KR102635818B1

KR102635818B1 - 김치에서 분리한 항산화 활성이 우수한　엔테로코커스 페슘 mg5232 균주 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102635818B1
Application number: KR1020220149601A
Authority: KR
Inventors: 백남수; 강창호
Original assignee: 주식회사 메디오젠
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2024-02-14

Abstract

본 발명은 엔테로코커스 페슘(Enterococcus faecium) MG5232 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 본 발명의 균주가 항생제 내성 및 병독성 인자를 나타내지 않음을 확인하였으므로, 균주의 안전성과 높은 위장 생존율은 상기 균주는 프로바이오틱스로 식품 분야에서 활용될 수 있다.

Description

김치에서 분리한 항산화 활성이 우수한　엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 및 이를 포함하는 조성물 {Enterococcus faecium MG5232 strain with excellent antioxidant activity isolated from kimchi and composition comprising the same}

유산균(lactic acid bacteria; LAB)의 그룹인 엔테로코커스 종 (Enterococcus spp.)은 위장관과 관련된 토착 미생물상의 많은 부분을 구성하며 동물성 식품에 서식할 수 있다. 50종 이상의 엔테로코커스 종이 보고되었으며 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis)와 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)은 사람에게 주요 감염을 일으키는 장구균의 가장 흔한 유형이다.

이러한 엔테로코커스 종은 그람 양성, 혐기성, 조건적, 카탈라아제 음성 및 비 포자 형성의 특성을 나타낸다. 이들 균주는 염분과 산에 대한 내성이 강하고 발효종(starter)으로서 유익한 역할을 하고, 유제품 배양을 보조하며, 치즈 풍미를 발달시킨다. 그러나 항생제 내성, 병독성과 같은 안전성 문제로 엔테로코커스 페슘, 엔테로코커스 페시움 등의 소수 종만이 프로바이오틱스로 사용되고 있다.

엔테로코커스 종은 심내막염, 균혈증, 요로 감염(UTI) 및 기타 감염과 같은 병원 감염을 일으키는 기회감염 병원체로 알려져 있다. 일부 균주는 항생제에 내성이 있는데, 특히 반코마이신(vancomycin)에 내성이 있어 병원성을 증가시킨다. 또한, 엔테로코커스 종으로부터 조직 침입인자, 세포독소, 응집물질 등 다양한 독성인자가 보고되고 있다.

그러나, 수평적 유전자 전이 가능성으로 인해 병원성 및 비병원성 엔테로코커스 종을 구별하기가 어렵다. 따라서 엔테로코커스 종은 매우 고유한 독성을 나타낼 가능성이 높으므로 사용하기 전에 안전한 균주인지 여부를 확인해야 한다.

한국의 전통 배추 발효식품인 김치는 비타민, 플라보노이드, 폴리페놀, 유산균 등의 다양한 생체작용 성분을 포함하고 있어 건강기능식품으로 널리 알려져 있다.

발효는 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.), 페디오코쿠스 종(Pediococcus spp.), 류코노스톡 종 (Leuconostoc spp.), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp.)과 같은 김치에 첨가된 원재료에서 파생된 다양한 내생 미생물에 의해 시작된다. 유산균은 초기 발효 동안 우세종이 되어 젖산을 생성하고 식품의 pH를 감소시킨다. 김치를 보관하는 동안 이러한 다양한 박테리아는 발효를 통해 김치 고유의 맛과 건강에 유익한 화합물을 생성한다.

한국의 전통 배추 발효식품인 김치로부터 항생제에 내성이 없으며, 조직 침입인자, 세포독소, 응집물질 등 다양한 독성인자가 없는, 안전성이 높은 엔테로코커스 종을 발굴하여, 식품, 의약품 및 화장품 등의 산업에서 효과적으로 사용이 시급한 실정이다.

