KR102184142B1 - 피부 미백 활성을 갖는 신균주 워커하모마이세스 아노말루스 ｅｙ２２２ 및 이의용도 - Google Patents
피부 미백 활성을 갖는 신균주 워커하모마이세스 아노말루스 ｅｙ２２２ 및 이의용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피부 미백 활성을 갖는 신규한 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 미백 활성을 갖는 신규한 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주, 상기 균주를 함유한 미백 활성을 갖는 식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 균주를 이용한 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주 및 상기 균주를 이용하여 수득한 발효물은 티로시나제 억제 활성 및 멜라닌 생성 저해 활성이 우수하여 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물 및 식품 조성물의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 피부 미백 활성을 갖는 신균주 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22 및 이의 용도에 관한 것이다.
성형, 미용, 화장에 대한 일반 대중의 관심이 급속도로 높아지고 있다. 특히 동안 열풍 및 하얀 얼굴에 대한 선호 현상으로 인하여 미백화장품 및 주름개선화장품에 대한 관심이 지속적이면서도 폭발적으로 증가하고 있다.
특히 미백화장품에 대한 관심은 미백 증진 소재에 대한 수요의 증가와 효소, 유산균 등의 미생물을 이용한 화장품의 개발로 이어지고 있고, 최근에는 피부에 안정성이 높으며 피부 미백활성이 우수한 소재를 천연소재로부터 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 피부색은 주로 피부 속에 존재하는 멜라닌(melanin)이라는 색소의 함량에 의해 결정되는데, 멜라닌은 피부의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성세포(멜라노사이트, melanocyte)에 의해서 생합성되고 세포질 돌기를 통하여 각질형성세포(keratinocyte)의 각화과정에 의해서 표피의 기저층에서 각질층으로 이동하게 된다. 이 멜라닌을 형성하는 주효소인 티로시나아제(tyrosinase)는 속도결정단계(rate-limiting step)인 타이로신(tyrosine)에서 디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA, 도파)으로의 전환단계와 이후 단계인 도파(DOPA)에서 도파퀴논(DOPA quinone)으로의 전환단계를 매개한다. 따라서 티로시나아제 효소의 활성을 저해하고 멜라닌 생성을 억제시켜 피부 미백 효과를 얻을 수 있다.
현재 미백제로 가장 많이 사용되는 알부틴은 L-타이로신과 경쟁적으로 작용하는 저해제이다. 또한 미백제로 많이 사용되는 코직산(Kojic acid)는 타이로시나아제 활성 부위의 구리를 킬레이팅(chelating)하여 타이로신에서 도파로, 그리고 도파에서 도파퀴논으로 진행되는 과정을 저해한다. 그러나 이러한 미백제들은 피부 부작용을 초래할 수 있는 문제점이 있어 부작용이 없으면서도 피부 미백 활성을 높일 수 있는 새로운 소재의 개발이 필요한 시점이다.
