KR101149819B1

KR101149819B1 - 스포로락토바실러스 비니에 ｓｌ１５３을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 생육 저해 활성을 갖는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101149819B1
Application number: KR1020090046468A
Authority: KR
Inventors: 장영효; 정민영; 박인순
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2012-05-25
Also published as: KR20100128041A

Abstract

본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주(기탁번호: KCTC 11493BP)를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것으로, 구체적으로 비브리오속 병원성 세포주 및 여러 병원성 미생물에 대한 항균 능력을 가지는 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다. 본 발명의 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주는 장내 세포의 흡착 능력이 우수할 뿐 아니라 비브리오속 미생물을 포함하는 병원성 미생물에 대한 성장 억제 활성 효과를 가지므로 병원성 미생물에 의해 발생하는 질환의 치료 및 예방용 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

스포로락토바실러스 비니에 SL153, 유산균, 비브리오, 항균력, 장내 정착성, 프로바이오틱스

Description

스포로락토바실러스 비니에 ＳＬ１５３을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 생육 저해 활성을 갖는 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions containing Sporolactobacillus vineae SL153 as an active ingredient with the ability of growth suppression of pathogenic microorganisms}

본 발명은 스포로락토바실러스 세포주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다.

스포로락토바실러스(Sporolactobacillus)속의 미생물은 1963년에 키타하라(Kitahara) 및 스즈키(Suzuki)에 의해 처음 발견된 후, 카탈라아제(catalase) 음성이고, 젖산(Lactic acid) 및 내생포자를 형성하는 특징으로 락토바실라시에(Lactobacillaceae)과로 분류 되었지만 락토바실라사에과와 달리 내생포자를 생성하는 유산균으로 최근에 스포로락토바실라시에(Sporolactobacillaceae)과로 새로이 나뉘어졌다(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Garrity & Holt, 2001). 현재까지 보고된 스포로락토바실러스속 6종의 세포주 중, 스포로락토 이눌리너스(S. inulinus) 는 닭 사료에서, 스포로락토 코퓨엔시스(S. kofuensis), 스포 로락토 락토서스(S. lactosus), 스포로락토 래보락티쿠스(S. laevolacticus), 스포로락토나카야마에(S. nakayamae) 및 스포로락토 테라에(S. terrae)는 일본과 동남아시아의 나무 뿌리 근처의 토양에서 분리되어 스포로락토바실러스 미생물들이 매우 한정되어진 장소에서만 분리되어졌음을 보여주었다. Holzapfel 및 Botha(Holzapfel, W. H. & Botha, S. J. Int J Food Microbiol 7, 161-168. 1988)와 Huang 등(Huang, et al , Curr Microbiol 54, 396-404, 2007)은 이러한 특징을 가진 스포로락토바실러스 세포주가 바실러스 종(Bacillus species)과 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 등의 병원균에 대한 항균력을 지니는 있다고 보고하여 앞으로 프로바이오틱스(probiotic)로서의 유용성을 제시하였다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 항생제에 상대적인 개념의 용어로서, 숙주인 인체나 가축에 투여되어 여러가지 우호적 생리활성 효과를 나타내는 미생물 및 대사물질을 함유하는 제제를 통칭하는 용어로 사용된다(Berg, R. D. Trends in Microbiol. 6: 89-92, 1998). 주요한 특징으로서 장내 세균총 개선, 항생물질 생산, 질병에 대한 저항력 증대, 유해세균의 억제, 부패 독성물질의 생성억제, 비타민 합성 및 면역체계 강화 등이 보고되어 있다. 축산분야에서 프로바이오틱스는 주로 양돈을 비롯한 가축의 생산성 향상과 육질개선 등의 전통적인 목적에 이용되어 왔으며, 최근엔 농장 내 악취제거나 분뇨 처리 등 환경개선 목적으로 사용되는 등 그 활용 추세에 변화를 보이고 있다(Chang et al., Antonie Van Leeuwenhoek 80:193-199, 2001). 더불어 최근에는 프로바이오틱스의 생리활성 효능을 인체의 질병치료에 적용하는 연구들이 시도되고 있는데, 주로 과민성 장증후군(irritable bowel syndrome, IBS)과 염증성장질환(inflammatory bowel disease, IBD)의 치료 및 증상 개선효과에 대한 연구들이다. 또한 정상적인 장내세균총의 균형이 파괴되는 경우 장내 유해세균이 이상 증식하고, 이로 인한 질병발생의 연관성에 주목한 학계는 프로바이오틱스의 적용에 관심을 갖기 시작하였다 (O’Sullivan, M. A and O’Morain, C. A. Dig Liver Dis . 32: 294-301, 2000). 아직까지는 프로바이오틱스의 임상적 유효성에 대해서는 논란이 있으나, 감염성 및 항생제 관련 설사증 개선, 항염증 효과, 장벽 및 근신경계 기능개선, 비정상적인 발효 억제 작용 및 장신경 전달 조절 등의 기능은 주로 정상 장내세균총 개선과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다(Saggioro, A.. J Clin Gastroenterol. 38, S104-106, 2004). 이러한 프로바이오틱스로 이용되기 위한 미생물의 조건으로서 생체에 대한 안전성, 제조 및 유통과정의 안정성 및 보존성, 장관내 소화효소, 위산 및 담즙산에 대한 내성, 유해세균 항균력 등이 요구된다(Kim el al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 74, 1103-1111, 2007). 그러나 스포로락토바실러스 세포주에 대한 국내 연구는 거의 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들이 토양에서 분리한 스포로락토바실러스 비니에 SL153(S. vineae SL153) 세포주(기탁번호: KCTC 11493BP)가 비브리오속 세포주 및 여러 병원성 미생물의 생육억제 효과를 가져서 프로바이오틱스로서의 이용가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주(기탁번호: KCTC 11493BP), 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 건강 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스포로락토 바실러스 비니에 SL153 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주(기탁번호: KCTC 11493BP), 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스를 제공한다.