Tilwani Y M et al., Characterization of potential probiotic bacteria Enterococcus faecium MC-5 isolated from the gut content of Cyprinus carpio specularis, Microb Pathog, 2022, 172, 105783, 1-11 Divyashri G et al., Probiotic attributes, antioxidant, anti-inflammatory and neuromodulatory effects of Enterococcus faecium CFR 3003: in vitro and in vivo evidence, J Med Microbiol, 2015, 64, 1527-1540 Kim H J et al., Antibiotic Resistance and Safety Assessment of Enterococcus faecium CKDB003 for Using as Probiotics, Korean J Food Nutr, 2020, 33, 3, 223-236

이에 본 발명자들은 김치에서 분리된 엔테로코커스 페슘 (Enterococcus faecium) MG5232 균주의 안전성을 항생제 내성 및 다양한 병독성 유전자를 통해 확인하였고, 식품 산업에서 사용하기 위한 프로바이오틱스로서의 가능성을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 장내 미생물균총 개선용 프로바이오틱스 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식품 첨가제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 장내 미생물균총 개선 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 식품 첨가제용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주를 이용한 장내 미생물균총 개선 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 엔테로코커스 페슘(Enterococcus faecium) MG5232 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 16s rRNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 한국생명공학연구원 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 2022년 10월 17일자 기탁번호 KCTC 15141BP로 기탁되었다.

본 발명의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 증가된 식품 안전성을 갖는다.

병원체에서 히알루로니다제 (hyaluronidase) 및 젤라티나아제 (gelatinase)와 같은 일부 효소는 숙주 조직의 침입에 대한 촉매 활성 때문에 감염을 확립하고 퍼뜨리는 병독성 특성과 관련이 있다. 또한, 프로바이오틱 박테리아의 히알루로니다제 및 젤라티나아제 활성은 숙주에 연쇄 감염을 유발할 수 있다. 따라서 잠재적으로 유해한 프로바이오틱 후보를 배제하기 위해 이들의 활동을 평가해야 한다.

히알루로니다제는 N-아세틸 글루코사민과 글루쿠론산 잔기가 교대하는 뮤코 펩티드 화합물인 고분자 기질 히알루론산을 촉매하는 글리코시다아제 효소이다. 그러나 연쇄상구균, 폐렴구균, 포도구균, 클로스트리디아 등 다양한 병원성 유기체가 히알루로니다제를 생산한다. 앞서 언급했듯이, 히알루로니다제는 병독성 인자로서 침습성 질환에 영향을 미친다.

세포외기질 금속함유 단백분해효소 (MMP, matrix metalloproteinase)인 젤라티나아제는 기저막 성분을 포함한 거의 모든 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)을 분해하며 인간 젤라티나아제 또는 기타 세균성 프로테이나제 (proteinases)의 추가 활성에 적합한 기질을 제공할 수 있다. 젤라티나아제는 주로 병원성 미생물과 생물막의 합성물에 의해 생성된다. 병독성 인자로서 면역에 관여하는 콜라겐, 피브리노겐, 부속물 등 다양한 타입의 단백질을 분해하여 숙주에 독성을 발휘한다. 또한 주로 광범위한 단백질 분해 활성으로 인해 숙주 면역계의 교란 및 심내막염 유도와 같은 문제를 일으키는 것으로 알려져 있다.

용혈 활성은 적혈구를 파괴하는 질병이나 병원체의 성질을 말한다. 게다가 GRAS(Generally Recognized as Safe) 또는 QPS(Quality Presumption of Safety) 상태라도 식품에 사용하기 위해서는 프로바이오틱스의 용혈 활성에 대한 평가가 강력히 권고된다.

용혈을 일으키는 세균의 특징은 α, β, γ-용혈로 나눌 수 있다. α-용혈은 적혈구와 헤모글로빈이 부분적으로 용해되어 배양 후 콜로니 영역을 녹색으로 변화시킨다. β-용혈에서는 적혈구와 헤모글로빈이 완전히 용해되고 배양 후 콜로니가 투명해진다. γ-용혈은 용혈을 일으키지 않으며 콜로니 영역의 변화가 없는 것이 특징이다. 세포융해소 (cytolysin)라는 β-헤모라이신-박테리오신 (β-hemolysin-bacteriocin)을 생성하는 엔테로코커스는 환자의 감염률을 5배 증가시키는 것으로 보고되었다.

본 발명의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 β-용혈능을 나타내지 않는다.

엔테로코커스는 면역력이 약한 사람에게 위장염, 심내막염, 요로감염, 뇌수막염을 유발할 수 있어서 유해균에 대한 측면이 계속해서 주목 받고 있다. 급성경구독성실험은 프로바이오틱스 균주의 안전성을 평가하기 위한 기초적인 실험이다.

본 발명의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 경구 투여는 실험 랫드의 생존율, 일반 증상, 체중, 요검사 및 육안 부검 소견에 영향을 미치지 않음을 확인하여, 급성 독성이 없음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 항생제 내성, 히알루로니다제 및 젤라티나아제 활성, 및 용혈 활성을 가지고 있지 않으므로, 증가된 식품 안전성을 가지며, 프로바이오틱스로 사용하기에 적합한 균주이다.

