KR101489569B1 - 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 혈전 용해능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물 및 그 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명을 통해 혈전 용해성이 우수한 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제공한다.
또한 본 발명을 통해 혈전 용해성이 우수한 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
혈전은 생체내 반응 중 자연스럽게 생성과 분해가 평형을 이루고 있는 대사과정의 산물로서 혈액의 응고와 관련이 있다. 혈액응고는 혈관벽의 손상, 수술 후 혈류속도의 변화에 따른 혈액내 혈소판 수의 증가, 피브리노겐(fibrinogen)의 증가 등 혈액조성에 변화가 생겼을 때 발생할 수 있다. 혈전의 생성은 손상된 혈관 내피세포에 혈소판이 부착하여 피브린(fibrin)을 형성하면서 시작된다.
혈전은 지혈작용의 일환으로 생기는 물질이며 지혈은 혈관벽이 손상되어 혈액이 유출되면 이를 방지하기 위하여 혈관이 수축하고 내경이 좁아지며 혈액응고 인자들이 관여하여 혈액을 응고시킴으로서 발생한다. 지혈과정은 크게 4단계로 나눌수 있는데 1)혈관의 수축, 2)혈소판의 응집으로 인한 혈전형성, 3)혈액응고, 4)응고된 혈액내 섬유성 조직의 증식 순으로 일어난다. 즉, 혈관 상처부위에서 노출된 콜라겐(collagen)에 혈소판과 조직이 모여 혈액응고가 시작되며 이 부위에 섬유성 조직이 증식하여 혈관이 막히게 되며, 이렇게 형성된 혈전은 뇌졸증과 같은 뇌 혈관계 질환의 원인이 되기도 한다. 일단 상처 등으로 노출된 콜라겐 주위로 혈소판이 모여들어 혈소판 뭉치가 커지면 혈소판의 코헤전(응집, cohesion)이 일어나며 아라키돈산(arachidonic acid)의 유리 및 산화가 일어나고 혈소판의 재정비가 일어나 혈전을 형성하는데, 이렇게 혈전이 생성됨과 동시에 혈액응고가 일어나는 과정에는 많은 인자가 관여한다. 이러한 혈액응고 과정의 산물이 피브린이며, 또한 혈관내 혈액응고나 혈전의 생성시 생체내에는 스스로 이를 분해하는 기전이 있는데, 여기에 플라스민(plasmin)이라는 세린 프로테아제(serine protease)가 관여한다. 플라스민(plasmin)은 피브리노겐(fibrinogen)이나 피브린(fibrin)을 용해시켜 혈액응고를 억제하며 간에서 유리되는 헤파린(heparin)은 트롬빈(thrombin)의 작용을 억제하여 항응고작용을 나타낸다.
혈전의 생성 원인은 아직까지 정확하게 밝혀진 바 없으나 파종성혈관내응고병증(disseminated intravascular coagulation, DIC)과 같은 선천적 유전질환, 신체의 노화에 따른 생리적 기능의 변화, 스트레스 등이 그 원인으로 지목되고 있다. 특히 현대인의 과다한 업무로 인한 스트레스는 혈액응고기전에 관여하는 인자의 양에 변화를 일으켜 비정상적인 혈전을 일으키는 원인 중의 하나로 지목되고 있다. 생체반응 기작에 의하여 뇌혈관에 혈전이 생성되어 뇌혈전증이 일어나면 반신불수가 되고, 뇌의 미세한 혈관이 파열되어 뇌출혈이 일어나 뇌와 머리뼈 사이의 공간으로 출혈되는 거미줄막 출현 등이 일어나면 생명에 치명적인 상태가 되며, 또한 혈전에 의하여 심장혈관이 막히게 되면 심부전증이나 심장마비가 된다.
사망의 중요한 원인이 되는 혈전을 제거하기 위하여 많은 연구가 진행되어 왔으며, 그 결과 혈전의 생성을 억제하거나 생성된 혈전을 용해시키는 작용을 하며 혈전의 생성을 억제하는 약물로는 헤파린, 안크로드, 와파린 등이 있으며, 혈전을 용해하는 약물로는 플라스민(plasmin)을 활성화시키거나 간접적으로 혈전을 용해시키는 유로키나제(urokinase) 등이 사용되어 왔다. 특히, 스트렙토키나제(streptokinase)와 유로키나제(urokinase)같은 플라스미노겐 활성인자가 유용함이 알려져 이들을 정맥주사하여 혈전용해계(fibrinolytic system)를 활성화하는 치료법이 오래전부터 사용되어 왔다. 이 두 가지 약제를 실제로 사용하였을 때 혈전용해에 상당한 효과가 있음이 임상실험 결과 증명이 되었으나, 전신출혈 등의 부작용 역시 보고되어 있다. 최근에는 이들 기존의 혈전용해제들의 단점을 극복하는 새로운 혈전용해제를 개발하기 위한 많은 노력이 시도되었다.
새로운 혈전용해제를 개발하기 위한 하나의 방법은 자연계로부터 우수한 혈전용해능을 가지는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 새로운 혈전용해제를 개발하기 위한 시도가 있었으며, 은행잎에서 추출한 성분이 혈류순환을 원활히 해주는 것으로 밝혀져 이를 사용한 제제들이 개발되어 상품화되었다. 동물에서도 혈전을 용해하는 것으로 알려진 많은 물질들이 보고되어 있는데 흡혈박쥐의 침샘조직에서 분리한 신규 플라스미노겐 활성인자(plasminogen activator), 거머리에서 분리된 헤메틴(hemetin), 지네에서 분리된 피브린 분해효소(fibrinolytic enzyme) 등이 있다.
또한, 미생물에서도 여러 가지 혈전용해 물질들이 확인되었는데 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.)에서 분리된 스트렙토키나제(streptokinase), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.)에서 분리된 스테필로키나제(staphylokinase), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)에서 분리된 브리노라제(brinolase), 예르시니아 속(Yersinia sp.)에서 분리된 피브리노리신(fibrinolysin), 바실러스 속(Bacillus sp.)에서 분리된 피브린 분해효소(fibrinolytic enzyme) 등이 혈전용해제로 보고되어있다.
그 중에서 바실러스 속 균주를 사용한 항혈전성 물질 및 이를 사용한 기능성 식품으로는 한국등록특허 10-1016457(바실러스 아밀로리쿼파시엔스 CH86-1), 한국등록특허 10-0861468(바실러스 속 9-4), 한국등록특허 10-0864850(바실러스 서브틸리스 HA, KCCM-10775P) 등이 있다.
