KR20160045661A - 비타민 ｋ2 생성능이 높은 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 청국장의 제조방법 - Google Patents

비타민 ｋ2 생성능이 높은 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 청국장의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 및 이를 이용한 청국장의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주는 비타민 K2 합성능이 기존의 공지된 균주보다 높으며, 이 균주를 이용하여 본 발명의 최적화된 발효 조건으로 제조된 청국장은 기존의 발효식품에 비해보다 많은 양의 K2 비타민을 함유하고 있어 골다공증 예방 및 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다

Description

비타민 Ｋ2 생성능이 높은 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 청국장의 제조방법{Bacillus subtilis having high productivity of vitamin K2 and method for producing cheonggukjang using the same}
본 발명은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 및 이를 이용한 청국장의 제조방법에 관한 것이다.
최근 의료기술의 발달과 건강이 증진됨에 따라 노년층의 인구가 증가로 골다공증은 인간의 건강문제에 심각한 위협 요인이 되고 있다. 골다공증은 그 자체로는 증상이 없으나, 낮은 골량과 골조직 구조의 황폐화로 인하여, 대퇴골, 척추, 손목 등의 골절 위험도를 증가시키는 원인이 되며, 이로 인하여 높은 이환율과 사망률을 초래하게 된다. 미국의 경우, 1995년 기준으로 골다공증과 관련된 질병의 치료를 위하여 연간 138억 달러가 소비되고 있고, 골다공증 관련 사회 경제적 비용 또한 증가하고 있어 이에 대한 예방관리가 필요한 상황이다. 골다공증은 남성의 경우 연령이 증가함에 따라 천천히 진행되는 반면, 여성은 폐경을 기점으로 골밀도가 급속도로 감소하므로 폐경기 여성에게는 유병률이 상대적으로 높다. 우리나라는 한국인의 50세 이상 여성 중 50%가 골감소증을, 20~30%가 골다공증을 가지고 있으며, 60~69세의 한국여성의 골다공증 유병률이 24.9%라고 보고되었다.
한편, 비타민 K2는 골아세포 형성을 촉진시키고, 골파괴세포를 감소시켜 골형성을 돕고, 골 흡수를 막아주는 역할을 한다. 뼈에 존재하는 오스테오칼신(osteocalcin)은 일명 Bone Gla(γ-calboxyl glutamic acid) protein 이라고 불리는 단백질로서 칼슘과 결합할 수 있는 Gla를 3개 포함하고 있는데 비타민 K2에 의하여 카르복실화되어야 칼슘과 결합할 수 있으며, 비타민 K2가 결핍되는 경우, 카르복실화되지 않은 오스테오칼신은 낮은 수준으로 카르복실화(under-carboxylatio)된 상태로 혈액으로 흘러오게 되고, 상기 혈액 중에 낮은 수준으로 카르복실화된 오스테오칼신(under-carboxylated osteocalcin)이 증가되어 골다공증이 유발될 수 있다.
따라서, 골다공증 예방은 칼슘 흡수가 중요한 요인으로 작용하는데, 오스테오칼신(osteocalcin)은 칼슘과 결합하여 뼈의 무기질화 과정에 작용하고, 오스테오칼신(osteocalcin)생성은 비타민 K2에 의존한다. 비타민 K2의 공급원으로 일반식품은 함량이 매우 부족하기 때문에 바실러스 서브틸리스가 합성하는 대두발효제품을 권장하고 있으며, 이러한 관점에서 일본에서는 "나토(natto )"를 이용한 칼슘 흡수와 관련 특정보건용 식품이 시판되고 있고 또한 미국에서도 비타민 K2를 강화시킨 콩 발효 제품이 판매되고 있으나 국내에서는 아직 이러한 연구는 전혀 진행되지 않고 있으며 제품 또한 개발되지 못하고 있다. 따라서 비타민 K2의 합성능이 우수한 균주 및 건강기능식품의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
청국장은 콜레스테롤 저하, 고혈압방지 효과, 항산화효과, 항균효과, 항암효과 및 혈전용해활성과 관련된다고 보고되고 있어, 청국장은 많은 질병에 대한 건강기능식품으로 사용가능하다.
이에 본 발명자들은 기존의 우수한 효능을 가진 청국장에 비타민 K2를 강화시키고자 노력한 결과, 비타민 K2의 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스를 동정하였고, 이를 이용하여 청국장을 제조하는 경우, 메나퀴논-7의 함량이 우수함을 확인하였으며, 메나퀴논-7을 생산하기 위한 최적 배양조건을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(Bacillus subtilis BY07) 균주를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(Bacillus subtilis BY07)를 이용한 청국장의 제조 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(Bacillus subtilis BY07)를 이용하여 제조한 청국장을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(Bacillus subtilis BY07)를 제공한다.
또한, 본 발명은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(Bacillus subtilis BY07)를 이용한 청국장의 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(Bacillus subtilis BY07)를 이용하여 제조한 청국장을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주는 비타민 K2 합성능이 기존의 공지된 균주보다 높으며, 이 균주를 이용하여 본 발명의 최적화된 발효 조건으로 제조된 청국장은 기존의 발효식품에 비교하여 보다 많은 양의 K2 비타민을 함유하고 있어 골다공증 예방 및 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HPLC로 얻어진 메나퀴논-7 (menaquinone-7)의 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주에 의하여 발효된 청국장에서 메나퀴논-7의 함량을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주와 다른 균주 사이의 자이레이즈 B 유전자 서열계통수를 나타낸 도이다.
(B.w.KBAB4=Bacillus_weihenstephanensis_KBAB4,_NC_010184;
B.cereus=Bacillus_cereus_Q1,_CP000227;
B.an.AB190=Bacillus_anthracis,_AB190227;
B.t.str_CP=Bacillus_thuringiensis_str,_CP000485;
B.p.SAFR-0=Bacillus_pumilus_SAFR-032,_NC_009848;
B.l.NC_006=Bacillus_licheniformis,_NC_006270;
B.am.BY-1=Bacillus_amyloliquefaciens_BY-1_KCTC11712BP;
B.am.FZB42=Bacillus_amyloliquefaciens_FZB42,_CP000560;
B.su.subsp=Bacillus_subtilis_subsp._subtilis_str,_NZ_ABQK01000001;
B.sp._AB01=Bacillus_sp.,_AB010081;
B.halodura=Bacillus_halodurans_C-125,_NC_002570;
B.c.KSM-K1=Bacillus_clausii_KSM-K16,_AP006627;임.)
도 4는 바실러스 아밀로리퀴파엔스 BY-1 균주에 의하여 발효된 청국장에서 메나퀴논-7의 함량을 나타낸 도이다.
도 5는 청국장에서 본 발명의 균주의 배양 온도에 따른 메나퀴논-7 생산능을 확인한 도이다.
도 6은 청국장에서 본 발명의 균주의 접종량에 따른 메나퀴논- 7 생산능을 확인한 도이다.
도 7은 청국장에서 본 발명의 균주의 배양 습도에 따른 메나퀴논-7 생산능을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 균주의 탄소원에 따른 메나퀴논-7의 생산능 확인한 도이다(1:대조구, 2:글루코오스(glucose), 3:글리세롤 (glycerol), 4:말토스(maltose), 5:설탕(sucrose), 6:폴리 글리세롤(poly-glycerol), 7:말티톨 (maltitol), 8:올리고당(oligosaccharide).
도 9는 청국장에서 본 발명의 균주의 말티톨 첨가 농도에 따른 메나퀴논-7의 생산능을 확인한 도이다.
도 10 및 도 11은 청국장에서 본 발명의 균주의 6% 말티톨 첨가에 따른 메나퀴논-7의 생산능을 확인한 도이다.
본 발명은 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY07(수탁번호:KCTC12392BP)를 제공한다.
본 발명의 균주는 청국장을 시험관에 넣고 멸균수를 가한 후, 상등액을 배지에 희석하여 도말하고, 이를 호기적으로 배양 후 콜로니의 색상과 형태를 기준으로 분리하였다. 이 후 대두를 증자 후, 분리된 균주를 대두에 접종한 후 청국장을 제조하여, 본 발명의 균주의 비타민 K2 생성능이 높음을 확인하였다. 이 후, 본 발명의 균주를 gyrB 유전자를 이용하여 동정하여, 본 발명의 균주가 바실러스 서브틸리스에 속하는 균주임을 확인하였고, 이를 바실러스 서브틸리스 BY07(수탁번호:KCTC12392BP)으로 명명하였다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주는 비타민 K2의 합성능이 우수하다. 상기 비타민 K2는 바람직하게는 메나퀴논-7(menaquinone-7)이다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주는 서열번호 1의 자이레이즈 B(gyrage B)를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 BY07, 이의 배양액 또는 이의 배양액의 농축액을 포함하는 청국장 발효용 조성물을 제공한다.
