CN109294944B - 一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，利用全自动肠道菌群体外模拟模型装置，将普雷沃肠型健康志愿者的新鲜粪便用PBS稀释成粪便悬液，然后将粪便悬液接种至改良VI培养基中，在37℃、pH5.2‑5.8、磁力搅拌转速150rpm、以330ml/12h速度补加培养基的条件下发酵培养，获得普雷沃肠型体外模拟模型；本发明找到体外模拟普雷沃肠型的重要营养条件，且探究出了连续发酵过程中的理化条件，能够将发酵液中的普雷沃菌的比例提高到40％‑80％，同时发酵液中的微生物群与原始粪便样品的相关系数达到了80％左右，从而可以稳定地在体外模拟出普雷沃肠型。

Description

一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法

(一)技术领域

本发明涉及一种体外模拟人肠道普雷沃肠型的方法，特别涉及一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法。

(二)背景技术

人体内含有数以万计的微生物群，定居在肠道内的微生物群落被视为人体的一个额外的器官，它们能产生一些人体必需的重要因子，也可以和宿主共同形成一条特殊的代谢通路。小肠相当于一种功能强大的厌氧生物反应器，微生物与肠上皮细胞对发酵底物的利用以及它们之间物质、信息的交流，都在这个反应器中有条不紊的进行。微生物通过发酵膳食中难以消化的碳水化合物来获取能量，也可以代谢产生氨基酸、维他命等宿主必须的营养元素，还可以通过如还原反应、水解作用、功能基团转移等作用参与药物的代谢过程等。但是当肠道菌群发生紊乱，则会引起一些肠道疾病，特别是肠易激综合征、炎症性肠病，甚至是结、直肠恶性肿瘤等肠道疾病。

肠道内不同群落的组成呈现高的动态性，且个体间肠道微生物按照一定的偏好聚集，因此肠道微生物可以被区分为平衡和稳定的群落组成。仔细调查了门、属、基因、通路水平和一些大量共生菌在肠道微生物组成结构上的不同后，从系统发育树和功能上确定了肠道微生物的3种基本肠型：拟杆肠型、普雷沃肠型和瘤胃球肠型。拟杆肠型的驱动可能是通过发酵多糖和蛋白质获得能量，因为与此肠型相关的菌属有一个非常广的糖降解能力，并且基因编码的酶也参与到了这些底物的降解中，如半乳糖苷酶、己糖苷酶和蛋白酶等，这些酶伴随着糖酵解和戊糖磷酸途径共同强化了这种肠型。普雷沃肠型个体的肠道微生物和脱硫弧菌属一同出现，它能够协同降解在肠道粘液层中的黏蛋白，普氏菌是众所周知的黏蛋白降解菌，而脱硫弧菌属可以通过去除硫酸盐来限制黏蛋白脱硫步骤从而增强普雷沃菌降解黏蛋白的效率。瘤胃球肠型最常见的是具有丰富的瘤胃球菌属，以及共生菌疣微菌属，这两种菌都能降解黏蛋白。它也富含膜转运蛋白和多种糖类，这表明黏蛋白的结合及其随后的水解产生的多糖都与该菌属有关。这三种肠型中拟杆肠型在人群中最常见，而且该肠型已经在体外被模拟出来，瘤胃球肠型现在还是一个比较模糊的型，普雷沃肠型在已有的报道中没有证实该肠型可以在体外很好的模拟出来。

目前体外模拟人体肠型的设备主要是体外连续发酵系统，且在体外已经成功模拟出了拟杆菌肠型。但是对普雷沃肠型的模拟一直处在一个瓶颈期，对普雷沃肠型的模拟主要存在两种关键未知因素：一是无法确定哪些关键营养元素在体外模拟中对普雷沃氏菌的生长起决定性作用，二是在体外模拟时具体的生理生化条件还不清楚。

