CN116463227A

CN116463227A - 一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN116463227A
Application number: CN202310594950.0A
Authority: CN
Inventors: 王早; 郑晓琼
Original assignee: Yunnan Yinge Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yunnan Yinge Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-05-25
Filing date: 2023-05-25
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2043-05-25
Also published as: CN116463227B

Abstract

本发明提供一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用。所述具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌为异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus WX3‑1菌株，保藏编号为CCTCC NO:M 2022757，保藏时间为2022年05月30日。本发明采用了分离自香格里拉维西县生长的青刺果果实上分离到的异常威克汉姆酵母为原料，制备的发酵液和溶胞液能够促进细胞迁移，有修复的功效。

Description

一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用。

背景技术

酵母菌在食品酿造中有着悠久的应用历史，有一种能够产生特殊香气的异常威克汉姆酵母常与酿酒酵母配合发酵酱香型白酒，从而改善食品风味。如贵州大学发现在米酒酿造过程中以液态接种的形式加入所述异常威克汉姆酵母可提高发酵速率，减少米酒中高级醇（丙醇、异丁醇、丁醇、异戊醇、己醇和β-苯乙醇）的含量，尤其减少异戊醇和异丁醇含量，对改善中国传统低度米酒的品质具有重要意义。

且酵母菌发酵产物滤液是从酵母中提取的活性物，富含蛋白质、多肽、氨基酸、维生素B、矿物质、免疫多糖等50多种天然营养物质，并含有多种生物活性物质；因此，随着对酵母等有益菌的研究的深入，利用它们的发酵能力开发出发酵植物代谢产物来丰富护肤品原料的种类，为此提供了一种利用酵母菌发酵产物制作皮肤健康护理制剂的制备方法。但酵母菌提取物护肤品在备受追捧时存在以下问题：1.酵母是具有生物活性的微生物，直接加入到护肤品中会导致微生物严重超标，破坏皮肤及身体。2.现有主打活酵母类护肤品，往往宣称“活酵母”，拥有强大修护和强韧功效，实则成分复杂、功效单一，难以满足修护肌肤屏障、美白、抗衰老等多重功效。

CN112980704A公开了一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用，酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316。该菌种具有较高的淀粉酶和蛋白酶活性，并且在复筛时表现出较高的酪氨酸酶抑制活性。该菌发酵大米，得到的发酵后大米滤液的香气化合物种类增多，含量升高。

CN111088174A公开了一种扣囊复膜孢酵母菌，其胞外上清液的DPPP自由基清除率为81.9%，酪氨酸酶抑制率68.1%。将该发明的扣囊复膜孢酵母菌的胞外上清液以药用植物为基质发酵，并测得其发酵液有较好的抑痤疮丙酸杆菌效果，所制备出的含有扣囊复膜孢酵母菌的植物发酵液的产品能有效清除自由基、促进皮肤更新、减少黑色素的合成，具有非常好的应用前景。

CN112708568A公开了一种具有缓解急性结肠炎功能的酿酒酵母，该酿酒酵母BR14菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20352，保藏时间为2020年7月13日。本发明的酿酒酵母菌株能够有效缓解急性结肠炎症状，修复结肠炎造成的肠道屏障损伤，减轻炎症状况，具有良好的应用前景。

因此，亟待提供一种异常威克汉姆酵母，其发酵液、溶胞液均能应用于化妆品中，且具有优异的抗炎修复的功效。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用。所述具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌从生长于香格里拉维西县的青刺果果实上分离到的共生酵母菌异常威克汉姆酵母，其发酵液、溶胞液应用于化妆品中具有抗炎修复的功效。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌，所述具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌为异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus WX3-1菌株，保藏编号为CGMCC No: M 2022757，保藏时间为2022年05月30日。