본 발명의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다.

항산화 기능은 체내에서 일어나는 산화반응을 억제시키거나 그 속도를 느리게 하는 것인데, 체내에서 일 어나는 산화 반응은 노화의 유발과 세포의 변이를 유발하여 암세포를 생성한다. 따라서, 항산화 작용은 이런 체내의 부정적인 반응을 억제하기 위한 예방 방편 중 하나로서 활용되고 있다. 구체적으로, 체내에서는 세포 호흡 과 더불어 에너지에 해당하는 ATP생성이 주기능인 세포 내의 미토콘드리아가 호흡의 부산물인 자유 라디칼(free radical)을 생성하는데, 이는 불안정하여 지질, 핵산, 단백질 등의 다른 물질과 급격하고 무차별적으로 반응한다. 따라서 항산화를 통하여 이러한 자유 라디칼의 생성을 막을 수 있다면 간접적으로 노화와 암을 예방할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 장내 미생물균총 개선용 프로바이오틱스 조성물에 관한 것이다.

본 명세서상의 용어 “추출물”은 균주의 배양액에서 분리한 것을 의미하며, 추출물은 배양 여액을 포함한다.

본 명세서상의 용어 "배양 상층액"은 원심분리 방법을 통해 배양액으로부터 대부분의 미생물을 제거한 후 획득한 상층의 액을 의미한다.

본 명세서상의 용어 "배양 여액"은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 균체를 여과하여 제거한 뒤에 남은 액체를 의미한다. 배양 여액은 미생물이 자라는 과정에서 형성하여 배출한 물질들이 포함되어 있어서 그 물질을 정제하거나 추출할 수 있다.

본 명세서상의 용어 "프로바이오틱스(probiotics)"는 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 의미한다.

프로바이오틱스로서 실질적인 기능을 나타내기 위해서는 장내 생존력도 중요하지만, 무엇보다 장 상피세포에 부착하여 균총을 형성하는 능력이 중요한데, 콜로니를 형성하여 기타 병원성 미생물이 자리잡지 못하도록 막아주기 위해서는 장　내 부착능력이 필수요소이다.

프로바이오틱스 조성물은 장 기능 개선을 위한 다양한 용도에서 활용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 정장 작용을 가지므로 "정장용" 조성물로서 사용 가능하다.

본 명세서상의 용어 "정장용"이란 사람이나 동물 의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및/또는 개선하는 용도를 말한다. 상기 증상으로는 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

프로바이오틱스 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 식품/의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 건강기능식품 또는 약학 조성물로서 활용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식품 첨가제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 식품은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류일 수 있으며, 더욱 자세히는, 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜릿 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료(dairy drink) 및 우유 음료, 차, 두유 및 콩 유제품(soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 케이크, 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 식품 첨가제용 조성물에 함유된 유효성분으로서의 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명에 있어서 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등, 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미 하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용 도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로 서의 적합 여부는 다 른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질캅셀에 생약 추출물에 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 생약 추출물에 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세 린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 생약 추출물에 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조 제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환 의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 상기 생약 추출물에 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으 로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕 해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동 일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 16s rRNA 시퀀싱 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 용혈 활성 테스트 결과를 보여주는 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 (1.4 x 10¹⁰ CFU/g) 1회 투여 후 14일 동안 SD 수컷 랫드의 체중 변화를 관찰한 급성 독성 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 (1.4 x 10¹⁰ CFU/g) 1회 투여 후 14일 동안 SD 암컷 랫드의 체중 변화를 관찰한 급성 독성 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 세포독성을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 NO 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주 및 배양조건

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 김치에서 분리되었다. 균주는 37℃에서 24시간 동안 MRS(de Man Rogosa Sharpe) 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에서 배양되었다. 분리된 균주는 16s rRNA 시퀀싱을 통해 동정하였으며, 25% 글리세롤 스탁(glycerol stock)으로 준비하여 실험 전까지 -70℃에서 보관하였다. 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 16s rRNA 시퀀싱은 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 전체 게놈 시퀀싱 분석(Whole-genome sequencing analysis (WSG))

