CN116836872B

CN116836872B - 一种枯草芽孢杆菌多糖类α-淀粉酶抑制剂及其应用

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Publication number: CN116836872B
Application number: CN202310830580.6A
Authority: CN
Inventors: 李才明; 李兆丰; 张兰; 陈荻; 顾正彪; 班宵逢; 洪雁; 程力
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2023-07-06
Filing date: 2023-07-06
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2043-07-06
Also published as: CN116836872A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌多糖类α‑淀粉酶抑制剂及其应用，属于微生物技术领域。该α‑淀粉酶抑制剂生产菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.27209。本发明首先将菌株进行发酵，使其发酵液中积累一定量的α‑淀粉酶抑制剂；然后进行煮沸灭酶，去除蛋白和细胞沉淀，得到澄清上清液；进一步用无水乙醇沉淀，冷冻干燥后即得α‑淀粉酶抑制剂。该α‑淀粉酶抑制剂能强烈抑制猪胰腺α‑淀粉酶，且体外抑制效果强于阳性对照阿卡波糖，同时能明显降低小鼠的餐后血糖水平，可用于制备治疗和预防糖尿病、肥胖症的药物或功能性食品。

Description

一种枯草芽孢杆菌多糖类α-淀粉酶抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌多糖类α-淀粉酶抑制剂及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

淀粉作为人类膳食的重要组成和能量的主要来源，其消化性与人体健康密切相关。加工食品中绝大部分淀粉在进入人体后快速降解成葡萄糖，是引起餐后血糖上升的最主要因素。血糖稳态是维持生命正常运转的基础，而餐后血糖的剧烈波动极大增加了机体调节血糖稳态的压力，不利于机体健康，长此以往，甚至会导致糖代谢紊乱，诱发一系列代谢类疾病，如肥胖、糖尿病和心血管疾病等。降低淀粉消化性能够减弱餐后血糖负荷，有助于维持血糖稳态和机体正常运转，对于非胰岛素依赖型糖尿病和心血管疾病也具有预防和辅助治疗作用。

淀粉进入消化道后，依次经唾液α-淀粉酶、胰腺α-淀粉酶和小肠刷状缘α-葡萄糖苷酶降解，抑制这些淀粉消化酶活性是降低淀粉消化性、维持餐后血糖平衡的重要手段之一。目前常见的淀粉消化酶抑制剂以α-葡萄糖苷酶抑制剂为主，如阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等。然而这些抑制剂主要作为治疗糖尿病的临床药物使用，不能满足普通人群对调控淀粉消化性的日常需求。同时，α-葡萄糖苷酶抑制剂用于减缓寡糖的降解，但寡糖在肠道中将进行厌氧发酵，从而导致胀气、腹痛和腹泻等副作用。因此，选择性抑制淀粉消化金字塔顶端的α-淀粉酶，是有效控制淀粉降解、调节血糖水平的手段。

天然存在的α-淀粉酶抑制剂从结构上可分为蛋白质、多肽、多糖及多酚类等。自20世纪70年代开始，α-淀粉酶抑制剂的研究得到了广泛的关注。目前，已从禾本科和豆科植物的种子果实中提取分离得到了蛋白类α-淀粉酶抑制剂，特别是从白芸豆中提取的α-淀粉酶抑制剂，能特异性地水解人体口腔和肠道内α-淀粉酶，国内外已将其应用为商业化的减肥保健食品。蛋白质和多肽类的α-淀粉酶抑制剂虽然对α-淀粉酶的抑制作用强，但对酸、碱或高温环境敏感。多酚类物质由于含有大量的酚羟基，导致其对α-淀粉酶的特异性较弱，也能较强地抑制体内的胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰脂肪酶等。而多糖类α-淀粉酶抑制剂对酸碱、温度和胃肠道环境的稳定性较强，安全无毒，可作为天然的降糖产品。大多数研究已报道了植物多糖对α-淀粉酶的抑制作用，如食用菌多糖、秋葵多糖、淮山多糖、黄芪多糖等。相对于植物多糖，微生物多糖具有提取工艺简单、生产周期短、不受季节和地域限制等优点，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。目前，日本学者报道了一株枯草芽孢杆菌AK(保藏编号：FERM P－18291)，其发酵代谢物可以增强免疫力、抗血栓、改善db/db小鼠胰岛素抵抗以及降低血糖。该菌株16s rRNA序列与多粘芽孢杆菌(Paniebacilluspolymyxa)同源性较高，属于类芽孢杆菌属，与典型的芽孢杆菌菌种枯草芽孢杆菌(即芽孢杆菌属)亲缘关系较远。此外，该报道的发酵代谢物成分复杂，无法判断发挥降血糖功能的成分种类，也无法确定所述发酵代谢物降低血糖的原理，更没有证据证明所述发酵代谢物对于普通人群餐后血糖的调控作用。