상기 기술들은 모두 혈전 용해성이 확인되기는 하였으나, 그 균주를 사용하여 제조한 식품조성물은 청국장, 된장 등 콩류에 한정되어 있다.
1. Anson, M. L. "The estimation of pepsin, papain and cathepsin with hemoglobin." J. Gen. Physiol. 1939, vol.22, pp.78-89.
본 발명의 목적은 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다. 이를 통해 여러 혈전성 질환에 대해 우수한 효능을 갖는 다양한 식품 조성물을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보솜 DNA를 갖고 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주로 발효한 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물로서, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)이고, 상기 발효물은 보리, 찹쌀, 마늘, 율무 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발효한 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효물은 보리 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 발효한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효물은 보리 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 발효한 것임을 특징으로 한다.
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본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효물은 보리 1 중량부 대비 양배추를 0.01 내지 5 중량부 혼합한 것을 발효한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효물은 발효한 후 동결건조 또는 분무건조한 분말인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효물이 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 50 중량%로 포함된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보솜 DNA를 갖고 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주로 발효하는 단계를 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법으로서, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)이고, 상기 발효하는 단계는 보리, 찹쌀, 마늘, 율무 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법인 것을 특징으로 한다.
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본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효하는 단계는 보리 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효하는 단계는 보리 1 중량부 대비 양배추를 0.01 내지 5 중량부 혼합한 것에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효하는 단계는 31 내지 40℃ 온도에서, 50 내지 200 rpm 속도로 교반되는 조건에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 발효하는 단계 이후에 수득된 발효물을 동결건조 또는 분무건조하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 상술한 제조방법으로 제조된 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주의 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물은 우수한 혈전 분해 효능 및 혈액 순환을 개선하는 효능을 갖는다.
본 발명에 따른 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법을 통하여 혈전 분해 효능이 우수한 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 얻을 수 있다.
도 1은 각 식물별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 발효물의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 2는 각 식물복합물별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 발효물의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다. a는 다양한 조합의 복합물에 대한 실험결과이고, b는 보리, 마늘, 양배추의 혼합물에 대한 실험결과이다.
도 3은 식물복합물의 배합비율별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 발효물의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다. a는 0시간 내지 48시간 배양 결과이고, b는 72시간 내지 120시간 배양 결과이다.
도 4는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 균주의 배양온도별 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 5는 최적복합물의 교반속도별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 6은 최적발효물(동결건조물)의 농도별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다. A는 2시간 반응한 경우, B는 5시간 반응한 경우이다.
도 7은 최적발효물의 분말화에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 8은 최적발효물(분무건조물)의 농도별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 2는 각 식물복합물별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 발효물의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다. a는 다양한 조합의 복합물에 대한 실험결과이고, b는 보리, 마늘, 양배추의 혼합물에 대한 실험결과이다.
도 3은 식물복합물의 배합비율별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 발효물의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다. a는 0시간 내지 48시간 배양 결과이고, b는 72시간 내지 120시간 배양 결과이다.
도 4는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 균주의 배양온도별 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 5는 최적복합물의 교반속도별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 6은 최적발효물(동결건조물)의 농도별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다. A는 2시간 반응한 경우, B는 5시간 반응한 경우이다.
도 7은 최적발효물의 분말화에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
도 8은 최적발효물(분무건조물)의 농도별 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전 용해능을 나타낸 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보솜 DNA를 갖고 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주로 발효한 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 우리나라 근해에서 채취한 해조류에서 분리된 바실러스 속 신균주인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105를 다양한 발효 대상물(기질), 그 중에서도 특히 천연식물에 접종하여 발효시킨 발효물의 피브린 분해 정도를 통해 혈전 용해능을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이하 본 발명의 구성을 첨부된 도면과 함께 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)일 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 발효기질(대상물)은 식용 가능하고 바실러스 속 균주에 의해 발효될 수 있는 식물이면 제한없이 사용가능하고, 곡류, 두류, 감자류, 해조류, 버섯류, 채소류 및 과일류로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물일 수 있다.
보다 구체적으로는 강낭콩, 대두, 마늘, 매화콩, 보리, 샐러리, 완두콩, 율무, 작두콩, 쥐눈이콩, 찹쌀, 키위, 토마토, 팥, 현미, 바나나, 미역, 서리태, 양배추, 우뭇가사리 등일 수 있다. 그 중에서도 상기 식물은 보리, 찹쌀, 마늘, 율무, 양배추, 현미 및 서리태로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 특히 보리, 찹쌀, 마늘, 율무 및 양배추의 발효물이 우수한 혈전 용해능을 나타내므로 바람직하다. 상기 식물을 단독으로 사용하거나 또는 두 가지 이상을 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 발효기질(대상물)의 형태는 발효 과정이 일어날 수 있는 형태이면 제한없이 적용가능하고, 예컨데, 비건조물, 건조물, 절단물, 분쇄물 및 추출물 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일례로, 곡류, 두류, 해조류의 경우 건조물을 그대로 사용하거나, 건조물을 분쇄하거나, 건조물을 적정한 시간 동안 물에 침지하여 사용하거나, 상기 침지한 것을 분쇄하여 사용하거나, 건조물에 물을 가하여 열수추출하여 추출한 열수추출액 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일례로, 채소류 및 과일류는 비건조물 상태로 그대로 사용하거나, 비건조물을 일정한 크기로 절단하여 사용하거나, 건조물을 사용하거나, 건조물을 분쇄하거나, 상기 건조물 또는 절단물에 물을 가하여 열수추출한 추출액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 발효 방법은 통상의 기술자가 사용할 수 있는 발효 방법이면 제한없이 적용될 수 있으며, 예컨데, 발효기질에 따라 고체발효, 액체발효 등이 적용될 수 있다. 본 발명의 일례로, 건조된 형태의 곡류(보리)를 적당한 양의 물에 1시간 내지 24시간 동안 침지한 후, 침지된 곡류와 침지액이 존재하는 상태에서 그 침지액에 균주를 접종하여 발효할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일례로, 채소(양배추)를 적당한 크기로 절단한 후 적당한 양의 물을 가한 후 균주를 접종하여 발효할 수 있다. 이 경우 발효기질에 가해지는 물의 양은 발효를 순조롭게 도와줄 수 있는 정도로 적당양이 가해질 수 있으며, 보다 구체적으로 발효기질의 중량 대비 0.1 내지 100배 부피의 물이 가해질 수 있다. 또한 발효 효율을 높이기 위하여 미생물 발효에서 통상적으로 첨가될 수 있는 영양소 성분, 예컨데, 포도당, 효모추출액, 비타민, 무기질 등이 더 첨가될 수 있다.
