KR102577640B1 - 바실러스 서틸리스 sb011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

바실러스 서틸리스 sb011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 서틸리스 SB011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 전통장류 발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 서틸리스 SB011 균주가 10종의 효소 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 바실러스 세레우스 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않으며, 본 발명의 SB011 균주를 이용한 콩 발효물을 근손실 동물모델에 투여하였을 때, 악력 및 근육량이 증가하는 효과가 있다. 따라서 근육질환 관련 건강기능식품 또는 의약품 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 서틸리스 SB011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for muscle strengthening, muscle development, muscle differentiation, muscle regeneration or for preventing, ameliorating or treating sarcopenia comprising Bacillus subtilis SB011 strain or fermented soybean using the same as effective component}
본 발명은 바실러스 서틸리스 SB011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
우리 몸의 근육은 뼈에 붙어 뼈를 보호하고 체형을 바르게 유지시켜 주는 등의 여러 가지 기능을 한다. 또한, 근육은 칼슘 유입을 촉진시켜 골 밀도를 높여 주기도 한다. 그러나 신체는 노화하면서 구성성분의 변화로 인해 체지방과 체단백질의 재분포가 일어나며, 사람의 근육은 40세 이후부터 점진적으로 감소하며, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소되는 것으로 알려져 있다. 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 요소로 인식되고 있고, 노화가 진행될수록 근육과 지방의 함량, 골격 왜곡 등 체형이 변화되는 것을 인지하게 되는데, 노년기 근감소에 의한 비만 유병률은 전 세계적으로 30% 이상 수준에서 지속적인 증가 추세를 보이고 있다. 또한, 인슐린 분비 이상인 경우 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못해 근육발달 장애를 일으킬 수 있어, 일반인보다 당뇨병 환자에게 근감소증이 증가한다. 근육의 감소는 관절염, 허리통증, 만성통증을 증가시키는 원인이 되며, 복부비만에 의한 요실금 증세도 악화시킬 수 있고, 골절에 의한 부상은 노년의 우울증을 증가시켜 사망에 이를 수도 있기 때문에 노년기의 근감소는 정신건강을 해칠 뿐만 아니라, 노인성 만성질환으로 연계되어 삶의 질을 떨어뜨리는 주요 원인이 된다. 이와 같은 노인성 만성질환과도 밀접한 관계가 있으므로, 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생, 근감소 또는 근피로의 예방, 개선 또는 치료를 통해 노화로 인한 신체 활동력의 감소를 억제할 수 있다.
세계의 진행성 운동실조증 및 근력약화 치료제 시장은 2011년 약 140억 달러 규모를 기록했으며 그 이후에는 94%의 연평균 복합 성장률로 성장해 2017년에는 약 235억 달러에 이를 것으로 전망되고 있다. 근감소의 치료법으로는 미토콘드리아 생성 증가, 근육 단백질 분해억제, 항염제 등이 제시되고 있으나 뚜렷한 치료약이 없는 실정이다. 또한, 노인의 근감소증을 예방하기 위하여 제시되고 있는 식사법으로는 매 식사마다 25~30g의 양질의 단백질을 섭취해야 하는 것으로 나타났다. 이는 달걀 4-5개 또는 닭 가슴살 약 120g을 매 식사마다 섭취해야만 하는 것으로 일상생활을 하는 일반인이 현실적으로 실천하기 어렵다. 따라서 최근 많은 사람이 단백질 보충제를 대안으로 선택하고 있지만 단백질 보충제는 단백질 과다 섭취의 원인이 되어 부작용의 가능성이 크다. 더욱이 신장질환이 있는 경우 고단백질 식이를 할 수 없고 노화에 따라 신장 기능 또한 감소되므로 근감소증 예방을 위해서 고단백질 섭취 이외의 다른 대안이 필요하다.