对现有技术的文献检索发现，文献(FanBetal，)报道中VI培养基对拟杆肠型的模拟较好，但是对普雷沃肠型的模拟条件很难确定。我们研究中发现低聚异麦芽糖(IMO)在体外菌群培养是对普雷沃菌的生长有明显的促进作用，所以我们利用IMO作为VI培养基中的主要碳源，并且对体外模拟的理化条件加以控制，并成功模拟出发酵液中普雷沃菌比例较高的人体肠道的普雷沃肠型。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，克服了对普雷沃肠型体外模拟的技术难点，找到了未知的营养和生理生化条件，建立起了一套稳定、可靠的体外模拟普雷沃肠型系统，并对此系统的稳定性进行了验证。

本发明采用的技术方案是：

一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，所述方法为：利用全自动肠道菌群体外模拟模型装置，将普雷沃肠型健康志愿者的新鲜粪便用PBS稀释成粪便悬液，然后将粪便悬液接种至改良VI培养基中，在37℃、pH5.2-5.8、磁力搅拌转速150rpm、以330ml/12h的速度补加培养基的条件下发酵培养，获得普雷沃肠型体外模拟模型，用于16SrRNA的分析鉴定；所述改良VI培养基组成为：低聚异麦芽糖5-20g/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘液素0.5g/L、3号胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、1mL/L吐温80、NaCl 4.5g/L、KCl 2.5g/L、MgCl₂·6H₂O 4.5g/L、CaCl₂·6H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄0.4g/L，微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.3～6.8，灭菌后将培养基放到连续发酵装置上，打开磁力搅拌并通入氮气；微量元素的浓度为：MgSO₄·7H₂O 3.0g/L，CaCl₂·2H₂O0.1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.32g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CoSO₄·7H₂O 0.18g/L，ZnSO₄·7H₂O0.18g/L，CuSO₄·5H₂O 0.01g/L，NiCl₂·6H₂O 0.092g/L，溶剂为蒸馏水。

进一步，所述新鲜粪便用PBS稀释成0.1g/ml的粪便悬液。

进一步，所述粪便悬液体积接种量为10％。

进一步，优选所述改良VI培养基中低聚异麦芽糖终浓度为8g/L。

本发明所述低聚异麦芽糖(IMO)为2-5个葡萄糖以α-1，6糖苷键连接而成，分子量为342-823，优选购自保龄宝公司。所述普雷沃肠型健康志愿者的标准是3个月内未服用抗生素或其它药物，且粪便样品中普雷沃菌的比例达到40％-80％，符合文献中定义的普雷沃肠型。

本发明所述全自动肠道菌群体外模拟模型装置同专利申请CN102399692A实施例1所述全自动肠道菌群体外模拟模型，其中发酵系统由3个发酵单元结构串联组成。

本发明在肠道菌群体外模拟模型构建所用的VI培养基的基础上加以改进，找到最适合的糖源-IMO，并找到了培养过程中的最适理化条件，即培养基补充的流量为330ml/12h，pH为5.2-5.8，综合糖原、pH和培养基流量三方面才能模拟出普雷沃氏肠型。我们试过淀粉、低聚果糖两种碳源，还有不同的流加速度和pH，都未能使普雷沃菌丰度增加。

与以前的模拟结果相比，本发明显著成果主要体现在：本发明找到体外模拟普雷沃肠型的重要营养条件，且探究出了连续发酵过程中的理化条件，能够将发酵液中的普雷沃菌的比例提高到40％-80％，同时发酵液中的微生物群与原始粪便样品的相关系数达到了80％左右，从而可以稳定地在体外模拟出普雷沃肠型。

(四)附图说明

图1为实施例1不同流加速度的连续发酵过程中不同时间点的PCR-DGGE的电泳图。

图2为实施例1三位志愿者的粪便样品和发酵液的16SrRNA测序结果图。

图3为实施例1发酵液和原始粪便样品菌群属水平的PCA图。

图4为实施例1发酵液和原始粪便样品菌群属水平的Heatmap。

图5为实施例2发酵液的16SrRNA测序结果图。

图6为实施例3发酵液的16SrRNA测序结果图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所述低聚异麦芽糖为2-5个葡萄糖以α-1，4糖苷键连接而成，优选购自保龄宝公司。所述普雷沃肠型健康志愿者的标准是3个月内未服用抗生素或其它药物，且粪便样品中普雷沃菌的比例达到50％-80％，符合文献中定义的普雷沃肠型。