이에 본 발명자들은 피부의 미백 활성을 증진시킬 수 있는 방법으로, 피부에 바르는 화장품 뿐만 아니라 미백 활성을 증진시킬 수 있는 기능성 식품의 원료로도 사용할 수 있는 소재를 미생물로부터 찾기 위해 연구하던 중, 미백 활성을 증진시킬 수 있는 새로운 균주를 동정하고 이의 우수한 미백활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 활성을 갖는 식품 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주를 이용하여 전분질 원료를 발효시키는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 티로시나제(tyrosinase) 억제 활성 및 멜라닌(melanin) 생성 억제를 통해 미백 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 활성을 갖는 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주를 이용하여 전분질 원료를 발효시키는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효물은, (1) 입국에 물 및 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 혼합하고 발효시켜 1차 발효물을 제조하는 단계; (2) 상기 1차 발효물에 증자된 전분질 원료 및 물을 혼합한 후 발효시켜 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 2차 발효물을 증류시키고 남은 잔사물을 수득하는 단계를 포함하는 과정으로 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 전분질 원료는 서류 또는 곡류일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서류는 고구마 또는 감자이고, 상기 곡류는 쌀, 찹쌀, 보리, 겉보기, 옥수수, 메밀, 귀리 또는 조일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계에서 상기 발효는 20~25℃의 온도에서 4~6일간 발효시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계에서 전분질 원료는 물로 세척 후, 2~4시간 동안 상온의 물에서 침지한 후, 40~60분 동안 스팀으로 증자하고, 20~30분 동안 상온에서 냉각시킨 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계에서 2차 발효는 20~25℃의 온도에서 8~12일간 발효시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서 증류는 상기 2차 발효물에 함유된 알코올을 증류기를 이용하여 제거하되, 증류 후 남은 잔사물에 함유된 알코올 성분이 1%(v/v) 미만이 되도록 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 미백 활성을 갖는 신규한 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물은 티로시나제 억제 활성이 우수하고 멜라닌 생성 저해 활성이 우수하여 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물 및 식품 조성물의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 신균주인 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주를 이용하여 수득한 고구마 발효물의 증류 잔사물에 대한 티로시나제 억제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 신균주인 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주를 이용하여 수득한 고구마 발효물의 증류 잔사물에 대한 멜라닌 생성 억제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 신균주인 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주를 이용하여 수득한 고구마 발효물의 증류 잔사물에 대한 멜라닌 생성 억제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 미백 활성을 갖는 신규한 균주를 제공함에 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명은 피부 미백 활성을 갖는 신균주인 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주를 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 체내 부작용을 유발하지 않으면서 효과적으로 피부 미백 활성을 증진시킬 수 있는 새로운 소재를 천연에서 찾기 위해 연구하던 중, 미백 활성을 갖는 신균주를 분리 및 동정하였고, 본 발명에서 분리한 신규 미생물을 16s rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학 분석을 통해 분리된 상기 균주가 종래 존재하지 않은 신규한 균주임을 확인하였으며, 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22 균주를 한국미생물보존센터에 2019.02.19.일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12438P를 부여받았다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22 균주에 대해 피부 미백활성이 있는지 확인하기 위하여, 상기 EY2-22 균주의 미백활성 여부 및 상기 균주를 이용하여 제조된 발효물에 대한 멜라닌 생성 저해활성 및 티로시나제 억제 활성을 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22 균주, 구체적으로 상기 균주의 배양물이 우수한 미백활성이 있는 것으로 확인할 수 있었고, 또한, 상기 본 발명의 균주를 이용하여 수득한 발효물이 멜라닌 생성 저해 활성 및 티로시나제 억제 활성이 있는 것으로 나타났으며 이러한 미백 활성은 다른 종류의 사카로마이세스 세레비지애 균주들에 비해 더 우수한 것으로 나타났다.
따라서 본 발명의 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22 균주는 피부 미백 증진을 위한 화장품 및 기능성 식품의 소재로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물은 본 발명에 따른 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 적합한 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양물은 본 발명에 따른 신균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액(파쇄물) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에서 상기 발효물은 본 발명에 따른 신균주를 이용하여 발효시킨 발효물이라면 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 발효물은 증자된 전분질 원료에 본 발명의 신균주를 처리한 후, 발효시켜 수득한 발효물을 증류 처리한 다음, 알코올이 제거되고 남은 잔사물일 수 있다.