근력개선 관련 기술로는 한국등록특허 제2329853호에 아커만시아 뮤시니필라 균주를 포함하는 근위축증 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2272616호에 피컬리박테리움 프로스니치 균주를 포함하는 근위축증 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 바실러스 서틸리스 SB011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 전통장류 발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 서틸리스 SB011 균주가 10종의 효소 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 바실러스 세레우스 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않으며, 본 발명의 SB011 균주를 이용한 콩 발효물을 근손실 동물모델에 투여하였을 때, 악력 및 근육량이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효소 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCTC19094P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 바실러스 서틸리스 SB011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 전통장류 발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 서틸리스 SB011 균주가 10종의 효소 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 바실러스 세레우스 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않으며, 본 발명의 SB011 균주를 이용한 콩 발효물을 근손실 동물모델에 투여하였을 때, 악력 및 근육량이 증가되는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주의 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 활성을 나타낸 결과이다. A는 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주이고, B는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB011 균주이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 22종의 균주들과 과산화수소를 동시에 근육세포에 처리하였을 때, 세포 생존율을 측정한 결과이다. Cont은 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, H2O2은 과산화수소 단독 처리군이며, KCTC 3014은 과산화수소 및 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주를 처리한 군이다. a-d는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 3은 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주를 근육세포에 처리하였을 때, 근육의 단백질 합성 관련 유전자(Akt 및 mTor)의 발현 변화를 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, H2O2은 과산화수소 단독 처리군이고, KCTC 3014은 과산화수소 및 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주를 처리한 군이며, SB011은 과산화수소 및 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB011 균주를 처리한 군이다. a-c는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 4는 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주를 근육세포에 처리하였을 때, 근육의 단백질 분해 관련 유전자(MuRF-1 및 Atrogin-1)의 발현 변화를 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, H2O2은 과산화수소 단독 처리군이고, KCTC 3014은 과산화수소 및 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주를 처리한 군이며, SB011은 과산화수소 및 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB011 균주를 처리한 군이다. a-c는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 5는 근손실 동물모델에서 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여하였을 때, 악력 변화를 확인한 결과이다. Cont은 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, Dex은 덱사메타손을 단독 투여한 대조군이고, Non-DB은 덱사메타손 및 균주를 접종하지 않은 콩 건조물을 투여한 군이고, KCTC 3014은 덱사메타손 및 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군이며, SB011은 덱사메타손 및 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB011 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군이다. a-c는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 6은 근손실 동물모델에서 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여하였을 때, 비복근(Gastrocnemius) 및 비장근(Soleus)의 무게 변화를 측정한 결과이다. a-c는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 7은 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
본 발명은 효소 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCTC19094P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주를 제공한다.
본 발명에서 메주 및 된장으로부터 균주를 분리하였고, 효소 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주로 동정하여 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2023년 5월 12일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC19094P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 리파아제(lipase), 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리아파제(esterase lipase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 독소 유전자는 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin) 및 사이토톡신 K(Cytotoxin K) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물을 제공한다.
상기 균주는 전술한 바와 같다.
상기 콩은 대두, 서리태(검은콩), 백태(노란콩), 강낭콩, 렌틸콩, 병아리콩, 밤콩 또는 동부콩일 수 있으며, 바람직하게는 백태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 콩 발효물은 당업계에서 콩 발효에 의해 생산될 수 있는 모든 형태(예컨대, 메주, 간장, 된장, 고추장, 청국장 및 낫토 등)를 포함한다.
본 발명의 콩 발효물은 콩 발효물 추출물, 콩 발효물 엑기스, 콩 발효물 농축액 또는 콩 발효물 분말일 수 있으며, 바람직하게는 콩 발효물 분말일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다..
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 균주 및 콩 발효물은 전술한 바와 같다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 형개 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 캐러멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02~0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 균주 및 콩 발효물은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 근육질환은 근 기능 저하, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육퇴화로 인한 근육질환인 것이며, 더 바람직하게는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증, 악액질(cachexia), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 근육 감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적으로 허용되는 어떠한 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 근육 내 투여, 점안 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 패치 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있고, 구체적으로 근육 내 투여의 경로를 통해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[재료 및 방법]
1. 균주 탐색 및 분리
순창지역 및 타 지역(전국 8도)에서 전통적인 방식으로 제조된 메주 및 된장 시료를 수집 및 구입하여 1.0g의 시료를 9.0㎖의 멸균된 생리 식염수(0.85% NaC)에 단계적으로 희석하여 고초균 LB 배지(Luria-bertani agar, DifcoTM,, USA)에 각각 도말한 후 미생물의 배양 조건에 따라 배양하면서 각 배지에서 자라는 세균의 콜로니의 형태학적으로 분리하여 새로운 배지에 2~3회 도말하여 순수분리하였다.