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 게놈 DNA는 PureLink? Microbiome DNA Purification Kit(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 추출되었다. 게놈 시퀀싱은 Illumina 플랫폼(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)과 함께 PacBio RS II 기기(Pacific Biosciences of California Inc., CA, USA)를 사용하여 Macrogen Inc.(서울, 한국)에서 수행하였다. 데이터는 Hierarchical Genome Assembly Process(HGAP3)를 사용하여 수집되었다. 조립 후 Pilon(v1.21)을 사용하여 정확한 게놈 서열을 위해 Illumina 읽기를 적용하였다. 집합체(assembly)의 정확성을 입증하기 위해 Illumina 읽기를 집합체(assembly) 결과에 매핑(map)하였다. NCBI 데이터와 BLAST 분석을 기반으로 각 스캐폴드 (scaffold)가 유사성을 나타내는 종을 식별하기 위해 실행되었다. 조립된 유전자를 염기서열 상동성을 분석하고 Prokka(v1.12b) 및 EggNOG(v4.5) 데이터베이스를 기반으로 주석을 달아 coding sequence, transfer RNA(tRNA), ribosomal RNA(rRNA) 유전자 정보 추정하였다. 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 원형 폐쇄 게놈의 유전 지도 분석 결과를 표 1에 나타내었다.

Feature	*E. faecium* MG5232
No. of contiqus	2
Chromosome size (bp)	2,640,853
Plasmid size (bp)	136,433
G+C contents (%)	37.92
Total genes	2,707
rRNA genes	18
tRNA genes	68
Coding sequence (CDS)	2,621
Total genome size (bp)	2,777,286
No. of plasmid	1

표 1에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 게놈에는 2개의 contig(서로 겹치면서 연속되어 있는 DNA 절편들의 집합)가 있으며, 2,777,286bp로 구성되며 GC 함량은 37.92%임을 확인하였다.

실험예 1. 항생제 감수성 테스트

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 10가지 항생제에 대한 내성은 최소 억제 농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentration) 테스트를 스트립 방법을 사용하여 분석되었다.

구체적으로, 균주의 펠렛(pellet)을 37℃에서 18시간 동안 MRS broth 배지에서 배양하였다. 그 다음 원심분리(3,460 x g, 10분)로 수확하고, PBS(pH 7)로 두 번 세척하여, PBS에 재현탁하여 0.5 McFarland 탁도를 얻었다. 현탁된 용액을 90% Iso-Sensitest 배지(Oxoid Ltd., Hampshire, UK)와 1.5% 한천이 있는 10% MRS 혼합물인 유산균 감수성 시험 배지(LSM) 플레이트에 면봉을 사용하여 접종하였다. 그 다음, 플레이트를 10분간 건조시킨 후 제조사의 지시에 따라 MIC 테스트 스트립(Liofilchem Inc., Italy)을 플레이트 위에 놓고 37℃에서 배양하였고, 24시간 접종 후 결과를 측정하였다. 항생제 감수성은 EFSA (European Food Safety Authority) 지침에 따라 결정되었다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Antibiotics	MIC (μL/mL)	Cut-off value (μL/mL)
Ampicillin	2.0 ± 0.0	2.0
Chloramphenicol	8.0 ± 0.0	16.0
Clindamycin	2.0 ± 0.0	4.0
Erythromycin	4.0 ± 0.0	4.0
Gentamycin	8.0 ± 0.0	32.0
Kanamycin	1,024.0 ± 0.0	1,024.0
Streptomycin	64.0 ± 0.0	128.0
Tetracycline	4.0 ± 0.0	4.0
Tylosin	4.0 ± 0.0	4.0
Vancomycin	2.0 ± 0.0	4.0

표 2에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주에 대한 10가지 항생제 모두의 MIC는 EFSA 가이드라인의 컷오프 (cut-off) MIC 값과 같거나 낮으므로 감수성으로 식별되었다. 따라서, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 EFSA 가이드라인에 따라 사용 가능한 프로바이오틱스로 확인되었다.

실험예 2. 히알루로니다제(Hyaluronidase) 활성 테스트

히알루론산(HA)과 소의 알부민 분획 V(albumin fraction V (BAFV))를 각각 400μg/ml 및 1%까지 1% 한천이 포함된 Brain Heart Infusion(BHI) 배지에 첨가되었다. BHI-HA-BAFV 배지를 페트리 접시에서 고형화시켰다. MRS 배지에서 배양한 박테리아 한 방울을 BHI-HA-BAFV 한천 플레이트에 접종한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 2N 아세트산으로 10분 동안 염색한 후, 히알루로니다제 활성이 박테리아 콜로니 주변에서 제거되는 영역으로 검출되었다. 비활성은 알부민 비분해 히알루론산 복합체의 아세트산 침전에 의해 흐린 배경으로 결정되었다. 황색포도상구균 KCCM12214를 양성대조군으로 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

Strains	Hyaluronidase
E. faecium MG5232	( - )

(-), no activity

표 3에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 히알루로니다제 활성이 없음을 확인하였다.