其保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

本发明从生长于香格里拉维西县的青刺果果实的样本中分离获得并保藏了一株新的具有修复功效的异常威克汉姆酵母，将其命名为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）WX3-1菌株，由该菌株产生的WX3-1发酵滤液、菌体和发酵液中含糖类、氨基酸等具有生物活性的成分，能够促进细胞迁移、促进划痕愈合，具有较好的修复功效。

在本发明中，所述异常威克汉姆酵母菌WX3-1菌株的来源如下所示：

（1）选取分离自生长于香格里拉维西县的青刺果果实的样本，使用液体培养基28~32℃（例如可以是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等）培养18~24 h（例如可以是18 h、19 h、20h、21 h、22 h、23 h、24 h等）后，将增菌液涂布在固体培养基上，挑取出不同形态的菌落后在固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落使用液体培养基扩大培养，再使用甘油进行保藏；

（2）针对保藏的3株单菌进行显微形态观察，筛选出具有酵母菌形态特征的一株进行鉴定。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：将异常威克汉姆酵母WX3-1菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到WX3-1菌株发酵产物。

优选地，所述异常威克汉姆酵母WX3-1菌株的接种量为0.5-5 vol%，例如可以是0.5 vol%、1 vol%、1.5 vol%、2 vol%、2.5 vol%、3 vol%、3.5 vol%、4 vol%、4.5 vol%、5vol%等。

优选地，所述发酵培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物4-6 g/L、胰酪胨4-6 g/L、葡萄糖18-22 g/L。

在所述发酵培养基中，动物组织胃蛋白酶水解物的浓度为4-6 g/L，例如可以是4g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L、6 g/L等。

在所述发酵培养基中，胰酪胨的浓度为4-6 g/L，例如可以是4 g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L、6 g/L等。

在所述发酵培养基中，葡萄糖的浓度为18-22 g/L，例如可以是18 g/L、19 g/L、20g/L、21 g/L、22 g/L等。

优选地，所述发酵培养的温度为26-36℃，例如可以是26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃等，发酵培养的时间为24-48 h，例如可以是24 h、26 h、28 h、30 h、32 h、34 h、36h、38 h、40 h、42 h、44 h、46 h、48 h等。

优选地，所述发酵培养在摇床振摇下进行，发酵培养的转速为100-200 rpm，例如可以是100 rpm、120 rpm、140 rpm、160 rpm、180 rpm、200 rpm等。

优选地，所述发酵培养完成后菌液中酵母菌含量在10⁵CFU/mL以上，例如可以是10⁵CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL等。

优选地，所述发酵培养完成后还需依次进行灭菌、离心收集沉淀、破壁。

在本发明中，得到WX3-1菌株发酵产物包括：① 离心收集的沉淀（WX3-1菌体）；②离心得到的上清液（WX3-1发酵滤液）；③ 破壁处理后得到的产物（WX3-1溶胞产物）。本发明获得的这三种WX3-1菌株发酵产物中均含有丰富的糖类、氨基酸等具有生物活性的成分，能够促进细胞迁移、促进划痕愈合，具有较好的修复功效。

优选地，所述灭菌的温度为110-125℃，例如可以是110℃、115℃、120℃、125℃等，灭菌的时间为5-30 min，例如可以是5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min等。

优选地，所述离心采用实验室离心机进行，离心的转速为3000-5000 rpm，例如可以是3000 rpm、3500 rpm、4000 rpm、4500 rpm、5000 rpm等，离心的时间为15-20 min，例如可以是15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min等。

优选地，所述离心采用带式离心机进行，离心的转速为18000-20000 rpm，例如可以是18000 rpm、18500 rpm、19000 rpm、19500 rpm、20000 rpm等，离心的流速为15-20min，例如可以是15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min等。（车间生产放大时使用。）

优选地，所述破壁采用高压均质机进行，破壁的压力为1000-2000 bar，例如可以是1000 bar、1200 bar、1400 bar、1600 bar、1800 bar、2000 bar等。

第三方面，本发明提供一种WX3-1菌株发酵产物，所述WX3-1菌株发酵产物由如所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌的培养方法培养得到。

