KR20100096442A - 목이버섯 유래 혈전분해효소의 발효 생산방법 및 그의 용도 - Google Patents
목이버섯 유래 혈전분해효소의 발효 생산방법 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목이버섯(Auricularia auricula) 유래 혈전분해효소의 발효 생산방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 목이버섯 균사체 유래 신규 혈전분해효소는 종래의 혈전분해효소와 상이한 기질 특이성을 가지고, 뛰어난 피브린 및 피브리노겐 분해 활성을 가지며, 생체내외에서 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지며, 부작용이 없는 안전한 물질이므로 혈전용해제 또는 혈행개선용 건강식품에 유용하게 이용될 수 있다.
목이버섯, 균사체, 혈전분해효소, 혈전증.
Description
본 발명은 목이버섯(Auricularia auricula) 유래 혈전분해효소의 발효 생산방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목이버섯 균사체 유래 신규 혈전분해효소, 목이버섯 균사체 배양용 배지, 목이버섯 균사체 유래 신규 혈전분해효소를 고농도로 생산하는 방법, 및 목이버섯 균사체 유래 신규 혈전분해효소를 유효성분으로 함유하는 혈전용해제 또는 혈행개선용 건강식품에 관한 것이다.
최근 식생활의 서구화가 진전되면서 비만, 당뇨병 등 성인병 요인과 함께 심혈관계 질환의 발병율이 급격히 증가하고 있는데, 뇌혈관계 질환 및 심장질환 관련 사망자의 통계수치는 1999년(십만명당 112명) 이후 국내 사망율 1, 2위를 다투는 상황에 이르고 있다. 한편, 미국의 경우에도 매년 50만 명 이상의 뇌졸중 환자가 발생하며 2000년 이후 심혈관계 질환 관련 치료 비용은 매년 3,000억불 이상 발생 하고 있을 정도로 국내 외 심각한 발병율을 나타내고 있으며 관련된 의료시장은 매년 20% 이상 증가하고 있다. 심혈관계 질환과 관련하여 발생하고 있는 과도한 보건, 의료 및 사회적 비용을 고려할 때 신규 의약품의 개발과 함께 동시에 예방의학적 관점에서 발병율을 감소시키는 것에 기여할 수 있는 저비용의 식이성 경구투여 소재의 개발 필요성이 매우 높아지고 있다고 할 수 있다.
기존의 혈전용해제 중 대표적인 것은 스트렙토키나제(streptokinase) 및 유로키나제(urokinase) 등이 있으나 이것은 뇌졸중 등 발병 후 막힌 혈관을 뚫기 위하여 사용하는 것으로서 예방적 관점에서의 사용이 어렵고 전신출혈 등 부작용이 있으며 경구투여가 불가능하거나 가격이 고가인 결점이 있어 부작용이 없고 경구투여가 가능한 신규한 항혈전제나 혈전용해제의 개발이 시도되고 있으나 새롭게 개발되어 의약품으로서 상용화된 것은 아직 국내외 없다.
식용 가능한 소재로서 혈전분해효소를 생산하는 유용한 방법 중 하나는 식용미생물의 배양에 의한 것인데 대표적인 것은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 균에 의한 것으로서 일본의 나토나 한국의 청국장 분리 미생물을 예로 들 수 있다. 이것에 의한 직접 생산은 배양시간이 짧은 장점이 있으나 관능 및 향취 특성이 불량하고 상대적으로 활성이 미약하며 바실러스 균이 생산하는 PGA 등 다당체 점성에 의하여 대형의 분리공정 설계가 어려우며 이를 대두 등의 발효식품으로 이용하는 경우에도 가열조리에 의해서는 효소활성이 파괴되므로 역겨운 관능특성에도 불구하고 생식을 해야 하는 결점을 지니고 있다.
한편, 혈행개선과 관련하여 다수의 식약용 담자균류가 자실체 내에 혈전분해효소를 함유하고 있는 것으로 알려져 있는데 독성이 없는 식약용 균종으로서 대표적인 것은 뽕나무버섯, 검은비늘버섯, 민자주방망이버섯 등이지만 자실체의 대량생산법이 확보되어 있지 못하고 자실체 내에 효소활성을 높이는 최적화 방법이 현실적으로 용이하지 못하여 담자균류에 의한 혈전분해효소는 아직까지 본격적 개발 및 상용화가 이루어지지 않고 있다. 담자균류 유래의 혈전분해효소의 상용화를 이루기 위해서는 자실체 생산기간이 길고 자실체 중의 효소함량이 낮은 점을 고려할 때에 우선 우량균주 선발과 액체배양 및 고체배양의 최적화에 의하여 생산기간을 단축시키고 고농도 및 고활성의 혈전분해효소를 대량으로 생산시키는 발효공정 최적화가 선행되어야 한다.
담자균류 균사체 배양물은 인체에 부작용이 없고 관능 및 이미지 특성이 우수하며 배양 및 효소발생 유도조건의 최적화에 의해 고활성의 혈전분해효소를 생산할 수 있어 그 배양물 자체로는 혈행개선 및 심혈관계 질환 예방을 위한 유망한 기능성식품 소재가 될 수 있으며, 나아가 적절한 수준의 분리, 정제 및 물질규명 작업을 거치게 되면 항혈전제나 혈전분해제 의약품으로도 본격적 개발이 가능한 장점을 지니고 있다. 또한, 면역증강 활성이나 항산화 활성을 함께 보유한 다기능성 식품 소재 개발이 가능한 장점도 동시에 지니고 있다. 따라서, 기존의 혈전분해제, 일본의 나토키나제 및 신규 개발이 시도되고 있는 tPA나 트롬빈(thrombin) 억제제 등과 비교시 기능성식품 및 의약품으로서 상용화에 관련한 용도적성이 비교적 넓고 기능적 측면에서도 우수한 항혈전 및 혈전제거능을 발휘할 수 있는 신규 기능 성 소재의 개발이 가능할 것으로 기대할 수 있다.
담자균 유래의 혈전분해효소는 혈전 피브린(fibrin)에 직접 작용하여 용해시키는 피브린분해효소(fibrinolytic enzyme)라는 측면에서 간접적 활성인 트롬빈(thrombin) 억제제나 플라스미노겐(plsminogen) 활성화제와 차별성이 있으며, 경구투여가 가능하고 부작용이 없으며 비교적 가격 경쟁력이 있다는 점에서 기존의 혈전용해제와 비교가 된다. 액체배양 및 식이성 고체발효에 의하여 대량의 혈전분해활성을 지닌 식품소재로서 원료 및 제품 개발이 가능하기 때문에 이를 상복하는 경우 뇌졸중 및 심혈관계 질환의 발병율을 크게 감소시키고 질환의 개선효과를 기대할 수 있어 심혈관계 질환 관련하여 발생하는 과도한 보건의료 및 사회적 비용부담을 저비용, 고효율 구조로 크게 개선시킬 수 있을 것이다. 또한, 전문의약품 업체와의 추가적인 협업연구를 통하여 의약품으로서 본격적 개발하는 경우 전문의약품 소재로서 고부가가치 신약개발로 이어질 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자들은 담자균 유래의 혈전분해효소 및 이의 고농도 생산방법에 관한 연구 중, 목이버섯(Auricularia auricula)을 최적의 배양 조건을 통해 신규한 혈전분해효소를 고농도로 생산하는 방법을 확립하였으며, 상기 방법으로 생산한 신규한 혈전분해효소가 시험관내에서 혈전용해 활성, 혈소판 응집 억제능 및 혈압조절능을 나타내고, 생체내에서 뛰어난 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 나타내며, 안전성 시험에서 부작용이 거의 없는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 목이버섯(Auricularia auricula) 유래 신규 혈전분해효소, 상기 혈전분해효소를 고농도로 생산하는 방법, 및 상기 혈전분해효소를 유효성분으로 함유하는 혈전용해용 조성물 또는 혈행개선용 건강식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체로부터 분리되고, 분자량이 15 ~ 17 KDa이며, 최적 활성 pH가 6.0 ~ 8.0이며, 최적 활성 온도가 20 ~ 40℃이며, Fe2+에 의해 활성이 증가하고 Ca2+, Co2+, Zn2+, Cu2+, Mg2+, Hg2+ 및 EDTA에 의해 활성이 감소하며, 피브린 및 피브리노겐 분해 활성을 가진 것을 특징으로 하는, 목이버섯 유래의 혈전분해효소를 제공한다.
또한, 본 발명은 탄소원 0.1 ~ 10 중량부; 효모추출물, 카제인펩톤 및 대두펩톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 5 중량부; 분리대두단백(ISP) 또는 탈지유 0.01 ~ 1 중량부; 및 MgSO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 액체 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 목이버섯 균사체를 상기 액체 배지에서 온도 22 ~ 26℃ 및 pH 6.0 ~ 8.0인 조건에서 배양하는 단계;
2) 배양된 배양물을 감압여과로 균체를 제거한 후 여액을 배제분자량 20 ~ 200 KDa의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 배제분자량 1 ~ 15 KDa의 막으로 농축하는 한외여과에 의한 활성 분획 농축액을 제조하는 단계; 및
3) 상기 활성 분획 농축액을 동결건조하는 단계를 포함하는, 목이버섯 유래의 혈전분해 조효소 조성물 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 현미 또는 백미 70.0 ~ 99.09 중량부; 분리대두단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두 및 대두분으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 30 중량부; 및 MgSO4H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 고체 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 목이버섯 균사체를 상기 고체 배지에 온도 22 ~ 26℃ 및 상대습도 60 ~ 80%인 조건에서 배양하는 단계;
2) 배양된 배양물을 무균수에 침지시킨 후, 균질화시킨 다음 고형분을 제거하여 수추출물을 제조하는 단계;
3) 수추출물을 배제분자량 20 ~ 200 KDa의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 1 ~ 15 KDa의 막으로 농축하는 한외여과에 의한 활성 분획 농축액을 제조하는 단계; 및
4) 상기 활성 분획 농축액을 동결건조하는 단계를 포함하는, 목이버섯 유래의 혈전분해 조효소 조성물 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 방법에 의해 제조되는 혈전분해 조효소 조성물을 염석한 후 투석하여 1차 부분 정제물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 부분 정제물을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 활성 분획물을 수득하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 활성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 활성 분획물을 수득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 활성 분획물을 젤 필트레이션으로 정제한 후 동결건조 및 농축하는 단계를 포함하는, 목이버섯 유래의 혈전분해효소 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 목이버섯 유래의 혈전분해효소, 또는 상기 방법에 의해 제조된 혈전분해 조효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈전용해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 혈전용해용 조성물을 혈전증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전증 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 혈전용해용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전증 예방방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 목이버섯 유래의 혈전분해효소, 상기 방법에 의해 제조된 혈전분해 조효소 조성물, 또는 목이버섯 균사체 배양 여액을 유효성분으로 함유하는 혈행개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따른 목이버섯(Auricularia auricula) 유래 신규한 혈전분해효소는 종래의 혈전분해효소와 상이한 기질 특이성을 가지고, 뛰어난 피브린 및 피브리노겐 분해 활성을 가지며, 생체내에서 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지며, 부작용이 없는 안전한 물질이므로 혈전용해제 또는 혈행개선용 건강식품에 이용할 수 있다. 또한, 상기 신규 혈전분해효소를 고농도로 생산하는 방법을 확립함으로써 의약품 또는 식품의 상용화가 가능하다.
이하, 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다.
본 발명에서 사용된 용어 "혈전분해효소"는 피브린에 직접 작용하여 피브린을 분해하는 효소를 의미하며, 본질적으로는 기능상에 차이가 없으나 "혈전용해효소","피브린 분해효소" 또는 "단백질 분해효소"라는 표현과 상호 교환적으로 사용하며 이들 모두 상기 개념에 포함하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효소변이체 또는 돌연변이 효소"는 하나 또는 복수의 아미노산이 모유전자 또는 그의 유도체의 DNA 뉴클레오티드 서열의 변경에 의하여 수식되거나 변경된, 상기 피브린분해효소와 기능적으로 동일한 효소를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "혈전증"은 생체 내부를 순환하고 있는 혈액의 일부가 혈관 속에서 굳어져서 생긴 혈액응괴로 인해 유발되는 모든 질환을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 혈전증 형성을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 혈전증의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 비만의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 혈전증의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체 유래 혈전분해효소를 제공한다.
상기 목이버섯은 Auricularia auricula MML 118, Auricularia auricula MML 105 및 Auricularia auricula MML-북으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 모든 목이버섯 균주가 사용가능하다.
본 발명자들은 목이버섯균이 평판배양 및 액체배양을 통해 단백질분해효소 활성 및 혈전분해효소 활성이 다른 균종에 비해 가장 높게 검출되었으며, 배양하기가 용이하며, 식용으로서 안전성 문제가 없으므로 이를 선발하였다.
본 발명의 혈전분해효소는 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 목이버섯 균사체를 고체 또는 액체 배지에 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양물에서 분리, 여과, 농축 및 동결건조하는 단계.
본 발명의 혈전분해효소는 분자량이 15 ~ 17 KDa인 것이 바람직하고 16 kDa인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 목이버섯 균사체 유래 신규 혈전분해효소의 특성을 알아보기 위해, 분자량 및 혈전분해 활성을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 혈전분해효소 의 분자량은 약 16,000 Da이고, 혈전을 분해시키는 효소활성이 있음을 확인하였다(도 8 및 도 9 참조).