실험예 3. 젤라티나아제(Gelatinase) 활성 테스트

MRS broth 배지에서 37℃에서 18시간 동안 성장시킨 MG5232 배양물을 MRS 젤라틴 영양 배지(0.12g/mL 젤라틴, 0.005g/mL 펩톤, 0.03g/mL 쇠고기 추출물이 포함된 MRS)에 접종하였다. 접종된 배지를 37℃에서 9일 동안 배양하였다. 배양된 젤라틴 영양배지는 4℃에서 4시간 동안 냉장 보관하였고, 기울어진 형태의 응고가 관찰되었다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

Strains	Gelatinase
E. faecium MG5232	( - )

(-), no activity

표 4에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 젤라티나아제 활성이 없음을 확인하였다.

실험예 4. 용혈 활성 테스트

용혈 활성을 평가하기 위해 MG5232를 MRS broth 배지에서 18시간 동안 성장시키고 5% 양 혈액(MB cell, Seoul, Korea)이 함유된 TSA(tryptic soy agar)배지 (Oxoid Ltd., Hampshire, UK)에 선조접종(streaking)하였다. 호기성 조건에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 용혈 특성은 집락 주변의 적혈구 용해를 기반으로 평가하였다. 그 결과를 도 2 및 표 5에 나타내었다.

Strains	Hemolysis
E. faecium MG5232	γ

α, α-hemolysis; γ, hemolysis

도 2 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 γ-용혈을 나타냈으며, β-용혈능을 나타내지 않음을 확인하였다.

실험예 5. 급성 독성 테스트

급성 독성 테스트는 ㈜켐온(대한민국 용인)에서 실시하였으며, ㈜켐온 동물보호이용위원회의 동물윤리위원회(No. 20-RA-0146, 0147)의 승인을 받았다. 급성경구독성 연구는 OECD(경제협력개발기구) 가이드라인 No. 420 "급성 경구 독성 고정 용량 절차"의 프로토콜에 따라 수행되었다.

구체적으로, 1주간의 적응 기간 후, 70마리의 건강한 Sprague-Dawley (SD) 랫드(각 그룹의 성별에 따라 5마리씩, 7주령)를 선택하고 무작위로 7개 그룹으로 나누었다. 동물들은 12시간 명암 주기로 온도와 습도가 제어된 방(22±2℃, 50±5% 습도)에 개별적으로 가두었다. 먹이와 물은 동물에게 임의로 제공되었다. 16시간 금식 후 엔테로코커스 페슘 MG5232 (증류 식염수 용액에 1.4 x 10¹⁰ CFU/g)를 1,250(저용량), 2,500(중간 용량), 5,000 mg/kg (고용량)의 농도로 시험군의 동물에게 경구 투여하였다. 대조군의 동물에게는 균주가 없는 식염수를 투여하였다. 균주의 단일 경구 투여 후, 동물의 임상 징후를 14일 동안 모니터링하였다. 랫드의 체중과 음식섭취량은 이틀에 한번 측정하였다. 15일째에 모든 랫드를 12시간 동안 금식시키고 CO₂를 사용하여 마취시켰다. 모든 쥐에 대한 부검은 육안 검사로 수행되었다. 모든 조직학적 평가는 면허가 있는 독성 병리학자가 수행하였다. 그 결과를 도 3a 내지 도 3b에 나타내었다.

실험 결과 실험 기간이 종료되었을 때 모든 동물이 생존했을 뿐만 아니라 건강해 보였고 정상적인 성장 및 발달 패턴을 보였다. 또한, 도 3a 내지 도 3b에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 처리군과 대조군의 체중에는 차이가 없음을 확인하였다. 또한, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 처리군의 행동 징후 및 부검 소견은 대조군과 유사하였다.