본 발명의 상기 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물은 화장수류, 크림류, 로션류, 팩류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등과 같은 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 다양한 성상으로 적용가능하다. 또한 통상적인 화장료 또는 피부연고 제조법을 사용하여 본 발명의 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 피부 미백 활성을 갖는 화장료 조성물에 있어 본 발명의 유효성분의 함량은 조성물 총 중량 대비 0.0001 내지 20 중량%인 것이 바람직하다. 유효성분의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 본래 목적하는 피부의 미백 효과를 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 유효성분의 함량이 20 중량%를 초과하는 경우에는 조성물의 안정성에 문제를 발생시킬 수 있고, 이로 인해 조성물의 외관에 문제를 일으킬 우려가 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 신균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 활성을 갖는 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 신균주들을 이용하여 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 미백 활성 또는 미백 활성의 증진 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 발효물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 유효성분에 대한 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 고형물 함량 0.01 내지 50 중량%이다. 또한 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 본 발명의 조성물을 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 신균주를 이용한 미백 활성이 우수한 발효물을 제조하기 위한 연구를 진행하였는데, 그 결과, 전분질 원료를 기질로 하고 본 발명의 신균주를 이용하여 발효시킨 발효물이 다른 종류의 균주를 이용하여 발효시킨 발효물에 비해 더 우수한 미백 활성이 있는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명에서 분리 및 동정한 상기 신균주인 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P)를 이용하여 전분질 원료를 발효시키는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법을 제공할 수 있다.
구체적으로 상기 방법은, (1) 입국에 물 및 본 발명의 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 혼합하고 발효시켜 1차 발효물을 제조하는 단계; (2) 상기 1차 발효물에 증자된 전분질 원료 및 물을 혼합한 후 발효시켜 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 2차 발효물을 증류시키고 남은 잔사물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저 (1) 입국에 물 및 본 발명의 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(KCCM12438P) 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 혼합하고 발효시켜 1차 발효물을 제조한다.
여기서 상기 입국은 증자된 쌀을 이용하여 통상적인 방법으로 제조한 입국을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 증자한 쌀에 균을 접종하고 항온항습기 내에서 33℃의 온도 및 습도 95%로 유지하면서 48시간 동안 균을 번식시켜 입국을 제조하여 사용하였다.
상기 1차 발효물은 입국에 물과 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 첨가하고 발효시켜 수득할 수 있는데, 바람직하게는 상기 입국에 물과 본 발명의 신균주의 배양물을 첨가하고 20~25℃의 온도에서 4~6일간 발효시켜 수득할 수 있다.
1차 발효물의 제조가 완료되면, 그 다음으로 1차 발효물에 증자된 전분질 원료 및 물을 첨가하고 혼합한 후 발효시켜 2차 발효물을 제조한다.
이때 상기 전분질 원료로는 서류 또는 곡류를 사용할 수 있으며, 상기 서류로는 이에 제한되지는 않으나, 고구마 또는 감자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 고구마를 사용할 수 있다.
상기 곡류로는 이에 제한되지는 않으나, 쌀, 찹쌀, 보리, 겉보기, 옥수수, 메밀, 귀리 또는 조를 사용할 수 있다.
상기 전분질 원료는 물로 세척 후, 2~4시간 동안 상온의 물에서 침지한 후, 40~60분 동안 스팀으로 증자하고, 20~30분 동안 상온에서 냉각시킨 것을 사용한다.
상기 2차 발효물의 제조를 위한 발효는 20~25℃의 온도에서 8~12일간 발효시킨다.
이렇게 2차 발효물의 제조가 완료되면, 이후 상기 2차 발효물을 증류시키고 남은 잔사물을 수득하며, 이때 상기 증류는 2차 발효물에 함유된 알코올을 증류기를 이용하여 제거함으로써 남은 잔사물에는 알코올 성분이 1%(v/v) 미만이 되도록 한다.