본 발명의 혈전분해효소는 최적 활성 pH가 6.0 ~ 9.0의 범위인 것이 바람직하고 pH가 7.0 ~ 8.0의 범위인 것이 더욱 바람직하며, 최적 활성 온도가 15 ~ 45℃의 범위인 것이 바람직하고 온도가 20 ~ 40℃의 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 혈전분해효소의 효소학적 특성을 알아보기 위해, 다양한 조건에서 피브린 분해 활성을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 pH 6 ~ 8인 중성 근처에서 효소 활성의 안정성이 가장 높았으며, 40℃까지는 효소활성에 변화가 없었으나 50℃부터는 효소활성이 감소하였다(도 10 및 도 11 참조).
본 발명의 혈전분해효소는 인공위액에서 비교적 안정하고 Fe2+에 의해 활성이 증가하고 Ca2+, Co2+, Zn2+, Cu2+, Mg2+ 및 Hg2+에 의해 활성이 감소하며, EDTA에 의해 활성이 감소하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 경구투여시 혈전분해효소의 효소활성의 안정성을 평가하기 위해, 인공위액에서 활성을 측정하였다. 그 결과, 4시간 노출시까지 약 26%의 활성감소가 발생하여 비교적 인공위액에 잘 견디는 특성을 나타내었다. 본 발명의 혈전분해효소는 Fe2+에 의해서는 10% 정도 활성이 증가되었고, 다른 이온들에 의해서는 10 ~ 50% 가량 활성이 감소되었으며, 메탈로프로테아제(metalloprotease) 저해제인 EDTA에 의해서 약 40% 가량 활성이 감소되어 메탈로프로테아 제(metalloprotease)임을 확인하였다(도 10 내지 도 12 참조).
본 발명의 혈전분해효소는 피브리노겐 및 피브린 분해 활성을 가지고, 피브리노겐의 분해에 있어서 α 사슬은 10분 이내에 분해하고, β 사슬은 90분 이내 분해하며, γ 사슬은 4시간까지 계속 분해하며, 피브린의 분해에 있어서 α와 γ―γ 사슬은 10분 이내에 분해하고, β 사슬은 120분 이내에 분해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 혈전분해효소의 시간에 따른 피브리노겐 및 피브린의 분해 패턴을 알아보기 위해, SDS 페이지를 수행하여 피브린의 분해 패턴을 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 피브리노겐의 분해에 있어 α 사슬을 10분 안에 모두 분해하였고, β 사슬은 90분에 모두 분해하였으며, γ 사슬은 4시간까지 계속 분해하는 경향을 나타내었고, 피브린의 분해에 있어 α와 γ―γ 사슬은 10분 안에 모두 분해하였고, β 사슬은 120분에 모두 분해하였다(도 14 및 도 15 참조).
본 발명의 혈전분해효소는 시험관내(In Vitro)에서 혈전용해 활성을 가지고, 혈소판 응집 억제능을 가지며, 혈압조절능을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 혈전분해효소의 혈전용해능을 알아보기 위해, 피브린 플레이트 분석법을 이용하여 분석한 결과, 본 발명의 혈전분해효소 1 mg이 100 플라스민 유닛과 유사한 활성을 보유하고 있음을 알 수 있었다(표 14 및 도 16 참조). 또한, 혈소판 응집 억제능을 알아보기 위해, 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)에 혈전분해효소 및 응집제를 첨가한 후 응집측정기를 사용하여 응집 억제능을 분석한 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 강한 혈소판 응집 억제 효과를 보유하고 있음을 알 수 있었다(표 15 참조). 또한, 혈압조절능을 알아보기 위해, 혈전분해효소 및 ACE 효소를 첨가한 후 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정한 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 농도 의존적으로 ACE 저해능을 나타내어 혈압조절능을 보유하고 있음을 알 수 있었다(표 16 참조).
본 발명의 혈전분해효소는 생체내(In Vivo)에서 혈전용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 본 발명의 혈전분해효소가 생체내에서 혈전용해능이 있는지 알아보기 위해, ICR 마우스에 다양한 용량으로 혈전분해효소를 경구투여한 후 피브린 플레이트 분석을 수행한 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 뛰어난 혈전분해 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(표 17 및 도 17 참조). 또한, 생체내에서 혈액응집 억제능이 있는지 알아보기 위해, ICR 마우스에 다양한 용량으로 혈전분해효소를 경구투여한 후 채혈한 혈액에서 응집제를 첨가한 후 응집측정기를 사용하여 응집 억제능을 분석한 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 강한 혈소판 응집 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다(표 18 참조). 또한, 생체내에서 항혈전 효능이 있는지 알아보기 위해, ICR 마우스에 다양한 용량으로 혈전분해효소를 경구투여한 후, 혈전유발주사로 혈전을 유발한 다음, 경련지속시간을 측정한 결과, 본 발명의 혈전분해효소를 처리한 경우 경련지속시간이 감소하는 경향을 나타냈다(표 19 참조). 또한, 생체내에서 뇌경색 보호효능이 있는지 알아보기 위해, ICR 마우스에 다양한 용 량으로 혈전분해효소를 경구투여한 후, KCN을 주사하여 전뇌 허혈성 혼수 또는 치사를 유발시킨 다음, 회복시간을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 혈전분해효소가 혈전에 의해 야기되는 뇌경색에 대한 보호 효과가 있음을 제시하고 있다(표 20 및 표 21 참조). 아울러, 생체내에서 면역증강 효능이 있는지 알아보기 위해, ICR 마우스에서 분리한 대식세포를 배양하여 생성한 NO, IL-1a 및 TNF-a 양을 측정한 결과, 본 발명의 혈전분해효소가 NO 및 IL-1a 생성은 변화하지 않았으나, TNF-a 생성은 현저히 증가시켜 면역활성 효능을 보유하고 있음을 알 수 있었다(표 22 참조).
본 발명의 혈전분해효소는 부작용이 없는 안전한 시료인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 본 발명의 혈전분해효소의 안전성을 시험하기 위해, 식품의약품안전청의 독성시험기준에 의거하여 ICR 마우스에 혈전분해효소를 경구투여한 후 치사율 및 임상증상을 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 혈전분해효소는 ICR 마우스에서 최소 치사량이 암수 모두 1,000 mg/kg 이상이며, 치사된 개체나 별다른 이상 징후가 발견되지 않아서 안전성에 문제가 없는 것으로 판단하였다(표 23 및 표 24 참조). 또한, 본 발명의 혈전분해효소 투여에 의한 체중, 장기 및 혈액학적 변화를 검사하였다. 그 결과, 본 발명의 혈전분해효소 경구투여가 동물의 체중 변화에 영향을 미치지 않았고, 개체의 장기에서 유의성 있는 변화와 특이할만한 부검 소견은 관찰되지 않았고 간, 신장 및 비장의 무게는 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 혈청 GOT 및 GPT는 감소되어 오히려 간독성 해소의 특성을 나타내었다(표 25 내지 표 28 참조).
따라서, 본 발명의 목이버섯 균사체 유래 혈전분해효소는 종래의 혈전분해효소와 상이한 분자적 및 효소학적 특성을 가지고, 생체내외에서 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지며, 부작용이 없는 안전한 물질이므로 신규한 혈전분해효소임을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 탄소원 0.1 ~ 10 중량부; 효모추출물, 카제인펩톤 및 대두펩톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 5 중량부; 분리대두단백(ISP) 또는 탈지유 0.01 ~ 1 중량부; 및 MgSO4H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1% 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 액체 배지를 제공한다.
상기 탄소원은 글루코즈인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 배지에서 탄소원으로 사용되는 것은 모두 사용 가능하다.
본 발명자들은 액체배양 배지 조건의 최적화를 확립하기 위해, 다양한 탄소원, 질소원, 이온류 및 첨가물들을 농도를 달리하여 배지 조성한 후 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해활성을 관찰하였다. 이때, 균사체량은 건조균사체량으로 측정하였고, 단백분해활성은 10배 농축여액을 단백질 평판에 찍어서 분해환의 직경을 측정하였으며, 혈전분해활성은 피브린분해활성의 측정법에 따라 정량하였다. 그 결과, 목이버섯균의 액체 배지는 질소원 첨가물로서 단백질과 이온이 첨가된 배지에서 혈전분해활성이 높게 유도되었으며, 첨가된 배지 성분이 분해되는 제한된 시점에서 활성이 높게 유도된 후 약간 감소되는 경향을 나타내었다. 구체적으로, 탄소원으로서 글루코즈 0.1~10 중량부; 효모추출물, 카제인펩톤 및 대두펩톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 5 중량부; 분리대두단백(ISP) 또는 탈지유 0.01 ~ 1 중량부; 및 MgSO4H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1% 중량부일 때 현저히 많은 균사체를 형성하였고, 현저히 높은 단백분해활성 및 혈전분해활성을 나타냄으로써 적절한 액체 배지 조건임을 알 수 있었다(표 2 내지 표 7 참조).
또한, 본 발명은 현미 또는 백미 70.0 ~ 99.09 중량부; 분리대두단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두 및 대두분으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 30 중량부; 및 MgSO4H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1% 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 고체 배지를 제공한다.
본 발명자들은 고체배양 배지 조건의 최적화를 확립하기 위해, 다양한 질소원, 이온류 및 첨가물들을 농도를 달리하여 배지 조성한 후 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해활성을 관찰하였다. 그 결과, 목이버섯균의 고체 배지는 액체 배지와 유사한 경향을 나타내었다. 구체적으로, 현미 또는 백미를 70.0 ~ 99.09% 중량부, 첨가물로서 대두분리단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두, 대두 분 0.01 ~ 30 중량부, 및 이온류로서 MgSO4H2O, K2HPO4, KH2PO4 0.01 ~ 1% 중량부 일때, 현저히 많은 균사체를 형성하였고, 현저히 높은 단백분해활성 및 혈전분해활성을 나타냄으로써 적절한 고체 배지 조건임을 알 수 있었다(표 8 내지 표 10 참조).
또한, 본 발명은 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체를 이용하여 고농도의 신규 혈전분해효소를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 하기와 같은 단계를 포함하는 제조방법으로 혈전분해 조효소 조성물을 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 목이버섯 균사체를 액체 배지에 배양하는 단계;
2) 배양된 배양물을 감압여과로 균체를 제거한 후 여액을 한외여과하는 단계; 및
3) 여과된 여과액을 농축한 후 동결건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 목이버섯은 Auricularia auricula MML 118, Auricularia auricula MML 105 및 Auricularia auricula MML-북으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 모든 목이버섯 균주가 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 액체 배지는 탄소원 0.1 ~ 10 중량부; 효모추출물, 카제인펩톤 및 대두펩톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 5 중량부; ISP 또는 탈지유 0.01 ~ 1 중량부; 및 MgSO4H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1 중량부를 포함하는 것이 바람직하고, 탄소원 2 ~ 5 중량부; 효모추출물, 카제인펩톤 및 대두펩톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.3 ~ 0.5 중량부; 분리대두단백(ISP) 또는 탈지유 0.1 ~ 0.2 중량부; 및 MgSO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.03 ~ 0.15% 중량부를 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 글루코즈 3 ~ 4 중량부; 효모 추출물0.3 ~ 0.4 중량부 및 카제인 펩톤 0.3 ~ 0.4 중량부; ISP 0.1 ~ 0.15 중량부 및 탈지유 0.1 ~ 0.15 중량부; 및 MgSO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4를 각각 0.05 ~ 0.1 중량부를 포함하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 배양은 온도로 20 ~ 28℃ 및 pH로 6.0 ~ 8.0인 조건에서 배양하는 것이 바람직하고, 온도로 22 ~ 26℃ 및 pH로 6.5 ~ 7.5인 조건에서 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다(표 2 내지 표 7 참조).
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 한외여과는 배제분자량 20 KDa 이상의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 15 KDa 이하의 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 바람직하고, 배제분자량 20 ~ 200 KDa의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 1 ~ 15 KDa 이하의 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 더욱 바람직하며, 50 ~ 100 KDa 막으로 투과액을 얻은 후 다시 5 KDa 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 제조방법으로 혈전분해 조효소 조성물을 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 목이버섯 균사체를 고체 배지에 배양하는 단계;
2) 배양된 배양물을 무균수에 침지시킨 후, 균질화시킨 다음 고형분을 제거하여 수추출물을 제조하는 단계;
3) 수추출물을 한외여과한 후, 여과액을 농축한 다음, 동결건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 고체 배지는 현미 또는 백미를 70.0 ~ 99.09 중량부; 분리대두단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두 및 대두분으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 30 중량부; MgSO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1 중량부를 포함하는 것이 바람직하고, 현미 또는 백미 99.0 ~ 99.8 중량부; 분리대두단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두 및 대두분으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.1 ~ 0.2 중량부; 및 MgSO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.03 ~ 0.15 중량부를 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 현미 또는 백미를 99.5 ~ 99.8 중량부, ISP 0.1 ~ 0.15 중량부, MgSO4·H2O, K2HPO4, KH2PO4를 각각 0.05 ~ 0.1 중량부를 포함하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 배양은 온도로 20 ~ 28℃ 및 상대 습도로 60 ~ 80%인 조건에서 배양하는 것이 바람직하고, 온도로 22 ~ 26℃ 및 상대습도로 65 ~ 75%인 조건에서 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다(표 8 및 표 9 참조).