2. 효소 활성 확인
분리 균주의 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 활성을 분석하기 위해, Hole diffusion method를 사용하였다. 각 균주의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종한 후 37℃, 150 rpm의 진탕배양기에서 24시간 동안 배양하였으며, 각 배양액을 13,000rpm으로 원심분리하여 상층액을 회수하여 분석 시험액으로 사용하였다.
아밀라아제 활성을 분석하기 위한 기질로 가용성 전분(soluble starch)을 선택하여 가용성 전분 1%가 포함된 1.5% 아가 배지를 제조하였으며, 배지에 8mm hole을 형성한 후 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 루골 용액(Lugol solution)을 처리한 후 용액을 제거하고, hole 주변에 형성된 투명환의 지름을 측정하여 아밀라아제 활성을 평가하였다.
프로테아제 활성을 분석하기 위한 기질로 탈지유(skim milk)를 선택하여 탈지유 2%가 포함된 1.5% 아가 배지를 제조하였으며, 배지에 8mm hole을 형성한 후 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 hole 주변에 형성된 환의 지름을 측정하여 프로테아제 활성을 평가하였다.
셀룰라아제 활성을 분석하기 위한 기질로 CMC(Carboxylmethyl cellulose)를 선택하여 CMC 1.5%가 포함된 1.5% 아가 배지를 제조하였으며, 배지에 8mm hole을 형성한 후 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 0.5% 콩고 레드 용액(congo red solution)을 부어 15분간 배지를 염색시킨 후 1M NaOH 용액을 부어 탈색하고, hole 주변에 형성된 투명환의 지름을 측정하여 셀룰라아제 활성을 평가하였다.
리파아제 활성을 분석하기 위해, 기질로 1% TBN(tributyrin)를 선택하여 1% LB 아가 배지(1.5% agar)를 제조하였으며, 1시간 동안 초음파 처리하여 유화시킨 후 배지에 8mm hole을 형성하여 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 hole 주변에 형성된 환의 지름을 측정하여 리파아제 활성을 평가하였다.
3. 근육세포에서 근육생성능 확인
1) 근육세포 보호 효과
C2C12 세포를 웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 후보 균주 22종 및 비교 균주인 KCTC 3014를 농도별로 처리하였다. 시료 처리와 동시에 0.5mM의 H2O2를 24시간 처리하여 XTT{2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide innersalt} 분석을 통해 세포생존율을 측정하였다. 배지가 제거된 세포에 XTT 및 PMS(N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate)을 첨가하여 1시간 배양시킨 후 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenase에 의한 XTT의 tetrazolium ring을 분해시켜 formazan crystal을 형성하게 되면, formazan crystal은 수용액에 녹아 노란색을 나타나게 되는데, 이 노란색을 ELISA(VersaMax ELISA Microplate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 450nm에서 측정하여 세포 독성 평가에 이용하였다.
2) 근육 단백질의 합성 및 분해 관련 유전자 발현
마우스 근원세포(mouse myoblast cell line, C2C12 cell)를 ATCC사(Manassas, VA, USA)로부터 구매하였고, 세포를 10% FBS(fetal bovine serum media) 및 1% P/S(Penicillin/Streptomycin)를 함유한 고농도 포도당 DMEM에서 배양하였다. 근육세포 분화를 유도하기 위해, 100% confluence가 되면, 근육세포 분화 유도물질인 인슐린, 2% HS(horse serum) 및 1% P/S를 함유한 DMEM으로 2일마다 교체하면서 4~6일간 분화를 유도하였다. 분화가 완료되면 근육세포의 융합에 의해서 근관세포(myotube) 형태가 관찰되었다. C2C12 근육세포 분화를 4일째 진행하고, SB011 선별 균주와 비교 균주인 KCTC 3014를 농도별로 처리하였다. 분화를 2일 더 진행한 후, 1mM의 H2O2를 5시간 처리하였고, 세포를 수확하여 제조사의 프로토콜에 따라 easy-BLUE™를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출후 nanodrop을 이용하여 정량하고 500ng을 채취하여 iScript cDNA 생합성 키트를 활용하여 cDNA를 합성하였다. 합성이 완료된 cDNA는 하기 표 1에 개시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 진행하였다(iQ SYBR Green supermix, Biorad, USA).