본 발명의 발효물은 보리 1 중량부 대비 양배추를 0.01 내지 5 중량부 혼합한 것을 발효한 것일 수 있다. 보다 구체적으로 보리 및 양배추의 총함량이 전체 발효대상물의 5 %(W/V) 범위가 되도록 조정하면서, 일례로 보리 2 %(W/V) 및 양배추 3 %(W/V)를 포함하도록 혼합한 것에 균주를 접종하여 발효할 수 있다.
한편 2가지 이상의 식물을 발효하여 발효물을 제조하는 경우 각 식물의 혼합 비율은 구체적으로 사용되는 식물마다 다를 것이나, 보리 및 양배추의 경우 2:3 내지 3:2의 중량비율로 포함하는 경우 그 발효물의 혈전 용해능이 우수하다.
본 발명의 발효물은 원칙적으로 식품 조성물에 사용될 수 있는 제형이면 제한되지 않으며, 액체 또는 고체이거나, 여과액, 추출액, 현탁액, 농축액, 건조분말, 동결건조분말, 분무건조분말 등이 될 수 있다.
본 발명의 발효물은 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 발효물의 함량은 특별히 제한되지 않으나 본 발명이 목적하는 혈전 용해성을 나타낼 수 있도록 포함되어야 하고, 발효물의 제형에 따라 적절한 농도가 달라진다. 일례로, 추출액인 경우에는 10 내지 50 중량%, 농축액인 경우에는 그 첨가량은 0.1 내지 3.0 중량%인 것이 바람직하고, 분말인 경우 첨가량은 1.0 내지 10.0 중량%인 것이 바람직하다. 상기 양보다 적으면 혈전 용해능이 떨어지고, 상기 양보다 많으면 균주의 생육을 저해할 우려가 있다.
본 발명의 식품 조성물의 제형은 통상의 기술자에게 알려져 있는 다양한 제형이 적용될 수 있으며, 예를 들어, 상기의 발효물을 포함하여 음료나 환, 분말 등과 같은 통상의 건강기능식품 제형, 또는 액제, 환제, 현탁액 등과 같은 조성물 제형이 될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기와 같이 하여 조제한 발효물과 식품 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 부형제(예를 들어, 전분 혹은 덱스트린, 셀룰로오스, 유당, 맥아당, 환원 유당, 환원 맥아당, 소르비톨, 만니톨, 에리트리톨, 자일리톨 등)나 보조제(예를 들어, 용매, 분산 매질, 피복제, 안정제, 희석제, 보존제, 방부제, 살균제, 항진균 시약 등 삼투압 시약, 흡수 억제 시약, 붕괴제, 유화제, 결합제, 윤활제, 색소 등)와 혼합하여, 식품 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 제제 방법에 의해, 예를 들어 정제, 캡슐, 과립, 분말, 추출액, 용액, 시럽, 현탁액, 유탁액의 형태로 제조할 수 있다.
일례로, 본 발명에 따른 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파탐 등을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 식품조성물은 상기 발효물에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이때, 첨가제의 비율은 제한이 없으나 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보솜 DNA를 갖고 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주, 보다 구체적으로는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)로 식물을 발효하는 단계를 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 균주에 대한 구체적인 내용은 상기에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 발효하는 단계에 사용되는 발효 대상물은 상기 균주에 의하여 발효될 수 있는 것이면 특별한 제한되지 않으며, 예컨데, 곡류, 두류, 감자류, 해조류, 버섯류, 채소류 및 과일류로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 발효할 수 있다. 보다 구체적으로 보리, 찹쌀, 마늘, 율무 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것일 수 있다. 구체적인 내용은 상기 발효물에서 기술한 바와 같다.
본 발명의 발효하는 단계에 사용되는 발효 대상물은 보리 1 중량부 대비 양배추를 0.01 내지 5 중량부 혼합한 것에 균주를 접종하여 발효한 것일 수 있다. 보다 구체적으로 보리 및 양배추의 총함량이 전체 발효대상물의 5 %(W/V) 범위가 되도록 조정하면서, 일례로 보리 2 %(W/V) 및 양배추 3 %(W/V)를 포함하도록 혼합한 것에 균주를 접종하여 발효할 수 있다.
한편 2가지 이상의 식물을 발효하여 발효물을 제조하는 경우 각 식물의 혼합 비율은 구체적으로 사용되는 식물마다 다를 것이나, 보리 및 양배추의 경우 2:3 내지 3:2의 중량비율로 포함하는 경우 그 발효물의 혈전 용해능이 우수하다.
본 발명은 상기 발효하는 과정에 이전에 통상의 기술자가 미생물 발효과정을 위하여 발효 대상물에 가할 수 있는 적절한 전처리 과정을 가할 수 있다. 예컨데, 본격적인 발효 단계 이전에 발효 대상물을 건조하는 단계, 절단하는 단계, 분쇄하는 단계 및 용매를 가하여 추출하는 단계 중 어느 하나 이상을 추가로 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일례로, 상기에서 상술한 바와 같이, 곡류, 두류, 해조류를 발효하는 경우에는 건조물을 그대로 사용하거나, 건조물을 분쇄하거나, 건조물을 적정한 시간 동안 물에 침지하여 사용하거나, 상기 침지한 것을 분쇄하여 사용하거나, 건조물에 물을 가하여 열수추출하여 추출한 열수추출액 등을 사용할 수 있다. 보다 상세한 내용은 상기에서 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 발효는 통상의 기술자가 바실러스 속 균주에 적용할 수 있는 발효 조건이면 액상발효, 고체발효 등의 방법 등에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 발효하는 단계는 31 내지 40℃ 온도에서, 50 내지 200 rpm 속도로 교반되는 조건에서 수행될 수 있다. 상기 온도 또는 속도 범위보다 낮은 경우는 물론 상기 온도 또는 속도 범위보다 높은 경우에도 미생물이 성장하기에 환경이 적절하지 않아 단백질 분해능 및 혈전 용해능을 갖는 단백질의 합성이 저하될 우려가 있다.