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 한외여과는 배제분자량 20 KDa 이상의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 15 KDa 이하의 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 바람직하고, 배제분자량 20 ~ 200 KDa의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 1 ~ 15 KDa 이하의 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 더욱 바람직하며, 50 ~ 100 KDa 막으로 투과액을 얻은 후 다시 5 KDa 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 제조방법으로 혈전분해효소를 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 상기 방법에 의해 제조되는 혈전분해 조효소 조성물을 염석한 후 투석하여 1차 부분 정제물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 1차 부분 정제물을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 활성 분획물을 수득하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 활성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 활성 분획물을 수득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 활성 분획물을 젤 필트레이션으로 정제한 후 동결건조 및 농축하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 염석은 암모늄설페이트 용액으로 단백질을 침전시키는 것이 바람직하고, 상기 암모늄설페이트 용액은 70% 포화 암모늄설페이트 용액인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 양이온 교환 크로마토그래피는 CM-셀룰로오즈 컬럼(CM-cellulose column)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE-셀룰로즈 컬럼(DEAE-Cellulose column)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 젤 필트레이션은 세퍼덱스 G-150 컬럼(Sephadex G-150 column)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 혈전분해효소의 정제 단계별 혈전분해 활성을 알아보기 위해, 혈전분해 조효소를 암모늄설페이트 용액으로 단백질을 침전시키고 투석하여 획득한 1차 부분정제물, 이에 CM-셀룰로오즈 컬럼을 완충액으로 평형화시킨 후 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획물, 상기 분획물 중 피브린 플레이트 분석법으로 혈전분해 활성이 있는 부분만을 취한 후 DEAE-셀룰로즈 컬럼 완충액으로 평형화시킨 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하여 회수한 분획물, 및 세퍼덱스 G-150 컬럼 완충액으로 평형화시킨 다음 젤필트레이션을 진행하여 회수한 분획물을 각각 피브린 분해 활성을 측정한 후 비교한 결과, 모두 높은 피브린 분해 활성을 가지고 있었으며, 정제할 수록 높은 활성을 나타내었다(표 13). 따라서, 본 발명의 혈전분해 조효소 뿐만 아니라 이들의 각 정제 단계별 부분 정제물은 모두 혈전용해제 또는 혈행개선에 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 목이버섯(Auricularia auricula) 유래 신규 혈전분해효소, 또는 상기 방법에 의해 제조되는 혈전분해 조효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈전용해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 혈전분해효소 또는 혈전분해 조효소 조성물은 뛰어난 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지며, 부작용이 거의 없으므로 혈전용해용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
상기 조성물의 혈전분해효소는 유사한 효능을 가지는 경우 이들의 효소변이체 또는 돌연변이 효소를 사용하는 것도 가능하다.
상기 조성물의 혈전분해효소는 고형분만 제거한 수추출물을 그대로 사용할 수도 있고, 상기 수추출물을 여과 및 농축한 농축물을 그대로 사용할 수도 있으며, 상기 농축물을 동결건조하여 얻은 분말형태의 조효소를 그대로 사용할 수도 있으며, 이를 통상의 방식으로 추가로 정제하여 순도 높게 사용할 수도 있다.
상기 정제에는 염석, 이온교환크로마토그래피, 젤 필트레이션 및 피브린자이모 전기영동을 통하여 순수 분리할 수 있으며, 구체적으로 상기 혈전분해효소는 암모늄설페이트 용액으로 단백질을 침전시키고 투석하여 획득한 1차 부분정제물, 이에 CM-셀룰로오즈 컬럼을 완충액으로 평형화시킨 후 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획물, 상기 분획물 중 피브린 플레이트 분석법으로 혈전분해 활성 이 있는 부분만을 취한 후 DEAE-셀룰로즈 컬럼 완충액으로 평형화시킨 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하여 회수한 분획물, 및 세퍼덱스 G-150 컬럼 완충액으로 평형화시킨 다음 젤필트레이션을 진행하여 회수한 분획물을 모두 이용할 수 있다.
본 발명의 혈전용해용 조성물은 유효성분으로서 상기 혈전분해효소, 그의 효소 변이체 또는 돌연변이 효소, 및 약학적으로 허용되는 담체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 혈전용해용 조성물은 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 일반적으로는, 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등를 가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한, 이것을 사용 전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 만들 수 있는 건조품으로 할 수도 있다.
본 발명의 혈전용해용 조성물은 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제 중의 어떠한 것에 의해서도 투여할 수 있다.
의약용 담체는, 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 콘 스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효성분인 혈전 분해효소를 포함하는 혈전용해용 조성물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 또는 현탁시켜서 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제될 수 있다.
본 발명의 혈전용해용 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법은 특히 한정할 필요는 없고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다.
본 발명의 혈전용해용 조성물의 투여량은, 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 1 ㎍ ~ 2000 ㎎/㎏이다. 그러나, 당업자는 특정 시약의 약물동력학적인 특성, 그의 투여 모드 및 경로, 및 수여자의 나이, 건강 및 체중, 및 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과 등의 공지의 요인에 따라서 투여량이 변화될 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 혈전용해용 조성물을 혈전증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전증 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 혈전용해용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전증 예방방법을 제공한다.
본 발명의 신규 혈전분해효소 또는 혈전분해 조효소 조성물은 뛰어난 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지며, 부작용이 거의 없으므로 혈전증 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
상기 혈전증으로는 뇌혈전, 폐색전, 폐경색증, 하지심부정맥 혈전증, 신부전증 및 심근경색으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 투여는 혈전분해효소, 그의 효소 변이체 또는 돌연변이 효소, 및 약학적으로 허용되는 담체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 투여는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 경구 투여용으로 사용한다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 1 ㎍ ~ 2000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 10 ㎍ ~ 1000 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 혈전증의 예방, 지연 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 목이버섯 균사체 유래 혈전분해효소, 혈전분해 조효소 조성물, 또는 목이버섯 균사체를 배양한 배양여액을 유효성분으로 함유하는 혈행개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 목이버섯 균사체를 배양한 배양여액, 및 이로부터 분리한 신규 혈전분해효소 또는 혈전분해 조효소 조성물은 뛰어난 혈전 용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지며, 부작용이 거의 없으므로 혈행개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 식품은 목이버섯 균사체, 이의 배양 여액, 이로부터 분리한 혈전분해효소, 그의 효소변이체 또는 돌연변이 효소를 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 식품은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 식품은 목이버섯 균사체, 이의 배양 여액 또는 이로부터 분리한 혈전분해효소를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 혈전분해효소, 그의 효소변이체 또는 돌연변이 효소는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하 의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.04 중량부, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단백질 분해 고활성 균주의 선발
<1-1> 1차 균주 선발
본 발명자들은 목이버섯, 새송이버섯, 아위버섯, 느타리버섯, 동충하초, 검은비늘버섯, 민자주방망이버섯, 상황버섯, 차가버섯, 치마버섯 및 노루궁뎅이 버섯[자체분리(목이, 새송이, 치마버섯, 노루궁뎅이), 야생버섯균주은행(CCDBM: Culture Collection of DNA Bank of Mushrooms, 목이, 동충하초, 상황, 차가, 민자주방망이), 춘천 농업기술센터(아위, 뽕나무, 느타리, 검은비늘) 분양] 균사체 절편을 3% 탈지유(skim milk) 및 분리대두단백질(Isolated Soy Protein)가 첨가된 포테이토 덱스트로즈 아가 플레이트(Potato dextrose agar plate)에 이식하여 24℃ 조건에서 정치배양하면서 단백질 분해환의 생성유무를 24시간 간격으로 관찰하여 단백질 분해효소의 활성 유무를 1차 관찰하였다. 단백질 분해효소 활성이 뛰어난 균주에 대하여 각 균주별 기초배양 조건으로 액체배양 후 배양여액을 10배 이상 농축한 후 피브린 플레이트(Fibrin plate) 상에서의 피브린 분해 활성의 존재 유무를 관찰하였다. 이때 피브린 플레이트는 2% 아가로즈(Agarose) 용액에 녹인 0.5% 피 브리노겐(fibrinogen) 용액 10 ㎖을 100NIH units의 트롬빈(thrombin) 50 ㎕을 미리 방울방울 뿌려 놓은 평판 상에 붓고 신속히 혼합하여 피브린막을 제조하였으며 펀칭 후 시료 100 ㎕씩 투입하여 용해환의 형성 유무를 관찰하였다. 단백질 분해환 및 피브린 분해환이 2.5 ㎝ 이상으로 형성된 좋은 균주를 1차 선발하였다.
<1-2> 최종 균주 선발
1차 선발된 균주에 대하여 각 균주별 액체배양 배지로 10일간 배양하면서 24시간 간격으로, 동시에 각 균주별 고체배양 배지로 4주간 배양하면서 1주 간격으로 피브린분해활성(Fibrinolytic activity)(FU/㎖)을 측정하여 최종 균주 선발을 확정지었다. 이때, 피브린분해활성(FU/ml)은 다음과 같이 측정하였다: 1) 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.4) 1.4 ㎖와 동일 완충용액에 녹인 0.5% 피브리노겐 용액을 혼합한 후 37℃ 수조에서 5분간 가온한 후 트롬빈 용액 0.1 ㎖를 첨가하고 10분간 동 수조에서 방치하여 혈전을 생성시켰다. 2) 시료용액 100 ㎕를 첨가하여 60분간 동일 수조에서 반응시켰으며, 이때 20분 간격으로 격렬하게 교반을 가해주었다. 3) TCA 용액 2 ㎖을 가하여 반응을 정지시킨 후 20분간 동일 수조에서 방치 후에 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 여액을 채취 후 275 nm에서 흡광도를 측정하였다. 4) 이때, 대조구로는 미리 동량의 TCA 용액을 가하고 시료를 첨가한 것을 동법에 따라 사용하였다. 5) 각 시료의 활성은 하기 [수학식 1]에서 보는 바와 같이 시료 1 ㎖가 1분간 0.01의 흡광도 증가를 가져오는 활성으로 정의하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이 목이버섯균의 경우에 평판배양 및 액체배양을 통해 단백질분해효소 활성 및 혈전분해효소 활성이 다른 균종에 비해 가장 높게 검출되었으며, 배양하기가 용이하며, 식용으로서 안전성 문제가 없으므로 사용할 균주로서 최종 확정하였다. 목이버섯 균주로는 Auricularia auricula MML 118(야생버섯균주은행), Auricularia auricula MML 105(야생버섯균주은행) 및 Auricularia auricula MML-북(자체분리) 등 3균주를 실험하였으며, 3균주 모두 유사한 경향을 나타내었으나 118 균주가 배양성이 약간 더 양호하여 이하 실험에 이용하였다.
| 단백질분해환(cm) | 혈전분해환(cm) | 배양성(액체/고체) | 식용성분류 | |
| 목이버섯 | 3.5 | 3.0 | 양호 | 식용 |
| 큰느타리버섯 | 3.0 | 2.8 | 양호 | 식용 |
| 아위버섯 | 2.7 | 1.9 | 양호 | 식용 |
| 뽕나무버섯 | 3.3 | 2.3 | 불량 | 식용 |
| 검은비늘버섯 | 3.0 | 2.5 | 양호 | - |
| 민자주방망이버섯 | 2.9 | 2.7 | 불량 | - |
| 동충하초 | 1.0 | 0 | 양호 | 식용 |
| 상황버섯 | 0.5 | 0 | 양호 | 약용 |
| 차가버섯 | 0.3 | 0 | 양호 | 식용 |
| 노루궁뎅이버섯 | 0.2 | 0 | 양호 | 식용 |
| 치마버섯 | 0.3 | 0 | 양호 | - |
<실시예 2> 배양 배지의 최적화
<2-1> 액체배양 배지 조건의 최적화
본 발명자들은 탄소원으로서 글루코즈(glucose)를, 질소원으로서 효모 추출물(yeast extract), 카제인 펩톤(casein pepton) 또는 대두 펩톤(soy pepton)을, 이온류로서 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 또는 인산칼륨(potasium phosphate)을, 첨가물로서 ISP 또는 탈지유(Skim milk)을 농도를 달리하여 조성하여 200 ㎖의 워킹 볼륨(working volume)으로 10일간 플라스크 진탕배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다. 각 실험구에서의 균사체량, 단백분해활성, 혈전분해 활성을 관찰하여 배지조성을 결정하였으며 최종 조성된 배지를 사용하여 20L의 통기 배양기에서 15 L의 워킹 볼륨으로 10일간 통기 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다. 한편, 조성된 배지에 대하여 온도, pH 및 통기 조건을 달리하여 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다. 이때, 균사체량은 건조균사체량으로 측정하였고, 단백분해활성은 10배 농축여액을 단백질 평판에 찍어서 분해환의 직경을 측정하였으며, 혈전분해활성은 피브린분해활성(fibrinolytic activity)의 측정법에 따라 정량하였다.
<2-1-1> 탄소원의 영향
본 발명의 목이버섯균을 기본배지(효모 추출물 0.5%, 카제인 펩톤 0.5%)에 탄소원으로서 글루코즈를 다양한 농도로 첨가하여 조성한 각 배지에서 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다.