본 발명에 사용된 프라이머 정보
정방향(5'→3') 역방향(5'→3')
β-actin ACGGCCAGGTCATCACTATTG
(서열번호 1)		 CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA
(서열번호 2)
근육 단백질의
합성		 Akt CTTCTATGGTGCGGAGATTGTG
(서열번호 3)		 CCCGGTACACCACGTTCTTC
(서열번호 4)
mTOR TGATGTGCCGAGACCTTGAG
(서열번호 5)		 GCTTGGATGTGATGACTTGCA
(서열번호 6)
근육 단백질의
분해		 MuRF-1 TCTGCCTGGAGATGTTTACCAA
(서열번호 7)		 TCCGGCAGAGGTTGTGTTG
(서열번호 8)
Atrogin-1 AAGGGCAGCTGGATTGGAA
(서열번호 9)		 GGTGACCCCATACTGCTCTCTT
(서열번호 10)
4. 근손실 동물모델에서 근력개선 효과 확인
1) 선별 균주를 이용한 콩 발효물 제조
전남 영광에서 구입한 백태(메주콩)를 수세 후, 24시간 동안 침지하여 약 1.8배 무게 증량을 실시하였다. 1kg씩 유리수기에 소분하여 121℃에서 15분간 습식멸균하여 콩을 익히고, 55℃ 온도에서 SB011 선별 균주 및 비교균주인 KCTC 3014의 배양액 각각을 0.5% 비율로 접종하여 37℃, 습도 80% 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 획득한 콩 발효물을 열풍 저온건조(45℃, 72시간)하고, 미세분쇄 및 균질화하여 실험동물에 투여하였다.
2) 근손실 동물모델 설계
실험동물로서 생후 5주령된 수컷 ICR 마우스를 ㈜샘타코(SAMTACO, Korea)로부터 구입하여 동물 사육실에서 일정한 조건(온도: 22±2℃, 습도:50±5%, 명암: 12시간 light/dark cycle)으로 일주일간 적응시킨 후 사용하였다. 실험군은 정상군(Cont), 덱사메타손을 투여한 대조군(Dex), 덱사메타손 및 200mg/kg의 균주 미접종 콩 건조물 투여군(Non-DB), 덱사메타손 및 200mg/kg의 SB011 콩 발효물 투여군(SB011), 덱사메타손 및 200mg/kg의 KCTC 3014 콩 발효물 투여군(KCTC 3014)으로 나누었다.
적응기간 이후, 정상군(Cont)과 덱사메타손을 투여한 대조군(Dex)은 실험기간인 7일동안 물을 경구투여하였다. 근위축 유도를 위해, 실험기간 동안 덱사메타손을 투여한 대조군(Dex), 덱사메타손 및 200mg/kg의 균주 미접종 콩 건조물 투여군(Non-DB), 덱사메타손 및 200mg/kg의 SB011 콩 발효물 투여군(SB011), 덱사메타손 및 200mg/kg의 KCTC 3014 콩 발효물 투여군(KCTC 3014)은 경구투여 30분 후 덱사메타손(water soluble, SIGMA, USA) 20mg/kg 복강투여 하였고, 근육손실을 유도하였다.
3) 악력 측정
0일, 2일, 4일, 6일째에 Grip strength meter(BioSeb)을 이용하여 실험동물의 악력을 3회 측정 후, 평균악력을 몸무게로 나누어 비교하였다.
4) 근육무게 측정
실험동물 희생 후, 비복근(gastrocnemius, GA) 및 비장근(soleus, SOL)을 적출하여 무게를 측정하였다.