본 발명의 발효시간은 미생물의 발효에 통상적으로 적용되는 2시간 내지 120시간 정도일 수 있다. 상기 시간보다 발효시간이 적은 경우에는 단백질 분해능 및 혈전 용해능을 갖는 단백질의 합성이 충분치 않고, 상기 시간보다 발효시간이 긴 경우에는 배양시간의 증가에 따른 미생물 성장의 효율이 감소하고 미생물 성장 환경이 악화될 수 있다.
본 발명은 상기 발효하는 단계 이후에 수득된 발효물을 동결건조 또는 분무건조하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 동결건조하는 방법 또는 분무건조하는 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법으로 수행할 수 있다. 본 발명의 일례로, 본 발명에 따른 발효물을 여과한 다음 상등액을 분무하면서 건조할 수 있으며, 이 과정에서 분무 효율을 높이기 위하여 덱스트린 등을 첨가할 수 있다.
본 발명은 상기에서 수득한 발효물에 통상의 기술자에게 알려져 있는 다양한 제형의 제조방법을 적용하여 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기의 발효물을 음료나 환, 분말 등과 같은 통상의 건강기능식품 제형, 또는 액제, 환제, 현탁액 등과 같은 조성물 제형이 될 수 있다. 상기와 같은 제형에 추가될 수 있는 성분은 상기에서 상술한 바와 같다.
본 발명은 상기 상술한 제조방법으로 제조된 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물에 의해 다양한 혈전성 질환을 예방하거나 개선할 수 있다. 상기 혈전성 질환은 혈전에서 기인하여 발생하는 질환이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 신정맥 혈전증, 경정맥 혈전증, 버드키아리 증후군, 액와-쇄골하정맥 혈전증, 뇌정맥동 혈전증 및 폐혈전 색전증 등과 같은 정맥 혈전증, 또는 뇌경색, 심근경색, 장간막동맥 혈전증, 하지 급성 동맥 혈전증, 간동맥 혈전증, 신동맥 혈전증, 비동맥 혈전증 및 폐색 동맥 경화증과 같은 동맥 혈전증 등을 들 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
1. 실험 준비 및 실험 방법
1) 혈전
용해능을
갖는 신규 미생물의 분리 및 동정
본 발명에 사용된 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 미생물은 본 출원인의 선행출원 10-2011-0138674 및 10-2012-0116239에 기재된 방법을 통하여 수득하였다.
2) 혈전
용해능
확인
다음과 같은 방법을 통해 혈전 용해능을 확인하였다. 피브리노겐(fibrinogen) 0.06g을 0.1M 보레이트 완충액(Borate buffer) 10㎖에 넣어 37℃의 항온기에서 2시간 동안 완전히 녹인 다음, 완전히 녹은 피브리노겐(fibrinogen)을 페트리 디쉬에 10㎖ 분주하고, 트롬빈(thrombin, 5,000 unit)을 40 unit/10㎖으로 0.1M 보레이트 완충액(Borate buffer)에 희석한 후 400㎕를 페트리 디쉬 전면에 골고루 갈 수 있도록 유의하면서 넣고 상하좌우로 적당하게 흔들어 주면서 투여하였다. 완전히 굳은 피브린 플레이트에 종이 디스크(8 mm)를 올린 다음 그 위에 조효소액 50㎕를 점적하여 2 내지 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 후 나타나는 저해환의 생성 유무 및 그 크기로 혈전 용해능을 확인하였다.
상기 피브린 배지에 점적할 조효소액의 제조는, 배양 완료된 배양액 5㎖를 14,000rpm / 4℃ / 10분간 원심분리하여 상등액만을 따로 분리한 후, 막필터(0.2㎛ 막필터, Advantec Inc., 미국)로 제균한 후, 고체배지에 있는 종이 디스크에 점적 직전에 회전혼합(voltexing)한 후 사용하였다.
2. 실험 방법 및 실험 결과
1) 식물 소재별
발효물의
혈전
용해능
총 20가지의 식물소재, 강낭콩, 대두, 마늘, 매화콩, 보리, 샐러리, 완두콩, 율무, 작두콩, 쥐눈이콩, 찹쌀, 키위, 토마토, 팥, 현미, 바나나, 미역, 서리태, 양배추 및 우뭇가사리를 대상으로 최적 발효물 선정 실험을 실시하였다(표 1 참조). 추출시의 사용 분량은 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 최적 배양조건을 (4% 갈락토오즈, 2% 효모추출액, 0.2% 염화칼슘)을 고려하여 설정하였다.
발효 대상의 각 식물 재료 중 두류(강낭콩, 대두, 매화콩, 완두콩, 작두콩, 쥐눈이콩, 서리태), 곡류(보리, 율무, 찹쌀, 팥, 현미) 및 해조류(미역, 우뭇가사리)는 12시간 침지하고, 그 외의 재료(마늘, 샐러리, 키위, 토마토, 바나나, 양배추)는 채썰거나 분쇄하여 준비하였다.
상기 준비된 재료에 하기 표 1에 기재된 분량대로 증류수를 가하여 121℃에서 5분간 가압멸균한 후, 500㎖ 삼각플라스크에 총 부피 200㎖로 준비한 후, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 시드(seed) 배양액을 2%(w/v)로 접종하였다. 상기 접종물의 발효는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 최적배양 조건인 37℃에서 48 시간까지 교반속도 150rpm에서 수행하였다. 각각 샘플을 멸균된 플라스틱 튜브에 5㎖씩 샘플링하여 0.2㎛ 시린지 필터로 제균하였다.
비교예는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105 시드(seed) 배양액(2%)을, 4% 갈락토오즈, 2% 효모추출액 및 0.2% 염화칼슘이 포함된 배지(초기 산도 pH 9)에 접종한 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일하게 수행하였다.
혈전 용해능 확인은 상기 기술처럼 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후 2 내지 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응한 후 생성된 저해환을 확인하였다. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 최적배지 배양액을 비교예(control)로 사용하였다.