그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 균사체 함량은 글루코즈 함량이 2 중량% 부터 급격히 증가하였고, 5 중량% 때까지 점차 증가하였으나, 5 중량% 이후부터 급격히 감소하였다. 따라서, 액체배지에 탄소원으로서 글루코즈가 2 ~ 5 중량%인 것이 가장 적절한 배지 조성임을 알 수 있다. 이하, 실험에서는 글루코즈를 3 중량%로 사용하였다(표 2).
| 0 % | 1 % | 2 % | 3 % | 4 % | 5 % | 6 % | 7 % | |
| 균사체량(g/L) | 2.1 | 2.9 | 5.4 | 9.8 | 9.9 | 9.4 | 3.0 | 2.2 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | - | - | - | - | - | - | - |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | - | - | - | - | - | - | - |
| 기본배지: 효모 추출물 0.5%, 카제인 펩톤 0.5% | ||||||||
<2-1-2> 질소원의 영향
본 발명의 목이버섯균을 기본배지(효모 추출물 0.5 중량%, 카제인 펩톤 0.5 중량%)에 글루코즈 3 중량%를 첨가한 배지에 질소원으로서 효모 추출물, 카제인 펩톤 및 대두펩톤을 각각 다양한 농도로 첨가하여 조성한 각 배지에서 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다.
그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 균사체 함량은 효모 추출물, 카제인 펩톤 또는 대두펩톤이 0.2 중량% 부터 급격히 증가하였고, 0.6 중량% 때까지 점차 증가하였으나, 0.5 중량% 이후부터 급격히 감소하였다. 따라서, 액체배지에 질소원으로서 효모 추출물, 카제인 펩톤 또는 대두펩톤가 0.2 ~ 0.6 중량%인 것이 가장 적절한 배지 조성임을 알 수 있다. 이하, 실험에서는 질소원으로 효모 추출물을 0.3 중량% 및 카제인 펩톤을 0.3 중량%로 사용하였다(표 3).
| 0 % | 0.1 % | 0.2 % | 0.3 % | 0.4 % | 0.5 % | 0.6 % | 0.7 % | ||
| 효모 추출물 | 균사체량(g/L) | 1.1 | 6.7 | 9.5 | 10.4 | 12.6 | 12.0 | 11.4 | 6.2 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | - | - | - | - | - | - | - | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | - | - | - | - | - | - | - | |
| 카제인 펩톤 | 균사체량(g/L) | 0.9 | 5.4 | 7.9 | 8.1 | 11.9 | 11.9 | 11.0 | 6.0 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | - | - | - | - | - | - | - | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | - | - | - | - | - | - | - | |
| 대두 펩톤 | 균사체량(g/L) | 1.0 | 4.4 | 8.1 | 9.6 | 12.9 | 11 | 10.2 | 5.3 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | - | - | - | - | - | - | - | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | - | - | - | - | - | - | - | |
| 기본배지: 글루코즈 3% | |||||||||
<2-1-3> 이온의 영향
본 발명의 목이버섯균을 기본배지(효모 추출물 0.5 중량%, 카제인 펩톤 0.5 중량%)에 글루코즈 3 중량%, 효모 추출물을 0.3 중량%, 및 카제인 펩톤을 0.3 중량%를 첨가한 배지에 이온류로서 MgSO4·H2O, K2HPO4, 및 KH2PO4를 각각 다양한 농도로 첨가하여 조성한 각 배지에서 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다.
그 결과, 표 4에서 보는 바와 같이 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성은 이온류로 MgSO4·H2O, K2HPO4, 및 KH2PO4가 0.03 중량% 부터 급격히 증가하였고, 0.15 중량% 때까지 증가하였으나, 0.15 중량% 이후부터 급격히 감소하였다. 따라서, 액체배지에 이온류로 MgSO4·H2O, K2HPO4, 및 KH2PO4가 0.03 ~ 0.15 중량%인 것이 가장 적절한 배지 조성임을 알 수 있다. 이하, 실험에서는 이온류로 MgSO4·H2O, K2HPO4, 및 KH2PO4를 0.05 중량%로 사용하였다(표 4).
| 0 % | 0.03 % | 0.06 % | 0.09 % | 0.12 % | 0.15 % | 0.18 % | ||
| MgSO4·H2O | 균사체량(g/L) | 11.0 | 13.7 | 14.5 | 15.2 | 16.2 | 13.2 | 11.1 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | 5 | 6 | 5 | 4 | 5 | 2 | |
| K2HPO4 | 균사체량(g/L) | 12.5 | 14.7 | 15.1 | 16.2 | 13.2 | 14.5 | 12.2 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | - | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | 3 | 4 | 5 | 5 | 2 | 1 | |
| KH2PO4 | 균사체량(g/L) | 10.7 | 12.8 | 16.4 | 15.8 | 16.0 | 15.2 | 11.2 |
| 단백분해 활성(cm) |
- | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
- | 3 | 3 | 5 | 4 | 5 | 2 | |
| 기본배지: 글루코즈 3%, 효모 추출물 0.3%, 카제인 펩톤 0.3% | ||||||||
<2-1-4> 첨가물의 영향
본 발명의 목이버섯균을 기본배지(효모 추출물 0.5 중량%, 카제인 펩톤 0.5 중량%)에 글루코즈 3 중량%, 효모 추출물을 0.3 중량%, 카제인 펩톤을 0.3 중량%, 및 MgSO4·H2O 0.05 중량%, K2HPO4 0.05 중량%, KH2PO4 0.05 중량%를 첨가한 배지에 첨가물로서 탈지유, 분리대두단백(ISP) 및 대두분을 각각 다양한 농도로 첨가하여 조성한 각 배지에서 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다.
그 결과, 표 5에서 보는 바와 같이 단백분해활성 및 혈전분해 활성은 탈지유 및 ISP가 0.1 중량% 부터 급격히 증가하였고, 0.2 중량% 때까지 증가하였으나, 0.2 중량% 이후부터 급격히 감소하였다. 이와 달리 대두분의 경우 0.15 중량% 부터 급격히 증가하였고, 0.2 중량% 때까지 증가하였으나, 0.2 중량% 이후부터 급격히 감소하였다. 따라서, 액체배지에 첨가물로 탈지유 및 ISP가 0.1 ~ 0.2 중량%, 및 대두분이 0.15 ~ 0.2 중량%인 것이 가장 적절한 배지 조성임을 알 수 있다(표 5).
| 0 % | 0.05 % | 0.1 % | 0.15 % | 0.2 % | 0.25 % | ||
| 탈지유 | 균사체량(g/L) | 14.3 | 15.3 | 13.2 | 14.9 | 15.3 | 15.2 |
| 단백분해 활성(cm) |
0.3 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 1.4 | 0.9 | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
10.4 | 9.5 | 12.1 | 13.2 | 12.5 | 11.9 | |
| ISP | 균사체량(g/L) | 13.2 | 14.5 | 14.1 | 13.2 | 11.8 | 12.0 |
| 단백분해 활성(cm) |
0.3 | 0.4 | 0.9 | 1.2 | 1.0 | 1.1 | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
11.2 | 12.1 | 10.6 | 9.8 | 12.1 | 11.8 | |
| 대두분 | 균사체량(g/L) | 12.9 | 13.9 | 14.5 | 13.7 | 14.6 | 15.0 |
| 단백분해 활성(cm) |
0.3 | 0.4 | 0.4 | 0.7 | 0.6 | 0.6 | |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
11.5 | 11.4 | 10.9 | 12.0 | 13.1 | 11.8 | |
| 기본배지: 글루코즈 3%, 효모 추출물 0.3%, 카제인 펩톤 0.3% MgSO4·H2O 0.05, K2HPO40.05%, KH2PO40.05% |
|||||||
<2-1-5> 온도의 영향
본 발명의 목이버섯균을 배지(효모 추출물 0.5 중량%, 카제인 펩톤 0.5 중량%, 글루코즈 3 중량%, 효모 추출물을 0.3 중량%, 카제인 펩톤을 0.3 중량%, 대두분리단백 0.1 중량%, 탈지분유 0.1 중량% 및 MgSO4·H2O 0.05 중량%, K2HPO4 0.05 중량%, KH2PO4 0.05 중량%)에 다양한 온도로 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다.
그 결과, 하기 표 6에서 보는 바와 같이 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성은 배양 온도가 22 ~ 26℃일때 가장 높았으며, 20℃ 이하 및 28℃ 이상에서는 급격히 감소하였다. 따라서, 액체배지에서 온도가 22 ~ 26℃에서 배양하는 것이 가장 적절한 배양 조건임을 알 수 있다(표 6).
| (℃) | 18 | 20 | 22 | 24 | 26 | 28 | 30 |
| 균사체량 | 13.0 | 13.2 | 14.8 | 15.7 | 15.2 | 12.3 | 12.0 |
| 단백분해 활성(cm) |
1.0 | 1.0 | 1.5 | 1.4 | 1.4 | 1.0 | 1.0 |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
12.5 | 14.0 | 14.9 | 15.1 | 14.0 | 10.5 | 9.5 |
| 기본배지: 글루코즈 3%, 효모 추출물 0.3%, 카제인 펩톤 0.3%, 대두분리단백 0.1%, 탈지분유 0.1%, MgSO4·H2O 0.05, K2HPO4 0.05%, KH2PO4 0.05% |
|||||||
<2-1-6> pH의 영향
본 발명의 목이버섯균을 배지(효모 추출물 0.5 중량%, 카제인 펩톤 0.5 중량%, 글루코즈 3 중량%, 효모 추출물을 0.3 중량%, 카제인 펩톤을 0.3 중량%, 대두분리단백 0.1 중량%, 탈지분유 0.1 중량%, 및 MgSO4·H2O 0.05 중량%, K2HPO4 0.05 중량%, KH2PO4 0.05 중량%)에 다양한 pH로 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 관찰하였다.
그 결과, 하기 표 7에서 보는 바와 같이 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성은 배양 pH가 6.0 ~ 8.0일때 가장 높았으며, 5.5 및 8.5에서는 급격히 감소하였다. 따라서, 액체배지에서 pH가 6.0 ~ 8.0에서 배양하는 것이 가장 적절한 배양 조건임을 알 수 있다(표 7).
| 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 | 8.5 | |
| 균사체량 | 9.7 | 12.6 | 13.9 | 12.9 | 13.1 | 9.5 | 9.0 |
| 단백분해 활성(cm) |
0.3 | 1.5 | 1.7 | 1.6 | 1.5 | 1.5 | 1.0 |
| 혈전분해 활성(Fu/ml) |
8.3 | 9.9 | 12.6 | 12.0 | 11.3 | 9.8 | 8.2 |
| 기본배지: 글루코즈 3%, 효모 추출물 0.3%, 카제인 펩톤 0.3%, 대두분리단백 0.1%, 탈지분유 0.1%, MgSO4·H2O 0.05, K2HPO4 0.05%, KH2PO4 0.05% |
|||||||
<2-2> 고체배양 배지 조건의 최적화
가식성 곡류 배지로서 백미, 현미 단독으로, 또는 현미에 이온류로서 MgSO47H2O 0.05%, K2HPO40.05% 또는 KH2PO40.05%를 첨가한 기본 배지에 대하여 질소원 첨가물로서 효모 추출물, 카제인 펩톤, 대두 펩톤, ISP, 탈지유, 대두, 대두분을 각각 일정 농도로 첨가하여 4주간 배양 후 균사체 활착도 및 혈전분해 활성을 관찰하여 최적배지를 결정하였으며, 결정한 배지에서 다시 4주간 배양경시변화를 관찰하여 확인하였다. 이때, 배양 조건은 24℃, pH 비조절, 정치 배양, 70% 상대습도 조건을 사용하였으며, 배양기는 1.2 L 버섯 배양병을 사용하였다.
그 결과, 표 8, 표 9 및 표 10에서 보는 바와 같이, 고체배양은 질소원 첨가물로서 액체배양시와 유사하게 가수분해물보다는 단백질이 첨가된 배지에서 혈전분해활성이 높게 유도되었으며, 배양기간은 액체배양에 비해 길었으나 활성은 높게 유도되었다. 상기 고체배양의 경우는 액체배양과 달리 배양물 내에 그대로 축적되는 결과를 나타내었다. 고체배양 조건은 액체배양시와 유사한 결과를 얻었으며, 구체적으로 고체배양 배지는 현미(또는 백미)에 무게비로 0.1% ISP, 0.05% MgSO4H2O, K2HPO4, KH2PO4를 첨가할 때 가장 적절한 고체배지 배양조건임을 알 수 있었다(표 8, 표 9 및 표 10).