또한, 본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 건강 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 사료 첨가제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 스포로락토 바실러스 비니에 SL153 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주(기탁번호: KCTC 11493BP)는 담즙산에 내성을 가지며, 장내 세포의 흡착 능력이 우수할 뿐 아니라 비브리오속 미생물을 포함하는 병원성 미생물에 대한 성장 억제 활성 효과를 가지므로 프로바이오틱스로서 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주(기탁번호: KCTC 11493BP), 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스를 제공한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명자들은 카탈라아제(catalase) 음성, 젖산(Lactic acid)생성 및 내생포자를 형성하는 특징을 가지는 유산균을 분리하고 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주로 명명하였다(도 1 참조). 상기 세포주는 내담즙성을 가지고(표 3 참조), 비브리오(Vibrio), 에어로모나스(Aeromonas), 리스토넬라(Listonella) 속 병원성 미생물의 성장을 효과적으로 억제하며(표 4 참조), 장내 정착력이 우수하여(도 2 참조) 프로바이오틱스로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등 액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이며, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 조성물은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 알지놀리티쿠 스 (Vibrio alginolyticus), 비브리오 플루비알리스 (Vibrio fluvialis), 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 에어로모나스 비발비움 (Aeromonas bivalvium) 및 리스토넬라 안귈라룸 (Listonella anguillarum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 미생물의 생육 저해 활성을 가진다.

상기 건강 식품은 본 발명의 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 건강식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있고, 건강식품의 종류는 버터, 요구르트, 치즈를 포함한 유제품, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 유산균 제제, 발효유, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 바람직하게는 유산균 제제 및 발효유이며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강식품은 통상의 건강식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 건강 식품은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 에어로모나스 비발비움(Aeromonas bivalvium) 및 리스토넬라 안귈라룸(Listonella anguillarum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 미생물의 생육 저해 활성을 가진다.