상기 결과는 표 1 및 도 1에 도시하였다.
| 종류 |
분량 (%,w/v) |
저해환의 크기 (cm) |
상대활성 비율환산(%) | ||
| 실시예 A1 | 강낭콩 | 건조 | 10 | 2.5 | 83.33 |
| 실시예 A2 | 대두 | 건조 | 10 | 2.3 | 76.67 |
| 실시예 A3 | 마늘 | 비건조 | 20 | 3.2 | 106.67 |
| 실시예 A4 | 매화콩 | 건조 | 10 | 2.6 | 86.67 |
| 실시예 A5 | 보리 | 건조 | 10 | 3.3 | 110.00 |
| 실시예 A6 | 샐러리 | 생물 | 20 | 2.5 | 83.33 |
| 실시예 A7 | 완두콩 | 건조 | 10 | 2.8 | 93.33 |
| 실시예 A8 | 율무 | 건조 | 10 | 3.1 | 103.33 |
| 실시예 A9 | 작두콩 | 건조 | 10 | 2.8 | 93.33 |
| 실시예 A10 | 쥐눈이콩 | 건조 | 10 | 2.8 | 93.33 |
| 실시예 A11 | 찹쌀 | 건조 | 10 | 3.2 | 106.67 |
| 실시예 A12 | 키위 | 비건조 | 20 | 1.4 | 46.67 |
| 실시예 A13 | 토마토 | 비건조 | 20 | 1.0 | 33.33 |
| 실시예 A14 | 팥 | 건조 | 10 | 2.8 | 93.33 |
| 실시예 A15 | 현미 | 건조 | 10 | 2.9 | 96.67 |
| 실시예 A16 | 바나나 | 비건조 | 20 | 0.0 | 0.00 |
| 실시예 A17 | 미역 | 건조 | 0.5 | 1.9 | 63.33 |
| 실시예 A18 | 서리태 | 건조 | 10 | 3.0 | 100.00 |
| 실시예 A19 | 양배추 | 비건조 | 20 | 2.9 | 96.67 |
| 실시예 A20 | 우뭇가사리 | 건조 | 1 | 2.3 | 76.67 |
| 비교예(B) | 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 최적배지배양액 | 3.0 | 100.00 | ||
상기 실험결과, 총 20가지의 발효물 중 마늘, 보리, 율무, 찹쌀, 현미, 서리태, 양배추의 발효물이 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 최적배양액과 유사하거나 그보다 우수한 혈전 용해능을 보였다.
2) 식물 소재
복합발효물의
혈전
용해능
상기에서 우수한 혈전 용해능을 보인 식물 소재 중 보리, 찹쌀, 율무, 마늘 및 양배추를 사용하여 혈전용해효소 활성의 최적 배합소재 선정을 위한 실험을 진행하였다(표 2 참조).
상기 표 2 분량으로 시료를 제조한 것을 제외하고는 상기 1의 식물 소재별 발효물의 혈전 용해능에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
혈전 용해능 확인은 상기와 동일하게 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후, 2 내지 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응한 후 생성된 저해환을 확인하였다.
상기 결과는 표, 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
| 구분 |
발효물의 조성 | 저해환의 크기(cm) |
상대활성 비율(%) |
||||
| 보리(%) | 찹쌀(%) | 율무(%) | 마늘(%) | 양배추(%) | |||
| 실시예 B1 | 5 | 5 | 5 | 0.0 | 0.0 | ||
| 실시예 B2 | 5 | 5 | 5 | 5 | 2.8 | 100.0 | |
| 실시예 B3 | 5 | 5 | 5 | 5 | 2.0 | 71.4 | |
| 실시예 B4 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 2.6 | 92.9 |
| 실시예 B5 | 5 | 5 | 2.0 | 71.4 | |||
| 실시예 B6 | 5 | 5 | 2.7 | 96.4 | |||
| 실시예 B7 | 5 | 5 | 1.1 | 39.3 | |||
| 실시예 B8 | 2.5 | 2.5 | 1.1 | 39.3 | |||
| 실시예 B9 | 2.5 | 2.5 | 3.1 | 110.7 | |||
| 실시예 B10 | 2.5 | 2.5 | 1.2 | 42.9 | |||
| 비교예(B) | 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 최적배지배양액 |
2.8 | 100.0 | ||||
상기 실험 결과, 2가지 소재를 혼합한 실험(도 2b)에서는 보리 및 양배추를 조합한 실시예 B6(각 5%) 및 실시예 B9(각 2.5%)에서 우수한 혈전 용해능이 나타났다.
3가지 이상의 소재를 혼합한 실험에서는(도 2a) 보리, 찹쌀, 율무 및 양배추를 조합한 경우(실시예 B2)와 보리, 찹쌀, 율무, 마늘 및 양배추를 조합한 경우(실시예 B4)에서 우수한 혈전 용해능이 나타났다.
한편, 실시예 B1 내지 B10 중에서 실시예 9(보리 2.5% 및 양배추 2.5%)에서 가장 우수한 혈전 용해능이 나타났다.
3) 최적
복합발효물의
배합별
혈전
용해능
상기에서 우수한 혈전 용해능을 보인 보리 및 양배추의 혼합 소재를 사용하여 혈전용해효소 활성의 최적 배합비율 선정을 위한 실험을 진행하였다(표 3 참조).
| 보리(%) | 양배추(%) | ||
| 실시예 C1 | 0 | 5 | |
| 실시예 C2 | 1 | 4 | |
| 실시예 C3 | 2 | 3 | |
| 실시예 C4 | 3 | 2 | |
| 실시예 C5 | 4 | 1 | |
| 실시예 C6 | 5 | 0 | |
| 비교예(B) | 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 최적배지배양액 | ||
상기 표 3 분량으로 시료를 제조한 것을 제외하고는 상기 1)의 식물 소재별 발효물의 혈전 용해능에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
혈전 용해능 확인은 상기와 동일하게 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응한 후 생성된 저해환을 확인하였다.