| 구 분 | 첨가 농도 (중량비%) |
배양성 (균사 활착도 %) |
효소활성 (Fu/g) |
기본 배지 |
| 대조구 | 무첨가 | 100 | 54 | 현미 base 3종 이온 각 0.05% |
| 대조구 | 무첨가 | 100 | 57 | 백미 base 3종 이온 각 0.05% |
| 효모 추출물 |
0.1 | 100 | 59 | 현미 base 3종 이온 각 0.05% -MgSO47H2O, KH2PO4, K2HPO4 |
| 0.2 | 100 | 55 | ||
| 0.3 | 100 | 57 | ||
| 0.4 | 100 | 58 | ||
| 0.5 | 100 | 60 | ||
| 가제인 펩톤 |
0.1 | 100 | 60 | |
| 0.2 | 100 | 58 | ||
| 0.3 | 100 | 55 | ||
| 0.4 | 100 | 59 | ||
| 0.5 | 100 | 58 | ||
| 대두 펩톤 |
0.1 | 100 | 54 | |
| 0.2 | 100 | 58 | ||
| 0.3 | 100 | 55 | ||
| 0.4 | 100 | 57 | ||
| 0.5 | 100 | 56 | ||
| ISP | 0.05 | 100 | 64 | |
| 0.1 | 100 | 89 | ||
| 0.15 | 100 | 88 | ||
| 0.2 | 100 | 90 | ||
| 0.25 | 100 | 90 | ||
| 탈지분유 | 0.05 | 100 | 61 | |
| 0.1 | 100 | 82 | ||
| 0.15 | 100 | 82 | ||
| 0.2 | 100 | 80 | ||
| 0.25 | 100 | 82 | ||
| 대두분 | 0.05 | 100 | 60 | |
| 0.1 | 100 | 64 | ||
| 0.15 | 100 | 66 | ||
| 0.2 | 100 | 68 | ||
| 0.25 | 100 | 68 | ||
| 대두 | 6 | 100 | 52 | |
| 12 | 100 | 54 | ||
| 18 | 100 | 60 | ||
| 24 | 100 | 62 | ||
| 30 | 100 | 61 |
| 조 건 | |
| 배지조성 | 백미(또는 현미) 99.75%, ISP 0.1%, MgSO4·H2O 0.05%, K2HPO4 0.05%, KH2PO4 0.05% |
| 온도(℃) | 24 |
| pH | 비조절 |
| 배양실내 상대습도 | 70% |
| 살균 및 호화 조건 | 12시간 침지, 121℃, 60분 |
| 배양기간(일) | 7 | 14 | 21 | 28 |
| 평균 균사체 활착도(%) | 15 | 45 | 85 | 100 |
| 단백분해 활성(U/g) | 3 | 25 | 37 | 40 |
| 혈전분해 활성(Fu/g) | 5 | 30 | 70 | 80 |
<실시예 3> 물질회수공정 최적화
<3-1> 액체 배양물에서의 조효소 제조
최적 배지에서 10일간 배양이 종료된 액체배양물에 대하여 여과포 및 0.5 u필터로 자체제작한 감압여과기를 이용하여 고액분리하여 균사체를 제거하였으며(이때, 제거한 균사체는 별도로 균질화한 후 재여과하여 시료액에 합하였다.) 획득한 여액에 대하여 배제분자량 100 KDa의 한외여과막을 사용하여 한외여과하여 투과액을 모은 후 다시 10 KDa의 한외여과막(Lab UF/SYS., 한성환경, 가동압력 3kgf/㎠)을 사용하여 농축액을 모았다. 농축액은 그대로 동결건조하여 건조분말을 획득하여 조효소분말로 하였으며 상법에 따라 피브린 플레이트 분석(fibrin plate assay) 및 피브린 분해활성(Fibrinolytic activity)을 측정하여 활성 및 배양액 대비 회수도를 평가하였다.
<3-2> 고체 배양물에서의 조효소 제조
고체배지에서 4주간 배양이 종료된 고체배양물에 대하여 2배량의 멸균수를 가하여 균질화하고 24시간 동안 4℃에서 방치하여 수추출하였다. 수추출 시료에 대하여 7,000 rpm 이상의 원심분리를 실시하거나 감압여과기, 압출기를 이용하여 고형분을 제거하였으며, 획득한 여액에 대하여 배제분자량 100 KDa의 한외여과막을 사용하여 한외여과하여 투과액을 모은 후 다시 10 KDa의 한외여과막을 사용하여 농축액을 모았다. 농축액은 그대로 동결건조하여 건조분말을 획득하여 조효소분말로 하였으며 상법에 따라 피브린 플레이트 분석(fibrin plate assay) 및 피브린 분해활성(Fibrinolytic activity)을 측정하여 활성 및 배양물 대비 회수도를 평가하였다. 한외여과로 분획, 농축 제조된 조효소분말 시료를 제형실험 및 효능 평가를 위한 동물실험 등의 시료로 사용하였다.
그 결과, 표 11에서 보는 바와 같이 조효소 형태의 원료 제품을 만들 수 있었으며 전체 공정 중 회수율은 약 78% 정도를 나타내었다(표 11).
| 공정 | 부피/무게 | 활성 | 회수율(%) |
| 고체배양물 | 10 kg | 80 Fu/g | 100 |
| 수추출물(고형분제거) | 20 L | 34 Fu/ml | 85 |
| 한외여과 분리, 농축물 | 2 L | 330 Fu/ml | 82.5 |
| 동결건조분말(조효소) | 0.5 kg | 1250 Fu/g | 78.125 |
<실시예 4> 조효소의 이용제형의 개발 및 효소활성 가속 시험
본 발명자들은 1차 획득한 조효소 제품의 물성 특성에 맞추어 산제 및 과립제 등의 제형화를 실시하였다. 산제의 경우에는 동결건조물을 그대로 분쇄하여 100메시 이상의 균일한 분말을 제조하였다. 과립제의 경우 제조한 산제에 대하여 10% 말토 덱스트린(Malto dextrin) 및 5% 락토오즈(Lactose)를 사용하여 역회전 과립기를 사용하여 직경 3 mm로 제조하였다.
또한, 제조한 산제 및 과립제에 대하여 알루미늄 파우치에 100 g 소분 후 40℃, 70% 습도 조건에서 보존하면서 8주간 활성의 안정성을 관찰하였다.
그 결과, 표 12에서 보는 바와 같이 8주간 가속시험에서 산제는 약 80%, 과립제는 약 90%의 안정성을 나타내었다(표 12).
| 보존기간 (week) |
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 산제 (Fu/g) |
1250 | 1250 | 1200 | 1150 | 1100 | 1050 | 1030 | 1020 | 1000 |
| 과립제 (Fu/g) |
1060 | 1060 | 1050 | 1050 | 1050 | 1030 | 1000 | 990 | 960 |
<실시예 5> 분리정제 및 물질규명
<5-1> 염석에 의한 부분 정제 및 탈염
본 발명자들은 배양여액, 고체배양 추출 여액 또는 각 조효소 분말을 재용해시킨 시료에 대하여 70% 포화 암모늄설페이트 용액으로 단백질을 침전시켜 1차 부분정제하였다. 이때, 에탄올 및 아세톤의 유기용매 침적법도 별도 실시하여 1차 부분정제 및 단백질 회수도(활성)을 비교하였으며 비교실험의 결과 유기용매 사용시 단백질의 회수도가 불량하거나 효소활성이 사라지는 경향이 있어 사용하지 않았다. 염석은 4℃ 조건에서 24시간 이상 침적하였으며 원심분리하여 침전물을 회수한 후 배제분자량 10,000 Da.의 투석막을 사용하여 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.4) 용액에서 4℃ 조건으로 48시간 이상 투석하여 염을 제거하였다.
<5-2> 양이온교환 크로마토그래피
CM-셀룰로즈 컬럼(CM-Cellulose column)(2.5 x 30 cm)을 0.1 N HCl과 0.1 N NaOH로 활성화시킨 후 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)으로 평형화시키고 부분정제 시료를 주입하여 크로마토그래피를 수행하였다. 0 ~ 2 N NaCl이 포함된 동일한 완충용액을 흘려보내 1 ml/min의 속도로 5 ml씩 분획 수집기(fraction collector)를 이용하여 275 nm에서의 흡광도 분획을 회수하였다. 회수한 분획은 피브린 플레이트 분석법을 이용하여 혈전분해활성이 있는지 확인하였다.
<5-3> 음이온 교환 크로마토그래피
DEAE-셀룰로즈 컬럼(DEAE-Cellulose column)(2.5 x 30 cm)을 0.1 N HCl과 0.1 N NaOH로 활성화시킨 후 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)으로 평형화시키고 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 활성 분획을 주입하여 크로마토그래피를 수행하였다. 0 ~ 2N NaCl이 포함된 동일한 완충용액을 흘려보내 1 ml/min의 속도로 5 ml씩 분획 수집기를 이용하여 275 nm에서의 흡광도 분획을 회수하였다. 회수한 분획에 대하여 피브린 플레이트 분석법을 이용하여 혈전분해활성이 있는지 확인하였다.
<5-4> 젤 필트레이션
세퍼덱스 G-150 컬럼(Sephadex G-150 column)(3.5 x 50 cm)을 0.1 N NaCl을 포함한 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)로 평형화시킨 후 음이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 활성 분획 시료를 주입하여 크로마토그래피를 수행하였다. 0.1 N NaCl을 포함한 동일한 완충용액을 1 ml/min의 속도로 흘려보내 5 ml씩 분획 수집기를 이용하여 275 nm에서의 흡광도 분획을 회수하였다. 회수된 분획물에 대하여 피브린 플레이트 분석법을 이용하여 혈전분해활성이 있는지 확인한 후 투석하고 동결건조를 이용하여 농축시킨 후 정제시료로 사용하였다.
그 결과, 표 13에서 보는 바와 같이 암모늄설페이트 용액으로 단백질을 침전시켜 1차 부분정제한 경우는 총 단백질이 975.20 mg이었고 피브린분해활성이 54.3 PU/mg이었으며, 양이온 교환크로마토그래피로 정제한 경우는 798.89 mg이었고 피브린분해활성이 79.3 PU/mg이었으며, 음이온 교환크로마토그래피로 정제한 경우는 392.12 mg이었고 피브린분해활성이 130.1 PU/mg이었으며, 젤 필트레이션으로 정제한 경우는 49.22 mg이었고 피브린분해활성이 237.7 PU/mg이었다(표 13, 도 5 내지 도 7).
| 단계 | 총단백질 (mg) |
피브린분해활성 (PU/mg) |
수율(%) | 정제 배수 |
| 수추출물 | 1689.23 | 11.6 | 100 | 1 |
| 암모늄설페이트 | 975.20 | 54.3 | 57.7 | 4.68 |
| CM-Cellulose | 798.89 | 79.3 | 47.3 | 6.84 |
| DEAE-Cellulose | 392.12 | 130.1 | 23.2 | 11.22 |
| Sephdex G-150 | 49.22 | 237.7 | 2.9 | 20.49 |
<5-5> SDS-page 전기 영동
분리정제한 효소 시료는 12%의 세퍼레이팅 젤(seperating gel)과 5%의 스태킹 젤(stacking gel) 상에서 SDS-page 전기영동하였다. 전기영동시료는 분리정제효소를 5 × SDS 완충액[60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 베타-머캅토에탄올(β-mecaptoethanol), 0.1% 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)]에 용해시킨 후 100℃에서 7분간 물중탕하여 사용하였다. 이때, 물중탕하지 않은 시료도 함께 영동하여 전개율을 비교하였으며, 전기영동한 젤은 comassie brilliant blue 용액으로 염색한 후 탈색하여 밴드를 확인하였으며, 마커 단백질의 밴드와 비교하여 분자량을 확인하였다.
<5-6> SDS 피브린-자이모그래피(Fibrin zymography)에 의한 활성 밴드 확인
피브리노겐 농도가 0.12%(w/v) 되도록 12% 폴리아크릴아마이드 용액에 혼합하고 즉시 트롬빈(200 NIH/ml)을 첨가하여 피브린젤을 제조하여 전기영동을 수행하였다. 분리정제 시료는 베타-머캅토에탄올이 함유되지 않은 5 × SDS 완충액에 5% 농도로 용해하여 사용하였으며 전기 영동은 상온조건에서 90 ~ 180 V로 진행하였다. 전기영동 후 젤은 SDS에 의해 불활성화된 효소를 재활성화 시키기 위하여 2.5% Triton X-100을 함유한 Tris-HCl(pH 6.0)에서 30분간 진탕하여 SDS를 제거하였으며, 증류수로 여러회 세척하여 Triton X-100을 제거하였다. 그리고, 젤을 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2가 포함된 Tris-HCl(pH 6.0) 완충용액에서 15분간 2회 세척하d였고, 다시 Tris-HCl 용액에 넣어 37℃ 항온기에서 15시간 반응을 시켰다. 반응이 끝난 젤은 Comassie brilliant blue 용액으로 염색하고 탈색용액으로 피브린이 분해된 단백질 투명대가 잘 관찰되는 시점까지 탈색하여 효소활성을 지닌 밴드를 확인하여 SDS-page상의 단백질 밴드와 비교하여 분자량을 확인하였다. 그 결과, 도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이 효소의 분자량은 약 16,000 Da이었고, SDS-피브린 지모그래피 상에서 혈전을 분해시키는 효소활성이 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 효소학적 특성의 분석
<6-1> 효소 활성에 대한 pH의 영향
본 발명자들은 혈전분해효소반응의 최적 pH를 검토하기 위하여 정제된 혈전분해효소를 pH 3 ~ 11까지의 각 완충용액에 동량으로 가하여 37℃ 항온기에서 60분간 반응시킨 후 효소활성을 비교하였다. 이때, pH 조절 완충용액은 0.1 M 아세트산나트륨 완충용액(pH 3 ~ 5), 0.1 M 인산나트륨 완충용액(pH 6 ~ 8), 0.1 M 글라이신 완충용액(pH 9 ~ 11)을 사용하였다.
그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 pH 6 ~ 8인 중성 근처에서 효소 활성의 안정성이 가장 높았다(도 10).
<6-2> 효소 활성에 대한 온도의 영향
정제된 혈전분해 단백질의 열 안정성을 알아보기 위하여 20 ~ 80℃에서 10℃ 간격의 온도로 30분간 열처리한 후 피브린 아가로즈 플레이트법을 이용하여 혈전분해활성을 측정하여 비교하였다. 이때, 효소용액은 0.1M 인산나트륨 완충용액에 5% 농도로 용해하여 사용하였으며 온도처리하지 않은 것과 비교하여 상대활성으로 나타내었다.
그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 40℃까지는 효소활성에 변화가 없었으나 50℃부터는 효소활성이 감소하여 열에 비교적 약한 효소특성을 나타내었다(도 11).