第四方面，本发明提供一种所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌、或所述的WX3-1菌株发酵产物在制备促进细胞迁移的产品中的应用。

第五方面，本发明提供一种所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌、或所述的WX3-1菌株发酵产物在制备具有抗炎和修复功效的化妆品中的应用。

第六方面，本发明提供一种化妆品原料，所述化妆品原料包括所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌、或所述的WX3-1菌株发酵产物。

优选地，所述具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌占所述化妆品原料总质量的0.1-5%，例如可以是0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、2%、4%、5%等。

优选地，所述WX3-1菌株发酵产物占所述化妆品原料总质量的0.1-5%，例如可以是0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、2%、4%、5%等。

优选地，所述化妆品原料还包括溶剂和/或辅料。

优选地，所述溶剂选自纯化水、生理盐水、磷酸缓冲液、甘油、丁二醇或丙二醇中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述辅料选自乳酸、苯氧乙醇、山梨酸钾或苯甲酸钠中的任意一种或至少两种的组合。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

附图说明

图1为异常威克汉姆酵母WX3-1菌株的菌落的宏观形态图；

该异常威克汉姆酵母WX3-1命名为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）WX3-1菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年05月30日，保藏编号为CGMCC No: M 2022757，地址为：中国，武汉，武汉大学。

图2为异常威克汉姆酵母WX3-1菌株的菌落的微观形态图。

图3为WX3-1发酵滤液、菌体和溶胞液的0 h、24 h划痕愈合结果图。

图4为WX3-1发酵滤液、菌体和溶胞液的24 h划痕愈合率结果对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一株异常威克汉姆酵母菌WX3-1菌株，所述异常威克汉姆酵母菌WX3-1菌株分离步骤如下所示：

（1）选取分离自生长于香格里拉维西县的青刺果果实的样本，使用液体培养基30℃培养18~24 h后，将增菌液涂布在固体培养基上，挑取出不同形态的菌落后在固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落使用液体培养基扩大培养，再使用甘油进行保藏；

实施例2

本实施例对实施例1得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：

（1）形态鉴定：

将WX3-1菌株接种在MEA培养基中，在28℃下培养72 h，在显微镜下进行观察。观察可得，菌落平伏，白色奶油状，质地粘稠，表面反光，边缘不整齐；细胞椭圆形或卵圆形，单生或对生，2.5-8.5 μm（单个菌体的直径）。

（2）分子生物学鉴定：

异常威克汉姆酵母菌WX3-1菌株通过ITS rDNA基因序列系统发育分析，将其准确鉴定到种；

序列信息如下所示：

CATTATAGTA TTCTATTGCC AGCGCTTAAT TGCGCGGCGA TAAACCTTAC

ACACATTGTC TAGTTTTTTT GAACTTTGCT TTGGGTGGTG AGCCTGGCTT

ACTGCCCAAA GGTCTAA.ACA CATTTTTTTT AATGTTAAAA CCTTTAACCA

ATAGTCATGA AAATTTTTAA CAAAAATTAA AATCTTCAAA ACTTTCAACA

ACGGATCTCT TGGTTCTCGC AACGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAC

GTATTGTGAA TTGCAGATTT TCGTGAATCA TCGAATCTTT GAACGCACAT

TGCACCCTCT GGTATTCCAG AGGGTATGCC TGTTTGAGCG TCATTTCTCT

CTCAAACCTT CGGGTTTGGT ATTGAGTGAT ACTCTGTCAA GGGTTAACTT

GAAATATTGA CTTAGCAAGA GTGTACTAAT AAGCAGTCTT TCTGAAATAA

TGTATTAGGT TCTTCCAACT CGTTATATCA GCTAGGCAGG TTTAGAAGTA

TTTTAGGCTC GGCTTAACAA CAATAAACTA AAAGTTTGAC CTCAAATCAG

GTAGGACTAC GCGCTGAACT TAAGCATATC AATAAG。

实施例3

本实施例对异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus WX3-1菌株的培养条件进行优化，步骤如下：