상기 조성물을 이용하여 콩 파쇄물, 대두 또는 검정콩을 발효시켜 청국장을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은,
(ⅰ) 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물을 증자하는 단계;
(ⅱ) 상기 증자된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물에 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(수탁번호:KCTC 12392BP), 이의 배양액 또는 이의 배양액의 농축액을 접종하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 접종된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물을 발효시키는 단계를 포함하는, 청국장의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비타민 K2(메나퀴논-7) 함량이 우수한 청국장을 제공한다.
이하, 본 발명의 청국장의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
상기 (ⅰ)단계는 콩을 증자하는 단계로, 0.2% 내지 0.6%의 소금용액에 대두, 검정콩 또는 콩파쇄물을 8시간 내지 12시간 침지한 후, 이를 100 내지 140℃에서 20분 내지 1시간 동안 멸균 및 증자하고, 40℃ 내지 50℃에서 냉각하여, 이를 균주 접종을 위해 사용할 수 있다.
상기 (ⅱ) 단계는 상기 증자된 대두, 검정콩 또는 콩파쇄물에 콩 파쇄물에 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(수탁번호:KCTC 12392BP), 이의 배양액 또는 상기 이의 배양액의 농축액을 접종하는 단계로, 상기 균주, 상기 균주의 배양액 또는 상기 균주의 배양액의 농축액은 40 내지 60mL의 TSB 배지에서 30 내지 50℃로 5 내지 7시간 동안 1차 배양한 균주, 배양액 또는 배양액의 농축액일 수 있고, 상기 1차 배양 후, 10%의 콩추출물 20 mL에서 30 내지 50℃에서 5 내지 7시간 동안 2차 배양한 균주, 배양액 또는 배양액의 농축액일 수 있다. 상기 1차 배양 및 2차 배양하는 경우, 탄소원으로 글루코오스(glucose), 글리세롤(glycerol), 말토오스(maltose), 설탕(sucrose), 폴리 글리세롤(poly-glycerol), 말티톨(maltitol) 또는 올리고당(oligosaccharide)을 이용할 수 있고, 바람직하게는 말티톨을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, (ⅱ) 단계의 접종은 증자된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물의 총 부피의 2%의 바실리스 서브틸리스 BY07 균주를 접종하는 것을 특징으로 한다.
상기 (ⅲ) 단계는 접종된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물을 발효시키는 단계로, 상기 발효는 41℃ 내지 45℃, 바람직하게는 43℃에서, 습도조건 85% 내지 95%, 바람직하게는 90%에서 수행할 수 있다. 또한, 발효하는 경우, 탄소원으로 말티톨(maltitol)을 첨가하여 발효할 수 있고, 상기 말티톨은 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물의 총 부피의 5 내지 7%, 바람직하게는 6%의 말티톨을 가할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 청국장은 비타민 K2(메나퀴논-7) 함량이 바실러스 아미로리퀴파시엔스 BY-1 균주로 제조된 청국장보다 2~5배 정도 높게 생성함을 확인하였다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 청국장을 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 청국장은 비타민 K2(메나퀴논-7)함량이 종래의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 BY-1 군주로 제조된 청국장보다 2 내지 5배 높게 생성됨으로써, 골다공증의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 청국장을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 청국장을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 바이칼린의 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 비타민 생성능이 우수한 바실러스 서브틸리스 BY 07 균주의 분리 및 동정
1.균주의 분리
청국장은 전라북도에서 전통으로 제조된 제품을 구입하였으며, 수집된 청국장 5 g을 시험관에 넣고, 멸균수 10 mL를 가한 후 80℃에서 15분간 중탕하였다. 이 후 상등액을 LB 아가(agar) 배지(Difco사, USA)에 희석하여 도말하고 호기적으로 37℃에서 2~3일간 배양한 후, 콜로니 색상과 형태 등을 기준으로 균주들을 분리하였다. 이 후, 분리된 균주는 Tryptic Soy Broth (TSB) (Becton, MD, USA)에 24시간 배양하였고, 그 중에서 활성이 가장 높은 균주를 선별하였다.
2. 분리된 균주를 이용한 청국장의 제조
원료 대두는 전북 전주시 하나로 마트에서 2011년산 한국산 백태를 구입하여 사용하였다. 대두(한국산 백태) 50g을 실온에서 24시간 침지한 후 121℃에서 30분간 증자 후 45℃로 냉각시켰다. 분리된 균주들의 청국장 발효능을 확인하기 위하여, 냉각된 대두에 각각의 분리된 균주를 배양한 종균(107 cells/mL)을 2%(v/w) 비율로 접종하여 43℃, 90% 습도로 항온항습기(SeJong Scientific Co. Korea)에서 36시간 배양하여 청국장을 제조하였으며, 이를 시험에 사용하였다.
3 . 청국장에서 비타민 K2 ( Menaquinone -7)생성능이 우수한 균주의 선정
비타민 K 분석을 위한 표준물질로는 메나퀴논-7(menaquinone-7)(Sigma-Aldrich Co., Louis Mo, USA)을 사용하였고, 분석용 용매인 메탄올(J.T. Baker. Phillipsburg, NJ, USA)은 특급시약을 사용하였다. 비타민 K2 분석은 Wu 와 Ahn의 방법(WU, W.J. and AHN, B.Y. Isolation and identification of Bacillus amyloliquefaciens BY01 with high productivity of menaquinone for cheonggukjang production. J. Korean Soc . Appl . Biol . Chem . 54, 783789; 2011)에 따라 측정하였다. 상기에서 제조된 청국장 4g을 2-프로판올:n-헥산(v/v, 1:2)의 혼합용매로 추출한 후, 핵산층 2 mL을 취하여 질소 가스로 농축하였다. 농축물에 에탄올 2 mL를 첨가하여 0.45 ㎛ 주사기 여과기(syringe filters; Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과한 후, HPLC(Waters, MA, USA)와 Waters 474 Scanning 형광 검출기(Fluorescence Detector)를 이용하여 측정하였다. 이때 사용컬럼은 Nova-Pak C18 column (Part No. WAT086344; 3.9 mm×150 mm, Waters, Dublin, Ireland)을 이용하였다. 이동상은 100% 메탄올이었고, 1.0 mL/min의 유속으로 흘러주었고, 투입양은 20 ㎕ 이었다. 상기 형광 검출기는 여기 파장(excitation) 320nm; 방출 파장(emission) 430 nm 파장으로 측정하였다.
메나퀴논-7의 표준곡선을 도 1에 나타내었고, 분리된 각각의 균주로 발효된 청국장 중 비타민 메나퀴논-7의 함량이 높은 청국장에서의 메나퀴논-7의 측정 결과를 도 2에 나타내었다(상기 메나퀴논 생성능이 가장 우수한 청국장을 발효시킨 균주를 선정함; 바실러스 서브틸리스 BY07 균주)
도 2에 나타난 바와 같이, 분리된 각각의 균주로 발효된 청국장에서 메나퀴논-7의 함량이 가장 높은 청국장에서 메나퀴논 함량은 18.87㎍/g임을 확인하였다.
이하, 상기 청국장을 발효시킨 균주를 동정하였다.
4. 균주의 동정
상기 비타민 K2 생성능이 높은 균주의 분류 및 동정을 위하여, gyrB 유전자의 염기서열을 분석하였다. 자이레이즈 B(Gyrase B) 유전자의 프라이머는 바실러스속들의 자이레이즈 B 유전자의 보존 도메인을 비교하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 FZB42(Bacillus amyloliquefaciens FZB42; CP000560)의 자이레이즈 B 유전자의127 ~ 142 bp와 1495 ~ 1511 bp의 염기서열과 같은 하기 표 1에 제시된 프라이머를 제작하여 사용하였다(Yamada et al . 1999; K. Cloning and nucleotide sequence analysis of gyrB of Bacillus cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, and B. anthracis and their application to the detection of B. cereus in rice. Appl. Environ. Microbiol . 65(4), 14831490).