결과적으로, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 경구 투여는 실험 랫드의 생존율, 일반 증상, 체중, 요검사 및 육안 부검 소견에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

실험예 6. 자가응집 (Autoaggregation) 테스트

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 MRS broth 배지에서 37℃에서 20시간 동안 성장되었다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 2회 세척하고, pH 7.2로 조정된 PBS에 재현탁시켰다. 현탁액(4mL)을 10초 동안 교반(vortexing)하여 혼합하였다. 그 후, 0.1mL의 상부 현탁액을 0.9mL PBS와 혼합하고, 600nm에서의 흡광도(A0)를 측정하였다. 동일한 방법을 사용하여 실온에서 5시간 동안 배양한 후 흡광도(A1)를 측정하였다. 자가응집 백분율은 다음의 계산식을 통해 계산하였다.

[계산식]

자가응집 백분율 (%) = (1 - A1 / A0) Х 100

Strains	Autoaggregation (%)
E. faecium MG5232	66.30 ± 1.30

표 6에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 자가 응집 능력은 66.30 ± 1.30%로 일반 유산균에 비해 낮은 자가응집 범위와 유사함을 확인하였다.

실험예 7. 용매에 대한 세균 부착(Bacterial adhesion to solvent) 테스트

박테리아 세포를 PBS(pH 7.2)에 1 x 10⁸ CFU/mL의 농도로 현탁시켰다. 세포 현탁액(3mL)을 1mL의 용매와 혼합하였다. 자일렌(Xylene)은 무극성 용매로, 클로로포름(chloroform)은 전자 수용체로, 에틸 아세테이트(ethyl acetate)는 전자 공여체로 사용되었다. 혼합물을 1분 동안 교반하고 20분 동안 방치하여 2개의 상으로 분리하였다. 수상(aqueous phase)의 흡광도는 UV 분광광도계를 사용하여 흡광도 (600 nm)를 측정하였다. 다른 물리화학적 특성(소수성 및 전자 공여체-전자 수용체 상호작용)을 갖는 용매에 대한 친화도는 다음 계산식을 사용하여 표현되었다.

[계산식]

BATS (%) = (1 - At / A0) Х 100

A0: 유기 용매로 추출하기 전 흡광도

At: 유기 용매로 추출한 후 흡광도

Strains	Adhesion to solvents (%)
Strains	Xylene	Chloroform	Ethyl acetate
E. faecium MG5232	12.69 ± 1.18	28.88 ± 1.95	54.60 ± 15.73

표 7에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 낮은 소수성이 관찰되었으며(12.69 ± 1.18%, 28.88 ± 1.95%) 각각 자일렌(xylene) 및 클로로포름(chloroform)에 대한 접착력으로 측정되었다

실험예 8. 인공 위장관액 pH 조건에서의 균주 생존 테스트

위장 저항을 평가하기 위해 37℃에서 24시간 동안 MRS broth 배지에서 배양한 후 원심분리(3,460 x g, 10분)에 의해 균주를 수확하였다. 균주 펠렛 (pellet)을 PBS(pH 7)로 두 번 세척하고 시뮬레이션된 위액(SGF; PBS 중 3g/L의 펩신, pH 3 및 pH 4) 및 시뮬레이션된 장액(SIF; 1 g/L of pancreatin in PBS, pH 7 and 8)에 재현탁하였다(10⁸ CFU/mL). 생존 세포는 37℃에서 3~4시간 동안 배양한 후 MRS 한천에서 결정되었다. 박테리아 생존은 다음 계산식과 같이 계산되었다.

[계산식]

생존율 (%)=[Log(생존 세포의 생존 가능한 CFU)/Log(초기 생존 세포의 CFU)]Х100

Strains	Viable counts (log CFU/mL)
	Simulated gastric fluid (SGF)		Simulated intestinal fluid (SIF)
	pH 3	pH 4	pH 7	pH 8
E. faecium MG5232	6.93 ± 0.04	7.62 ± 0.06	7.56 ± 0.04	7.58 ± 0.02

표 8에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주가 pH 3 및 4에서 눈에 띄게 생존하는 것으로 관찰되었다. 위 통과는 0분에서 90분, 그 다음 최대 180분까지 관찰되었으며, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 상당히 생존하는 것으로 확인되었다.

또한, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 pH 7 및 8의 판크레아틴(pancreatin) 조건에서 생존하였다. 담즙염과 판크레아틴에 대한 내성은 유산균이 소장에서 생존하는 데 필수적이다. 따라서, 이들 결과로부터 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주가 위와 장에서 생존할 가능성이 있음을 확인하였다.