이상의 과정을 통해 제조된 본 발명의 신균주를 이용하여 수득한 발효물, 바람직하게는 발효물의 증류 잔사물은 멜라닌 생성 억제 활성이 우수하고 티로시나제 억제 활성이 우수하여 피부 미백을 효과적으로 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 미백 활성을 갖는 발효물의 증류 잔사물은 본 발명의 신균주 대신 다른 종류의 미생물(사카로마이세스속 균주, 락토바실러스속 균주)을 이용하여 제조된 잔사물에 비해 더 우수한 미백 활성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 나아가 본 발명의 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22 균주, 상기 균주를 이용하여 수득한 발효물 또는 상기 발효물의 증류 잔사물은 미백 활성을 갖는 주류의 제조에도 사용될 수 있으며, 상기 주류는 이에 제한되지는 않으나, 희석식 소주, 증류식 소주, 일반 증류주, 약주, 탁주, 맥주, 인삼주, 매실주 또는 과실주일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
신균주의 분리 및 동정
본 발명자는 미백 활성이 우수한 신규한 균주를 분리 및 동정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 신균주의 분리 및 동정을 위한 과정으로, 곰팡이 균사 발육 억제와 세균 생육 억제를 위해 chloramphenicol 0.01%, sodium propionate 0.3%를 첨가하여 만든 PDA(Potato dextrose agar)배지에 희석한 고구마소주 술덧 0.1ml을 도말 한 후 30℃에서 24hr 배양하였다. 배양 후, 형성된 콜로니를 취하여 다시 획선 배양하여 오염되지 않은 순수한 단일 콜로니를 확보하였고, 확보된 균주로부터 18s rDNA의 분석을 통해 종래 존재하지 않았던 신규 균주를 분리하였다.
이때, 균주의 동정을 위한 18s rRNA 시퀀싱은 전문 기관인 ‘마크로젠’에 의뢰하여 진행하였으며 진행방법은 순수분리가 확인된 균주의 whole genomic DNA를 분리 한 후 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR증폭에 사용된 primer는 ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)과 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 이용하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분, 94℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분, 72℃에서 10초의 사이클을 총 35회 반복하였다. PCR prodect의 분석은 ABI 3730XL sequencing 기계를 이용하였다. 분석이 된 염기서열을 BioEdit seqencing 프로그램을 이용하여 alignment시킨 후 그 결과를 NCBI의 data base와 비교하여 동정하였다.
분석 결과, 종래 규명되지 않았던 새로운 균주를 확인하였는데, 이를 본 발명자들은 Wickerhamomyces anomalus EY2-22로 명명하였고, 상기 균주의 18s rRNA에 대한 ITS1의 영역 및 ITS4 영역의 염기서열을 분석하여 이를 서열번호 1(ITS1) 및 2(ITS4)에 기재하였으며, 국제미생물기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년 02월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12438P를 부여받았다.
여기서 상기 ITS (Internal Transcribed Spacer)는 염색체의 small-subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)와 large-subunit rRNA(LSU rRNA) 유전자 사이에 위치한 DNA 영역을 의미하는 것으로, 진핵생물은 18S rRNA에 대한 특정 ITS1, ITS4 영역에 대한 염기서열 분석결과를 얻을 수 있고, 종래 알려진 균주와의 염기서열 유사성 분석을 통해 신균주 여부를 파악할 수 있다.
<실시예 2>
본 발명의 신균주를 이용한 우수한 미백 활성을 갖는 발효물의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주인 Wickerhamomyces anomalus EY2-22을 이용하여 미백 활성이 우수한 발효물을 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
먼저 쌀에 균을 혼합 및 배양하여 입국을 제조하였다. 이때 입국은 증자된 쌀(10 kg)에 균(백국균 2g)을 접종하여 통상적인 방법에 따라 제조하였고, 증자한 쌀에 균을 접종하고 항온 항습기 내에서 33℃의 온도 및 습도 95%로 유지하면서 48시간 동안 균을 번식시켜 입국을 제조하였다. 이후 상기 제조된 입국에 본 발명에서 동정한 신균주의 각 배양액을 물과 혼합하고 발효시켜 1차 발효액을 제조하였다. 여1차 발효를 위해 상기에서 제조한 입국 513 g에 물 718 g을 첨가하여 혼합한 후, 입국 당화액에서 배양하여 108/ml 이상의 균주가 됨을 확인한 본 발명의 신균주 배양액 10 ml을 접종하였다. 본 발명의 효모 배양액인 입국 당화액은 상기 방법으로 제조된 입국 200g과 물 600 g을 섞은 후 65℃에서 3 시간 30 분 동안 교반하여 당화시켰다. 당화 후, 4,700 rpm에서 30 분간 원심분리한 후 여과포로 여과한 뒤 물로 10˚brix로 희석하여 제조하였다. 상기 혼합액을 25℃에서 5 일간 발효시켜 1차 발효액을 제조하였다.