프라이머 염기서열
forward primer(GyrB135) 5`CCC AAG CTT AAC TGC ACT GGG AAA TYG THG AYA AYA G3`
reverse primer(gyrB1510) 5`CGG AAT TCG GAT CCA CRT CGG CRT CBG TCA TRA T3’
자이레이즈 B 유전자를 클로닝하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 Wu와 Ahn (Wu and Ahn 2011)방법으로 수행하였다. 균주에서 추출한 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형 DNA로 사용하였고, PCR 증폭은 My Genie 96 Thermal block (Bioneer Co., Daejon, Korea)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응 용액은 PCR premixer (Bioneer Co., Korea)에서 제작된 상기 표 2의 프라이머 (10 pmol/μL) 3 μL, 주형 DNA(10 ng; Genomic DNA) 3 μL 및 멸균증류수 44 μL를 혼합하였다. 상기 혼합액에 pfu 중합효소 1 (pfu polymerase 1 unit)을 가하고, 미네랄 오일을 가하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 4분 동안 변성(denaturation)을 1 사이클 수행하고, 94℃에 1 분 동안 변성(denaturation), 58℃에 1 분간 결합(annealing) 시킨 후 72℃에 1분간 신장(elongation)과정을 30 사이클을 수행하였다. 이 후, 72℃에서 10 분간 최종 신장(final extention)을 통하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 밴드는 Agarose Gel Extraction Kit (MEGAspinTM, Intron Co, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하고, 코스모진텍 유전자 해석센터 (Seoul, korea) 에 염기서열 분석을 의뢰하였고, 분석된 자이레이즈 B(gyrage B)의 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
염기서열 분석을 통하여 얻은 균주의 서열번호 1의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였고, 이의 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
또한, ClustalW Multiple Sequence Alignment 프로그램을 이용하여 계통학적 트리(phylogenetic tree)를 분석하였다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.
표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이, 청국장에서 비타민 K2의 생성능이 우수한 균주의 자이레이즈 B 유전자 단편들과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY-1 (KCTC11712BP) 및 GeneBank에서의 DNA 서열을 비교한 결과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 99% 이상의 상동성을 나타내었고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 최종 확인하였다. 따라서 최종 분리 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) BY07로 명명하였으며, 생명공학연구원 유전자원센터에 2013년 4월 3일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 12392BP를 수여받았다.
B.w.KBAB4 ATTGATGAAGCTTTAGCAGGATATTGTGATGAAATTAATGTCAGTATTGAAGAAGATAAT
B.cereus ATTGATGAAGCACTTGCAGGTTACTGTGATGAAATTAACGTTAGTATCGAAGAAGATAAT
B.an.AB190 ATCGATGAAGCACTTGCAGGGTACTGTGACGAAATTAACGTTAGTATCGAAGAAGATAAT
B.t.str_CP ATCGATGAAGCACTTGCAGGGTACTGTGACGAAATTAACGTTAGTATCGAAGAAGATAAT
B.p.SAFR-0 ATTGATGAGGCTTTAGCTGGATATTGCACAGATATTACCGTGCAAATTGAAAAGGATAAT
B.l.NC_006 ATCGATGAAGCATTGGCCGGTTACTGCACTGAAATCAATGTCGCAATTGAAAAAGACAAC
B.am.BY-1 --------TGCCCTGGCCGGTTATTGTACAGATATTAATATCGAGATTGAAAAAGATAAC
B.am.FZB42 ATTGACGAAGCCCTGGCCGGTTATTGTACAGATATTAACATCGAGATTGAAAAAGATAAC
BY07. TTGGGAACAAGCTTCGCCGGTTATTGTACGGATATCAATATCCAAATCGAAAAAGACAAC
B.su.subsp ATTGACGAAGCCCTCGCCGGTTATTGTACGGATATCAATATCCAAATCGAAAAAGACAAC
B.sp._AB01 ATTGACGAAGCGATGGCTGGCTTTTGTGATGAGATCGGGGTTGTAATCGAAGAGGATAAT
B.halodura ATTGACGAAGCGATGGCTGGCTTTTGTGATGAGATCGGGGTTGTAATCGAAGAGGATAAT
B.c.KSM-K1 ATTGACGAAGCGATGGCTGGTTTCTGTGATGAAATTAAAGTAACGATCGAGGAAGGAAAC
* ** ** * ** ** ** * ** ** * * **
B.w.KBAB4 AGTATTGTTGTAACAGATGATGGTCGTGGTATCCCTGTTGGTATACAAGAAAAAATGGGA
B.cereus AGTATTCGTGTAACGGATAATGGACGTGGTATTCCAGTTGGTATACAAGAAAAAATGGGA
B.an.AB190 AGTATTCGTGTAACAGATAATGGACGTGGTATTCCAGTTGGTATACAAGAAAAAATGGGA
B.t.str_CP AGTATTCGTGTAACAGATAATGGACGTGGTATTCCAGTTGGTATACAAGAAAAAATGGGA
B.p.SAFR-0 AGCATTACAGTGAAAGATAATGGTCGCGGAATTCCTGTTGGGATTCATGAGAAAATGGGA
B.l.NC_006 AGCATCACAGTAAAAGACAACGGACGGGGTATCCCGGTCGGTATTCATGAGAAGATGGGT
B.am.BY-1 AGCATTACCGTTAAGGACAACGGGCGCGGAATTCCGGTCGGTATCCAGGAGAAGATGGGC
B.am.FZB42 AGCATTACCGTTAAGGACAACGGGCGCGGAATTCCGGTCGGTATCCAGGAGAAGATGGGC
BY07 . AGTATCACGGTTGTAGATAATGGCCGCGGTATTCCAGTCGGTATTCATGAAAAAATGGGC
B.su.subsp AGTATCACGGTTGTAGATAATGGCCGCGGTATTCCAGTCGGTATTCATGAAAAAATGGGC
B.sp._AB01 AGCATTACAGTTACCGACAATGGTCGAGGCATTCCTGTTGGGATTCATGAAAAGATGGGG
B.halodura AGCATTACAGTTACCGACAATGGTCGAGGCATTCCTGTTGGGATTCATGAAAAGATGGGG
B.c.KSM-K1 GCCCTTACGGTTGAGGATAATGGCCGTGGCATTCCTGTCGGCATCCAAGAAAAAATGGGC
* ** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** *****
B.w.KBAB4 CGTCCTGCTGTAGAAGTTATTATGACGGTACTCCATGCCGGTGGTAAATTTGGCGGTGGT
B.cereus CGTCCTGCTGTAGAGGTTATTATGACCGTTCTTCATGCTGGTGGTAAGTTTGGCGGCGGC
B.an.AB190 CGTCCTGCTGTAGAAGTTATTATGACCGTTCTTCATGCTGGTGGTAAGTTTGGCGGCGGC
B.t.str_CP CGTCCTGCTGTAGAAGTTATTATGACCGTTCTTCATGCTGGTGGTAAGTTTGGCGGCGGG
B.p.SAFR-0 CGTCCTGCTGTAGAGGTTATTATGACTGTTCTTCACGCTGGCGGTAAATTTGACGGCAGT
B.l.NC_006 CGTCCCGCTGTGGAAGTCATCATGACTGTCCTGCACGCCGGAGGAAAGTTTGACGGAAGC
B.am.BY-1 CGCCCTGCGGTTGAAGTCATCATGACCGTTCTCCACGCCGGCGGTAAATTTGACGGAAGC
B.am.FZB42 CGCCCTGCGGTTGAAGTTATCATGACCGTTCTCCACGCCGGCGGTAAATTTGACGGAAGC
BY07. CGTCCTGCGGTAGAAGTCATTATGACGGTACTTCATGCCGGAGGAAAATTTGACGGAAGC
B.su.subsp CGTCCTGCGGTAGAAGTCATTATGACGGTGCTTCATGCCGGAGGAAAATTTGACGGAAGC
B.sp._AB01 CGTCCGGCTGTCGAGGTCATTATGACCGTTCTCCATGCAGGAGGGAAGTTCGGCGGCGGT
B.halodura CGTCCGGCTGTCGAGGTCATTATGACCGTTCTCCATGCAGGAGGGAAGTTCGGCGGCGGT
B.c.KSM-K1 CGTCCGGCGGTCGAGGTCATTATGACTACCCTTCATGCCGGAGGGAAATTTGGCGGTGGC
** ** ** ** ** ** ** ***** ** ** ** ** ** ** ** * *** *
B.w.KBAB4 GGTTATAAAGTTTCTGGTGGTTTGCATGGTGTAGGTGCATCTGTTGTAAATGCTTTATCA
B.cereus GGTTATAAAGTTTCTGGTGGTTTGCATGGTGTTGGGGCATCTGTAGTAAATGCCCTATCA
B.an.AB190 GGTTATAAAGTTTCTGGTGGTTTGCATGGTGTTGGGGCATCTGTAGTAAATGCTCTATCA
B.t.str_CP GGTTATAAAGTTTCTGGTGGTTTGCATGGTGTTGGGGCATCTGTAGTAAATGCTCTATCA
B.p.SAFR-0 GGTTATAAAGTATCTGGCGGTCTGCATGGCGTAGGGGCATCTGTTGTTAATGCGTTATCT