또한, 본 발명은 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등 액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료조성물은 본 발명의 프로바이오틱스 이외에도, 당해 기술분야에 공지된 일반적인 사료 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 사료 조성물은 곡물 가루, 당질, 비타민, 아미노산, 단백질, 지질, 광물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 곡물 및 곡물 부산물이 사용될 수 있는데, 예컨대 평지씨, 면실, 대두, 밀기울，미강，탈지강，맥강，옥수수겨，맥아근，대두피,감자 전분，고구마 전분，옥수수 전분，커피박，잠사，잠분，해조분，타피오카，대두박，면실박，임자박，채종박，아마박，호마박，옥수수글루텐，밀글루텐，낙화생박，야자박，해바라기씨박，주정박，옥수수배아박，고추씨박，장유박，맥주박 중에서 하나 또는 2종 이상이 혼합될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 수용성 및 수불용성 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드와 같은 당 및 복합 탄수화물을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 당질로서 보다 상세하게는, 포도당, 만노오스, 프룩토오스, 백당, 맥아당, 셀로비오스, 젖당, 트레할로오스, 멜리비오스, 라피노오스, 에스크린, 살리신, 아미그달린, 만니톨, 솔비톨, 소르보스, 멘티토오스 등을 들 수 있으며, 당밀, 자당뿐만 아니라 올리고당도 병용하여 이용할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 임의의 아미노산 성분에는 아르기닌, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 티로신, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산나트륨, 글리신, 프롤린, 세 린, 시스테인, 및 이들의 동족체, 및 이들의 염이 있다.

본 발명의 사료 조성물에 임의로 첨가할 수 있는 비타민에는 티아민? HCl, 리보플라빈, 피리독신?HCl, 니아신, 니아신아미드, 이노시톨, 염화콜린, 판토텐산칼슘, 바이오틴, 폴산, 아스코르브산, 및 비타민 A, B, K, D, E 등이 있다. 이 중, 특히 비타민 A, 비타민 B군 및 비타민 E는 항산화 물질로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 지방산은, 예를 들어, 대두유, 평지씨유, 옥수수유, 홍화유, 해바라기유, 라이스유, 비프스테이크 식물유, 달맞이꽃유, 유리지치유, 아마인유 등의 식물유, 및 가다랭이, 고등어, 정어리 등의 어유 및 각종 미생물 유래의 트리글리세라이드 등의 유지를 가수 분해 처리함으로써 수 득할 수 있다. 그리고, 상기에서 얻어지는 지방산의 금속염으로서 지방산의 칼슘염 및 마그네슘염 또한 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 사장석, 벤토나이트, 맥반석 등 공지의 바이오세라믹 물질이 소량 첨가되어 항균 기능 등을 배가시킬 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 약제 성분을 첨가할 수 있고, 특히 항생제, 생균제, 감미제, 제산제, 지사제 등의 인공적 화학약품을 포함시켜도 본 발명의 범주 안에 든다. 이외에도, 본 발명의 사료 조성물은 칼슘원으로서 패각류를, 철, 망간, 구리, 아연, 몰리브덴의 미네랄원으로서 게 껍질, 소라 껍질 등을 소량 첨가할 수도 있다.

상기 사료 첨가제는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리 오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 에어로모나스 비발비움(Aeromonas bivalvium) 및 리스토넬라 앵귈라룸(Listonella anguillarum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 미생물의 생육 저해 활성을 가진다.

상기 병원성 미생물에 의해 발생되는 질환은 급성 설사, 장염, 위장관염, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 방법에서 추가로 상기 프로바이오틱스를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프로바이오틱스 회수는 원심분리, 마이크로 필터를 이용한 농축 회수법 또는 흡착제를 이용하여 회수 방법으로 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포주의 분리 및 동정

본 발명자들은 젖산 생성하는 세포주를 분리하기 위하여 대전 인근 포도밭에 서 채취한 토양을 희석하여 1%의 CaCO₃를 포함한 유산균 선별 배지인 GYP(glucose-yeast extract-pepton) 배지에서 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 상기 배지에 산을 생성하여 투명환(clear zone)을 나타내는 집락(colony)을 선별 분리하였다. 상기 선별된 집락을 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리 하였다. 순수 배양된 미생물은 20% 글리세롤이 첨가된 배양배지에 담아 영하 80℃에서 보존하였다.