<6-3> 효소 활성에 미치는 이온의 영향
CaCl2, CoCl2, ZnCl2, CuSO4, MgCl2, FeCl2, HgCl2, EDTA가 미치는 효소활성에의 영향을 검토하였다. 2 mM로 조제된 이온용액에 대하여 동량의 효소를 용해시키고, 인산나트륨 완충용액에 용해시킨 효소활성과 비교하였다.
그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이 Fe2+에 의해서는 10% 정도 활성이 증가되었고, 다른 이온들에 의해서는 10 ~ 50% 가량 활성이 감소되었다. 메탈로프로테아제(metalloprotease) 저해제인 EDTA에 의해서도 약 40% 가량 활성이 감소되어 메탈로프로테아제(metalloprotease)임을 알 수 있었다(도 12).
<6-4> 인공위액에서의 효소활성의 안정성 평가
인공위액은 CaCl2 396.28 mg/L, KCl 87.69 mg/L, NaCl 2.86 mg/L, 펩신(pepcin) 36.4 유닛(unit), HCl 1.78 ml/L로 조제한 후, 5% 농도로 정제효소를 용해시킨 후 30분 간격으로 효소활성을 피브린 플레이트 분석법으로 활성을 측정하여 상대활성으로 비교하였다.
그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이 인공위액에서의 효소 활성의 안정성을 조사하였다. 1시간 노출시 약 20%, 2시간 노출시 20%, 3시간 노출시 25%, 4시간 노출시 26% 정도의 활성 감소가 발생하여 비교적 인공위액에 잘 견디는 특성을 나타내었다(도 13).
<6-5> 시간에 따른 피브리노겐 및 피브린의 분해 패턴
피브리노겐 5 ㎍에 동량의 효소를 37℃ 조건에서 시간대(10분, 20분, 30분, 60분, 120분)별로 반응시킨 후 SDS page를 수행하여 피브리노겐의 분해 패턴을 관찰하였다. 이때, 동일한 방법으로 플라스민(plasmin)으로도 반응시켜 분해패턴을 비교하였다. 한편, 피브리노겐 5 ㎍에에 적당량의 트롬빈을 첨가하여 피블린을 형성시킨 후, 동량의 효소를 37℃ 조건에서 시간대(10분, 20분, 30분, 60분, 120분)별로 반응시킨 후 SDS page를 수행하여 피브린의 분해 패턴을 관찰하였다. 이때, 동일한 방법으로 플라스민으로도 반응시켜 분해패턴을 비교하였다.
그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 피브리노겐의 분해에 있어 α 사슬은 10분 안에 다 분해되었고, β 사슬은 90분에 다 분해되었으며, γ 사슬은 4시간까지 계속 분해되는 경향을 나타내었다. 플라스민의 경우에 α 사슬은 30분, β 사슬은 90분, γ 사슬은 4시간 정도의 분해 경향을 나타내는데 당 시료의 경우 α 사슬의 분해 패턴에서는 차이가 있었고, β 및 γ 사슬의 분해 경향은 유사한 패턴을 보여주었다(도 14). 또한, 도 15에서 보는 바와 같이 피브린의 분해에 있어 α와 γ―γ 사슬은 10분 안에 다 분해되었고, β 사슬은 120분에 다 분해되었다. 플라스민의 경우에 α 사슬은 10분, γ―γ 사슬은 90분 정도의 분해 시간이 필요한 경향을 나타내는데 당 시료의 경우 α 사슬의 분해 패턴에서는 유사한 경향을 보였고, β 및 γ―γ사슬의 분해 경향에서는 차이가 있었다(도 15).
<실시예 7> 시험관내(
In Vitro
) 효능 검토
<7-1> 피브린 분해 활성
본 발명자들은 혈전 용해능은 피브린 플레이트 분석법(Astrup et al, 1991)을 변형하여 측정하였다. 0.1 M 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)으로 피브리노겐의 농도가 1%가 되도록 완전 용해시킨 다음, 그 용액 5 mL에 2% 아가로즈 용액 5 mL 첨가하여 잘 혼합하고, 100 U/mL 트롬빈 용액 0.1 mL을 첨가하였다. 잘 혼합한 용액을 페트리디쉬에 부어 상온에서 30분간 방치하여 피브린 덩어리(fibrin clot)를 형성시켜 피브린 아가로즈 플레이트를 제조하였다. 피브린 플레이트에 구멍을 만들어 각각의 시료를 떨어뜨린 후, 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 다음, 형성된 투명환의 직경을 측정하였다. 이때, 대조구로서 플라스민의 농도별 활성별 용해면적과 비교하였다.
모든 분석 수치는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 수집된 결과는 SAS(Statistical Analysis System) Window v. 8.12 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 a = 0.05 수준에서 다양성 분석 및 던칸의 다중범위검정(Duncan's multiple range test)에 의해 분석하였다.
그 결과, 표 14 및 도 16에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소 1 mg이 100 플라스민 유닛에 가까운 활성을 보유하고 있음을 알 수 있었다(표 14 및 도 16).
| 플라스민 | 피브린 분해 활성(cm) | 조효소 | 피브린 분해 활성(cm) |
| 1 U | 0.53 ± 0.09 | 0.5 mg | 0.73 ± 0.07d |
| 10 U | 0.82 ± 0.07 | 1 mg | 1.23 ± 0.09c |
| 50 U | 0.91 ± 0.07 | 10 mg | 1.60 ± 0.12b |
| 100 U | 1.32 ± 0.23 | 25 mg | 2.13 ± 0.13a |
<7-2> 혈소판 응집 억제능
수컷 SD 랫트를 마취한 후 개복하여 심장에서 혈액을 채혈하였으며, 혈액의 응고를 방지하기 위해 3.8% 구연산나트륨(sodium citrate)를 처리하여 혈액과 3.8% 구연산나트륨의 비율이 9 : 1이 되도록 하였다. 혈액을 1,200 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취해 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 얻었다. PRP를 취한 후 튜브에 남아있는 펫릿(pellet)을 다시 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취해 혈소판 결핍 혈장(platelet-poor plasma; PPP)를 얻었다. 혈구 계산기(Hemocytometer)를 사용하여 PRP의 혈소판 수를 세어 혈소판의 수가 3 ×108 개/mL가 되게 PPP를 사용하여 PRP를 희석하였다. 응집측정기(Aggregometer)(Chronolog Co.)용 큐벳(cuvette)에 PRP와 시료를 첨가하여 37℃에서 2분간 배양한 후, 응집제(aggregating agent)인 20 umol/L ADP를 첨가하여 혈소판 응집를 유도하였고, 혈액 응고에 따른 빛의 전달(light transmission) 변화를 응집측정기를 사용하여 측정하였다. 이때, 혈액응고 억제능(%)는 하기의 [수학식 2]에 따라 계산하였다.
그 결과, 하기 표 15에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소 5 mg, 10 mg 및 25 mg을 각각 처리한 경우 ADP에 의해 유도된 혈소판 응집이 현저히 저해되었다. 이는 상기 조효소가 강한 혈소판 응집 억제 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다(표 15).
| 조효소 | 억제(%) |
| 5 mg | 26.9 ± 1.9b |
| 10 mg | 50.7 ± 5.6a |
| 25 mg | 75.9 ± 7.6a |
<7-3> ACE 저해능
0.1 M 인산칼륨 완충용액(pH 8.3)에 녹인 5 mM HHL(Hip-Hip-Leu) 200 ul과 조효소 용액 10 ul을 가하여 37℃, 5분간 방치하고, ACE 효소 용액(100 mU/mL) 20 ul을 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 다시 1 N HCl 250 ul, 아세트산에틸(ethyl acetate) 2 ml를 가하고 3000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액 1.8 ml를 취하여 120℃에서 30분간 완전히 건조시키고 증류수 0.5 ml를 가하여 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, ACE 저해율(%)은 하기의 [수학식 3]에 따라 계산하였다:
Ec = 시료대신 증류수 첨가시의 흡광도;
Ecb = 반응정지 후 증류수 첨가시의 흡광도;
Es = 시료 첨가 시의 흡광도; 및
Esb = 반응정지 후 시료 첨가시의 흡광도.
그 결과, 하기 표 16에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소의 농도 의존적으로 ACE 저해율(%)이 증가하였으며, 이는 조효소가 혈압조절능을 보유하고 있음을 알 수 있다(표 16).
| 조효소 (%) | 억제 (%) |
| 1 | 20 |
| 3 | 32.5 |
| 5 | 42.5 |
| 10 | 45 |
<실시예 8> 생체내(
In Vivo
) 효능 검토
<8-1> 실험동물 및 사육 환경
본 발명자들은 혈전용해능 측정, 폐색전 실험, 전뇌 허혈성 혼수 유발 실험, 전뇌 허혈성 치사 유발 실험을 위해, 특정병원체(specific pathogen free)가 없는 5주령의 수컷 ICR 마우스를 (주)코아텍(평택, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친뒤 체중감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ~ 10%, 환기회수 10 ~ 15 회/시간, 조명시간 12시간(08:00 ~ 20:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 실험동물은 마우스용 실험동물사료(수퍼피드주식회사, 원주, 한국)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
또한, 혈액 응집 억제능 측정을 위해, 특정병원체(specific pathogen free)가 없는 5주령의 수컷 SD 랫트를 (주)코아텍(평택, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ~ 10%, 환기회수 10 ~ 15 회/시간, 조명시간 12시간(08:00 ~ 20:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 실험동물은 실험쥐용 실험동물사료(수퍼피드주식회사, 원주, 한국)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
<8-2> 혈전용해능 측정
시료의 혈전용해 활성을 조사하기 위해, 5주령의 수컷 ICR 마우스에 조효소를 다양한 용량(0 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg. 1,000 mg/kg, 2,000 mg/kg)으로 3일 동안 경구투여 하였다. 마지막 날에 시료를 경구 투여하고 2시간 후 혈액을 채취하여 혈청을 취하였다. 위와 같은 방법으로 제조한 피브린 플레이트에 혈청 100 ul을 피브린 플레이트의 구멍에 떨어뜨린 후 37℃에서 18시간 반응시킨 다음, 형성된 투명환의 직경을 측정하였다.
모든 분석 수치는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 수집된 결과는 SAS(Statistical Analysis System) Window v. 8.12 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 a = 0.05 수준에서 다양성 분석 및 던칸의 다중범위검정(Duncan's multiple range test)에 의해 분석하였다.
그 결과, 표 17 및 도 17에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소을 경구 투여한 동물의 혈청을 처리한 경우 피브린이 분해되어 형성된 투명환의 직경이 증가하였다. 500 mg/kg으로 처리한 경우 통계적으로 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 1,000 mg/kg 또는 2,000 mg/kg을 처리한 군에서는 유의적으로 증가하였다. 즉, 본 발명의 조효소는 생체내에서도 혈전분해 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(표 17 및 도 17).
| 플라스민 | 피브린 분해활성(cm) | 조효소 | 피브린 분해활성(cm) |
| 1 U | 0.53 ± 0.09 | 0 mg/kg | 0.50 ± 0.01c |
| 10 U | 0.82 ± 0.07 | 500 mg/kg | 0.60 ± 0.06bc |
| 50 U | 0.91 ± 0.07 | 1,000 mg/kg | 0.70 ± 0.12b |
| 100 U | 1.32 ± 0.23 | 2,000 mg/kg | 0.87 ± 0.03a |
<8-3> 혈액응집 억제능(혈소판 응집 억제능) 측정
시료의 혈액응집 억제능을 측정하기 위해, ICR 마우스에 시료를 0 mg/kg, 500 mg/kg, 1,000 mg/kg 용량으로 3일 동안 경구투여한 후, 2시간 후 희생시켜 그 혈액을 취하여 혈소판 응집 억제능을 측정하였다. 경구투여가 끝난 수컷 SD 랫트를 마취한 후 개복하여 심장에서 혈액을 채혈하였으며, 혈액의 응고를 방지하기 위해 3.8% 구연산나트륨을 처리하여 혈액과 3.8% 구연산나트륨의 비율이 9 : 1이 되도록 하였다. 혈액을 1,200 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취해 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻었다. PRP를 취한 후 튜브에 남아있는 혈소판을 다시 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취해 혈소판 결핍 혈장(PPP)를 얻었다. 혈구 계산기를 사용하여 PRP의 혈소판 수를 세어 혈소판의 수가 3 × 108 개/mL가 되게 PPP를 사용하여 PRP를 희석하였다. 응집 측정기(Chronolog Co.)용 큐벳(cuvette)에 PRP와 시료를 첨가하여 37℃에서 2분간 배양한 후, 응집제인 20 umol/L ADP를 첨가하여 혈소판 응집를 유도하였고, 혈액 응고에 따른 빛의 이동 변화를 응집 측정기를 사용하여 측정하였다. 혈액응고 억제능(%)은 [(용액의 최고 혈소판 응집률 % - 시료 처리시의 최고 혈소판 응집률 %) / 용액의 최고 혈소판 응집률 %] × 100 으로 계산하였다.