B.l.NC_006 GGATATAAAGTTTCGGGCGGTTTGCACGGCGTCGGTGCTTCTGTTGTTAACGCCCTTTCA
B.am.BY-1 GGATATAAAGTATCCGGCGGTCTTCACGGTGTAGGGGCGTCCGTCGTAAACGCCTTGTCG
B.am.FZB42 GGATATAAAGTATCCGGCGGTCTTCACGGTGTAGGGGCGTCCGTCGTAAACGCCTTGTCG
BY07 . GGCTATAAAGTATCCGGAGGATTACACGGTGTAGGTGCGTCTGTCGTAAACGCACTATCA
B.su.subsp GGCTATAAAGTATCCGGAGGATTACACGGTGTAGGTGCGTCGGTCGTAAACGCACTATCA
B.sp._AB01 GGTTATAAAGTATCTGGTGGTTTGCACGGTGTAGGTGCATCCGTCGTAAATGCTTTATCG
B.halodura GGTTATAAAGTATCTGGTGGTTTGCACGGTGTAGGTGCATCCGTCGTAAATGCTTTATCG
B.c.KSM-K1 GGCTATAAAGTATCAGGCGGCCTTCACGGAGTTGGTGCTTCCGTCGTCAACGCGCTGTCG
** ******** ** ** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** * **
B.w.KBAB4 ACAGAATTAGAGGTATTTGTACATCGAGATGGAAAAATACACTATCAAAAATATGAACGC
B.cereus ACAGAACTAGAGGTATTTGTACATCGTGAAGGTAAAATCCATTATCAAAAATACGAAAGA
B.an.AB190 ACAGAACTAGAGGTATTTGTACATCGTGAAGGTAAAATCCATTATCAAAAATACGAAAGA
B.t.str_CP ACAGAACTAGAGGTATTTGTACATCGTGAAGGTAAAATCCATTATCAAAAATACGAAAGA
B.p.SAFR-0 ACGACCTTAGACGTGACCGTATATCGTGATGGGAAAATTCATTATCAACAATTCAAACGC
B.l.NC_006 ACCGAGCTGGATGTAACGGTTTACAGAGATGGAAAAATCCATTATCAGGAATTTGAACGT
B.am.BY-1 ACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCGTGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGC
B.am.FZB42 ACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCGTGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGC
BY07. ACAGAGCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACTTATAAACGC
B.su.subsp ACAGAGCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGC
B.sp._AB01 ACGATGCTGGAAGTAGAAGTTCACCGTGAAGGGAAAGTCCACTATCAAAAATTTCATCGC
B.halodura ACGATGCTGGAAGTAGAAGTTCACCGTGAAGGGAAAGTCCACTATCAAAAATTTCATCGC
B.c.KSM-K1 ACACACTTAACGGTCAATGTCCATTTAGACGGGAAAATCCATAGCCAATCTTATAGCCGT
** * ** ** * ** ** *** * ** ** * *
B.w.KBAB4 GGGGTCCCGGCTGCGGATTTAAAAGTAATAGGTGAAACTGATCGTACAGGAACGATCACA
B.cereus GGTATTCCGGTTGCGGATTTAAAAGTCATTGGTGACACAGATCAAACAGGAACGATAACT
B.an.AB190 GGTATTCCGGTTGCGGATTTAAAAGTCATTGGTGATACAGATCAAACGGGAACGATAACT
B.t.str_CP GGTATTCCGGTTGCGGATTTAAAAGTCATTGGTGATACAGATCAAACGGGAACGATAACT
B.p.SAFR-0 GGTGTTCCAGTTGGAGATTTAGAGATCATTGGTGAAACAGATGTTACAGGGACAACCACT
B.l.NC_006 GGCGTTCCGAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGATACGGAAGTGACGGGAACGACCACA
B.am.BY-1 GGTGTGCCTGTGGCCGATCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACG
B.am.FZB42 GGTGTACCTGTGGCTGATCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACG
BY07 . GGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACA
B.su.subsp GGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACA
B.sp._AB01 GGTGTACCTGCTGCTGATTTAGAAGTCATTGGCACGACCGATCGAACAGGCACGAAAATC
B.halodura GGTGTACCTGCTGCTGATTTAGAAGTCATTGGCACGACCGATCGAACAGGCACGAAAATC
B.c.KSM-K1 GGTGTTCCCGATGCTGATTTGACCGTCATAGGTGAAACCGATAAAACCGGCACGACTATT
** * ** ** * * ** ** ** ** ** ** ** * *
B.w.KBAB4 CGCTTTAAGCCAGATTCAGAAATTTTTACAGAGACGACAGAATACGAATTTGATACATTA
B.cereus CGATTTAAACCAGATCCAGAAATTTTTCAGGAAACAACAGTATACGAATTTGATACGCTC
B.an.AB190 CGATTTAAACCAGATCCAGAAATTTTTCAGGAAACAACAGTATACGAATTTGATACACTA
B.t.str_CP CGATTTAAACCAGATCCAGAAATTTTTCAGGAAACAACAGTATACGAATTTGATACACTA
B.p.SAFR-0 CATTTTGTGCCAGATCCAGAAATTTTTACTGAAACCATTGAATTTGATTACGACACACTT
B.l.NC_006 CACTTCAAGCCTGATCCGGAAATATTCACGGAAACGACTGAATACGACTATGATACGCTC
B.am.BY-1 CACTTCGTTCCGGATCCGGAAATCTTCAAAGAAACAACTGTATACGACTATGATCTGCTT
B.am.FZB42 CACTTCGTTCCGGATCCGGAAATCTTCAAAGAAACAATCGTATACGACTATGATCTGCTT
BY07. CATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTATGATCTGCTT
B.su.subsp CATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTT
B.sp._AB01 CACTTTAAACCAGACGGTGACATTTTTACGGAAACAACGGTTTTCGAATATGATACTCTC
B.halodura CACTTTAAACCAGACGGTGACATTTTTACGGAAACAACGGTTTTCGAATATGATACTCTC
B.c.KSM-K1 ACGTTCCAGCCAGACCCAGAAATTTTCCGGGAGACGGTTGAATTTGATTATGAAACACTT
** ** ** ** ** ** ** ** * * ** * ** *
B.w.KBAB4 GCGACTCGTATGCGTGAGTTGGCGTTTTTAAATCGTAATATTAAATTAACAATTGAAGAT
B.cereus GCAACTCGTATGCGTGAATTAGCATTTTTAAATCGTAATATTAAATTAACAATTGAAGAT
B.an.AB190 GCAACTCGTATGCGTGAATTAGCATTTTTAAATCGTAATATTAAACTGACGATTGAAGAT
B.t.str_CP GCAACTCGTATGCGTGAATTAGCATTTTTAAATCGTAATATTAAACTGACGATTGAAGAT
B.p.SAFR-0 GCTAACCGTGTACGTGAATTAGCTTTCTTAACAAAAGGTGTAAACATCATTATTGAAGAT
B.l.NC_006 GCCACTCGTGTCCGCGAACTCGCTTTCTTGACAAAAGGCGTCAAAATCACGATCGAAGAC
B.am.BY-1 TCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAGGCGTAAACATCACGATTGAAGAC
B.am.FZB42 TCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAGGCGTAAACATCACGATTGAAGAC
BY07 . GCCAACCGCGTACGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAGGAT
B.su.subsp GCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGAT
B.sp._AB01 GCATCACGGTTGCGTGAATTGGCCTTTTTAAATAAAGGATTGCGCATTAAGATTACCGAT
B.halodura GCATCACGGTTGCGTGAATTGGCCTTTTTAAATAAAGGATTGCGCATTAAGATTACCGAT
B.c.KSM-K1 GCTGCCCGCATTCGCGAGTTGGCGTTTTTAAACAAAGGGCTGACGATCAAAATTGAGGAC
* ** * ** ** * ** ** * * * * * ** **
B.w.KBAB4 AAGCGTGA---ACATAAGCAAAAGAAAGAATTCCATTATGAAGGTGGAATTAAATCATAT
B.cereus AAACGTGA---ACATAAGCAAAAGAAAGAATTCCATTATGAAGGTGGAATTAAATCATAC
B.an.AB190 AAACGTGA---ACATAAGCAAAAAAAAGAATTCCATTATGAAGGTGGAATTAAATCATAT
B.t.str_CP AAACGTGA---ACATAAGCAAAAAAAAGAATTCCATTATGAAGGTGGAATTAAATCATAT
B.p.SAFR-0 TTACGCGAAGGTAAAGAACGACGAAATGAATACTGCTACGAAGGCGGTATTAAGAGCTAT
B.l.NC_006 AAGCGAGAAGGAAAAGAACGCAAGAATGAATACTGCTATGAAGGCGGTATTAAAAGCTAT