상기 결과는 표 4, 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 구체적으로, 보리와 양배추를 2:3 또는 3:2로 혼합한 군(실시예 C3 및 C4)을 48시간 이상 발효한 경우 저해환의 크기가 증가함을 보여준다.
| 구분 |
|
반응시간 | |||||
| 0hr | 24hr | 48hr | 72hr | 96hr | 120hr | ||
| 실시예 C1 |
저해환의 크기(cm) |
0 | 1.8 | 2.15 | 2.15 | 2.1 | 2.05 |
| 상대활성 비율환산(%) |
0.0 | 70.6 | 84.3 | 84.3 | 82.4 | 80.4 | |
| 실시예 C2 |
저해환의 크기(cm) |
0 | 2.25 | 2.45 | 2.75 | 2.95 | 2.9 |
| 상대활성 비율환산(%) |
0.0 | 88.2 | 96.1 | 107.8 | 115.7 | 113.7 | |
| 실시예 C3 |
저해환의 크기(cm) |
0 | 2.2 | 2.9 | 3 | 2.6 | 2.6 |
| 상대활성 비율환산(%) |
0.0 | 86.3 | 113.7 | 117.6 | 102.0 | 102.0 | |
| 실시예 C4 |
저해환의 크기(cm) |
0.75 | 1.85 | 2.35 | 2.55 | 2.3 | 3.1 |
| 상대활성 비율환산(%) |
29.4 | 72.5 | 92.2 | 100.0 | 90.2 | 121.6 | |
| 실시예 C5 |
저해환의 크기(cm) |
0 | 2.05 | 2.3 | 2.4 | 2.7 | 2.75 |
| 상대활성 비율환산(%) |
0.0 | 80.4 | 90.2 | 94.1 | 105.9 | 107.8 | |
| 실시예 C6 |
저해환의 크기(cm) |
0 | 2.2 | 2.05 | 2.5 | 2.8 | 3.1 |
| 상대활성 비율환산(%) |
0.0 | 86.3 | 80.4 | 98.0 | 109.8 | 121.6 | |
| 비교예 |
저해환의 크기(cm) |
0 | 2.5 | 2.55 | 2.7 | 2.6 | 2.9 |
| 상대활성 비율환산(%) |
0.0 | 98.0 | 100.0 | 105.9 | 102.0 | 113.7 | |
따라서, 단기간 반응시간 내에 우수한 혈전 용해능을 보인 보리 2% 및 양배추 3% 혼합물을 48시간 동안 발효하는 것을 최적 혈전 용해능을 보이는 최적 복합발효물로 선정하였다.
4) 최적
복합발효물의
발효온도별 혈전
용해능
바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) MieV B1105의 혈전용해효소 활성의 최적 발효 온도를 설정하기 위하여 배양온도별 혈전 용해능을 확인한 결과를 도 4에 도시하였다.
미생물의 최적 발효온도는 기질에 따라 변화하지 않기 때문에 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105의 최적 배양 온도를 적용하여 37℃에서 실시하였다.
5) 최적
복합발효물의
교반속도별
혈전
용해능
상기에서 우수한 혈전 용해능을 보인 최적 복합발효물(보리 2% 및 양배추 3%, 37℃, 48시간 발효)을 사용하여 혈전용해효소 활성의 최적 교반속도 선정을 위한 실험을 진행하였다(표 5 참조).
상기 표 5의 속도로 교반한 것을 제외하고는 상기 1)의 식물 소재별 발효물의 혈전 용해능에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, 상기에서 사용한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105의 최적배지배양에 대비하여 통상의 Tryptic soy broth(TSB) 배지에서 배양한 비교예 2와도 비교하였다.
혈전 용해능 확인은 상기와 동일하게 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응 후 생성된 저해환을 확인하였다.
상기 결과는 상기 표 5 및 도 5에 나타내었다.
| 교반속도 (rpm) | 저해환의 크기(㎝) | 상대비율환산(%) | |
| 실시예 D1 | 50 | 1.8 | 90 |
| 실시예 D2 | 100 | 2.2 | 110 |
| 실시예 D3 | 150 | 3.5 | 175 |
| 실시예 D4 | 200 | 2.6 | 130 |
| 비교예1 (OM, 최적배지배양) |
0 | 3.2 | 100 |
| 비교예2 (TSB, TSB배지배양) |
0 | 2.0 | 160 |
구체적으로, 보리 2% 및 양배추 3%를 포함하는 시료를 150rpm에서 교반하여 발효한 경우(실시예 D3)가 가장 우수한 혈전 용해능을 나타냈다.
결과적으로 혈전 용해 향상 및 혈액 순환 개선능이 우수한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105의 발효물은 보리 2% 및 양배추 3% 혼합물에 균을 접종하여 37℃, 150rpm의 속도로, 48시간 동안 발효한 것으로 나타났다.
6) 최적
복합발효물의
농도별 혈전 용해능
상기에서 수득한 우수한 혈전 용해능을 보인 발효물(보리 2% 및 양배추 3% 혼합물에 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105를 접종하여 37℃, 150rpm의 속도로, 48시간 동안 발효한 발효물)의 최적 농도를 설정하는 실험을 진행하였다(표 6 참조).
상기에서 수득한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105의 최적 발효물을 동결건조하여 분말화하였다. 동결건조의 수율은 0.02%로 비교적 낮은 수율을 확인하였다.
상기에서 수득한 동결건조 분말을 각각 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 3%, 5%(W/V)가 되도록 증류수로 희석하였으며, 희석한 샘플을 13,000rpm, 5분간 원심분리하여 상등액만 사용하였다. 원심분리 샘플 5㎖을 취하여 멸균된 플라스틱 튜브에 필터하여 샘플링하였다.
상기 표 7의 조건으로 시료를 포함한 것을 제외하고는 상기 1)의 식물 소재별 발효물의 혈전 용해능에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, 상기에서 사용한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105의 최적배지배양액(비교예 12, 22), 통상의 TSB 배지에서 배양한 TSB배지배양액(비교예 13, 23)은 물론 발효물을 동결건조하지 않은 것(비교예 11, 21)과 비교하였다.
혈전 용해능 확인은 상기와 동일하게 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후 2 내지 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응 후 생성된 저해환을 확인하였다.