실험예 9. 효소 생산과 탄수화물 발효 특성 평가

API ZYM 및 API 50 CHL 키트(Bio-Merieux, Lyon, France)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 균주의 효소 활성 및 탄수화물 발효를 평가하였다. 효소 및 발효 활성은 색상 변화 및 색상 강도를 제조업체에서 제공한 색상 차트와 비교하여 평가하였다.

Enzymes	Substrate	MG5232
Alkaline phosphatase	2-naphthyl phosphate	0
Esterase (C4)	2-naphthyl butyrate	3
Esterase Lipase (C8)	2-naphthyl caprylate	2
Lipase (C14)	2-naphthyl myristate	0
Leucine arylamidase	L- leucyl-2-naphthylamide	3
Valine arylamidase	L-valyl-2-naphthylamide	1
Crystine arylamidase	L-cystyl-2-naphthylamide	2
Trypsin	N-benzoyl-DL-arginine-2-naphthylamide	0
α-chymotrypsin	N-glutaryl-phenylanine-2-naphthylamide	0
Acid phosphatase	2-naphtyl phosphate	2
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	Naphthol-AS-BI-phosphate	2
α-galactosidase	6-Br-2-naphthyl-αD-galactopyranoside	0
β- galactosidase	2-naphthyl-βD-galactopyranoside	0
β-glucuronidase	Naphthol-AS-BI-βD-glucuronide	0
α-glucosidase	2-naphthyl- αD-glucopyranoside	0
β-glucosidase	6-Br-2-naphthyl- βD-glucopyranoside	0
N-acetyl-β-glucosaminidase	1-naphthyl-N-acetyl-βD-glucosaminide	0
α-mannosidase	6-Br-2-naphthyl- αD-mannopyranoside	0
α-fucosidase	2-narhthyl- αL-fucopyranoside	0

표 9에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 알칼리인산분해효소(alkaline phosphatase), 리파아제(lipase), 트립신(trypsin), α/β-갈락토시다아제(α/β-galactosidase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), α/β-글루코시다아제(α/β-glucosidase), N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase), α-만노시다아제(α-mannosidase), α-푸코시다아제(α-fucosidase)를 생성하지 않음을 확인하였다.

대조적으로, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 에스터가수분해효소(esterase), 지방분해효소(esterase lipase), 류신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 산 인산염(acid phosphate), 나프톨-AS-BI-포스토하이드롤라제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-키모트립신(α-chymotrypsin)을 생산함을 확인하였다.

Substrate	MG5232	Substrate	MG5232
Glycerol	+	Salicin	+
Erythritol	-	D-cellobiose	+
D-arabinose	-	D-maltose	+
L-arabinose	+	D-lactose	+
D-ribose	+	D-melibiose	-
D-xylose	+	D-sucrose	+
L-xylose	-	D-trehalose	+
D-adonitol	-	Inulin	-
Methyl-β D-xylopyranoside	-	D-melezitose	-
D-galactose	+	D-raffinose	-
D-glucose	+	Starch	-
D-fructose	+	Glycogen	-
D-mannose	+	Xylitol	-
L-sorbose	-	Gentiobiose	+
L-rhamnose	-	D-turanose	-
Dulcitol	-	D-lyxose	-
Inositol	-	D-tagatose	-
D-mannitol	+	D-fucose	-
D-sorbitol	+	L-fucose	-
Methyl-α D-mannoside	+	D-arabitol	-
Methyl-α D-glucoside	-	L-arabitol	-
N-acetyl-glucosamine	+	Gluconate	-
Amygdalin	+	2-keto-gluconate	-
Arbutin	+	5-kete-gluconate	-
Esculin	+

표 10에서 확인할 수 있듯이, 잠재적인 프로바이오틱 균주인 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 D-포도당(D-glucose), D-과당(D-fructose), D-만노오스(D-mannose), D-말토오스(D-maltose) 및 D-설탕(D-sucrose) 등을 비롯한 다양한 당을 발효할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 확인된 당 사용량을 활용하여 균주의 생산성을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

실험예 10. 세포 생존능 및 Nitric oxide (NO) 생성 억제능 평가

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 MRS에 배양 후, 원심분리 후 제세포 상등액 (CFS,　cell free supernatant)으로 준비하였다. 세포 배지의 조성을 다음 표 12와 같다.