상기 분리된 세포주의 16S rRNA 유전자를 대상으로 분자계통분류학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 배양한 균체를 모아 100 ㎕ STES 버퍼[0.4 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl(pH 7.6), 0.01 M EDTA, 1% SDS]에 현탁하고, 글래스 비드를 첨가하여 5분간 마이크로튜브 믹서 MT-360(TOMY, 미국)로 파쇄함으로써 세포질을 용출시켰다. 상기 용출액을 페놀-에탄올 PPT를 통하여 DNA를 정제한 다음 건조(vacuum dryer, SpeedVac, Eppendorf, 독일)시킨 후 멸균 증류수에 녹여 PCR을 수행시 주형으로 사용하였다. PCR은 27F(서열번호 1, 5'- GAG TTT GAT CCT GGC TCA G -3') 및 1492R(서열번호 2, 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3')의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였으며, PCR 조건은 DNA 변성을 위해 94℃에서 1분, 프라이머의 결합을 위해 50℃에서 1분, DNA 가닥의 합성을 위해 72℃에서 1분 50초 과정을 30회 반복하였다. 증폭된 DNA의 염기서열결정 및 계통분류학적 분석은 공지의 방법(Chang et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 377-381, 2002)에 따라 실시하였다.

상기 선별된 세포주의 형태적인 특징은 그람양성이며 간균인 것을 확인하였고, 상기 선별된 세포주의 16S rRNA 유전자 염기서열결정(서열번호 3)을 분석한 결과, 스포로락토바실러스 이눌리너스(Sporolactobacillus inulinus)와 95.7 %, 스포로락토바실러스 테라에(S. terrae)와는 95.5%의 상동성을 가지는 신규한 스포로락토바실러스로 동정되어 스포로락토바실러스 비니에(S. vineae)로 명명하였다. 상기 스포로락토바실러스 비니에 세포주의 분자계통분류학적 위치를 나타내는 계통 발생적 분지도(phylogenetic tree)를 도 1에 나타내었다. 상기 세포주를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2009년 03월 30일 자로 “스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153)”으로 기탁하였다(KCTC 11493BP).

< 실시예 2> 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주의 생리, 생화학적 특성 조사

실시예 1에서 분리한 세포주의 생화학적 특성 분석을 위하여 API 50CH system(BioMrieux, Marcy I'Etolite, 프랑스)을 이용하여 37℃에서 24 및 48 시간 동안 배양한 후 세포주의 당 발효패턴을 분석하였다(표 1). GYP 브로스 배지를 이용하여 상기 세포주의 적정 배양온도, pH 및 내염성 실험을 실시하였다. 또한 모든 실험은 16S rRNA 유전자 분석결과, 95.7%의 상동성을 보인 스포로락토바실러스 이눌리너스와 함께 실험하여 생리 및 생화학적 차이점을 비교하였다(표 1).

[표 1]

특성		비니에	이눌리너스
카탈라아제(Catalase)		-	-
옥시다아제(Oxidase)		-	-
성장 온도 범위(℃)		25-40	25-40
최적 온도 (℃)		37	37
7% NaCl에서 성장		+	약함
pH 범위		6.0-7.0	6.0-7.0
산 생성:	글루코오스(Glucose)	+	+
	프룩토오스(Fructose)	+	+
	만노오스(Mannose)	+	+
	갈락토오스(Galactose)	-	-
	소르보오스(Sorbose)	+	-
	만니톨(Mannitol)	+	+
	소르비톨(Sorbitol)	+	+
	α-메틸-D-글루코사이드(α-Methyl-D-glucoside)	+	+
	N-아세틸-글루코사마인(N-acethyl-glucosamine)	+	+
	아미그달린(Amygdalin)	-	-
	에스쿨린(Esculin)	-	-
	살리신(Salicin)	-	-
	셀로비오스(Cellobiose)	-	-
	말토오스(Maltose)	약함	약함
	멜리보오스(Melibiose)	-	-
	수크로오스(Sucrose)	약함	+
	트레할로스(Trehalose)	약함	+
	이눌린(Inulin)	-	+
	라피노오스(Raffinose)	-	+
	녹말	-	-
	젠티오비오스(Gentiobiose)	-	-
	D-투라노오스(D-Turanose)	+	+
	D-타가토오스(D-Tagatose)	-	+