微生物多糖安全稳定、适用于工业生产，是一种极具潜力的降血糖物质，但是尚无维持普通人群血糖稳定的微生物多糖产品。

发明内容

针对现有产品和技术存在的问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂的制备方法及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种产胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)STB22，已于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27209。

本发明的第二个目的是提供含所述枯草芽孢杆菌STB22的微生物制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂中含枯草芽孢杆菌STB22活菌数≥10⁷CFU/mL。

在一种实施方式中，所述微生物制剂还含有保护剂；所述保护剂包括但不限于甘油。

本发明的第三个目的是提供一种制备所述α-淀粉酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)发酵：于培养基中培养权利要求1所述的能产生α-淀粉酶抑制剂的生产菌株，使其发酵液中积累一定量的α-淀粉酶抑制剂；

(2)灭酶：将步骤(1)的发酵上清液于沸水中煮沸20-30min灭酶，冷却至室温。

(3)去除蛋白和细胞沉淀：向步骤(2)灭酶冷却后的溶液中加有机试剂去除蛋白，8000-10000r/min离心10-20min，除去细胞和蛋白沉淀，得到澄清上清液。

(4)乙醇沉淀：向步骤(3)的上清液中加入三倍体积的无水乙醇，4℃过夜沉淀，8000-10000r/min离心10-20min，得到沉淀。

(5)干燥：将步骤(4)的沉淀进行冷冻干燥或喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

在一种实施方式中，所述(1)中枯草芽孢杆菌可以利用单一或复合碳源，如：葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、乳糖、淀粉、糊精等，多种有机或无机氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素、玉米浆、硝酸盐、铵盐等；同时加入磷酸盐、硫酸盐、乙酸钠、柠檬酸盐等无机盐和吐温后制成液体培养基进行发酵。按4-10％接种量加入活化培养菌株，于30-37℃通气培养18-24h。

在一种实施方式中，所述(3)去除蛋白的方法为：向灭酶冷却后的溶液中加入15-17％(v/v)的85％三氯乙酸，或将灭酶后的溶液进行减压蒸发浓缩后利用Sevage法去除蛋白。

本发明的第四个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌STB22，或所述的微生物制剂，或所述的α-淀粉酶抑制剂在制备降血糖药品中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌STB22，或所述的微生物制剂，或所述的α-淀粉酶抑制剂在制备维持血糖健康水平的保健品中的应用。

有益效果：本发明利用枯草芽孢杆菌STB22进行发酵生产胞外多糖，作为α-淀粉酶抑制剂，所得胞外多糖的得率达到706mg/L，其中总糖含量65％，蛋白质含量7.09％。所得胞外多糖具有良好的α-淀粉酶抑制活性，能在体外有效抑制猪胰腺α-淀粉酶(IC₅₀:0.162mg/mL)，且抑制能力强于市售阳性对照阿卡波糖(IC₅₀:0.736mg/mL)；同时体内实验结果显示，摄入1g/kg体重的可溶性淀粉之后，小鼠的血糖浓度在餐后15min达到峰值(15.2mmol/L)，随后缓慢降低；摄入400mg/kg体重的多糖，小鼠的血糖浓度在餐后30min达到峰值(12.9mmol/L)，相比于空白对照的小鼠，其峰值血糖降低15.0％(p<0.05)，餐后血糖应答的曲线下方面积(AUC)降低了19.1％，表明该抑制剂能显著降低餐后高血糖，可有效地预防和管理糖尿病、肥胖病，具有良好的开发和应用前景。

生物材料保藏

一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)STB22，分类学命名为Bacillussubtilis，已于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27209，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1：阿卡波糖对猪胰腺α-淀粉酶的抑制曲线。

图2：枯草芽孢杆菌胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂对猪胰腺α-淀粉酶的抑制曲线。

图3：枯草芽孢杆菌胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂的分子量分布图。

图4：枯草芽孢杆菌胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂的单糖组成。

图5：枯草芽孢杆菌胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂对小鼠餐后血糖曲线(A)及AUC(B)的影响。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护的范围的不局限于此。

α-淀粉酶抑制率的测定方法:

以0.2M PBS(pH 6.9)配制1％可溶性淀粉溶液作为底物，取0.180mL猪胰腺α-淀粉酶(Sigma，货号：A3176)溶液于10mL试管中，加入0.020mL待测样品，混合均匀后置于37℃水浴锅孵育10min，取0.1mL混合溶液加入到1％可溶性淀粉中，反应10min后加入1.0mL DNS显色剂，沸水中反应5min后取出，立即冰浴冷却，加入2mL水混匀后于540nm下测定吸光度值。

按下式计算样品对α-淀粉酶的抑制率：

式中：

A₁：空白管(加酶液，不加样品)的吸光度值；

A₂：空白对照管(不加酶液和样品)的吸光度值；

A₃：抑制管(加酶液和样品)的吸光度值；

A₄：抑制对照管(加样品，不加酶液)的吸光度值。

IC₅₀的定义：半抑制浓度，即当酶活被抑制为50％时的抑制剂的浓度。

分子量测定方法：

采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定样品的分子量。称取2mg样品和不同分子量的葡聚糖标准品，制备成2mg/mL的溶液，然后向Agilent 1100高效液相色谱仪进样10μL，以超纯水为流动相(柱温：30℃，流速：1mL/min)，并在示差折光检测器下检测，然后绘制标准曲线。根据样品的保留时间，计算出样品的分子量。

单糖组成测定方法：

将5mg多糖样品在1mL三氟乙酸(TFA，2mol/L)中110℃水解2h。除尽TFA后，采用用糖腈乙酸酯衍生化法对其进行衍生化：分别加入盐酸羟胺5mg和吡啶0.25mL，并于90℃条件下反应30min。再加入乙酸酐0.25mL反应30min。单糖标准品(葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖和半乳糖)在相同条件下衍生化。将反应产物进样到气相色谱(GC)，根据样品色谱峰的保留时间和峰面积比例确定样品单糖组成的种类和比例。

小鼠餐后血糖测定方法：

将16只C57BL/6J小鼠分为空白组和实验组，每组8只。小鼠禁食12h，称体重，测量空腹血糖。分别灌胃100μL无菌水和100μL含400mg/kg体重的多糖，15min后，灌胃200μL含1g/kg体重的糊化后的可溶性淀粉溶液(称取1.6g可溶性淀粉于25mL去离子水中，于100℃糊化30min，可溶性淀粉购于国药试剂，货号：9005-84-9)，重新计时，并尾尖采血分别测定15min、30min、60min、90min和120min的血糖。

总糖含量测定方法：

首先制备一系列质量浓度的葡萄糖标准液(0.2、0.4、0.6、0.8和1mg/L)，再向溶液中加入5％苯酚(1.0mL)和浓硫酸(5mL)，置于100℃沸水中反应15min后，冷却至室温，并于490nm波长处测定紫外吸光度值。最后处理数据，制定标准曲线。

样品测定：取1mL多糖溶液按上述步骤操作，测其吸光度值，从而计算其总糖含量。

实施例1：菌株的分离与鉴定

从广西桂林米粉门店采集发酵样品。称取1g样品放入无菌均质袋，加入10mL无菌生理盐水，拍打均质10min。再取均质液进行梯度稀释(10¹、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶)，各取100μL涂布在培养基平板上，置30℃培养2d。观察菌落生长情况，选取形态不同的菌落作为初筛菌株，接种到发酵培养基中，30℃，200r/min，振荡培养3d。培养液经过12000r/min离心5min，收集菌泥，用于后续菌种鉴定。

以微生物的总DNA作为PCR模板，参照直接PCR试剂盒说明书，采用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR扩增条件：95℃5min、94℃30s、55℃30s、72℃90s，循环35次；72℃10min。将PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测后送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，用在NCBI上进行序列比对分析。

经上述方法获得和鉴定的菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)STB22，已于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27209。

实施例2：发酵时间优化

(1)将枯草芽孢杆菌STB22于发酵培养基(大豆蛋白胨10g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、K₂HPO₄·7H₂O 2g/L、醋酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、MnSO₄·4H₂O 0.05g/L)中活化18h，按2％接种量将活化液接种于新鲜的发酵培养基中，于37℃分别发酵24h、48h、72h和96h；

(2)将步骤(1)的发酵液于4℃，10000rpm离心15min获得发酵上清液于沸水中煮沸30min灭酶，冷却至室温；

(3)向步骤(2)灭酶冷却后的溶液中加入15％(v/v)的85％三氯乙酸去除蛋白，10000r/min离心10-20min，除去细胞和蛋白沉淀，得到澄清上清液；

(4)向步骤(3)的上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜沉淀，10000r/min离心10-20min，得到沉淀。