그 결과, 하기 표 18에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소를 섭취하지 않은 군에 비해 조효소를 경구투여한 군에서 혈소판 응집이 억제되었다. 조효소을 500 mg/kg 섭취한 경우 섭취하지 않은 군에 비해 혈소판 응집이 7.4 ± 2.5% 억제되었고, 조효소를 1,000 mg/kg 섭취한 경우 혈소판 응집이 20.5 ± 4.5% 감소하였다. 즉, 본 발명의 조효소는 생체내에서 강한 혈소판 응집 억제 효과를 나타냄을 제시하고 있다(표 18).
| 조효소 | 억제(%) |
| 500 mg/kg | 7.4 ± 2.5b |
| 1,000 mg/kg | 20.5 ± 4.5a |
<8-4> 폐색전 실험
하룻밤 절식 시킨 6주령 수컷 ICR 마우스에 시료(500 mg/kg, 1,000 mg/kg)를 생리식염수에 녹여 경구투여 하였다. 시료를 경구투여하고 1시간 후 혈전유발주사액[콜라겐 56.4 ug/mL, 에페네프린 6.5 ug/mL, CaCl2 1 mM을 녹인 HBSS(Hank's balanced salt solution)] 0.2 mL를 꼬리 정맥에 주사하여 혈전을 유발하였다(Lee et al, 2000; Sohn et al, 2006). 대조군으로는 아스피린(150 mg/kg)을 경구투여 하였다. 주사 후 경련지속 및 뒷다리 마비시간을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 19에서 보는 바와 같이 용매만을 경구투여한 대조군의 경련지속시간은 19.8 ± 2.8분이었고, 양성 대조군인 아스피린 투여군의 경련지속시간은 15.4 ± 1.8분이었으며, 본 발명의 조효소를 500 mg/kg 1,000 mg/kg 투여한 경우 경련지속시간 17.2 ± 2.3분, 14.8 ± 2.6분으로 나타났다. 용매만을 투여한 대조군에 비해 본 발명의 조효소를 처리한 경우 경련지속시간이 감소하는 경향을 나타냈다(표 19).
| 투여량(mg/kg) | 경련지속시간(분) | |
| 대조군 | - | 19.8 ± 2.8 |
| 아스피린 | 150 | 15.4 ± 1.8 |
| 조효소 | 500 | 17.2 ± 2.3 |
| 1,000 | 14.8 ± 2.6 |
<8-5> 전뇌 허혈성 혼수 유발 실험
하룻밤 절식 시킨 6주령 수컷 ICR 마우스에 시료(500 mg/kg 및 1,000 mg/kg)를 생리식염수에 녹여 경구투여 하였다. 시료를 경구투여하고 1시간 후 비치사량인 1.87 mg/kg 농도로 KCN을 마우스의 꼬리정맥에 주사하였다(Lee et al, 2000; Sohn et al, 2006). 대조군으로는 아스피린(150 mg/kg)을 경구투여 하였다. 실험동물이 정향반사소실 후 회복하여 원활한 움직임을 보일 때까지의 시간을 측정하여 시료의 효과를 비교하였다.
그 결과, 하기 표 20에서 보는 바와 같이 용매만을 경구투여한 대조군에서는 183.0 ± 6.7초 후, 아스피린 투여군에서는 158.6 ± 5.1초 후 원활한 움직임을 나타내었다. 본 발명의 조효소를 500 mg/kg 및 1,000 mg/kg 용량으로 처리한 경우 각각 122.4 ± 8.8초 및 96.2 ± 10.4초 후 원활한 움직임을 나타내었다. 이는 본 발명의 조효소가 혈전에 의해 야기되는 뇌경색에 대한 보호 효과가 있음을 제시하고 있다(표 20).
| 투여량(mg/kg) | 활동 움직임(초) | |
| 대조군 | - | 183.0 ± 6.7a |
| 아스피린 | 150 | 158.6 ± 5.1a |
| 조효소 | 500 | 122.4 ± 8.8b |
| 1,000 | 96.2 ± 10.4b |
<8-6> 전뇌 허혈성 치사 유발 실험
전뇌 허혈성 혼수 유발 실험과 동일한 방법으로 시료를 실험동물에 경구 투여하였다. 시료를 경구투여하고 1시간 후 치사량인 3.0 mg/kg 농도로 KCN을 마우스의 꼬리정맥에 주사하였다(Lee et al, 2000; Sohn et al, 2006). 양성대조군으로는 아스피린(150 mg/kg)을 경구투여하였다. KCN 투여한 후 동물의 생존 시간과 10분 후 동물의 치사율을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 21에서 보는 바와 같이 KCN 주사 후 사망할 때까지의 생존시간은 용매만을 투여한 군에서는 50.4 ± 4.1초, 양성대조군인 아스피린 투여군에서 133.0 ± 9.4초이었다. 본 발명의 조효소를 500 mg/kg 및 1,000 mg/kg 용량으로 투여한 경우 생존시간이 용매만을 투여한 대조군에 비해 유의적으로 연장되었다. 이는 본 발명의 조효소가 혈전에 의해 야기되는 뇌경색에 대한 보호 효과가 있음을 제시하고 있다(표 21).
| 투여량(mg/kg) | 생존시간(초) | 치사율(%) | |
| 대조군 | - | 50.4 ± 4.1b | 100 |
| 아스피린 | 150 | 133.0 ± 9.4a | 100 |
| 조효소 | 500 | 49.6 ± 7.9b | 100 |
| 1,000 | 69.2 ± 6.2b | 100 |
<8-7> 면역증강 활성
생쥐에서 유래한 대식세포(macrophage)인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, WelGENE Inc, 대구 한국) 배지에 10% 우태혈청(FBS, Cambrex Bio Technology, Walkersville, MD, USA), 100 units/mL 페니실린과 100 ug/mL 스트렙토마이신(streptomycin)(Cambrex Bio Technology, Walkersville, MD, USA)을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 인큐베이터(5%CO2/96% air)에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 차면 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후 세포 스크랩퍼(cell scraper)로 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 배지를 사용하여 50,000 cells/well의 밀도로 24 웰-플레이트(well-plate)에 분주하였다. 48시간 배양한 후 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 50 또는 100 ug/mL)의 시료가 들어있는 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 상기 배지를 수거하여 원심 분리하여 상층액을 취하여 NO, IL-1a 및 TNF-a를 측정하였다. NO는 수거해 놓은 배지에 동일 부피의 그리스(Griess) 시약[2.5% H3PO4 내 1% 술파닐아미드(sulfanilamide)/0.1% N-1-나프틸-에틸렌디아민 디하이드로콜라이드(N-1-naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride)](Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 아질산나트륨의 표준곡선으로부터 NO의 대사물인 아질산염의 생성정도를 산출하였다(Ding et al, 1988). IL-1a 및 TNF-a은 Quantikine mouse IL-1a 면역분석과 Quantikine mouse TNF-a 면역분석(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
그 결과, 하기 표 22에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소 처리에 의해 NO 및 IL-1a 생성은 변화하지 않았으나, TNF-a 생성은 현저히 증가하였다. 이는 본 발명의 조효소가 혈전분해효소이지만 면역활성 효능도 보유하고 있음을 제시하고 있다(표 22).
| 조효소 | NO (umol/L) |
IL-1a (pg/mL) |
TNF-a (pg/mL) |
| 0 ug/mL | 7.13 ± 0.11 | 4.92 ± 0.29 | 611 ± 6d |
| 5 ug/mL | 7.02 ± 0.11 | 4.96 ± 0.27 | 886 ± 15c |
| 10 ug/mL | 7.16 ± 0.05 | 3.55 ± 0.72 | 974 ± 38c |
| 20 ug/mL | 7.19 ± 0.15 | 4.07 ± 0.43 | 1,106 ± 34b |
| 50 ug/mL | 7.28 ± 0.20 | 4.96 ± 0.61 | 1,204 ± 27b |
| 100 ug/mL | 7.05 ± 0.10 | 3.95 ± 0.51 | 1,471 ± 55a |
<실시예 9> 안전성(Safety) 시험
<9-1> 실험동물 및 사육 환경
특정병원체(specific pathogen free)가 없는 5주령의 ICR 마우스를 (주)코아텍(평택, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 1주일 간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10 ~ 15 회/시간, 조명시간 12시간(08:00 ~ 20:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 실험동물은 마우스용 실험동물사료(수퍼피드주식회사, 원주, 한국)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
<9-2> 시료 투여 및 시험군
식품의약품안전청의 독성시험기준에 의거 시험물질의 독성이 약하여 중독량을 구하기 어려운 경우 기술적으로 투여할 수 있는 한계량(1,000 ~ 2,000 mg/kg/day)과 시료의 용해도를 고려하여 1,000 mg/kg/day를 최고 용량으로 설정하였고, 500 mg/kg/day를 중간 용량군으로 설정하였다. 시료는 생리식염수(0.1 mL)에 용해하여 경구투여용 존데를 사용하여 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다. 대조군은 시료가 없는 생리식염수(0.1 mL)를 투여군과 같은 방법으로 경구투여하였다. 실험동물은 각 용량별로 암수 각각 8마리를 사용하였다.
<9-3> 사망률 및 임상증상 관찰
암수 ICR 마우스에 조효소분말 시료를 0 mg/kg, 500 mg/kg과 1,000 mg/kg으로 14일 동안 경구투여하였다. 시료를 투여 후 1시간부터 6시간까지 생존여부와 병적 이상 증후를 관찰하였다. 또한, 투여 다음날부터 14일까지 매일 일정한 시간에 매일 1회 실험동물의 생존여부 및 병적 이상 증후를 관찰하였다.
그 결과, 하기 표 23에서 보는 바와 같이 시험 전 기간 동안 사망 동물은 관찰되지 않았다. 또한, 임상 증상을 관찰한 결과, 하기 표 24에서 보는 바와 같이 경구투여한 군에서 시료 투여에 의한 이상 증상이 나타나지 않았다. 이를 통해 ICR 마우스에서 투여할 수 있는 최대 농도인 1,000 mg/kg 농도 범위에서는 독성을 나타내지 않음을 알 수 있으며, 최소치사량(minimal lethal dose)는 암수 모두 1,000 mg/kg 이상이므로 안전성에 문제가 없는 것으로 판단하였다.
| 투여량 (mg/kg) |
동물수 | 투여 후 시간(일) | 치사율(%) | 대략치사투여량 | |||||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |||||
| 수컷 | 0 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 0 | > 1,000 |
| 500 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 0 | ||
| 1000 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 0 | ||
| 암컷 | 0 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 0 | > 1,000 |
| 500 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 0 | ||
| 1000 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 0 | ||
| 성별 | 투여량(mg/kg) | 동물수 | 임상증상 | 투여 후 시간(h) | 투여 후 시간(일) | ||||||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | ||||
| 수컷 | 0 | 8 | NAD1) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 500 | 8 | NAD | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
| 1000 | 8 | NAD | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
| 암컷 | 0 | 8 | NAD | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 500 | 8 | NAD | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
| 1000 | 8 | NAD | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
1) NAD: 비정상이 관찰되지 않음.
<9-4> 체중 측정
조효소분말 시료가 동물의 체중 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 시험 전 기간 동안 동물의 체중을 매일 측정하였다.
그 결과, 하기 표 25에서 보는 바와 같이 시험전 기간 동안 암수 모든 동물의 체중은 정상적으로 증가하였으나 수컷 동물에 비해 암컷 동물의 체중 증가가 적었다. 또한, 조효소의 500 mg/kg 및 1,000 mg/kg 투여군의 체중 변화는 대조군인 0 mg/kg 투여군과 유의적인 차이가 없었다. 이는 경구투여 시료가 동물의 체중 변화에 영향을 미치지 않음을 제시하고 있다(표 25).
| 성별 | 투여량(mg/kg) | 처리 후 시간(일) | ||||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | ||
| 수컷 | 0 | 23.8 ±0.6 |
23.6 ±0.3 |
25.4 ±0.8 |
27.2 ±0.7 |
27.9 ±0.6 |
28.5 ±0.7 |
28.6 ±0.6 |
29.3 ±0.7 |
29.5 ±0.7 |
30.3 ±0.8 |
30.3 ±0.8 |
31.1 ±0.8 |
31.2 ±0.7 |
31.5 ±0.7 |
32.5 ±0.7 |
| 500 | 26.0 ±0.4 |
24.9 ±0.3 |
27.7 ±0.7 |
29.0 ±0.8 |
29.7 ±0.7 |
30.3 ±0.8 |
31.3 ±1.3 |
30.8 ±0.7 |
31.4 ±0.7 |
32.0 ±0.7 |
32.3 ±0.7 |
32.9 ±0.7 |
32.8 ±0.8 |
32.9 ±0.8 |
33.7 ±0.9 |
|
| 1000 | 25.0 ±0.6 |
24.7 ±0.7 |
26.9 ±0.5 |
28.2 ±0.5 |
29.0 ±0.6 | 29.3 ±0.5 |
29.4 ±0.5 |
29.6 ±0.5 |
30.1 ±0.5 |
30.7 ±0.5 |
30.9 ±0.5 |
31.2 ±0.5 |
31.6 ±0.5 |
32.0 ±0.6 |
32.4 ±0.6 |
|
| 암컷 | 0 | 23.0 ±0.2 |
23.6 ±0.3 |
23.3 ±0.5 |
23.5 ±0.6 |
23.9 ±0.5 |
23.4 ±0.4 |
23.3 ±0.4 |
23.3 ±0.4 |
23.6 ±0.4 |
24.2 ±0.5 |
23.8 ±0.5 |
23.8 ±0.5 |
24.0 ±0.4 |
24.5 ±0.5 |
24.2 ±0.5 |
| 500 | 22.8 ±0.3 |
22.9 ±0.3 |
23.3 ±0.4 |
23.9 ±0.4 |
23.6 ±0.3 |
23.6 ±0.2 |
23.3 ±0.3 |
24.0 ±0.3 |
24.1 ±0.3 |
24.3 ±0.2 |
24.3 ±0.3 |
24.4 ±0.3 |
24.3 ±0.3 |
24.9 ±0.3 |
24.2 ±0.2 |
|
| 1000 | 22.5 ±0.3 |
21.7 ±0.7 |
21.6 ±1.1 |
22.7 ±0.4 |
23.1 ±0.6 |
23.6 ±0.4 |
23.2 ±0.4 |
23.4 ±0.4 |
23.3 ±0.3 |
23.8 ±0.4 |
23.6 ±0.4 |
23.9 ±0.4 |
24.1 ±0.4 |
24.3 ±0.4 |
23.7 ±0.4 |
|
<9-5> 부검소견의 관찰
조효소분말을 14일간 투여 후 부검하여 모든 장기의 이상 여부를 조사하였다. 14일간의 투여 및 관찰기간이 종료된 후 모든 실험동물에 마취제를 근육 주사하여 마취 시켜 해부한 후 육안으로 각종 장기의 이상 유무를 확인하고, 장기를 띠어내어 무게를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 26에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소 투여군의 모든 개체의 장기에서 유의성 있는 변화와 특이할만한 부검 소견은 관찰되지 않았다. 또한, 하기 표 27에서 보는 바와 같이 경구투여에 의해 간, 신장 및 비장의 무게는 유의적인 차이를 나타내지 않았다(표 26 및 표 27).