항목	RAW264.7 cells
항목	배양 배지	실험 배지
배지	DMEM	DMEM
Serum	10% Fetal bovine serum (FBS)	-
Antibiotic	1% Penicillin-streptomycin

10-1. 세포 생존능

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 배양 여액의 RAW264.7 세포에 대한 세포 독성이 있는지 MTT 테스트로 확인하였다. RAW264.7 세포(p13)를 2 x 10⁵ cell/well로 배양배지에 희석한 후 24 well plate에 접종하고, 24시간 하였다. 각 웰의 배지를 제거한 후 실험배지에 CFS (5%) 및 LPS (500 ng/mL)를 500 μL씩 처리하였다. 24 시간 배양 후, 배지를 제거하고 및 MTT (0.1 mg/mL) 용액을 2 시간 동안 처리하였다. 각 웰에 생성된 formazan을 DMSO (500 μL)로 녹인 후 96 well plate로 150 uL 분주하고 흡광도 (550 nm)를 확인하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 유산균 처리군 대비 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 배양 여액 5% 처리 시 세포 독성 없음을 확인하였다.

10-2. Nitric oxide (NO) 생성 억제능

엔테로코커스 페슘 MG5232 균주 배양 여액의 RAW264.7 세포에서의 항염 활성을 NO 테스트로 확인하였다. RAW264.7 세포(p13)를 2 x 10⁵ cell/well로 배양배지에 희석한 후 24 well plate에 분주하고, 24시간 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거한 후 실험배지에 CFS (5%) 및 lipopolysaccharide (LPS, 500 ng/mL)를 희석하여 500 μL 처리하였다. 24 시간 배양 후, 96웰에 획득한 배지 50 uL와 그리스 시약(griess reagent) 50 uL를 분주하고, 10분 뒤 흡광도 (550 nm)를 확인하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주는 항염증 효능이 뛰어남을 확인하였다.

소결

엔테로코커스 종은 안정성, 발효성과 같은 장점으로 식품발효에 사용된다. 그러나 엔테로코커스 종의 독성 때문에 종으로 간주되어 왔으며 잠재적인 항생제 내성 및 다양한 병독성 요인에 대한 안전성 문제가 계속 발생하고 있다. 따라서 새롭게 발견된 엔테로코커스 종의 안전성을 입증하는 것이 필수적이다.

본 발명에서는 WSG 분석을 통해 김치에서 분리한 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주의 유전형 독성을 확인하였을 뿐만 아니라, 항생제 감수성, 용혈 활성, 젤라틴 분해효소(gelatinase) 활성, 히알루론산 가수분해효소(hyaluronidase) 활성 등의 표현형 병독성도 함께 평가하였다.

그 결과, 엔테로코커스 페슘 MG5232 균주에서는 독성 유전자 및 인자, 항생제 내성, 용혈 활성 및 급성 경구 독성이 확인되지 않았다. 게다가, 균주의 높은 위장 생존율은 본 발명의 균주가 향후 잠재적인 프로바이오틱스로서 식품 분야에서 활용될 수 있음을 시사하였다. 또한, 본 발명의 균주의 효소 활성 및 탄수화물 발효능력 확인은 향후 생산성 향상을 위한 연구에 활용될 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원(KCTC)

KCTC15141BP

20221017

Claims

서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 염기서열을 포함하는 엔테로코커스 페슘 (Enterococcus faecium) MG5232 균주(기탁번호:KCTC 15141BP) 또는 이의 배양액을 유효 성분으로 포함하는 것으로서,
상기 균주는 내산성 및 내담즙성을 가지고,
암피실린, 클로람페니콜, 클린다마이신, 에리트로마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 타일로신 및 반코마이신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 항생제에 대하여 감수성을 가지며,
용혈 활성, 히알루로니다제 활성 및 젤라티나아제 활성이 없는 것인,
장 건강 개선용 식품 조성물.
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서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 염기서열을 포함하는 엔테로코커스 페슘 (Enterococcus faecium) MG5232 균주(기탁번호:KCTC 15141BP) 또는 이의 배양액을 유효 성분으로 포함하는 것으로서,
상기 균주는 내산성 및 내담즙성을 가지고,
암피실린, 클로람페니콜, 클린다마이신, 에리트로마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 타일로신 및 반코마이신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 항생제에 대하여 감수성을 가지며,
용혈 활성, 히알루로니다제 활성 및 젤라티나아제 활성이 없는 것인,
장 건강 개선용 식품 첨가제용 조성물.
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