CN111763647B - 枯草芽孢杆菌mk15及其发酵方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MK15,其保藏号为CGMCC NO.19743。属于微生物发酵领域。本发明还公开了采用枯草芽孢杆菌发酵米糠产α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法与用途。本发明提供了一种新的菌株枯草芽孢杆菌MK15,用枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠,通过优化的发酵条件,提高了产物对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制作用。经响应面法对发酵条件优化后,对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制率达到了88.8%。通过对纯化后的米糠发酵产物结构进行了表征,脱水的米糠发酵产物可形成多孔块状结构;FT‑IR的结果表明其为含有侧链的多糖类物质。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域,具体涉及一种枯草芽孢杆菌MK15;本发明还涉及该枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠工艺及产物抑制α-葡萄糖苷酶的用途。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是我国农业部批准使用的有益菌种,常作为生物发酵剂,在生长过程中可产生蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、纤维素酶等,常将其用于豆类水解成氨基酸、多肽及氨类化合物。2008年,朱运平等人用枯草芽孢杆菌发酵豆渣提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到90%,与本实验最优条件发酵米糠的产物的结果相似。2011年,张友维等人用枯草芽孢杆菌发酵花生,获得了具有抗氧化能力较强的花生多肽。2014年,Shin等用Bacillus subtilisCSYl91发酵了黑豆,显著提高了黑豆的抗氧化能力。2017年,罗斌等人用枯草芽孢杆菌发酵米糠制备活性肽。
米糠是稻米加工过程中的副产物,主要成分为种皮、糊粉层和牙胚,约占稻米质量的6%-8%,为可再生资源,其含有丰富的优质脂肪酸、维生素、γ-氨基丁酸和大量的膳食纤维等。根据资料显示,种植水稻的国家很多,区域很广,产量也很大,大部分集中在亚洲地区。中国是世界上最大的水稻种植国,米糠的年产量约为1800万吨。但是,以往大都用作牲畜的饲料或肥料,利用率低,如废弃还造成环境污染。II型糖尿病,又叫非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM),是胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足或者两样都兼有造成的。由于II型糖尿病的前期症状较轻,往往会被忽视,在我国糖尿病者中占95%以上为II型,其病程长,并发症多,对人类健康威胁大。在医学上,可以通过增加胰岛素敏感、促进胰岛素分泌、抑制α-葡萄糖苷酶活性等方法来缓解和治愈II型糖尿病。
α-葡萄苷酶抑制剂(简称AGI)通过抑制肠粘膜刷状缘的糖苷酶活性来降低双糖水解为单糖的速度,从而减缓餐后血糖的上升,因此,能有效减缓糖尿病前期患者发展为糖尿病,对糖尿病的并发症也有很好的预防作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为第4类公认的治疗糖尿病的药物,是较为重要的降血糖药物。除了治疗糖尿病外,AGI还被发现可用于治疗高血压、血脂、肥胖以及抗病毒感染等。阿卡波糖是首个上市的糖苷酶抑制剂,在我国是常见的血糖药物,对血糖的控制效果也较好。但是,长期服用存在一定的副作用,如对肝脏造成损害和引起肠梗阻等。所以寻找天然、安全、经济的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物是控制糖尿病的有效途径。目前,国外主要是将化学和生化相结合的方法,国内则多是从中药中提取等传统方法。从微生物发酵中提取,对活性成分进行分离和纯化的报道还比较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种新的菌株枯草芽孢杆菌MK15。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供了枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途。
为实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:本发明是一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MK15,其保藏号为CGMCC NO.19743。