| 성별 | 투여량(mg/kg) | 간 | 오른쪽 신장 | 왼쪽 신장 | 비장 | ||
| 수컷 | 0 | 비검출 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
| 비특이점 | 8 | 8 | 8 | 8 | |||
| 특이점 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 500 | 비검출 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
| 비특이점 | 8 | 8 | 8 | 8 | |||
| 특이점 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1000 | 비검출 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
| 비특이점 | 8 | 8 | 8 | 8 | |||
| 특이점 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 암컷 |
0 | 비검출 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
| 비특이점 | 8 | 8 | 8 | 8 | |||
| 특이점 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 500 | 비검출 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
| 비특이점 | 8 | 8 | 8 | 8 | |||
| 특이점 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1000 | 비검출 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
| 비특이점 | 8 | 8 | 8 | 8 | |||
| 특이점 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 성별 | 투여량(mg/kg) | Organ (g) | |||
| 간 | 오른쪽 신장 | 왼쪽 신장 | 비장 | ||
| 수컷 | 0 | 2.12 ± 0.06 | 0.27 ± 0.01 | 0.28 ± 0.01 | 0.12 ± 0.01 |
| 500 | 2.22 ± 0.06 | 0.27 ± 0.01 | 0.27 ± 0.01 | 0.13 ± 0.01 | |
| 1000 | 2.14 ± 0.05 | 0.27 ± 0.01 | 0.28 ± 0.01 | 0.11 ± 0.01 | |
| 암컷 | 0 | 1.35 ± 0.04 | 0.17 ± 0.01 | 0.18 ± 0.01 | 0.09 ± 0.01 |
| 500 | 1.31 ± 0.02 | 0.17 ± 0.01 | 0.18 ± 0.01 | 0.10 ± 0.01 | |
| 1000 | 1.41 ± 0.04 | 0.20 ± 0.01 | 0.21 ± 0.01 | 0.12 ± 0.01 | |
<9-6> 혈액의 생화학적 검사
부검 전에 안와 채혈을 통해 혈액을 취한 후 모세관채혈튜브(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 혈청을 분리하였다. 혈청의 크레아티닌(creatinine), GOT(glutamate oxaloacetate transaminase), GPT(glutamine pyruvate transaminase)는 혈액생화학 분석기(Themo Fisher Scientific, Waltham, Finland)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 28에서 보는 바와 같이 본 발명의 조효소 투여군에서 혈청 크레아틴의 변화는 나타나지 않았다. 한편, 간손상 수치에 있어서는 수컷 동물에서 조효소를 투여한 경우 투여하지 않은 대조군에 비해 GOT가 유의적으로 감소하였으나 투여 용량에 따른 감소의 차이는 나타나지 않았다. 암컷 동물에서도 조효소 투여에 의해 혈청 GOT가 감소하는 경향을 나타냈으나 투여용량에 따라 의존적이지는 않았다. 혈청 GPT는 암수 동물 모두에서 투여에 따른 감소경향이 있었으나 투여용량에 의존적이지는 않았다(표 28). 이상에서 당 조효소의 경구투여에 의해 간손상이 발생하지 않으며 오히려 간독성을 해소시키는 경향이 있음을 알 수 있다.
| 성별 | 투여량(mg/kg) | Creatinine(mg/dl) | GOT(U/L) | GTP(U/L) |
| 수컷 | 0 | 0.36 ± 0.01 | 123.23 ± 10.78a1) | 55.37 ± 7.60 |
| 500 | 0.35 ± 0.01 | 64.98 ± 6.63b | 41.65 ± 6.63 | |
| 1,000 | 0.35 ± 0.01 | 64.67 ± 7.31b | 44.84 ± 5.90 | |
| 암컷 | 0 | 0.38 ± 0.02 | 85.20 ± 11.17 | 39.52 ± 5.33 |
| 500 | 0.38 ± 0.01 | 78.09 ± 8.11 | 28.23 ± 2.18 | |
| 1,000 | 0.39 ± 0.01 | 78.05 ± 9.18 | 33.12 ± 3.55 |
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1> : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
목이버섯 유래의 혈전분해효소 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
목이버섯 유래의 혈전분해효소 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
목이버섯 유래의 혈전분해효소 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 환의 제조
목이버섯 유래의 혈전분해효소 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
5. 과립의 제조
목이버섯 유래의 혈전분해효소 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<제조예 2> : 식품의 제조
1. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소를 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
2. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소를 0.1 ~ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
3. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소를 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소를 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
5. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소를 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 동결건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 목이버섯 유래의 혈전분해효소의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
목이버섯 유래의 혈전분해효소(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<제조예 3> : 음료의 제조
1. 건강음료의 제조
액상과당(0.5 %), 올리고당(2 %), 설탕(2 %), 식염(0.5 %), 물(75 %)과 같은 부재료와 본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
2. 야채쥬스의 제조
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
3. 과일쥬스의 제조
본 발명의 목이버섯 유래의 혈전분해효소 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
본 발명의 신규 혈전분해효소 및 이를 고농도로 생산하는 방법을 이용하여 경구용 일반의약품 제품이나 주사제 등의 혈전용해제 또는 항혈전제 개발이 가능하고, 기능성 원료 또는 가공식품 등의 혈행개선용 건강식품 개발이 가능하다.
도 1은 목이버섯 균사체를 평판배양하여 단백분효효소 활성이 있는지 확인한 실험결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 목이버섯 균사체의 배양여액 농축물을 액체배양하여 혈전분해효소 활성이 있는지 확인한 실험결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 목이버섯 균사체의 통기 배양하면서 균사체량, 단백분해활성 및 혈전분해 활성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 목이버섯 균사체 배양물로부터 분리한 조효소를 산제 및 과립제로 제형화한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 목이버섯 균사체 배양물로부터 분리한 조효소를 양이온 교환크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 상기 양이온 교환크로마토그래피로 분리한 활성 분획물을 음이온 교환크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 상기 음이온 교환크로마토그래피로 분리한 활성 분획물을 겔 여과 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 상기 분리정제된 혈전분해효소를 SDS-페이지(page) 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 상기 분리정제된 혈전분해효소의 SDS-피브린 자이모그래피(Fibrin zymography) 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 분리정제된 혈전분해효소의 pH에 따른 단백질분해활성 변화를 나타 낸 그래프이다.
도 11은 분리정제된 혈전분해효소의 온도에 따른 단백질분해활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 분리정제된 혈전분해효소의 금속이온 및 EDTA에 따른 단백질분해활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인공위액에서 효소활성의 안정성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 분리정제된 혈전분해효소의 시간에 따른 피브리노겐(fibrinogen)의 분해 패턴을 나타낸 그림이다.
도 15는 분리정제된 혈전분해효소의 시간에 따른 피브린(fibrin)의 분해 패턴을 나타낸 그림이다.
도 16은 시험관내에서 분리정제된 혈전분해효소의 피브린 플레이트에서 피브린분해활성을 나타낸 그림이다:
A1: 플라스민 1 U, A2: 플라스민 10 U, A3: 플라스민 50 U, A4: 플라스민 100 U; 및
B1: 조효소 0 mg/kg, B2: 조효소 500 mg/kg, B3: 조효소 1,000 mg/kg, B4: 조효소 2,000 mg/kg.
도 17은 마우스에 분리정제된 혈전분해효소를 경구투여한 후 얻은 혈청에서의 피브린분해활성을 나타낸 그림이다:
A1: 플라스민 1 U, A2: 플라스민 10 U, A3: 플라스민 50 U, A4: 플라스민 100 U; 및
B1: 조효소 0 mg/kg, B2: 조효소 500 mg/kg, B3: 조효소 1,000 mg/kg, B4: 조효소 2,000 mg/kg.
Claims (12)
- 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체로부터 분리되고, 분자량이 15 ~ 17 KDa이며, 최적 활성 pH가 6.0 ~ 8.0이며, 최적 활성 온도가 20 ~ 40℃이며, Fe2+에 의해 활성이 증가하고 Ca2+, Co2+, Zn2+, Cu2+, Mg2+, Hg2+ 및 EDTA에 의해 활성이 감소하며, 피브린 및 피브리노겐 분해 활성을 가진 것을 특징으로 하는, 목이버섯 유래의 혈전분해효소.
- 제 1항에 있어서, 상기 혈전분해효소는 피브리노겐의 분해에 있어서 α 사슬은 10분 이내에 분해하고, β 사슬은 90분 이내 분해하며, γ 사슬은 4시간까지 계속 분해하며, 피브린의 분해에 있어서 α와 γ―γ 사슬은 10분 이내에 분해하고, β 사슬은 120분 이내에 분해하는 것을 특징으로 하는 혈전분해효소.
- 탄소원 0.1 ~ 10 중량부; 효모추출물, 카제인펩톤 및 대두펩톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 5 중량부; 분리대두단백(ISP) 또는 탈지유 0.01 ~ 1 중량부; 및 MgSO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1 중량부를 포함하는 것을 특 징으로 하는, 제 1항의 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 액체 배지.
- 제 3항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코즈인 것을 특징으로 하는, 제 1항의 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 액체 배지.
- 1) 목이버섯 균사체를 제 3항의 액체 배지에서 온도 22 ~ 26℃ 및 pH 6.0 ~ 8.0인 조건에서 배양하는 단계;2) 배양된 배양물을 감압여과로 균체를 제거한 후 여액을 배제분자량 20 ~ 200 KDa의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 배제분자량 1 ~ 15 KDa의 막으로 농축하는 한외여과에 의한 활성 분획 농축액을 제조하는 단계; 및3) 상기 활성 분획 농축액을 동결건조하는 단계를 포함하는, 목이버섯 유래의 혈전분해 조효소 조성물 생산방법.
- 현미 또는 백미 70.0 ~ 99.09 중량부; 분리대두단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두 및 대두분으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.01 ~ 30 중량부; 및 MgSO4H2O, K2HPO4 및 KH2PO4로 구성된 군으로부터 선택되는 어 느 하나 이상의 무기염 0.01 ~ 1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1항의 혈전분해효소 생산용 목이버섯 균사체의 고체 배지.
- 1) 목이버섯 균사체를 제 6항의 고체 배지에 온도 22 ~ 26℃ 및 상대습도60 ~ 80%인 조건에서 배양하는 단계;2) 배양된 배양물을 무균수에 침지시킨 후, 균질화시킨 다음 고형분을 제거하여 수추출물을 제조하는 단계;3) 수추출물을 배제분자량 20 ~ 200 KDa의 막으로 투과액을 얻은 후 다시 1 ~ 15 KDa의 막으로 농축하는 한외여과에 의한 활성 분획 농축액을 제조하는 단계; 및4) 상기 활성 분획 농축액을 동결건조하는 단계를 포함하는, 목이버섯 유래의 혈전분해 조효소 조성물 생산방법.
- 1) 제 5항 또는 제7항의 방법에 의해 제조되는 혈전분해 조효소 조성물을 염석한 후 투석하여 1차 부분 정제물을 제조하는 단계;2) 상기 단계 1)의 1차 부분 정제물을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 활성 분획물을 수득하는 단계;3) 상기 단계 2)의 활성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 활성 분획물을 수득하는 단계; 및4) 상기 단계 3)의 활성 분획물을 젤 필트레이션으로 정제한 후 동결건조 및 농축하는 단계를 포함하는, 제 1항의 목이버섯 유래의 혈전분해효소 생산방법.
- 제 1항의 목이버섯 유래의 혈전분해효소, 또는 제 5항 또는 제7항의 방법에 의해 제조된 혈전분해 조효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈전용해용 조성물.
- 약학적으로 유효한 양의 제 9항의 조성물을 혈전증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전증 치료방법.
- 약학적으로 유효한 양의 제 9항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈전증 예방방법.
- 제 1항의 목이버섯 유래의 혈전분해효소, 제 5항 또는 제7항의 방법에 의해 제조된 혈전분해 조효소 조성물, 또는 목이버섯 균사체 배양 여액을 유효성분으로 함유하는 혈행개선용 건강식품.
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Legal Events
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| B601 | Maintenance of original decision after re-examination before a trial | ||
| J121 | Written withdrawal of request for trial | ||
| WITB | Written withdrawal of application |