상기 제조된 1차 발효액은 2차 발효를 수행하였는데, 즉, 상기 1차 발효액에 증자된 고구마 및 물을 첨가하여 혼합하고 발효시켜 2차 발효액을 제조하였다.
구체적으로, 2차 발효를 위해 먼저 고구마를 준비하는데, 이물질이나 오염원을 제거하기 위하여 물로 깨끗이 세척하고 수분의 충분한 흡수를 위해 3 시간 동안 상온의 물에 침지한 후 상압에서 60 분간 스팀으로 고구마를 증자하였다. 증자 후 20 분간 상온에서 냉각시켰고, 이후 상기에서 제조된 1차 발효액에 물 1,743 g 및 증자된 고구마 1,026 g를 첨가하고 혼합하여, 25℃에서 10 일간 발효시켜 본 발명의 신균주를 이용한 2차 발효액(고구마 술덧) 4,000 g을 제조하였다.
이후, 2차 발효액을 증류시키고 남은 잔사물을 수득하였다. 구체적으로 상기 단계에서 수득한 2차 발효액을 단식 증류기를 이용하여 알코올을 제거하였는데, 내부온도는 40℃에서 110 mmHg로 감압 증류하였다. 감압 펌프는 수봉식 펌프를 이용하였다. 알코올을 제거하기 위한 증류기는 유리재 5 L용량의 라운드형 플라스크와 포말방지 증류 컬럼, 횡형 냉각사관, 감압 형성벨브가 달린 눈금있는 사이트 글래스, 유출액을 포집하는 리시버를 구비하는 증류기를 사용하였다. 알코올 제거를 위한 초기 발효액량은 2 L, 초기 발효액 온도는 25℃, 유출 증기의 냉각을 위한 냉각기의 설정온도는 5℃가 되게 하였고 15 L/분의 속도로 순환하게 하였다. 알코올 제거기에 투입되는 열로써 알코올 제거 속도를 조절하였다. 알코올을 제거하고 수득한 잔사물 중의 알코올 성분은 1% v/v 미만이 되게 하였다. 이와 같은 방법으로 본 발명의 신균주를 이용한 미백 활성을 갖는 고구마 발효물로서, 고구마 발효물의 증류 잔사물을 수득하였다.
<실시예 3>
미백 활성 분석
상기 실시예 2를 통해 제조한 본 발명의 신균주를 이용한 고구마 발효물의 증류 잔사물에 대한 미백 활성 분석을 수행하였다. 미백 활성 분석은 티로시나제 활성 억제 효능분석과 멜라닌 생성 억제 효능 분석으로 수행하였다. 이때 대조군으로는 본 발명의 신균주를 첨가하지 않은 군을 사용하였고, 비교군으로는 본 발명의 균주가 아닌 다른 균주를 이용하여 제조한 고구마 발효물의 증류 잔사물군을 사용하였다. 실험에 사용한 각 실험군은 하기 표에 나타내었다.
| 발효기질 | 실험군 no | 미생물 no | 미생물명 |
| 고구마 | 1 | control | 미생물 미첨가군 |
| 2 | EY2-22 | Wickerhamomyces anomalus EY2-22(KCCM12438P) | |
| 3 | EY2-2 | Saccharomyces cerevisiae EY2-2 | |
| 4 | EY2-12 | Saccharomyces cerevisiae EY2-12 |
<3-1>
티로시나제
활성 억제효능 분석
티로시나제 활성 억제 효능 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저 튜브에 20 ml의 0.1 M potassium phosphate 버퍼를 넣고, 여기에 0.02 mg/ml mushroom tyrosinase를 20 ml 넣고 첨가한 후, 본 발명의 증류 잔사물을 농도별(250ug/ml, 500ug/ml, 1000ug/ml)로 40 ml 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시켰으며, 기질로 1 mM L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 40ml 넣고 25℃ 에서 30분간 반응시켰다. 이후 475 nm 파장영역에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 티로시나제 활성 억제 정도를 분석하였다.