B.am.BY-1 AAACGTGAAGGACAAGAACGGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTAT
B.am.FZB42 AAACGTGAAGGACAAGAACGGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTAT
BY07. AAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTAT
B.su.subsp AAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTAT
B.sp._AB01 ATGCGTGAGGAAGAAAAGT---CGGACGAATTTCACTATGAGGGCGGGATCGCTTCATTT
B.halodura ATGCGTGAGGAAGAAAAGT---CGGACGAATTTCACTATGAGGGCGGGATCGCTTCATTT
B.c.KSM-K1 AAACGAACAGAGGACGGCAAAAAGGCCACCTACCATTACGAGGGTGGAATTTCGTCGTTT
** * * ** ** ** ** ** *
B.w.KBAB4 GTTGAACATTTAAATCGTTCAAAACAACCGATTCATGAAGAACCTGTATATGTTGACGGT
B.cereus GTCGAGCATTTAAATCGCTCAAAACAACCAATCCATGAAGAACCTGTATATGTAGAAGGA
B.an.AB190 GTTGAGCATTTAAACCGCTCAAAACAACCAATCCATGAAGAGCCTGTATATGTAGAAGGA
B.t.str_CP GTTGAGCATTTAAACCGCTCAAAACAACCAATCCATGAAGAGCCTGTATATGTAGAAGGA
B.p.SAFR-0 GTAGAACATTTAAATCGCTCAAAAGAAGTCGTTCATGAAGAACCTGTTTACATCGAAGGT
B.l.NC_006 GTTGAACACTTGAACCGTTCGCGGGAAGTTATTCATGAAGAGCCGGTCTATATTGAAGGA
B.am.BY-1 GTTGAGTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGC
B.am.FZB42 GTTGAGTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGC
BY07 . GTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGC
B.su.subsp GTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGC
B.sp._AB01 GTGGAGCATTTAAACCGCACGCGTGAGACTTTGCACGAAACGCCGATCCATATCGAAGGA
B.halodura GTGGAGCATTTAAACCGCACGCGTGAGACTTTGCACGAAACGCCGATCCATATCGAAGGA
B.c.KSM-K1 GTCAAACACCTCAACCGTTCAAAAGAAACGCTCCATGAAGAGCCGATTTATGTGGAAAGC
** * * * ** ** * * * ** *** ** * * * ** *
B.w.KBAB4 TCAAAAGATGGGATTCAGGTTGAGGTTGCTCTTCAATATAACGAAGGCTATACAAATCAT
B.cereus TCAAAAGATGGTATTCAAGTTGAGGTTTCCTTACAGTATAACGAAGGATATACAAATAAT
B.an.AB190 TCAAAAGATGGTATTCAAGTTGAAGTTTCCTTACAGTATAACGAAGGATATACAAATAAT
B.t.str_CP TCAAAAGATGGTATTCAAGTTGAAGTTTCCTTACAGTATAACGAAGGATATACAAATAAT
B.p.SAFR-0 GAAAGAGACGGAATTACGGTTGAAGTGGCATTACAATATAACGATTCCTATACAAGCAAC
B.l.NC_006 TCCAAAGACGGCATTACAGTCGAGGTGGCTCTTCAATACAATGACAGCTATACAAGCAAC
B.am.BY-1 GAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAAT
B.am.FZB42 GAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCGTTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAAC
BY07. GAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAAC
B.su.subsp GAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAAC
B.sp._AB01 GAGAAGCAAGGCGTTTACGTAGAGATCGCCGTCCAATATAACGATGGATTCACGAGCAAT
B.halodura GAGAAGCAAGGCGTTTACGTAGAGATCGCCGTCCAATATAACGATGGATTCACGAGCAAT
B.c.KSM-K1 GAAAAAGACGGCATTTCTGTTGAAGTAGCCGTCCAATACAATGACGGATTTACGAGCAGT
* * ** * ** ** * * * ** ** ** ** * ** *
B.w.KBAB4 ATTTATTCATTTACAAATAATATTCATACGTATGAAGGCGGTACACATGAGGTAGGTTTT
B.cereus ATTTACTCATTTACGAATAACATTCATACGTATGAAGGTGGAACACATGAAGTAGGGTTT
B.an.AB190 ATTTACTCATTTACGAACAACATTCACACGTATGAAGGTGGAACACATGAAGTAGGGTTT
B.t.str_CP ATTTACTCATTTACGAACAACATTCACACGTATGAAGGTGGAACACATGAAGTAGGGTTT
B.p.SAFR-0 ATCTATTCCTTCGCCAACAATATCAACACGTATGAAGGCGGAACACACGAAGCAGGCTTT
B.l.NC_006 ATTTATTCATTTGCTAACAACATTCATACGTATGAAGGCGGAACCCATGAAGCCGGCTTT
B.am.BY-1 ATTTATTCTTTCACAAATAATATCAACACATACGAAGGCGGGACGCACGAAGCCGGATTT
B.am.FZB42 ATTTATTCTTTCACAAATAACATCAACACATACGAAGGCGGGACGCACGAAGCCGGATTT
BY07 . ATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTC
B.su.subsp ATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTC
B.sp._AB01 ATTTACTCGTTTGCTAATAATATCAACACCCATGAAGGGGGAACGCACGAGTCAGGGTTT
B.halodura ATTTACTCGTTTGCTAATAATATCAACACCCATGAAGGGGGAACGCACGAGTCAGGGTTT
B.c.KSM-K1 ATTTACTCCTTCGCGAATAACATTAATACCCATGAAGGGGGCACGCATGAATCAGGCTTT
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B.w.KBAB4 AAGACTGCTCTAACACGTGTAATTAACGATTATGGTCGTAAAAATAATATTTTAAAAGAT
B.cereus AAAACAGCTTTAACTCGTGTGATTAACGATTATGGACGTAAAAATAGTATTTTAAAAGAT
B.an.AB190 AAAACAGCTTTAACTCGTGTGATTAACGATTATGGGCGTAAAAATAGTATTCTAAAAGAT
B.t.str_CP AAAACAGCTTTAACTCGTGTGATTAACGATTATGGGCGTAAAAATAGTATTCTAAAAGAT
B.p.SAFR-0 AAAACAGGTCTGACGCGTGTGATCAATGATTATGCTCGTAAAAATGGCGTATTCAAAGAT
B.l.NC_006 AAGACCGGTTTGACGAGGGTCATCAATGATTACGCGAGAAGAAACGGCGTATTCAAAGAA
B.am.BY-1 AAAACCGGTCTGACCCGTGTCATAAACGACTATGCGAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAA
B.am.FZB42 AAAACCGGTCTGACCCGTGTCATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAA
BY07. AAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAA
B.su.subsp AAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAA
B.sp._AB01 AAAACAGGTCTTACTCGTGTCATTAACGATTATGCTCGCAAGCATAATTTGTTCAAAGAA
B.halodura AAAACAGGTCTTACTCGTGTCATTAACGATTATGCTCGCAAGCATAATTTGTTCAAAGAA
B.c.KSM-K1 AAAACAGGCTTGACGCGCGTTATTAATGATTACGCCCGCAAAAATGGGTTGTTTAAAGAA
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B.w.KBAB4 GCGGATAGTAATTTAACTGGTGAAGATGTTCGTGAAGGCTTAACAGCAATCGTGTCAATT
B.cereus GCAGACAGTAACTTAACGGGTGAGGATGTTCGTGAAGGTTTAACTGCAATTGTATCAATT
B.an.AB190 GCAGACAGTAATTTAACTGGTGAGGACGTTCGTGAAGGTTTAACTGCAATTGTATCAATT
B.t.str_CP GCAGACAGTAATTTAACTGGTGAGGACGTTCGTGAAGGTTTAACTGCAATTGTATCAATT
B.p.SAFR-0 GGAGACTCGAATTTGAGCGGTGAAGATGTGCGAGAAGGCTTAACAGCCATTATCTCTATC
B.l.NC_006 AGCGATCCGAACTTAAGCGGAGAAGACGTCCGGGAAGGTTTGACAGCGATTATTTCAATC
B.am.BY-1 AATGATCCGAATTTAAGCGGGGATGATGTGAGAGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATT
B.am.FZB42 AATGATCCGAATTTAAGCGGGGATGATGTGAGAGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATT
BY07 . AATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATC
B.su.subsp AATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATC
B.sp._AB01 AGCGATCCGAACTTAACGGGGGAAGATGTACGTGAAGGATTAACCGCCATTATCTCGGTA
B.halodura AGCGATCCGAACTTAACGGGGGAAGATGTACGTGAAGGATTAACCGCCATTATCTCGGTA
B.c.KSM-K1 AACGATCCAAACTTAAGTGGCGAGGATGTCCGTGAAGGGCTGACAGCGATCATTTCCGTC
** ** * * ** ** ** ** * ***** * ** ** ** * ** *
B.w.KBAB4 AAGCATCCAAATCCACAATTTGAAGGACAAACAAAGACGAAACTTGGAAATAGTGAAGCG
B.cereus AAACATCCAAACCCACAATTTGAAGGACAAACGAAGACGAAACTTGGGAATAGTGAAGCA
B.an.AB190 AAACATCCAAATCCACAATTTGAAGGACAAACGAAGACGAAACTTGGGAATAGTGAAGCG
B.t.str_CP AAACATCCAAATCCACAATTTGAAGGACAAACGAAGACGAAACTTGGGAATAGTGAAGCG
B.p.SAFR-0 AAACATCCAGATCCTCAATTCGAAGGGCAAACGAAGACAAAGCTTGGGAACTCAGAAGCA
B.l.NC_006 AAGCACCCGGATCCTCAATTTGAAGGGCAGACGAAAACAAAGCTCGGCAACTCAGAAGCG
B.am.BY-1 AAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAAAACCAAGCTCGGCAACTCTGAAGCG
B.am.FZB42 AAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAAAACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCG
BY07. AAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCA
B.su.subsp AAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACAAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCA
B.sp._AB01 AAAATTCCTGATCCTCAGTTTGAAGGGCAAACGAAAACGAAGCTAGGAAATAGCGAAGCA
B.halodura AAAATTCCTGATCCTCAGTTTGAAGGGCAAACGAAAACGAAGCTAGGAAATAGCGAAGCA
B.c.KSM-K1 AAAATTCCTGAGCCCCAGTTTGAAGGGCAAACGAAAACAAAGCTAGGAAACAGTGAAGCA
** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** *****
B.w.KBAB4 AGAACGATTACAGAGTCTGTATTCTCAGAGGCGTTTGAAAAGTTCTTACTAGAAAATCCC
B.cereus AGAACGATTACAGAGTCTGTGTTTTCAGAGGCATTTGAAAAGTTCTTACTAGAAAACCCG
B.an.AB190 AGAACGATTACAGAGTCTGTGTTTTCAGAGGCATTTGAAAAGTTCTTACTAGAAAACCCG
B.t.str_CP AGAACGATTACAGAGTCTGTGTTTTCAGAGGCATTTGAAAAGTTCTTACTAGAAAACCCG
B.p.SAFR-0 AGAACCATTACCGACTCCCTTTTCTCTGAAGCACTTGAGAAATTCCTCTTAGAGAACCCT
B.l.NC_006 CGTACGATAACAGATGCGCTATTTTCAGAAGCGCTTGAAAAGTTTCTGCTAGAAAACCCG
B.am.BY-1 AGAACGATCACTGACACGCTGTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCG
B.am.FZB42 AGAACGATCACTGATACGCTGTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCG
BY07 . CGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCA
B.su.subsp CGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCA
B.sp._AB01 CGTACGATCACTGATTCCCTTTTCACAGAGCATTTTTCCCGGTTTCTGATCGAACATCCG
B.halodura CGTACGATCACTGATTCCCTTTTCACAGAGCATTTTTCCCGGTTTCTGATCGAACATCCG
B.c.KSM-K1 CGCACAATTACTGACTCTTTATTCAGCGAAAGTTTTGCAAGGTTCCTGTCTGAGAATCCA
* ** ** ** ** * * ** * ** * ** * **
B.w.KBAB4 AATGTTGCACGTAAAATTATAGATAAAGGGACTATGGCAGCACGTGCACGTGTAGCGGCT
B.cereus AATGTTGCACGAAAAATCGTAGAAAAAGGTACGATGGCAGCACGTGCACGTGTTGCAGCG
B.an.AB190 AACGTTGCACGAAAAATCGTAGAAAAAGGTACGATGGCAGCGCGTGCACGTGTTGCAGCG
B.t.str_CP AACGTTGCACGAAAAATCGTAGAAAAAGGTACGATGGCAGCGCGTGCACGTGTTGCAGCG
B.p.SAFR-0 GATGCGGCAAAGAAAATTGTGGAGAAAGGCGTGATGGCAGCTCGTGCAAGAATGGCTGCC
B.l.NC_006 GATTCAGCGAAAAAAATCGTTGAAAAAGGGGTTATGGCCGCCAGAGCACGGATGGCTGCA
B.am.BY-1 GACTCAGCCCGCAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCAGCG
B.am.FZB42 GACTCAGCCCGCAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCAGCG
BY07. GATGCAGCCAAAAAAATTGTCGATAAAGGCTTAATGGCGGCAAGAGCAAGAATGGCTGCG
B.su.subsp GATGCAGCCAAAAAAATTGTCGATAAAGGTTTAATGGCGGCAAGAGCAAGAATGGCTGCG
B.sp._AB01 CAAGTGGCACGTAAGCTAGTTGACAAAGGACTCATGGCTTCAAGGGCTAGGGAAGCAGCG
B.halodura CAAGTGGCACGTAAGCTAGTTGACAAAGGACTCATGGCTTCAAGGGCTAGGGAAGCAGCG
B.c.KSM-K1 GGAGTTGCCCGCAAGATTGTCGATAAAGGGTTGATGGCTTCCCGTGCCCGTGAGGCTGCT
** ** * * ** ***** ***** * * ** * ** **
B.w.KBAB4 AAAAAGGCTCGTGAACTAACGCGCCGAAAGAGTGCTCTAGAAGTTTCAAGTTTACCAGGG
B.cereus AAAAAAGCACGTGAATTGACACGCCGCAAGAGCGCATTAGAAGTTTCAAGTTTACCTGGT
B.an.AB190 AAAAAAGCACGTGAATTGACACGTCGTAAGAGCGCGTTAGAAGTTTCAAGTTTACCTGGT
B.t.str_CP AAAAAAGCACGTGAATTGACACGTCGTAAGAGCGCGTTAGAAGTTTCGAGTTTACCTGGT
B.p.SAFR-0 AAAAAGGCACGTGAGCTGACAAGACGTAAAAGCGCACTGGAAGTCTCCAGCTTACCGGGG
B.l.NC_006 AAGAAAGCACGCGAATTGACGCGCAGAAAAAGCGCCCTTGAAGTGTCCAATCTGCCGGGG
B.am.BY-1 AAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGGCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGC
B.am.FZB42 AAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGC
BY07 . AAAAAAGCCCGTGAACTAACACGTCGTAAGAGTGCTTTGGAAATTTCAAACCTGCCCGGT
B.su.subsp AAAAAAGCGCGTGAACTAACACGCCGTAAGAGTGCTTTGGAAATTTCAAACCTGCCCGGT
B.sp._AB01 AAAAAAGCACGTGAGCTTACGCGGAGAAAGAGCGCTCTTGAGGTAAGCTCTCTCCCAGGA
B.halodura AAAAAAGCACGTGAGCTTACGCGGAGAAAGAGCGCTCTTGAGGTAAGCTCTCTCCCAGGA
B.c.KSM-K1 AAAAAGGCCCGTGAGTTGACACGGCGGAAAAGCGCCTTAGAAGTAAGCTCGCTTCCTGGA
** ** ** ** ** * ** * * ** ** ** * ** * * ** **
B.w.KBAB4 AAGCTAGCTGATTGTTCTTCTAAAGATCCAGCAATTAGCGAAATTTACATCGTGGAGGGT
B.cereus AAATTAGCAGATTGCTCTTCGAAAGATCCAGCAATTAGTGAAATTTACATTGTAGAGGGT
B.an.AB190 AAATTAGCAGATTGCTCTTCAAAAGATCCAGCAATTAGTGAAATTTACATTGTAGAGGGT
B.t.str_CP AAATTAGCAGATTGCTCTTCAAAAGATCCAGCAATTAGTGAAATTTACATTGTAGAGGGT
B.p.SAFR-0 AAACTAGCGGACTGTTCTTCTAAAGACCCATCCATCTCTGAACTCTATATCGTAGAGGGA
B.l.NC_006 AAACTTGCTGACTGTTCTTCTAAAGACCCGACGATTTCCGAACTTTACATCGTTGAGGGT
B.am.BY-1 AAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGT
B.am.FZB42 AAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGT
BY07. AAGTTAGCGGACTGCTCTTCAAAAGATCCGAGCATCTCCGAGTTATATATCGTAGAGGGT
B.su.subsp AAGTTAGCGGACTGCTCTTCAAAAGATCCGAGCATCTCCGAGTTATATATCGTAGAGGGT
B.sp._AB01 AAACTAGCAGACTGTTCGTCACGCGACGCTTCGATTAGTGAGATTTACATTGTGGAGGGG
B.halodura AAACTAGCAGACTGTTCGTCACGCGACGCTTCGATTAGTGAGATTTACATTGTGGAGGGG
