつ服用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 7/48 Ａ６１Ｋ 7/48 Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/04 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１ (72)発明者築山良一兵庫県龍野市龍野町富永100−３ヒガシマル醤油株式会社研究所内Ｆターム(参考） 4B018 LB01 LB03 LB07 LB08 LB09 LE01 LE02 LE05 MD91 MD94 ME07 ME14 4C083 AA111 AA112 AA122 AC102 AC432 AC442 CC04 DD23 EE12 FF01 4C088 AB59 AB62 AB75 AC04 BA06 CA25 MA17 MA63 NA14 ZA89 ZB09 ZB13 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれら
の加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／ま
たは糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からな
る、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／
または免疫賦活活性物質。
【請求項２】大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれら
の加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／ま
たは糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分
子画分からなる、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー
活性および／または免疫賦活活性物質。
【請求項３】大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれら
の加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／ま
たは糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、
食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬し
て得られる高分子画分からなるヒアルロニダーゼ阻害、
抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。
【請求項４】大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれら
の加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／ま
たは糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、
食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬し
て得られる液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物
を採取することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに
記載のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および
／または免疫賦活活性物質の製造方法。
【請求項５】大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれら
の加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／ま
たは糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、
水、食塩水または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬
し、得られた液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒ
アルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または
免疫賦活物質の製造方法。
【請求項６】請求項１〜３のいずれかに記載される物質
を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー
活性および／または免疫賦活剤。
【請求項７】請求項１〜３のいずれかに記載される物質
を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレル
ギー活性および／または免疫賦活活性を有する食品。
【請求項８】請求項１〜３のいずれかに記載される物質
を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレル
ギー活性および／または免疫賦活活性を有する化粧品。
【請求項９】請求項１〜３のいずれかに記載される物質
を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレル
ギー活性および／または免疫賦活活性を有する医薬品。