< 실시예 3> 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주의 지방산 특성 조사

실시예 1에서 분리한 세포주의 지방산을 분석하기 위하여 GYP 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 균체를 모아, MIDI의 지방산 분석 표준 방법(MIDI Sherlock System, MIDI, 미국)에 따라 균체 지방산을 추출하였으며, 가스크로마토그래피 시스템 (Gas Chromatography, model 6890N 및 7683 autosampler; agilent, 미국)을 이용하여 지방산 성분과 함량을 동정하였다(표 2).

[표 2]

지방산	함량(%)
지방산	비니에	이눌리너스
C_14:0	t	t
iso-C_15:0	13.28	12.57
anteiso-C_15:0	15.17	14.25
iso-C_16:0	4.68	5.92
C_16:0	5.37	4.97
iso-C_17:0	6.09	6.13
anteiso-C_17:0	53.79	55.5

< 실시예 4> 스포로락토바실러스 비니에 세포주의 내담즙성 조사

실시예 1에서 분리한 세포주의 담즙산 내성을 실험하기 위하여, 담즙산(porcine bile extract, sigma, 미국)을 첨가하지 않거나, 0.3, 1, 3 및 5%(w/v)씩 첨가한 GYP 아가 플레이트에 상기 세포주 또는 이눌리너스 세포주를 도말하여 37℃ 조건에서 48시간 동안 배양한 후 각 세포주의 생육 여부를 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 비니에 및 이눌리너스 세포주 모두 5% 담즙이 포함된 배지에서 우수한 성장을 보여 담즙산에 강한 내성을 가짐을 확인하였다.

[표 3]

세포주	담즙 농도(%)
세포주	0	0.3	1	3	5
스포로락토바실러스 비니에 SL153	T	T	T	T	T
스포로락토바실러스 이눌리너스 KCTC5032	T	T	T	T	T

T; 담즙 내성

< 실시예 5> 병원성균 성장 억제 특성 조사

병원성 미생물의 성장 억제 활성을 측정하기 위하여 스포로락토바실러스 비니에 (Sporolactobacillus vineae) SL153과 비교 세포주로서 종래 알려진 스포로락토바실러스 이눌리너스 세포주에서 하기 실험을 진행하였다. 병원성세균은 KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 에셔리키아 콜리(Escherichi coli KCTC 2441) 등 총 10종을 지시 세포주로 사용하였다. 사용된 지시세포주 중 에셔리키아 콜리, 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC1621), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium KCTC 1925), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda KCTC12267) 세포주는 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar, Difco, 미국)에서, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae KCTC 2715), 비브리오 알기노리티쿠스(V. alginolyticus KCTC2928), 비브리오 플루비아리스(V. fluvialis KCTC2473), 비브리오 파라헤모리티쿠스(V. parahaemolyticus KCTC2729), 에어로모나스 비발비움(Aeromonas bivalvium KCTC22102), 리스토넬라 엥귈라룸(Listonella anguillarum KCTC2711)은 마린 아가(Marine agar, Difco)에서 각각 배양하였다. 실험은 공지의 방법(Chang et al., Kor . J. Appl. Microbiol . Biotechnol . 27 (1), 23-27, 1999)에 따라 수행하였으며, 페이퍼 디스크(8mm, Yoyo Roshi Kaisha, 일본)를 이용하여 억제환의 직경(mm, diameter)을 측정하였다. 약 18시간 배양한 지시세포주의 농도를 10^6~7CFU/ml로 조정하여 뮬러-힌튼 아가(Mueller-Hinton agar) 배지에 도말 건조한 후, 분리세포주의 배양 상등액 100 μl를 멸균된 디스크에 접종하여 48시간 배양하였다. 이때, 음성 대조군으로 균을 접종하지 않은 MRS 배지를 동량 사용하여 항균력을 비교하였다.