本发明公开的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MK15来自于四川泡菜。该菌株于2020年4月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC NO:19743。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明还公开了一种枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法,其特点是,包括以下步骤:
(1)枯草芽孢杆菌MK15种子液接入发酵培养基发酵培养:发酵温度为35℃,发酵时间为48 h-50 h,pH为8.0,接种量为3%,摇床转速为180 rpm,发酵装液量为50 mL/250mL;所述的发酵培养基是:米糠5%、葡萄糖0.1%、NaCl 0.5%、尿素 0.5%、pH 8.0、自来水配制,115℃灭菌 20 min;
(2)取枯草芽孢杆菌MK15发酵液,4℃,8000 rpm离心30 min,取上清液过0.45μm滤膜;
(3)发酵产物的纯化:用HCl和NaOH溶液调节pH去除米糠发酵产物中的酸性和碱性蛋白,用无水乙醇醇沉,再用Sevage法去除剩余的蛋白,真空冷冻干燥机冻干,即得。
本发明所述的一种枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法,其进一步优选的特点是,种子液的制备方法是:从斜面刮取两环枯草芽孢杆菌MK15接入50mL种子培养基,37℃,180 rpm,培养24 h;种子培养基的组成为:牛肉浸膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0、自来水配制,121℃灭菌20 min。
本发明所述的一种枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法,其进一步优选的特点是,发酵产物的纯化方法为:
(1)用氢氧化钠将米糠发酵液的pH值调至9.0,8000 rpm离心30 min,去除碱性蛋白;
(2)再用盐酸将pH值调至5.0去除酸性蛋白,然后将pH值调到7.0;
(3)用三倍体积的无水乙醇,4℃,醇沉24 h,8000 rpm离心30 min后取沉淀,用蒸馏水复溶;
(4)用Sevage法去除剩余蛋白,将样品溶液、氯仿、正丁醇之比调为25:5:1,混合物剧烈震荡30 min,8000 rpm,4℃,离心5 min,去除蛋白质与氯仿,正丁醇生成的凝胶物;发酵产物用真空冷冻干燥机冻干。
本发明还公开了一种枯草芽孢杆菌MK15发酵产物的用途,所述的用途为将枯草芽孢杆菌MK15发酵产物用于α-葡萄糖苷酶抑制剂,所述的发酵产物是采用以上技术方案所述的方法制得。
发明人对本发明的研究方法主要体现在:
⑴单因子实验设计:在基础培养条件的基础上,分别选取不同的可能对米糠发酵产抑制剂起到促进作用的培养条件,经过发酵培养后,4℃,8000 rpm离心30 min后,取上清液过0.45 μm滤膜,测量对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。
⑵显著性因子的筛选:以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值,对单因子实验设计中能影响到米糠发酵的培养条件进行筛选,选取对产抑制率显著性增强的培养条件。采用中心组合设计:根据单因素实验结果选取的显著正效应的培养条件,为响应面优化实验因素的中心点,采用统计软件Box-Benhnken进行实验设计,以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值,对响应面模型进行方差分析,确定培养组合效应产生对α-葡萄糖苷酶活性抑制率的最大值。
米糠发酵产物初步纯化:米糠发酵产物4℃,8000 rpm离心30 min后,用HCl和NaOH溶液调节pH去除酸性和碱性蛋白,用三倍体积的无水乙醇醇沉,再用Sevage法去除剩余的蛋白,用真空冷冻干燥机冻干备用。
通过FT-IR对纯化后的米糠发酵产物结构进行表征:将米糠发酵产物冻干粉在80℃下烘干,在红外灯下,将微量样品和干燥的KBr粉末混匀并充分研磨后,用真空压片机压片,然后用红外光谱仪进行扫描,扫描范围为4000-400 cm-1。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种新的菌株枯草芽孢杆菌MK15,用枯草芽孢杆菌MK15发酵米糠,其产物对α-葡萄糖苷酶活性具有很强抑制作用。
经响应面法对发酵条件优化后,对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到了88.8%。通过对纯化后的米糠发酵产物结构进行了表征,脱水的米糠发酵产物可形成多孔块状结构;FT-IR的结果表明其为含有侧链的多糖类物质。
本发明方法以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值,首先采用单因子实验设计对可能影响到枯草芽孢杆菌MK15发酵培养的条件进行筛选,选取发酵培养条件改变时对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率产生显著增强的培养条件。进一步采用中心组合设计,以对α-葡萄糖苷酶的抑制率为响应值,通过响应面统计分析确定发酵培养条件的最优组合效应。