상기 결과는 표 6 및 도 6에 나타내었다.
| 반응시간 (Hr) |
농도 (%) |
저해환의 크기 (cm) |
상대활성비율환산(%) | |
| 실시예 E11 | 2 | 0.01 | 0.0 | 0.0 |
| 실시예 E12 | 2 | 0.05 | 0.0 | 0.0 |
| 실시예 E13 | 2 | 0.1 | 1.4 | 77.8 |
| 실시예 E14 | 2 | 0.5 | 1.7 | 94.4 |
| 실시예 E15 | 2 | 1.0 | 2.5 | 138.9 |
| 실시예 E16 | 2 | 3.0 | 3.0 | 166.7 |
| 실시예 E17 | 2 | 5.0 | 2.9 | 161.1 |
| 비교예11 (BFD, 비동결건조) |
2 | - | 2.0 | 111.1 |
| 비교예12 (OM, 최적배지배양) |
2 | - | 1.9 | 105.6 |
| 비교예13 (TSB 배지배양) |
2 | - | 1.8 | 100.0 |
| 실시예 E21 | 5 | 0.01 | 0.0 | 0.0 |
| 실시예 E22 | 5 | 0.05 | 1.7 | 94.4 |
| 실시예 E23 | 5 | 0.1 | 2.3 | 127.8 |
| 실시예 E24 | 5 | 0.5 | 2.9 | 161.1 |
| 실시예 E25 | 5 | 1.0 | 4.0 | 222.2 |
| 실시예 E26 | 5 | 3.0 | 5.0 | 277.8 |
| 실시예 E27 | 5 | 5.0 | 6.0 | 333.3 |
| 비교예21 (BFD, 비동결건조) |
5 | - | 3.5 | 194.4 |
| 비교예22 (OM, 최적배지배양) |
5 | - | 3.9 | 216.7 |
| 비교예23 (TSB 배지배양) |
11 | - | 1.8 | 100.0 |
구체적으로, 동결건조발효물을 0.5% 포함하고 37℃에서 2시간 반응한 것(실시예 E14)과 동결건조하기 전(비교예 11)의 환의 크기가 비슷하였다. 또한 동결건조발효물을 포함하는 실시예들은 농도 의존적으로 환의 크기가 커짐을 보였다.
37℃에서 5시간 동안 반응한 후 피브린플레이트를 확인한 결과, 동결건조 후 1%이상의 처리군(실시예 E25, 26, 27)에서는 저해환의 크기를 측정할 수 없을 정도로 커졌고(도 6 참조), 0.5%와 동결건조 전의 천연물(2% 보리 및 3% 양배추)최적조건과 유사한 환의 크기를 보였다.
결과적으로 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105를 사용한 발효물을 동결건조한 분말은 0.1%이상 적용시 혈전 용해능을 확인할 수 있었으며, 0.5% 이상 적용시 매우 우수한 혈전 용해능을 보임을 알 수 있었다.
7) 최적
복합발효물의
분말화에
따른
혈전용해능
상기에서 수득한 우수한 혈전 용해능을 보인 발효물(보리 2% 및 양배추 3% 혼합물에 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105를 접종하여 37℃, 150rpm의 속도로, 48시간 동안 발효한 발효물)을 식품 소재로 사용하기 위해 분말화하는 실험을 진행하였다.
상기에서 수득한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105의 최적 발효물은 상등액과 슬러지 부분에서의 기능을 따로 확인하고자 상등부분과 슬러지부분으로 나누어 열풍건조와 분말건조를 하였다.
열풍건조는 각 대상물(슬러지 또는 상등액)을 90℃에서 48시간 동안 수행하였고, 발효물 슬러지의 열풍건조 수율은 0.18%였고, 발효물 상등액의 열풍건조 수율은 0.07%로 나타나서, 하기 분무건조에 비하여 수율이 낮음을 확인하였다.
분무건조는 분무시 스프레이에 슬러지가 함유되면 분사가 되지 않기 때문에 발효물을 여과한 여과액에 대해서만 분무 건조를 수행하였고, 분사력을 높이기 위해 덱스트린 10%를 첨가하여 수율은 6.1%가 나왔다.
상기에서 수득한 세 가지 분말을 각각 0.5%, 1%(w/v)가 되도록 증류수로 희석하였으며, 희석한 샘플은 상등액만 사용하여 혈전 용해능 샘플로 사용하였다.
혈전 용해능 확인은 상기와 동일하게 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후 2 내지 5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응 후 생성된 저해환을 확인하였다.
상기 결과는 표 7 및 도 7에 나타내었다.
| 구분 | 공정 | 농도 (%) |
저해환크기 (cm) |
상대 활성 비율 환산(%) |
| 실시예 F11 | 상등액열풍건조 | 0.5 | 1.8 | 62.1 |
| 실시예 F12 | 슬러지열풍건조 | 0.5 | 2.0 | 69.0 |
| 실시예 F13 | 상등액분무건조 | 0.5 | 1.8 | 62.1 |
| 실시예 F14 | 동결건조 | 0.5 | 2.9 | 100.0 |
| 실시예 F21 | 상등액열풍건조 | 1.0 | 2.1 | 45.0 |
| 실시예 F22 | 슬러지열풍건조 | 1.0 | 2.3 | 50.0 |
| 실시예 F23 | 상등액분무건조 | 1.0 | 2.0 | 45.0 |
| 실시예 F24 | 동결건조 | 1.0 | 4.0 | 100.0 |
구체적으로, 발효물 슬러지 열풍 건조에서 환의 크기가 가장 컸고 발효 상등액 열풍건조물과 분무건조물의 환 크기는 비슷하였다. 0.5% 보다 1%에서 환의 크기는 농도 의존적으로 커짐을 보였고, 이를 통해 열풍건조와 분무건조시에도 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105 발효물이 우수한 혈전 용해능을 보임을 알 수 있었다.
이를 종합하면, 혈전 용해능은 저해환의 지름 크기로 볼 때 발효물 분무 건조물이 발효물 슬러지 열풍 건조물 보다 20% 가량 작지만, 생산 수율이 33배 이상 나오므로 제품의 생산량을 늘려 적용한다면 더 경제적인 생산 방법으로 판단된다. 또한 발효 후 여과하여 덱스트린 혼합 후 진행 되는 분무건조법이 식품 소재화를 위한 건조 방법으로 가장 적합하다고 판단된다.
8) 최적
복합발효물의
분무건조물의 농도별
혈전용해능
상기에서 수득한 우수한 혈전 용해능을 보인 최적 복합 발효물(보리 2% 및 양배추 3% 혼합물에 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105를 접종하여 37℃, 150rpm의 속도로, 48시간 동안 발효한 발효물)의 분무건조물의 농도별 혈전용해능을 확인하였다(표 8 참조).
상기에서 수득한 분무건조 분말을 각각 1%, 2%, 3%, 4%, 5% (w/v)가 되도록 증류수로 희석하였으며, 희석한 샘플을 잘 혼합한 후 혈전 용해능 확인을 하였다. 상기와 동일하게 피브린 배지 위에 종이 디스크를 올린 다음 조효소액 50㎕ 점적 후 2~5시간 동안 37℃ 배양기에서 반응 후 생성된 저해환을 확인하였다.