将储存的WX3-1菌株在液体培养基中活化，通过培养时间和培养液浑浊度确定菌株活力后再接种；将异常威克汉姆酵母菌WX3-1接种于发酵培养基（发酵培养基包括：动物组织胃蛋白酶水解物5 g/L、胰酪胨5 g/L、葡萄糖20 g/L）中，分别于20-40℃的不同温度下培养84 h，所述发酵培养在摇床振摇下进行，发酵培养的转速为150 rpm培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD₆₀₀数值；

结果如表1所示：

表1

由表1所示，异常威克汉姆酵母菌WX3-1在26~36℃，培养24~48 h即可达到生长稳定期。

实施例4

本实施例对异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus WX3-1菌株的培养基进行优化，步骤如下：

将储存的WX3-1菌株在液体培养基中活化，通过培养时间和培养液浑浊度确定菌株活力后再接种；将异常威克汉姆酵母菌WX3-1接种于发酵培养基（不同培养基）中，分别于30℃的不同温度下培养36 h，所述发酵培养在摇床振摇下进行，发酵培养的转速为150 rpm培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD₆₀₀数值；

结果如表2所示：

表2

由表2所示，本发明异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus WX3-1菌株最佳培养基为：动物组织胃蛋白酶水解物4-6 g/L、胰酪胨4-6 g/L、葡萄糖18-22 g/L，在该配比下，能够有效地提供酵母菌生长过程中的营养物质，从而使得发酵条件有利于酵母菌菌体的繁殖，提高发酵液中的菌体密度。

实施例5

本实施例提供一种WX3-1菌株发酵产物的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

（1）将异常威克汉姆酵母WX3-1菌株以接种量为0.5%接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；

其中，所述发酵培养基配方：动物组织胃蛋白酶水解物5 g/L、胰酪胨5 g/L、葡萄糖20 g/L；所述发酵培养的温度为30℃，发酵培养的时间为36 h，且所述发酵培养在摇床振摇下进行，发酵培养的转速为150 rpm；

（2）将步骤（1）得到的发酵液在120℃下灭菌20 min后，经4000 rpm离心18 min后，收集沉淀，得到WX3-1菌体，收集上清液，得到WX3-1发酵滤液；

（3）将步骤（2）得到的WX3-1菌体进行破壁处理，得到WX3-1溶胞产物；其中，所述破壁采用高压均质机进行，破壁的压力为1500 bar。

实施例6

本实施例提供WX3-1发酵滤液、菌体、溶胞液的细胞迁移实验

测试样品：实施例5提供的WX3-1菌体、WX3-1发酵滤液和WX3-1溶胞产物；

测试方法：

S1 MTT法测定最大安全浓度：

将细胞密度调整为1×10⁵cell/mL，按照每孔200 μL的体积接种细胞至96孔板中，放入培养箱孵育（37℃、5%CO₂）。24 h后取出96孔板，弃除旧培养基，调零孔和空白对照组每孔加200 μL基础培养基，实验组每孔加200 μL用基础培养基配制的样品，按照每组每个浓度3个复孔进行布板。然后放回培养箱培养（37℃，5% CO₂）；加药处理后24 h，取出96孔板，每孔加入MTT工作液（5 mg/mL）20 μL，放回培养箱继续培养4 h，然后弃除孔内液体，每孔重新加入150 μL DMSO，振摇10 min后于490 nm波长处测定吸光度（OD值），结果见表3。

表3

由表3所示，WX3-1菌体在任意浓度范围内细胞活力平均值都在90%以上，其浓度为15%细胞活力平均值最佳达到126.48%；而WX3-1溶胞产物在任意浓度范围内细胞活力平均值都在64%以上，其浓度为1.875%细胞活力平均值最佳达到79.89%；WX3-1发酵滤液其浓度为1.875~7.5%之间时促进细胞迁移能力更好，活力平均值都达到60%以上，其浓度为1.875%细胞活力平均值最佳达到95.27%。S2 对角质形成细胞划痕损伤的影响：