<3-2> 멜라닌 생성 억제효능 분석
멜라닌 생성 세포주 B16F10 세포를 6웰 플레이트 2 x 105 cells/well 농도로 배양하고, 배양 12시간 후 상기 본 발명의 증류 잔사물을 농도별(250ug/ml, 500ug/ml, 1000ug/ml)로 처리하였다. 증류 잔사물 처리 1시간 후 멜라닌 생성을 유도하는 a-melanocyte-stimulating hormone (a-MSH)를 100 nM 농도로 처리한 다음, 72시간 후 세포 배양액을 튜브에 옮기고 상온에서 48시간 반응시켰다. 반응완료 후 400 nm 파장영역에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 멜라닌 생성 억제 정도를 분석하였다.
분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 티로시나제 활성 억제 효능은 본 발명의 신균주를 이용하여 수득한 증류 잔사물이 본 발명의 균주를 첨가하지 않고 수득한 대조군 잔사물에 비해 우수한 것으로 나타났고, 나아가 본 발명의 균주 처리 군은 비교군으로 사용한 다른 균주인 사카로마이세스 세레비지애 처리 군들에 비해서도 티로시나제 억제 활성이 더 우수한 것으로 나타났다.
또한, 도 2에서는 멜라닌 생성 억제 분석 결과를 확인할 수 있었는데, 본 발명의 균주를 첨가하지 않은 대조군 잔사물에서는 멜라닌 생성량이 증가되어 있는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 균주 처리 군에서는 멜라닌 생성량이 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났고, 이러한 멜라닌 감소 정도는 비교군으로 사용한 다른 균주인 사카로마이세스 세레비지애 처리 군(EY2-27)에 비해서도 더 우수한 것으로 나타났다.
이상의 결과를 통해 본 발명에서 동정한 신균주 및 상기 신균주로 전분질 원료를 발효시켜 수득한 발효물의 증류 잔사물은 우수한 피부 미백 활성을 가지고 있는 바, 피부 미백용 화장품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<120> Novel strain having skin whitening and use of the same
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<160> 4
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<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wickerhamomyces anomalus(EY2-22) ITS1 sequence
<400> 1
gcttcttatg tcggaggaca tatgcttaat tcgggcggcg ataaacctta cacacattgt 60
ctagtttttt tgaactttgc tttgggtggt gagcctggct tactgcccaa aggtctaaac 120
acattttttt taatgttaaa acctttaacc aatagtcatg aaaattttta acaaaaatta 180
aaatcttcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg caacgatgaa gaacgcagcg 240
aaatgcgata cgtattgtga attgcagatt ttcgtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca 300
ttgcaccctc tggtattcca gagggtatgc ctgtttgagc gtcatttctc tctcaaacct 360
tcgggtttgg tattgagtga tactctgtca agggttaact tgaaatattg acttagcaag 420
agtgtactaa taagcagtct ttctgaaata atgtattagg ttcttccaac tcgttatatc 480
agctaggcag gtttagaagt attttaggct cggcttaaca acaataaact aaaagtttga 540
cctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaagcatat ataaaccggg aagaaacaaa 600
tcttttttct gggcgtgccg gaggagccgg 630
<210> 2
<211> 1319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wickerhamomyces anomalus(EY2-22) ITS4 sequence
<400> 2
agggacatac ggcctggttt gaggcctcct tttattgtat attgttcgtt aagccgagcc 60
taaaatactt ctaaacctgc ctagctgata taacgagttg gaagaaccta atacattatt 120
tcagaaagac tgcttattag tacactcttg ctaagtcaat atttcaagtt aacccttgac 180
agagtatcac tcaataccaa acccgaaggt ttgagagaga aatgacgctc aaacaggcat 240
accctctgga ataccagagg gtgcaatgtg cgttcaaaga ttcgatgatt cacgaaaatc 300
tgcaattcac aatacgtatc gcatttcgct gcgttcttca tcgttgcgag aaccaagaga 360