B.c.KSM-K1 AAGCTAACCGACTGTACATCAAAAGATGCGTCGATTAGCGAATTGTTTATCGTTGAGGGC
** * * ** ** * ** ** * ** ** * * ** ** *****

B.w.KBAB4 GACTCTGCGGGCGGATCTGCAAAACAAGGACGCGATCGTCATTTTCAAGCGATTTTACCA
B.cereus GACTCTGCTGGTGGATCAGCAAAACAAGGGCGTGATCGTCACTTCCAAGCGATTTTACCG
B.an.AB190 GACTCTGCCGGTGGATCAGCAAAGCAAGGGCGTGATCGTCACTTCCAAGCGATTTTACCA
B.t.str_CP GACTCTGCCGGTGGATCAGCAAAGCAAGGGCGTGATCGTCACTTCCAAGCGATTTTACCA
B.p.SAFR-0 GATTCAGCGGGCGGATCTGCTAAGCAAGGTCGTGATCGTCACTTCCAAGCCATTTTGCCG
B.l.NC_006 GACTCTGCGGGCGGATCGGCAAAACAGGGCCGCGACCGTCATTTCCAAGCAATTTTGCCT
B.am.BY-1 GACTCTGCGGGCGGATCAGCGAAACAGGGACGGGACCGCCATTTCCAAGCCATTCTGCCG
B.am.FZB42 GACTCTGCGGGCGGATCAGCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCG
BY07 . GACTCTGCCGGAGGATCTGCTAAACAAGGACGCGACAGACATTTCCAAGCCATTTTGCCG
B.su.subsp GACTCTGCCGGAGGATCTGCTAAACAAGGACGCGACAGACATTTCCAAGCCATTTTGCCG
B.sp._AB01 GACTCTGCTGGCGGATCGGCCAAACAAGGCCGTGATCGGCATTTCCAAGCGATTCTCCCA
B.halodura GACTCTGCTGGCGGATCGGCCAAACAAGGCCGTGATCGGCATTTCCAAGCGATTCTCCCA
B.c.KSM-K1 GATTCTGCCGGCGGTTCGGCAAAAGGGGGCCGAGATCCCCATTTCCAAGCGATTCTTCCT
** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ***** *** * **
B.w.KBAB4 CTGAAGGGTAAAATTATTAACGTTGAAAAGGCACGTTTAGATAAGATTTTATCAAATGAT
B.cereus CTAAAAGGTAAAATTATTAACGTTGAAAAAGCAAGATTGGATAAAATTTTATCTAACGAT
B.an.AB190 CTGAAAGGTAAAATTATTAACGTTGAAAAGGCAAGATTAGATAAAATCTTATCTAACGAT
B.t.str_CP CTGAAAGGTAAAATTATTAACGTTGAAAAGGCAAGATTAGATAAAATCTTATCTAACGAT
B.p.SAFR-0 TTAAGAGGGAAGATCCTAAACGTTGAAAAAGCGCGACTAGATAAAATTCTATCGAACAAC
B.l.NC_006 TTGAGAGGGAAAATTTTGAACGTCGAAAAAGCCCGCCTGGACAAAATATTGTCCAACAAT
B.am.BY-1 CTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGATTCTCTCAAACAAT
B.am.FZB42 CTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAAATTCTCTCAAACAAT
BY07. CTTAGAGGTAAAATCCTAAACGTTGAAAAGGCCAGACTGGATAAAATCCTTTCTAACAAC
B.su.subsp CTTAGAGGTAAAATCCTAAACGTTGAAAAGGCCAGACTGGATAAAATCCTTTCTAACAAC
B.sp._AB01 TTGCGCGGGAAAATCTTAAATGTAGAGAAGGCTCGATTAGATAAAATATTAGCGAACAAT
B.halodura TTGCGCGGGAAAATCTTAAATGTAGAGAAGGCTCGATTAGATAAAATATTAGCGAACAAT
B.c.KSM-K1 TTGCGAGGGAAAATCCTTAACGTAGAAAAAGCCCGTCTGGACAAAATTTTAGCAAACAAT
* ** ** ** * ** ** ** ** ** * * ** ** ** * * ** *
B.w.KBAB4 GAAGTTCGTACAATTATTACAGCAATCGGTACAAATATTGGTGGGGATTTTGCTATTGAA
B.cereus GAAGTGCGTACAATTATTACTGCAATTGGTACGAACATTGGCGGCGATTTTGATATCGAG
B.an.AB190 GAAGTGCGTACAATTATTACTGCAATTGGTACGAACATTGGCGGAGATTTTGATATTGAG
B.t.str_CP GAAGTGCGTACAATTATTACTGCAATTGGTACGAACATTGGCGGAGATTTTGATATTGAG
B.p.SAFR-0 GAGGTTCGTTCAATGATTACAGCATTAGGAACTGGAATCGGAGAAGACTTCAATTTAGAG
B.l.NC_006 GAGGTTCGTTCTATGATCACCGCCCTTGGCACCGGAATCGGGGAAGATTTCAACCTTGAA
B.am.BY-1 GAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACAGGAATCGGCGAAGATTTTAATCT-GAA
B.am.FZB42 GAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACAGGAATCGGAGAAGATTTTAATCTTGAA
BY07 . GAAGTTCGCTCTATGATCACAGCGCTCGGCACAGGTATTGGGGAAGACTTCAACGT-GAG
B.su.subsp GAAGTTCGCTCTATGATCACAGCGCTCGGCACAGGTATCGGAGAAGACTTCAACCTTGAG
B.sp._AB01 GAAATTCGCGCGATCATTACCGCCCTTGGAACAGGAATTGGTGATGATTTCGACATTGAA
B.halodura GAAATTCGCGCGATCATTACCGCCCTTGGAACAGGAATTGGTGATGATTTCGACATTGAA
B.c.KSM-K1 GAAATTCGGATGATCATCACGGCAATTGGCACGGGAATTGGCGATGAATTTGATATTTCA
** * * ** ** ** ** * ** ** ** ** * ** ** *
B.w.KBAB4 AAAGCTCGCTATCATAAA---------
B.cereus AAAGCTCGTTATCATAAA---------
B.an.AB190 AAAGCTCGTTATCATAAA---------
B.t.str_CP AAAGCTCGTTATCATAAA---------
B.p.SAFR-0 AAGGCTCGCTATCACAAA---------
B.l.NC_006 AAAGCCCGCTACCACAAA---------
B.am.BY-1 AAAGCGCG-TATCATAAAGTGTACC--
B.am.FZB42 AAAGCGCGTTATCATAAA---------
BY07. AAAGCCCG-TACCACAAAGGGGGGCCC
B.su.subsp AAAGCCCGTTACCACAAA---------
B.sp._AB01 AAGGCTCGTTACCATAAA---------
B.halodura AAGGCTCGTTACCATAAA---------
B.c.KSM-K1 AAAGCACGCTACCATAAA---------
** ** ** ** ** ***
(상기 표 2에서 B.w.KBAB4=Bacillus_weihenstephanensis_KBAB4,_NC_010184.
B.cereus=Bacillus_cereus_Q1,_CP000227.
B.an.AB190=Bacillus_anthracis,_AB190227.
B.t.str_CP=Bacillus_thuringiensis_str,_CP000485.
B.p.SAFR-0=Bacillus_pumilus_SAFR-032,_NC_009848.
B.l.NC_006=Bacillus_licheniformis,_NC_006270.
B.am.BY-1=Bacillus_amyloliquefaciens_BY-1_KCTC11712BP.
B.am.FZB42=Bacillus_amyloliquefaciens_FZB42,_CP000560.
B.su.subsp=Bacillus_subtilis_subsp._subtilis_str,_NZ_ABQK01000001;
B.sp._AB01=Bacillus_sp.,_AB010081;
B.halodura=Bacillus_halodurans_C-125,_NC_002570;
B.c.KSM-K1=Bacillus_clausii_KSM-K16,_AP006627;임.)
[ 비교예 1] 바실러스 아미로리퀴파시엔스 BY -1(수탁번호: KCTC11712BP )로 발효된 청국장과 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주로 발효된 청국장에서 비타민 K 2 함량 비교
메나퀴논-7(Menaquinone-7) 생산의 공지된 균주인 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY-1 균주 (KCTC11712BP)를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Daejeon, Korea)로부터 분양받아 대조구로 사용하였고, 수집된 전통발효 청국장들로부터 총 50종의 바실러스 종 균주도 대조구로 사용하였다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주의 메나퀴논-7의 함량을 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 비타민 K2의 함량을 비교하였다. 이의 결과를 표 3, 도 2 및 도 4에 나타내었다.
시료 메나퀴논-7(㎍/g)
바실러스 아미로리퀴파시엔스 BY-1 균주(KCTC11712BP) 6.66±0.50
바실러스 서브틸리스 BY07 균주 18.87±0.62
평균 ± 표준편차 (n=3);동일한 컬럼의 대조군과 비교할 때, p<0.05에서 유의적인 차이가 있는 것으로 봄;
표 3 및 도 2 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주의 메나퀴논-7 함량은 18.87㎍/g이고, 바실러스 아미로리퀴파시엔스 BY-1(수탁번호: KCTC11712BP)의 메나퀴논-7의 함량은 6.66 ㎍/g으로, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주가 약 2.8배 정도 메나퀴논-7을 높게 생성함을 확인하였다.