5. 선별 균주의 16s rRNA 서열 분석을 통한 동정
선별 균주의 동정을 위하여 균주들의 균체는 아가 플레이트로부터 1 콜로니를 취하여 300㎕의 LB 액체배지에 접종 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 100℃에서 10분 동안 끓인 후 ice-cold 상태에서 10분 동안 반응 한 뒤 10,000rpm에서 10분동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 마이크로튜브에 옮겨준 뒤 -20℃에 냉동 보관하며 PCR에 사용하였다. 각 시료별 DNA 농도는 바실러스 하우스 키핑 유전자인 rpoB와 mdh 영역에 대한 PCR을 통해 확인하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머(Forward primer)는 27F 프라이머(5'-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3', 서열번호 11) 및 역방향 프라이머(Reverse primer) 1492R 프라이머(5'-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3', 서열번호 12). PCR을 위한 각 반응의 온도 조건은 다음과 같다: DNA의 변성(denaturation) 95℃에서 1분, 프라이머의 결합(annealing) 60℃에서 1분, DNA 가닥의 합성 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였다. 반응이 끝난 PCR 산물은 1.0% 아가로오스 겔(5 ㎕, X-gal 30mg/㎖)에서 전기영동한 후 밴드를 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 코스모진텍에 의뢰하여 균주를 동정하였다.
6. 선별 균주의 Bacillus cereu s 독소유전자(hb1 ACD, nhe ABC, cytK) 분석
바실러스 세레우스가 생성하는 것으로 알려진 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin, hb1 ACD), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin, nhe ABC) 및 사이토톡신 K(Cytotoxin K, CytK) 유전자에 대해 선별 균주의 보유 유무를 분석하기 위해, 특정 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 기기는 C1000 Thermal Cycler(Biorad)를 사용하으며, 이들 독소 검출용 프라이머 서열들은 하기 표 2와 같으며, PCR 조성물은 총 20㎕를 기준으로 TaKaRa사의 Emerald taq(2X) 10㎕ , DNA 시료 2㎕, 프라이머 세트 1㎕, 멸균증류수 7㎕를 혼합하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃ 1분간 변성, 56-58℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
Bacillus cereus 독소 유전자에 따른 프라이머
타겟유전자 정방향 염기서열(5'-3') 역방향 염기서열(5'-3') 생성물
사이즈(bp)
hblA ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA
(서열번호 13)		 TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC
(서열번호 14)		 909
hblB ATCAATACTCTCGCAACACCAATCG
(서열번호 15)		 ATGTGCTCGTTGCTCTGCTGTTAAT
(서열번호 16)		 957
hblC GACTGAAGACAGCATTGGCTCAAAC
(서열번호 17)		 CGATGTCTTTCGAAATGAATTCTGC
(서열번호 18)		 1059
hblD ATATGCGCAAAATGTAATTGCTCCA
(서열번호 19)		 TGCCTTCTTCAACATTTGTTTGAATTT
(서열번호 20)		 935
nheA ACTTATGGCAGTATTTGCAGCAGGA
(서열번호 21)		 TGCAACGCTGTAATTGCAGTATCAA
(서열번호 22)		 972
nheB GACCAGCAGGATTCCCAGATGTAAT
(서열번호 23)		 CCACGCCTTCATGTAATTTTTCTGT
(서열번호 24)		 930
nheC CGGTAGTGATTGCTGGG
(서열번호 25)		 CAGCATTCGTACTTGCCAA
(서열번호 26)		 582
cytK CCGCTGTTTTTGCTAGTAGTGCTGT
(서열번호 27)		 ACGTCTTTTACGTTGTTTCCAACCC
(서열번호 28)		 901
7. 선별 균주의 효소 및 기질 이용능 확인
선별 균주의 효소활성을 조사하기 위해 API ZYM 키트(bioMeriux Co., France)를 사용하여 19종의 효소 활성을 측정하였고, API CHB50 키트를 이용하여 선별 균주의 당 이용성을 확인하였다.
실시예 1. 분리 균주의 효소 활성 분석
전통장류 발효식품인 메주 및 된장 시료로부터 약 117종의 균주를 분리하였으며, 분리 균주의 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제 및 리파아제 활성을 분석하여 상호 비교분석을 통해 최종적으로 후보 균주 22종을 선발하였다. 22종 분리 균주의 효소 활성을 표 3에 나타내었으며, SB011 균주가 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제 및 리파아제의 활성이 다른 균주에 비해서 높은 것을 확인하였다(도 1).