实施例1

(1)培养基的配制

改良VI(VI-IMO)培养基的组成：低聚异麦芽糖(IMO，聚合度为2-5，分子量为342-823)8g/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘液素0.5g/L、3#胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、1mL/L吐温80、NaCl 4.5g/L、KCl 2.5g/L、MgCl₂·6H₂O 4.5g/L、CaCl₂·6H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.4g/L，微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.3～6.8，灭菌后将培养基放到连续发酵装置上，打开磁力搅拌并通入氮气。

微量元素的浓度为：MgSO₄·7H₂O 3.0g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，MnCl₂·4H₂O0.32g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CoSO₄·7H₂O 0.18g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄·5H₂O0.01g/L，NiCl₂·6H₂O 0.092g/L，溶剂为蒸馏水。

(2)全自动肠道菌群体外模拟模型装置

采用专利申请CN102399692A实施例1所述全自动肠道菌群体外模拟模型装置(发酵系统由3个发酵单元结构串联组成)，将培养基瓶和生物反应器用软管连接，并且接入调pH值的酸液、调pH值的碱液，输入工作指令，培养基的流加速度设置为330ml/12h，pH为5.5，温度为37℃，同时打开磁力搅拌器并对培养基瓶和生物反应器持续通入氮气。

(3)粪便的前处理

分别取3名普雷沃肠型志愿者(CHH、LW、YYS)的新鲜粪便，用PBS(pH7.0)配成10％(wt/vol，即10g粪便加入100ml PBS)的悬浮液，充分混匀后分别用直径为2mm的无菌金属筛过滤，除去大的食物颗粒，得到粪便PBS悬液。

(4)接种培养

将所得的粪便悬液以体积浓度10％的接种量分别接种到VI-IMO培养基中，保持反应器温度(37℃)并通入氮气，接种后，不开培养基流加和pH控制，静置培养24小时后取样检测，待取完样后打开培养基流加蠕动泵和pH控制蠕动泵，培养基的流加速度设置为330ml/12h，pH为5.5，温度为37℃。

(5)连续发酵8天，待反应容器内菌群结构达到稳定后，收集发酵液，然后差异离心获得细菌沉淀后，用作细菌DNA的提取、PCR-变形体梯度胶电泳(DGGE)分析和454测序，以此评价对肠型的模拟效果。同样条件下，将培养基流速改为330ml/12h、330ml/24h、330ml/36h、330ml/48h，分别在发酵培养1、6、7、8、9天取样进行PCR-DGGE的电泳检测，结果见图1所示。

DNA提取步骤：采用QIAamp DNA Stool Mini kit(cat 51604)试剂盒，按说明书操作步骤，提取粪便样品和发酵样品的细菌DNA。(1)称取180～220mg粪便于2ml离心管中，置于冰上；(2)加入1ml Inhibit EX Buffer，振荡1min，彻底混匀；(3)70℃金属浴5min，取出后振荡15s，14,000rpm离心5min；(4)加入15μl Proteinase K于新的1.5ml离心管中；(5)加入第3步中的上清液200μl于此；加入200μl Buffer AL，振荡15s；(6)70℃金属浴10min；(7)取出后，加入200μl无水酒精，振荡混匀；(8)将600μl混合液，置入QIAamp spin column，离心1min，重复至全部过柱；(9)加入500μl Buffer AW 1，14,000rpm离心1min；(10)加入500μl Buffer AW 2，14,000rpm离心3min；(11)14,000rpm离心甩干3min；(12)准备1.5ml离心管，将柱子置于其中，加入50μl ddH2O于柱子中，室温孵化1min，14,000rpm离心1min，收集DNA。DNA提完后送上海美吉生物公司测序得到样本属水平的菌群结构。