附图说明:
图1为培养温度对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图2为时间对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图3为pH对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图4为接种量对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图5为米糠添加量对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图6为转速对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图7为装液量对对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图;
图8为培养pH与温度的交互作用的响应面图和等高线图;
图9为培养时间与温度的交互作用的响应面图和等高线图;
图10为培养pH与时间的交互作用的响应面图和等高线图;
图11为米糠发酵产物在5000x放大倍数下的SEM图像;
图12为米糠发酵产物的红外色谱图(500-4000 cm-1)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述,以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明,而不构成对其权利的限制。
实施例1,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MK15,其保藏号为CGMCC NO.19743。
(一)枯草芽孢杆菌MK15的米糠发酵产物的制备及纯化方法如下:
发酵种子的制备:从斜面刮取两环枯草芽孢杆菌MK15接入50mL种子培养基(NA:牛肉浸膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0、自来水、121℃灭菌20 min),37℃,180rpm,培养24 h。
米糠发酵产物的制备:将种子液按3% 的量接种至米糠发酵培养基(米糠5%、葡萄糖0.1%、NaCl 0.5%、尿素 0.5%、pH 8.0、自来水配制,115℃,灭菌 20 min)中,35℃,180rpm发酵48 h后,8000 rpm,4℃离心30 min取上清液过0.45μm滤膜,测量对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。
米糠发酵产物进行初步纯化:用氢氧化钠将米糠发酵液的pH值调至9.0,8000rpm离心30 min,去除碱性蛋白,再用盐酸将pH值调至5.0去除酸性蛋白,然后将pH值调到7.0。用三倍体积的无水乙醇,4℃,醇沉24 h,8000 rpm离心30 min后取沉淀,用蒸馏水复溶。用Sevage法去除剩余蛋白,根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶于水的特点,将样品溶液、氯仿、正丁醇之比调为25:5:1,混合物剧烈震荡30 min,8000 rpm,4℃,离心5 min,去除蛋白质与氯仿,正丁醇生成的凝胶物。将初步纯化的米糠发酵产物用真空冷冻干燥机冻干。
米糠发酵产物在5000x放大倍数下的SEM图像参照图11;米糠发酵产物的红外色谱图(500-4000 cm-1)参照图12。
(二)米糠发酵产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定:
α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定:在96孔板中加入50 μL浓度0.5 M pH 6.7磷酸盐溶液,30 μL 0.5 mM PNPG底物溶液,50 μL样品溶液,20 μL α-葡萄糖苷酶溶液(用磷酸盐溶液将α-葡萄糖苷酶溶液配置成200 U/mL),在37℃ 反应30 min,加入50 μL 0.67 MNa2CO3溶液终止反应,混匀后在405 nm处测量吸光值,采用阿卡波糖作为阳性对照。空白组用磷酸盐溶液代替PNPG底物溶液和酶液,对照组用磷酸盐溶液代替样品溶液。
AGI(%)=[A对照-(A样品-A空白)] /A对照×100%
式中:AGI为α-葡萄糖苷酶抑制率,%;A样品为样品组的吸光度值;A空白为空白组的吸光度值;A对照为对照组的吸光度值。
(三)米糠发酵单因素实验
培养温度、时间、pH、接种量对α-葡萄糖苷酶活性的影响:
将枯草芽孢杆菌MK15活化后的种子液按3% 的量接种到装有50 mL发酵培养基的250 mL的三角瓶中,180 rpm,在不同温度(25-40℃)下发酵48 h后,按照实施案例(一)的步骤的方法制备成待测样品,按照实施例(二)的方法测试对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