상기 결과는 표 8 및 도 8에 나타내었다.
| 농도(%) | 저해환 크기 (cm) |
상대 활성 비율 환산(%) |
|
| 실시예 G1 | 1 | 1.8 | 100.0 |
| 실시예 G2 | 2 | 2.1 | 116.7 |
| 실시예 G3 | 3 | 2.1 | 116.7 |
| 실시예 G4 | 4 | 2.4 | 133.3 |
| 실시예 G5 | 5 | 2.6 | 144.4 |
| 대조군 1(덱스트린) | 1 | 0.0 | 0.0 |
| 대조군 2(덱스트린) | 5 | 0.0 | 0.0 |
구체적으로 분무건조 발효물(실시예)은 농도 의존적으로 환의 크기가 커졌으며, 기존의 합성 배지인 TSB에서 키운 B1105발효물의 환 크기보다 컸으며, 분무 건조시 사용되는 덱스트린의 혈전 용해능은 없었으므로 분무건조 발효물 자체에서 우수한 혈전 용해능이 있음을 알 수 있었다.
결론적으로 본 실험결과를 통해, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Miev B1105 발효물을 분말화 함으로서 식품 원료로 사용하기 용이할 뿐 아니라 안정성 및 편리함에도 부합됨을 확인하였다.
3.
제형예
1) 산제
하기 표의 성분을 혼합한 다음, 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다. 하기 조성비는 통상적인 산제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 다양한 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 발효동결건조물(실시예 E24) | 20mg |
| 유당 | 100mg |
| 탈크 | 10mg |
2) 정제
하기 표의 성분을 혼합한 다음, 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조한다. 하기 조성비는 통상의 정제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 다양한 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 발효동결건조물(실시예 E24) | 10mg |
| 옥수수전분 | 100mg |
| 유당 | 100mg |
| 스테아린산 마그네슘 | 2mg |
3) 연질 캅셀제
통상의 연질 캡슐제 제조방법에 따라 하기 표의 성분을 혼합하여 연질 캡슐제를 제조한다. 하기 조성비는 통상의 연질 칼슐제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 다양한 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 발효동결건조물(실시예 E24) | 10mg |
| 레시틴 | 0.5mg |
| 토코페롤 | 0.5mg |
| 대두유 | 8mg |
4) 경질 캡슐제
통상의 경질 캡슐제 제조방법에 따라 하기 표의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다. 하기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 다양한 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 발효동결건조물(실시예 E24) | 10mg |
| 결정성 셀룰로오스 | 3mg |
| 락토오스 | 15mg |
| 마그네슘 스테아레이트 | 0.2mg |
5) 건강식품(복합 영양제)
하기 표의 성분을 혼합한 다음, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 제조한다. 하기의 비타민 및 미네랄의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 다양한 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 발효동결건조물(실시예 E24) | 1000mg |
| 비타민 A | 2g |
| 비타민 B1 | 0.25mg |
| 비타민 B2 | 0.3mg |
| 비타민 B6 | 0.15mg |
| 비타민 B12 | 0.2㎍ |
| 비타민 C | 10mg |
| 비오틴 | 10㎍ |
| 니코틴산아미드 | 1.7mg |
| 엽산 | 50㎍ |
| 판토텐산 칼슘 | 0.5mg |
| 황산제1철 | 1.75mg |
| 산화아연 | 0.82mg |
| 탄산마그네슘 | 25.3mg |
| 제1인산칼륨 | 15mg |
| 제2인산칼륨 | 55mg |
| 구연산칼륨 | 90mg |
| 염화마그네슘 | 25mg |
| 증류수 | 적당량 |
6) 건강음료
통상의 건강음료 제조방법에 따라 하기 표의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열 후, 만들어진 용액을 여과하고 멸균된 2ℓ의 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 본 발명에 따른 건강음료 조성물 제조에 사용하였다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 다양한 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 발효동결건조물(실시예 E24) | 100mg |
| 비타민 C | 15g |
| 비타민 E | 100g |
| 젖산철 | 20g |
| 산화아연 | 3.5g |
| 비타민 A | 0.2g |
| 비타민 B1 | 0.25g |
| 비타민 B2 | 0.3g |
| 증류수 | 적당량 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Miev Co.
<120> Food Composition for Improving Thrombus and Blood Circulation
Containing Fermentated Product by Novel Bacillus sp.
Microorganism with Thrombolytic activity and Producing Method of
the same
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1029
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens Miev B1105
<400> 1
gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg 60
gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg 120
ggctaatacc ggatgcttgt ttgaaccgca tggttcaaac ataaaaggtg gcttcggcta 180
ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc 240
gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa 360
cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt 420
gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg 540
gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat 600
tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc 720
tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc 840
actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960
atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca 1020
tggttgtcg 1029
Claims (13)
- 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보솜 DNA를 갖고 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주로 발효한 발효물을 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물로서,
상기 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)이고,
상기 발효물은 보리, 찹쌀, 마늘, 율무 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 발효한 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 발효물은 보리 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 발효한 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 발효물은 보리 1 중량부 대비 양배추를 0.01 내지 5 중량부 혼합한 것을 발효한 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 발효물은 발효한 후 동결건조 또는 분무건조한 분말인 것을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 발효물이 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 50 중량%로 포함된 것을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물.
- 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보솜 DNA를 갖고 혈전 용해능을 갖는 바실러스 속 균주로 발효하는 단계를 포함하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법으로서,
상기 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MieV B1105 균주(Bacillus amyloliquefaciens MieV B1105, 기탁번호 : KCTC 12081BP)이고,
상기 발효하는 단계는 보리, 찹쌀, 마늘, 율무 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 발효하는 단계는 보리 및 양배추로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 발효하는 단계는 보리 1 중량부 대비 양배추를 0.01 내지 5 중량부를 혼합한 것에 상기 바실러스 속 균주를 접종하여 발효하는 것임을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 발효하는 단계는 31 내지 40℃ 온도에서, 50 내지 200 rpm 속도로 교반되는 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 발효하는 단계 이후에 수득된 발효물을 동결건조 또는 분무건조하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 및 혈액순환 개선용 식품조성물의 제조방법.
- 삭제
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