tccgttgttg aaagttttga agattttaat ttttgttaaa aattttcatg actattggtt 420
aaaggtttta acattaaaaa aaatgtgttt agacctttgg gcagtaagcc aggctcacca 480
cccaaagcaa agttcaaaaa aactagacaa tgtgtgtaag gtttatcgcc gcgcaattaa 540
gcgctggcaa tagaatacta taatgatcct tccgcggcac cccctaaggg aaaggggagg 600
gttccccctc cgctttcctg tgcccccccc cccctgcccc ccccaccaac cccacacaca 660
ctggccaatt tttttttcaa cccctgccca gcgggtgacc caaaccccgc cttaccacca 720
aaaggacaaa acacaattta tatataaagc taaaaaaccc cccaaccaat agcccaagaa 780
atattcttaa acaaaaaata aacacccccc acaatatcca ccaccggaaa ctctcgagct 840
cccccaacaa ataaaaaaaa cacgcaaaag cccaaaccca aacggggaaa attccaaaaa 900
tatcccggaa accacccaaa ccctttaaac acaatgggcc cccccgggga aatccccaag 960
agggtaagcc cgatttttga aacaccataa ccccccaaca ccaccccggg ttgggggtaa 1020
gtggaaggag gaaaccccct ttccacgggg ggggtaaaca cgggaaaaaa aattggcgac 1080
ctttaaacag aaaagggggg gccacaaaat aagaaacccc ccctttcgcc aaaaataaaa 1140
gggattggaa ttagacggga cggtgcacct tccttttaat ccgggggcgg ggggggtgtt 1200
taggaaaaga aattttgtta gagggggctg tcaaaataaa aaaaagggag tcgctctcat 1260
cctcccatct aaaatgaaag gataagaaaa aaggaatttt ggttttgggt tttcccttt 1319
<210> 3
<211> 828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Saccharomyces cerevisiae(EY2-27) ITS1 sequence
<400> 3
tggacaacta gcggaggact agcaatcgga cgtatggttt ggtttgggaa gagcatgaga 60
gcttttactg ggcaaaaaga caaaagaggg aaagtccagc cgggcctgcg cttaagtgcg 120
cggtcttgct aggcttgtaa gtttctttct tgctattcca aacggtgaaa gatttctgtg 180
cttttgttat aggacaatta aaaccgtttc aatacaacac actgtggagt tttcatatct 240
ttgcaacttt ttctttgggc attcaagcaa tcggggccca aaggtaacaa acacaaacaa 300
ttttatttat tcattaaatt tttgtcaaaa acaaaaattt tcgtaactgg aaattttaaa 360
atattaaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaaa acgcagcgaa 420
atgcgatacg taatgtgaat tgcaaaattc cgtgaatcat caaatctttg aacgcacatt 480
gcgccccttg gtattccagg gggcatgcct gtttgagcgt catttccttc tcaaacattc 540
tgtttggtag tgagtgatac tctttgaagt taacttgaaa ttgctggcct tttcattgga 600
tgtttttttt tcaaagagag gtttctctgc gtgcttgagg taaatgcaat acggccgttt 660
taggtttaca actgcggcta tcttttttta ctgagcgtat tggaacgtat cgataaaaaa 720
gagcgctagg caacatgttc taaagttgac tcaatcagga ggataccgtg actattatta 780
atggggggga gaaaaaggcg cccccctttt ttcttattaa aaaagttt 828
<210> 4
<211> 862
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Saccharomyces cerevisiae(EY2-27) ITS4 sequence
<400> 4
atgatggtac atacggcgtg gtttgaggcc tccttttata gcattgttcg cctagacgct 60
ctcttcttat cgataacgtt ccaatacgct cagtataaaa aagattagcc gcagttggta 120
aaacctaaaa cgaccgtact tgcattatac ctcaagcacg cagagaaacc tctctttgga 180
aaaaaaaaca tccaatgaaa aggccagcaa tttcaagtta actccaaaga gtatcactca 240
ctaccaaaca gaatgtttga gaaggaaatg acgctcaaac aggcatgccc cctggaatac 300