将枯草芽孢杆菌MK15种子液按3%的接种量接入发酵培养基中,在35℃,180 rpm,培养不同时间(25-72 h)取出测量对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
将发酵培养基pH值调至6.0-10.0,并在最优条件下发酵,取发酵液离心后,过0.45μm滤膜后测量对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
将枯草芽孢杆菌MK15种子液按照不同量添加到发酵培养基中,按照以上最优条件进行发酵48 h。
发酵培养基中的米糠添加量分别为0-9%,pH为8.0,接种量为3%,温度为35℃、摇床转速为180 rpm、发酵时间为48 h,然后测定α-葡萄糖苷酶的抑制率,确定最佳米糠添加量。
在不同转速(120~220 rpm),最优米糠添加量、温度、时间下进行培养,用标准的方法测对α-葡萄糖苷酶的抑制率,确定最佳pH。
将不同体积培养基(20-80 mL) 装入250 mL三角瓶中,115℃ 灭菌20 min,冷却后3%的接种量,温度为35℃,发酵48 h。测量发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
培养温度、时间、pH、接种量对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果参见图1-图4。米糠添加量、转速、装液量对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果参见图5-图7。
(四)响应面法优化米糠发酵工艺
在单因素实验的基础上,选取温度、时间、pH 三个因素,α-葡萄糖苷酶抑制率为相应值,结合单因素实验结果,采用Box-Behnken 响应面法设计中心组合实验,因素与水平见表1。
表1 响应面因素与水平表
培养pH与温度、培养时间与温度、培养pH与时间的交互作用的响应面图和等高线参见图8-图10。
(五)米糠发酵产物表征结构
将米糠发酵产物冻干粉在80℃下烘干,在红外灯下,将微量样品和干燥的KBr粉末混匀并充分研磨后,用真空压片机压片,然后用红外光谱仪进行扫描,扫描范围为4000-400cm-1。
数据处理:采用Design Expert 8.0.6 软件设计响应面、数据分析及建立回归模型,运用Origin Pro2018、进行作图。
Claims (3)
1.一 种 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillussubtilis) MK15 , 其 特 征 在 于 : 其保 藏 号 为 CGMCCNO.19743。
2.一种枯草芽孢杆菌 MK15 发酵米糠产 α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法,其特征在于,枯草芽孢杆菌 MK15的 保 藏 号 为 CGMCCNO.19743,产 α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法包括以下步骤:
(1)枯草芽孢杆菌 MK15 种子液接入发酵培养基发酵培养: 发酵温度为 35℃,发酵时间为48h-50h,pH 为 8.0,接种量为 3%,摇床转速为 180rpm,发酵装液量为 50mL/250mL;所述的发酵培养基是:米糠 5%、葡萄糖 0.1%、NaCl0.5%、尿素 0.5%、pH8.0、自来水配制,115℃灭菌 20min;
(2)取枯草芽孢杆菌 MK15 发酵液, 4℃,8000rpm 离心 30min, 取上清液过0.45μm滤膜;
(3)发酵产物的纯化:用 HCl 和 NaOH 溶液调节 pH 去除米糠发酵产物中的酸性和碱性蛋白,用无水乙醇醇沉,再用 Sevage 法去除剩余的蛋白,真空冷冻干燥机冻干;
种子液的制备方法是:从斜面刮取两环枯草芽孢杆菌 MK15 接入 50mL 种子培养基,37℃,180rpm,培养 24h;种子培养基的组成为:牛肉浸膏 3g/L、蛋白胨 10g/L、NaCl5g/L、pH7.0、自来水配制, 121℃灭菌 20min;
发酵产物的纯化方法为:用氢氧化钠将米糠发酵液的 pH 值调至 9.0 ,8000rpm 离心30min,去除碱性蛋白;再用盐酸将 pH 值调至 5.0 去除酸性蛋白,然后将 pH 值调到7.0;用三倍体积的无水乙醇,4℃醇沉 24h ,8000rpm 离心 30min 后取沉淀,用蒸馏水复溶;用 Sevage 法去除剩余蛋白,将样品溶液、氯仿、正丁醇之比调为 25:5:1,混合物剧烈震荡 30min, 8000rpm,4℃离心 5min,去除蛋白质与氯仿,正丁醇生成的凝胶物;发酵产物用真空冷冻干燥机冻干。
3.权利要求 1 所述的一种枯草芽孢杆菌 MK15 发酵产物的用途,其特征在于:所述的用途为将枯草芽孢杆菌 MK15 发酵产物用于 α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备,所述的发酵产物是采用权利要求 2 所述的方法制得。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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