[ 실험예 1]청국장에서 본 발명의 균주의 배양 온도에 따른 메나퀴논-7 생산능 확인
청국장에 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주를 접종 후, 37, 40, 43 및 46℃에서 36시간 발효 후 메탄올로 추출하여 이의 여액의 메나퀴논-7의 함량을 측정하였다. 이의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 37, 40, 43 및 46℃에서 발효한 경우 메나퀴논-7의 함량은 각각 8.02±1.49, 14.71±2.09, 19.30±0.28 및 12.39±2.40μg/g로 메나퀴논-7의 생산을 위한 최적의 배양온도는 43℃로 판단된다.
[ 실험예 2]청국장에서 본 발명의 균주의 접종량에 따른 메나퀴논-7 생산능 확인
청국장에 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주를 0.5, 1, 2, 3 및 4%로 접종 후, 43℃에서 36시간 발효 후 메탄올로 추출하여 이의 여액의 메나퀴논-7의 함량을 측정하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 0.5, 1, 2, 3, 및 4%로 균주를 접종 후 발효한 경우, 메나퀴논의 함량은 각각 17.83±1.65, 18.28±1.15, 20.91±0.41, 20.26±0.55, 18.86±0.38μg/g으로 메나퀴논의 생산을 위한 최적의 접종량은 2%로 판단된다.
[ 실험예 3]청국장에서 본 발명의 균주의 배양 습도에 따른 메나퀴논-7 생산능 확인
청국장에 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 균주를 2%로 접종하여, 평상 습도, 50, 70 및 90%에서 43℃로 36시간 발효 후 메탄올로 추출하여 이의 여액의 메나퀴논-7의 함량을 측정하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 평상 습도, 50, 70 및 90%에서 발효한 경우 메나퀴논의 함량은 각각 19.30±0.28, 19.73±0.34, 20.73±0.60, 22.09±0.80 μg/g으로 메나퀴논의 생산을 위한 최적의 습도는 90%로 판단된다.
[ 실시예 4]본 발명의 균주의 탄소원에 따른 메나퀴논-7의 생산능 확인
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BY07 (KCTC 12392BP)에 의한 메나퀴논-7의 생성에 미치는 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 콩 추출물을 기본 배지로 하여, 이를 대조구로 하고, 글루코오스(glucose), 글리세롤 (glycerol), 말토오스 (maltose), 설탕 (sucrose), 폴리 글리세롤(poly-glycerol), 말티톨(malitol) 또는 올리고당(oligosaccharide)을 각각 4% 첨가하여 배양액을 제조한 후 43℃에서 36시간 배양하였다. 메나퀴논-7 생성량을 측정하였고, 이의 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 글리세롤, 폴리 글리세롤, 말티톨, 올리고당 또는 설탕을 탄소원을 첨가한 경우에 메나퀴논-7 생성량이 대조구와 유의적인 차이를 나타내었으나, 말토오스를 첨가한 경우에는 대조구와 유의적인 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
또한, 글루코오스를 탄소원으로 4% 첨가한 경우에 메나퀴논-7 생성량이 대조구와 비교할 경우 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 글리세롤을 첨가한 경우 메나퀴논-7 생성량이 가장 높게 나타났고, 이는 Wu 와 Ahn (Wu W.J. and Ahn B.Y. Improved menaquinone (Vitamin K2) production in cheonggukjang by optimization of the fermentation conditions. Food Sci . Biotechnol. 20: 1586-1591 (2011b))의 보고된 결과와 같다. 그러나 글리세롤은 식품 중 첨가제로서 넓은 영역에 걸쳐 사용되지 않으므로 이와 비슷한 메나퀴논-7 생성량을 나타내는 폴리 글리세롤과 말티톨 중에서는 말티톨이 보다 넓게 이용된다. 따라서, 메나퀴논-7 생성을 위한 최적 탄소원은 말티톨로 판단되었다.
[ 실험예 5]청국장에서 말티톨 첨가 농도에 따른 메나퀴논-7의 생산능 확인
청국장 제조시, 말티톨을 각각 0, 2, 4, 6 및 8%의 농도로 첨가하여 청국장을 제조한 후, 메나퀴논-7 생성량을 측정하였다. 이의 결과를 도 9에 나타내었고, 본 발명의 균주를 이용하여 6%의 말티톨 첨가하여 청국장 제조시 메나퀴논-7의 생성량을 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 9 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, 6%의 말티톨을 첨가하였을 때 30.344 μg/g으로 가장 높게 나타남을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12392BP 20130403
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> bacillus subtilis having high productivity of vitamin K2 and method for producing cheonggukjang using the same <130> P-124 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is B.subtilis`s gyrage B DNA sequence. <400> 1 ttgggaacaa gcttcgccgg ttattgtacg gatatcaata tccaaatcga aaaagacaaa 60 gtatcacggt tgtagataat ggccgcggta ttccagtcgg tattcatgaa aaaatgggcc 120 gtcctgcggt agaagtcatt atgacggtac ttcatgccgg aggaaaattt gacggaagcg 180 gctataaagt atccggagga ttacacggtg taggtgcgtc tgtcgtaaac gcactatcaa 240 cagagcttga tgtgacggtt caccgtgacg gtaaaattca ccgccaaact tataaacgcg 300 gagttccggt tacagacctt gaaatcattg gcgaaacgga tcatacagga acgacgacac 360 attttgtccc ggaccctgaa attttctcag aaacaaccga gtatgattat gatctgcttg 420 ccaaccgcgt acgtgaatta gcctttttaa caaagggcgt aaacatcacg attgaggata 480 aacgtgaagg acaagagcgc aaaaatgaat accattacga aggcggaatt aaaagttatg 540 tagagtattt aaaccgctct aaagaggttg tccatgaaga gccgatttac attgaaggcg 600 aaaaggacgg cattacggtt gaagtggctt tgcaatacaa tgacagctac acaagcaaca 660 tttactcgtt tacaaacaac attaacacgt acgaaggcgg tacccatgaa gctggcttca 720 aaacgggcct gactcgtgtt atcaacgatt acgccagaaa aaaagggctt attaaagaaa 780 atgatccaaa cctaagcgga gatgacgtaa gggaagggct gacagcgatt atttcaatca 840 aacaccctga tccgcagttt gagggccaaa cgaaaacaaa gctgggcaac tcagaagcac 900 ggacgatcac cgatacgtta ttttctacgg cgatggaaac atttatgctg gaaaatccag 960 atgcagccaa aaaaattgtc gataaaggct taatggcggc aagagcaaga atggctgcga 1020 aaaaagcccg tgaactaaca cgtcgtaaga gtgctttgga aatttcaaac ctgcccggta 1080 agttagcgga ctgctcttca aaagatccga gcatctccga gttatatatc gtagagggtg 1140 actctgccgg aggatctgct aaacaaggac gcgacagaca tttccaagcc attttgccgc 1200 ttagaggtaa aatcctaaac gttgaaaagg ccagactgga taaaatcctt tctaacaacg 1260 aagttcgctc tatgatcaca gcgctcggca caggtattgg ggaagacttc aacgtgagaa 1320 agcccgtacc acaaaggggg gccc 1344

Claims (10)

  1. 비타민 K2 합성능이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BY07 균주(수탁번호:KCTC 12392BP).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 비타민 K2는 메나퀴논-7(menaquinone-7)인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(수탁번호:KCTC 12392BP).
  3. 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(수탁번호:KCTC 12392BP), 이의 배양액 또는 이의 배양액의 농축액을 포함하는 청국장 발효용 조성물.
  4. (ⅰ) 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물을 증자하는 단계;
    (ⅱ) 상기 증자된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물에 바실러스 서브틸리스 BY07 균주(수탁번호:KCTC 12392BP), 이의 배양액 또는 이의 배양액의 농축액을 접종하는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 접종된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물을 발효시키는 단계를 포함하는, 청국장의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (ⅱ) 단계의 접종은 증자된 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물의 총 부피의 2%의 바실리스 서브틸리스 BY07 균주를 접종하는 것을 특징으로 하는, 청국장의 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 (ⅲ) 단계의 발효는 41℃ 내지 45℃에서, 85% 내지 95%의 습도조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 청국장의 제조 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 (ⅲ) 단계의 발효는 탄소원으로 말티톨(maltitol)을 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는, 청국장의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 말티톨은 대두, 검정콩 또는 콩 파쇄물의 총 부피의 5 내지 7%의 말티톨인 것을 특징으로 하는, 청국장 제조 방법.
  9. 제4항에 의한 방법으로 제조되며, 비타민 K2, 메타퀴논-7 함량이 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 BY-1 균주에서 제조된 청국장에 비해, 2 내지 5배 높은 것을 특징으로 하는, 청국장.
  10. 제9항의 청국장을 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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