caaggggcgc aatgtgcgtt caaagattca atgattcacg gaattctgca attcacatta 360
cgtatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagaacc aaaagatccg ttgttgaaag 420
tttttaatat tttaaaattt ccagttacga aaattcttgt ttttgacaaa aatttaatga 480
ataaataaaa ttgtttgtgt ttgttacctc tgggccccga ttgctcgaat gcccaaagaa 540
aaagttgcaa agatatgaaa actccacagt gtgttgtatt gaaacggttt taattgtcct 600
ataacaaaag cacagaaatc tctcaccgtt tggaatagca agaaagaaac ttacaagcct 660
agcaagaccg cgcacttaag cgcaggcccg gctggactct ccatctcttg tcttcttgcc 720
cagtaaaagc tctcatgctc ttgccaaaca aaaaaatcca ttttcaaaat ataaatttct 780
taatgacctc aggccccccc cccccaaaaa aggtgggggg gggggttaaa aaattttaaa 840
aagtttaaaa tgggattgga tt 862
Claims (12)
- 티로시나제(tyrosinase) 억제 활성 및 멜라닌(melanin) 생성 억제를 통해 미백 활성을 갖는 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주.
- 삭제
- 제1항의 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 활성을 갖는 식품 조성물.
- 제1항의 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 활성을 갖는 화장료 조성물.
- 제1항의 균주를 이용하여 전분질 원료를 발효시키는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 발효물은,
(1) 입국에 물 및 워커하모마이세스 아노말루스 EY2-22(기탁번호: KCCM 12438P) 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 혼합하고 발효시켜 1차 발효물을 제조하는 단계;
(2) 상기 1차 발효물에 증자된 전분질 원료 및 물을 혼합한 후 발효시켜 2차 발효물을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 2차 발효물을 증류시키고 남은 잔사물을 수득하는 단계를 포함하는 과정으로 수득된 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 전분질 원료는 서류 또는 곡류인 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 서류는 고구마 또는 감자이고,
상기 곡류는 쌀, 찹쌀, 보리, 겉보기, 옥수수, 메밀, 귀리 또는 조인 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (1) 단계에서 상기 발효는 20~25℃의 온도에서 4~6일간 발효시키는 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (2) 단계에서 전분질 원료는 물로 세척 후, 2~4시간 동안 상온의 물에서 침지한 후, 40~60분 동안 스팀으로 증자하고, 20~30분 동안 상온에서 냉각시킨 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (2) 단계에서 2차 발효는 20~25℃의 온도에서 8~12일간 발효시키는 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (3) 단계에서 증류는 상기 2차 발효물에 함유된 알코올을 증류기를 이용하여 제거하되, 증류 후 남은 잔사물에 함유된 알코올 성분이 1%(v/v) 미만이 되도록 수행하는 것을 특징으로 하는, 미백 활성을 갖는 발효물의 제조방법.
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| KR20230021505A (ko) * | 2021-08-05 | 2023-02-14 | 주식회사 엘씨에스바이오텍 | 신규한 곡류 발효물, 그 곡류 발효물의 피부 보호 용도, 피부 유용 물질 스크리닝 방법 및 산화적 스트레스로 인한 피부 손상 예측 방법 |
| KR102664144B1 (ko) * | 2021-08-05 | 2024-05-10 | 주식회사 엘씨에스바이오텍 | 신규한 곡류 발효물, 그 곡류 발효물의 피부 보호 용도, 피부 유용 물질 스크리닝 방법 및 산화적 스트레스로 인한 피부 손상 예측 방법 |
| CN116463227A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-07-21 | 云南英格生物技术有限公司 | 一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用 |
| CN116463227B (zh) * | 2023-05-25 | 2024-01-12 | 云南英格生物技术有限公司 | 一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用 |
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