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 이눌리너스와 비교하여 비니에에서 비브리오 콜레라에, 비브리오 알기노리티쿠스, 비브리오 플루비아리스, 비브리오 파라헤모리티쿠스, 에어로모나스 비발비움 및 리스토넬라 엥귈라룸의 성장 억제능력이 더 좋은 것을 확인하였다.

[표 4]

세포주	성장 억제환 직경 (diameter, mm)
세포주	비니에	이눌리너스	GYP 배지
Vibrio cholerae KCTC2715	14	5	-
Vibrio alginolyticus KCTC2928	11	6	-
Vibrio fluvialis KCTC2473	11	6	-
Vibrio parahaemolyticus KCTC2729	11	4	-
Aeromonas bivalvium KCTC22102	9	5	-
Escherichia coli KCTC2441	-	-	-
Staphylococcus aureus KCTC1621	-	-	-
Salmonella typhimurium KCTC 1925	-	15	-
Edwardsiella tarda KCTC12267	-	-	-
Listonella anguillarum KCTC2711	15	-	-

< 실시예 6> 장내 정착성 특성 조사

본 발명자들은 실시예 1에서 선별한 세포주의 장내 세포에 대한 정착력 정도를 실험하기 위하여 인간 직장 선암 세포주(human colon adenocarcinoma cell)인 HT-29 세포주(ATCC HT-38)를 사용하였으며, 스포로락토바실러스 비니에 SL153 와 비교 세포주로서 스포로락토바실러스 이눌리너스 세포주를 사용하였다. HT-29 세포주는 10%(v/v) FBS가 함유된 RPMI 1640 배지(Gibco BRL, USA)에 배양하면서 세포 증식시켰다. GYP 브로스에서 잘 자란 비니에 세포주를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 다음, 혈청을 첨가하지 않은 RPMI 1640 배지에 첨가하여 준비하 였다. 배양된 HT-29 세포주는 16-웰(well) 세포배양 플레이트(BD science, USA)에 분주하여 단일층이 형성되도록 배양한 후, 준비된 비니에 세포주를(10⁹CFU/㎖) 첨가하여 5% CO₂를 포함하는 37℃ 세포배양기 내에서 배양시켰다. 배양 2시간 후, HT-29 세포주에 부착하지 못한 비니에 세포주는 PBS로 세척하고, 0.1% 트리톤 X-100으로 부착된 균은 떼어낸 다음 GYP 아가(Difco, 미국)를 이용하여 37℃에서 72시간 배양한 후 자란 균들의 수를 세었다. 상기와 같은 방법으로 비교 세포주인 이눌리너스도 HT-29 세포주를 대상으로 장내 정착성을 조사하였다.

그 결과 이눌리너스 세포주와 비교하였을 때 유사한 정도의 장내 정착력을 보여 프로바이오틱스로서의 우수함을 확인하였다(도 2).

< 제조예 1> 사료첨가제의 제조

본 발명자들을 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 사료첨가제를 제조하였다.

<사료첨가제의 조성>

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 0.1 ~ 10% 중량부

지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01% 중량부

제 3 인산칼슘 1 ~ 20% 중량부

비타민 E 0.01 ~ 0.1% 중량부

효소 분말 1 ~ 10% 중량부

145유산균 0.1 ~ 10% 중량부

바실러스(Bacillus) 배양 0.01 ~ 10% 중량부

포도당 20 ~ 90% 중량부

< 제조예 2> 건강식품의 제조

2-1. 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 0.48~1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

2-2. 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36~76.76 %

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 0.24~0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

2-3. 캔디의 제조

설탕 50~60 %

물엿 39.26~49.66 %

오렌지향 0.1 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

2-4. 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등 액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-5. 유제품( dairy products )의 제조

본 발명에 따른 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

< 제조예 3> 약학적 제제의 제조

본 발명의 스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질을 포함하는 약학적 제제는 다음과 같이 제조하였다.