从图1中可以看出，在pH5.5、330ml/12h的条件下，连续发酵8天后，反应器内的菌群组成进入稳定状态，其中的菌群结构基本上不会再发生改变。这时可以收集稳定期后的发酵液用于模拟效果的评估，评估方法主要包括454测序及发酵液中短链脂肪酸浓度的测定，我们取第11天的发酵液样本提DNA后送测序公司测序，结果见图2所示。从图2的16S测序结果中可以看出志愿者的原始粪便样品中普雷沃菌的比例较高，符合普雷沃肠型的定义，且模拟后对应的发酵液中普雷沃菌群的比例较原始样品有明显提高，且在菌群中占有较高比例。

分别取发酵11天的发酵液和原始粪便样品制作菌群属水平的PCA图，结果见图3，从图3可以看出用本发明中的培养方法培养后，不同志愿者的发酵液中菌群组成在图中聚在一起，说明本发明所采用的培养方法可以较稳定地培养出普雷沃肠型。

分别取发酵11天的发酵液和原始粪便样品制作菌群属水平的Heatmap，结果见图4所示，在图4的热图中，从上方的树状图可以看出原始粪便样品和发酵样品明显的分为两组，且发酵液中普雷沃菌的数量呈明显的上调趋势。根据16SrRNA的菌群测序结果，用统计学软件SPSS17.0计算发酵前后菌群的pearson距离远近相关系数，从表1中可以看出原始粪便样品和对应的发酵液中的菌群组成相关系数可以达到0.8左右。综上结果表明本发明所采用的培养方法可以在体外稳定模拟出普雷沃肠型。

表1

实施例2

同实施例1，采用YYS普雷沃肠型志愿者的新鲜粪便为样本，培养基的流加速度设置为330ml/12h(图5中yys-12h-d10)、330ml/24h(图5中yys-24h-d10)、330ml/36h(图5中yys-36h-d10)、330ml/48h(图5中yys-48h-d10)，pH为6.5，其他同实施例1，结果见图5所示。

如图5所示，粪便原液yys-10％的16S测序结果中普雷沃实菌的比例达到80％以上，而以IMO为主要糖源，pH设置为6.5时，改变流加速度，发酵11天后，4种流加速度的模拟结果中普雷沃菌的比例都很低，即不能模拟出普氏肠型。由其中12h的模拟结果也可以看出，当以IMO为糖源，流加速度为12h时，pH设置为6.5时普氏肠型也模拟不出来，而本发明所述的pH5.5的条件可以模拟稳定出来。

实施例3

同实施例1，采用CHH和YYS普雷沃肠型志愿者的新鲜粪便，培养基流加速度设置为330ml/12h，pH5.5时，以低聚果糖(FOS)为糖源代替IMO，发酵到第11天时取发酵液进行16SrRNA测序，菌群测序结果见图6所示。

由图6以看出，当其他条件不变，把IMO换成FOS时，发酵液中的普雷沃菌的比例较低，对普氏肠型的模拟效果较差。

Claims (5)

1.一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，其特征在于所述方法为：利用全自动肠道菌群体外模拟模型装置，将普雷沃肠型健康志愿者的新鲜粪便用PBS稀释成粪便悬液，然后将粪便悬液接种至改良VI培养基中，在37℃、pH5.5、150rpm、以330ml/12h速度补加培养基的条件下发酵培养，获得普雷沃肠型体外模拟模型；

所述改良VI培养基组成为：低聚异麦芽糖5-20g/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘液素0.5g/L、3号胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、1mL/L吐温80、NaCl 4.5g/L、KCl 2.5g/L、MgCl₂·6H₂O 4.5g/L、CaCl₂·6H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.4g/L，微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.3～6.8；微量元素的浓度为：MgSO₄·7H₂O 3.0g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.32g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CoSO₄·7H₂O 0.18g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄·5H₂O 0.01g/L，NiCl₂·6H₂O 0.092g/L，溶剂为蒸馏水。

2.如权利要求1所述普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，其特征在于所述新鲜粪便用PBS稀释成0.1g/ml的粪便悬液。

3.如权利要求1所述普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，其特征在于所述粪便悬液体积接种量为10%。

4.如权利要求1所述普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，其特征在于所述改良VI培养基中低聚异麦芽糖终浓度为8g/L。

5.如权利要求1所述普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法，其特征在于所述低聚异麦芽糖为2-5个葡萄糖以α-1，4糖苷键连接而成。

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