분리 균주의 효소 활성(단위: cm)
NO. Strain No. Protease Amylase Cellulase Lipase
1 SB008 1.6 0.9 1.9 　0
2 SB009 1.6 1.25 1.8 　0
3 SB011 2.8 1.7 2.4 1.5
4 SB031 1.45 0 1.6 　0
5 SB032 1.3 1.2 1.2 　0
6 SB033 1.3 1.2 1.2 　0
7 SB046 1.6 0 1.7 1.3
8 SB048 1.6 1.4 1.7 　0
9 SB049 1.3 1.1 1.2 　0
10 SB050 1.75 0 1.95 　0
11 SB051 2.7 1.2 2.3 1.4
12 SB056 1 0 1.75 　0
13 SB057 1.5 1.2 1.3 　0
14 SB058 1.7 1.6 1.75 1.2
15 SB060 1.3 1.3 1.6 　0
16 SB061 1.5 0 1.7 　0
17 SB085 1.6 1.5 1.8 1.3
18 SB086 1.6 1.3 1.7 　0
19 SB092 1.1 0 1.3 　0
20 SB097 1.5 1.3 1.7 　0
21 SB106 1.5 1 1.9 　0
22 SB115 1 1 1 　0
KCTC 3014 1.3 0 0.9 0
실시예 2. 분리 균주의 C2C12 근육세포 보호효과 확인
산화스트레스인 과산화수소(H2O2) 처리에 의한 근육세포 손상에 대한 보호효과를 평가하기 위해, 22종의 후보 균주를 동시 처리하여 근육세포 생존율을 비교하였다.
그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 정상군(Cont)에 대비하여 과산화수소 단독 처리군(H2O2)의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 과산화수소 단독 처리군 대비 본 발명의 SB011 균주 처리군의 세포 생존율이 유의미하게 증가하였다.
실시예 3. C2C12 근육세포에서 선별 균주의 근육의 단백질 합성 및 분해 관련 유전자 발현 조절능 확인
SB011 선별 균주의 투여에 따른 근육의 단백질 합성 및 분해 관련 유전자의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이, 과산화수소(H2O2) 처리에 의해 감소된 근육의 단백질 합성 유전자인 Akt 및 mTor 발현 수준이 본 발명의 SB011 균주 처리로 인해 유의미하게 증가하였으며, 근육의 단백질 분해 유전자인 MuRF-1 및 Atrogin-1의 경우, 과산화수소 처리에 의해 증가된 발현 수준이 본 발명의 SB011 균주를 처리한 군에서 유의미하게 감소한 것을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 근손실 동물모델에서 선별 균주의 근력개선 확인
근손실 동물모델에서 SB011 선별 균주를 이용하여 제조한 콩 발효물 투여에 따른 근력개선 효과를 확인하였다.
덱사메타손을 단독투여한 대조군(Dex)에서 근손실을 유발한 0day를 기준으로 2일간 간격으로 총 4회 악력(grip strenth)를 측정한 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 2일째부터 근손실이 진행되어 정상군(Cont)에 대비하여 악력이 유의미하게 감소되었고, 이에 대비하여 4일째부터 본 발명의 SB011 균주를 이용한 콩 발효물 투여군에서 악력이 유의미하게 증가된 것을 알 수 있었다.
또한, 해부 후, 비복근 및 비장근을 분리하여 근육량을 측정한 결과, 정상군(Cont)에 대비하여 덱사메타손을 단독투여한 대조군(Dex)의 경우, 비복근 및 비장근 모두 근육량이 유의미하게 감소된 반면, 본 발명의 SB011 균주를 이용한 콩 발효물 투여군에서는 덱사메타손을 단독투여한 대조군(Dex)에 대비하여 근육량이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다(도 6).
실시예 5. 선별 균주의 동정
최종 선발된 SB011 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 29) 분석 결과를 바탕으로 BLAST 검색한 결과, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)와 99.93% 상동성을 나타내었다(도 7). 최종적으로 선발된 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주로 명명하였고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2023년 5월 12일자로 기탁번호 KCTC19094P로 기탁하였다.