(5)将步骤(4)的沉淀进行冷冻干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。产物得率(mg/L)＝冻干样品质量/发酵体积。

经上述方法获得的产品信息如表1所示，结果表明，产物得率和总糖含量随着发酵时间的延长先增加后降低，可能由于发酵末期部分糖类物质作为菌株的发酵底物。发酵48h的产物得率和总糖含量与发酵72h的相差不大，综合发酵时间和经济考虑，后期选择发酵48h。

表1不同发酵时间获得的枯草芽孢杆菌胞外多糖

实施例3：发酵底物优化

具体实施方式同实施例2，区别在于，将步骤(1)中20g/L葡萄糖碳源用复合碳源代替，复合碳源为5g/L果糖、5g/L甘露糖、5g/L海藻糖和5g/L半乳糖的复合，同时发酵最优时间48h，结果显示产物得率为843mg/L，比仅以葡萄糖为碳源的产物得率高30％。结果表明，碳源的种类可以影响多糖的产量，主要是由于加入的碳源可以促进胞外多糖合成基因的启动并促进相应酶系的合成，从而提高胞外多糖的产量。

实施例4：提取工艺优化

具体实施方式同实施例2，区别在于，将步骤(4)中3倍体积的无水乙醇分别用终浓度为80％、86％、89％和91％的无水乙醇代替。结果显示产物得率分别为650mg/mL、678mg/mL、690mg/mL和706mg/mL，总糖含量分别为58.2％、60.6％、62.4％、65％。结果表明，乙醇浓度可以影响产物得率，乙醇浓度越大，获得的产物得率越高，同时沉淀的产物中糖含量越大。

表2不同乙醇浓度醇沉的枯草芽孢杆菌胞外多糖

实施例5：枯草芽孢杆菌胞外多糖类α-淀粉酶抑制剂的性质与功能表征

由实施例4获得的多糖类α-淀粉酶抑制剂的分子量约为58.91KDa，主要由甘露糖(35.1％)和葡萄糖(58.10％)组成，同时包括半乳糖(5.64％)、木糖(0.24％)、阿拉伯糖(0.22％)和鼠李糖(0.7％)。体外实验结果表明，该抑制剂能有效抑制猪胰腺α-淀粉酶(IC₅₀:0.162mg/mL)，且抑制能力强于市售阳性对照阿卡波糖(IC₅₀:0.736mg/mL)(如图1～2所示)；同时体内实验结果显示，摄入1g/kg体重的可溶性淀粉之后，小鼠的血糖浓度在餐后15min达到峰值(15.2mmol/L)，随后缓慢降低；摄入400mg/kg体重的多糖，小鼠的血糖浓度在餐后30min达到峰值(12.9mmol/L)，相比于空白对照的小鼠，其峰值血糖降低15.0％(p<0.05)，餐后血糖应答的曲线下方面积(AUC)降低了19.1％(如图5所示)，表明该抑制剂能显著降低小鼠的餐后高血糖。

对比例1：

具体实施方式同实施例4，区别在于，用三氯乙酸去除蛋白改为Sevage法去除蛋白并发酵48h，用终浓度为80％的乙醇沉淀，结果显示产物得率为650mg/L，蛋白含量为5.27％，总糖含量为58.2％。相对于85％三氯乙酸去蛋白的方法(蛋白含量7.07％，总糖含量56.4％)，采用该方法获得的样品中蛋白含量下降了25.5％，总糖含量下降了3.1％。结果表明，利用Sevage法去除蛋白能够显著降低蛋白含量，但同时也会降低多糖得率。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1. 一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）STB22，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌STB22于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 27209。

2.含权利要求1所述枯草芽孢杆菌STB22的微生物制剂。

3. 根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含枯草芽孢杆菌STB22活菌数≥10⁷ CFU/mL。

4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还含有保护剂；所述保护剂包括但不限于甘油。

5.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌STB22制备的α-淀粉酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂含有所述枯草芽孢杆菌STB22发酵生产的多糖。

6.制备权利要求5所述α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌STB22于培养基中发酵，获得发酵液；

（2）除去步骤（1）所得发酵液中的细胞和蛋白沉淀，得到澄清上清液；

（3）提取步骤（2）所述上清液中的多糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述培养基的碳源为葡萄糖或复合碳源，所述复合碳源包括果糖、甘露糖、海藻糖和半乳糖。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）用三氯乙酸法去除蛋白。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌STB22，或权利要求2~4任一所述的微生物制剂，或权利要求5所述的α-淀粉酶抑制剂在制备降血糖药品中的应用。