通过S1对于最大安全浓度的测试，样品选择1%浓度进行测试细胞迁移实验测试：选择角质形成细胞进行铺板，用200 μL枪头垂直于背面的横线进行划痕，每孔3条划痕；用PBS冲洗细胞3次，将划下的细胞碎屑冲洗干净，然后显微镜拍照记录划痕。阴性对照组每孔加入1.8 mLMEM基础培养基和200 μL浓度为10 μg/mL的LPS，阳性对照组每孔加1.8 mLMEM浓度为100 μg/mL的积雪草苷和200 μL浓度为10 μg/mL的LPS；实验组每孔分别加入1.8 mL浓度为1%的待测溶液和200 μL浓度为10 μg/mL的LPS，每组每个浓度3个复孔；按照公式I计算划痕愈合率%（即细胞迁移率%），比较各组间划痕愈合率（细胞迁移率%）的差异；

24 h划痕愈合率（细胞迁移率）%=[(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积]×100%；（公式I）

具体测试结果如下表4所示：

表4

其中，图3为WX3-1发酵滤液、菌体和溶胞液的0 h、24 h划痕愈合结果图。图4为WX3-1发酵滤液、菌体和溶胞液的24 h划痕愈合率结果对比图，如图3-4所示，WX3-1溶胞产物促进细胞迁移能力更好。

这说明在本发明中，得到WX3-1菌株发酵产物包括：① 离心收集的沉淀（WX3-1菌体）；② 离心得到的上清液（WX3-1发酵滤液）；③ 破壁处理后得到的产物（WX3-1溶胞产物）。本发明获得的这三种WX3-1菌株发酵产物中均含有丰富的糖类、氨基酸等具有生物活性的成分，能够促进细胞迁移、促进划痕愈合，具有较好的修复功效。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌及其培养方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌，其特征在于，所述具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌为异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus WX3-1菌株，保藏编号为CCTCC NO: M 2022757，保藏时间为2022年05月30日。

2.一种根据权利要求1所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：将异常威克汉姆酵母WX3-1菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到WX3-1菌株发酵产物。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述异常威克汉姆酵母WX3-1菌株的接种量为0.5-5 vol%；

其中，所述发酵培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物4-6 g/L、胰酪胨4-6 g/L、葡萄糖18-22 g/L。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为26-36℃，发酵培养的时间为24-48 h；且所述发酵培养在摇床振摇下进行，发酵培养的转速为100-200rpm。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养完成后菌液中酵母菌含量在10⁵CFU/mL以上。

6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养完成后还需依次进行灭菌、离心收集沉淀、破壁；

其中，所述灭菌的温度为110-125℃，灭菌的时间为5-30 min；所述离心采用实验室离心机进行，离心的转速为3000-5000 rpm，离心的时间为15-20 min；或所述离心采用带式离心机进行，离心的转速为18000-20000 rpm，离心的流速为15-20 min；所述破壁采用高压均质机进行，破壁的压力为1000-2000 bar。

7.一种WX3-1菌株发酵产物，其特征在于，所述WX3-1菌株发酵产物由如权利要求2-6中任一项所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌的培养方法培养得到。

8.一种根据权利要求1所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌、或权利要求7所述的WX3-1菌株发酵产物在制备促进细胞迁移的产品中的应用。

9.一种根据权利要求1所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌、或权利要求7所述的WX3-1菌株发酵产物在制备具有抗炎和修复功效的化妆品中的应用。

10.一种化妆品原料，其特征在于，所述化妆品原料包括权利要求1所述的具有修复功效的异常威克汉姆酵母菌、或权利要求7所述的WX3-1菌株发酵产物。