3-1. 산제의 제조

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

3-2. 정제의 제조

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3-3. 캡슐제의 제조

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

3-4. 환의 제조

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

3-5. 과립의 제조

스포로락토바실러스 비니에 SL153 세포주, 이의 배양 상등액; 및 이들로부터 회수한 항균 대사물질 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

도 1은 본 발명의 신세포주의 16S rRNA 서열을 분석하여 나타낸 분자계통도이다.

도 2은 본 발명의 신세포주와 비교세포주 스포로락토바실러스 이눌리너스(Sporolactobacillus inulinus KCTC5032) 와의 장내 정착능 비교 결과이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Probiotics containing Sporolactobacillus vineae as an active ingredient <130> 9p-04-73 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA sense primer <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA antisens primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1418 <212> DNA <213> Sporolactobacillus sp. SL153 16S ribosomal RNA gene, partial sequence <400> 3 tcgagcgcac agaagggagc ttgctcccgg aagtgagcgg cggatgggtg agtaacacgt 60 gggcaacctg cctgaaagtc ggggataact ccgggaaacg ggagctaata ccggataatc 120 gcctgcaccg catggtgcag gtgtgaaaga tggtttcngc catcactttc agatgggccc 180 gcggtgcatt agttagttgg cggggcaacg gcccaccaag accacgatgc atagccgacc 240 tgagagggtg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 300 agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagcgaagaa 360 ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgccgg agaagaacgg acgggagagg aaatgctcct 420 gtcgtgacgg tatccggcca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta 540 agtctgatgt gaaatcttgc ggctcaaccg caagcggcca ttggaaactg ggaagcttga 600 gtacagaaga ggagagtaga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660 ataccggtgg cgaaggcggc tctctggtct gttactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg 720 gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa acgatgaatg ctaggtgtta 780 ggggggtcca accccttagt gctgcagtta acacattaag cattccgcct gggaagtacg 840 accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagtg gagcatgtgg 900 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catccttcga ccgcctgaga 960 gatcaggctt tccccttcgg gggacggagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatccc agttgccagc 1080 attcagttgg gcactctggg gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140 tcaaatcatc atgcccctta tgatctgggc tacacacgtg ctacaatggg cggtacaaag 1200 ggctgcgaga ccgcgaggtc aagccaatcc cataaagccg cccccagttc ggattgcagg 1260 ctgcaacccg cctgcatgaa gccggaattg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320 aatccgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtcgg taacacccga 1380 agtcggtgcg ggaaccttta tggacccagc cgccgaag 1418

Claims

수탁번호 KCTC 11493BP로 기탁된 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주, 또는 이의 배양 상등액을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 의한 급성 설사, 장염, 위장관염, 콜레라, 식중독, 염증성장질환 및 과민성 장증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 에어로모나스 비발비움(Aeromonas bivalvium) 및 리스토넬라 안귈라룸(Listonella anguillarum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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수탁번호 KCTC 11493BP로 기탁된 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주, 또는 이의 배양 상등액을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 건강 식품용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 건강 식품용 조성물은 유산균 제제 또는 발효유인 것을 특징으로 하는 건강 식품용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 건강 식품용 조성물은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 에어로모나스 비발비움(Aeromonas bivalvium) 및 리스토넬라 안귈라룸(Listonella anguillarum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 미생물에 대한 생육 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건강 식품용 조성물.
수탁번호 KCTC 11493BP로 기탁된 스포로락토바실러스 비니에 SL153(Sporolactobacillus vineae SL153) 세포주, 또는 이의 배양 상등액을 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 사료 첨가제용 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 사료 첨가제용 조성물은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 에어로모나스 비발비움(Aeromonas bivalvium) 및 리스토넬라 안귈라룸(Listonella anguillarum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 미생물에 대한 생육 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제용 조성물.
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