실시예 6. 선별 균주의 Bacillus cereu s 독소 유전자 보유 유무 분석
최종 선발된 SB011 균주의 Bacillus cereus 독소 유전자 보유 유무를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 4에 개시한 바와 같이 최종 선발된 SB011 균주가 바실러스 세레우스가 생성하는 것으로 알려진 8종의 독소 유전자를 보유하지 않는 것을 알 수 있었다.
SB011의 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석 결과
Target SB011
hblA ND1)
hblB ND
hblC ND
hblD ND
nheA ND
nheB ND
nheC ND
cytK ND
ND : 미검출
실시예 7. 선별 균주의 효소 및 기질 이용능 확인
효소활성 시험 결과, 본 발명의 SB011 균주는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리아파제(esterase lipase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성을 가지고 있으며, 유해효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 생성하지 않는 것으로 나타났다(표 5).
또한, 본 발명의 SB011 균주의 당 이용성을 분석한 결과, 글리세롤(Glycerol), L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(riose), D-리보스(D-ribose), 메틸β-D-자일로피라노시드(Methyl-β-D-xylopyranoside), D-갈락토스(D-galactose), D-글루코스(D-glucose), D-푸룩토스(D-fructose), 이노시톨(inositol), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), α-메틸-D-글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), N-아세틸-글루코사민(N-Acethyl-Glucosamine), 에스쿨린(esculin), 말토스(mlatose), 수크로스(sucrose), 트레할로스(Trehalose), 라피노스(raffinose), 전분(Starch), 글리코겐(Glycogen)을 이용할 수 있다는 것을 확인하였다(표 6).
SB011 균주의 효소 활성 확인
NO. Enzyme SB011
1 Control 0
2 Alkaline phosphatase 0
3 Esterase (C4) 3
4 Esterase lipase (C8) 2
5 Lipase (C14) 0
6 Leucine arylamidase 0
7 Valine arylamidase 0
8 Cystine arylamidase 0
9 Trypisn 0
10 α-chymotrypsin 0
11 Acid phosphatase 0
12 Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase 1
13 α-Galactosidase 1
14 β-Galactosidase 1
15 β-Glucuronidase 0
16 α-Glucosidase 4
17 β-Glucosidase 0
18 N-acetyl-β-glucosamidase 0
19 α-manosidase 0
20 α-fucosidase 0
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC19094P 20230512

Claims (9)

  1. 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 리파아제(lipase), 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리아파제(esterase lipase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 분비능 및 근육세포 증식능이 있고, 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin) 및 사이토톡신 K(Cytotoxin K) 유전자를 보유하지 않으며, β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCTC19094P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB011 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물.
  4. 제1항의 균주 또는 제3항의 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항의 균주 또는 제3항의 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강기능식품 조성물.
  7. 제1항의 균주 또는 제3항의 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증, 악액질(cachexia), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 근육 감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
KR1020230069735A 2023-05-31 2023-05-31 바실러스 서틸리스 sb011 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력강화, 근육증강, 근육분화, 근육재생 또는 근감소의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR102577640B1 (ko)

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KR102651344B1 (ko) 2023-12-20 2024-03-27 주식회사 상상바이오 항염, 근육 증강, 관절 건강 및 연골 건강 개선용 식품 조성물

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KR20200008977A (ko) * 2018-07-17 2020-01-29 서울대학교산학협력단 약콩 발효물을 포함하는 근감소증의 예방, 치료용, 근력 개선 또는 근육량 증대용 조성물
KR102159379B1 (ko) * 2019-07-04 2020-09-24 재단법인 발효미생물산업진흥원 장 부착능 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 srcm101371 균주 및 이의 용도
KR20220081452A (ko) * 2020-12-08 2022-06-16 연세대학교 원주산학협력단 락토바실러스 플란타룸 Q1(Lactobacillus plantarum Q1, LPQ1)을 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20230005058A (ko) * 2021-06-30 2023-01-09 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 속 균주 3종을 포함하는 조성물 및 이의 용도

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