CN116515717B - 一株副干酪乳杆菌bigtree-b101145及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株副干酪乳杆菌BIGTREE‑B101145及其应用。本发明提供的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE‑B101145，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023438，该菌株生长繁殖能力、产酸能力和耐酸能力强，对胆盐有很高的耐受能力，其菌液及发酵产物对微生物早期感染有明显的抑制作用，可有效抑制蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌的生长，有效调节肠道菌群，预防或治疗便秘，从而起到调节及增强机体的免疫功能方面的作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145及其应用。
背景技术
由于微生物具有生长周期短、菌种改造容易等优势，微生物资源的开发和利用是当今研究的热点。乳酸菌是一类利用可发酵性糖并产生大量乳酸的微生物，其种类繁多，在自然界中分布广泛，绝大多数对人、畜安全无害，有保健和医疗功效，还具有改善食品风味、提高食品营养价值、抗菌防腐等作用，受到了国内外研究者的青睐。近年来，乳酸菌在食品、轻工、医药、饲料等领域的应用比重大幅增加，新型乳酸发酵食品及饮料、乳酸菌类防腐剂、乳酸菌制剂、乳酸菌类益生素、乳酸菌类饲料添加剂等层出不穷，在提高人们生活质量、促进人们身体健康的同时，也创造了巨大的经济效益，据统计，仅以乳杆菌作为发酵菌的食品工业所创造的经济价值就占全球发酵类食品的20%。由此可见，乳酸菌具有不可取代的优先研发地位。
副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）是兼性厌氧同型发酵乳酸菌、革兰氏阳性细菌；可抑制肠道致病菌生长繁殖，降胆固醇，抗高血压，预防糖尿病，改善肥胖等；不仅能增进发酵食品的营养价值，改善口感和风味，还能产生抗菌物质，延长发酵食品的保存时间，目前在发酵酸奶、豆乳制品、干酪制品、面食制品及发酵果蔬等食品中应用广阔。
然而，虽然目前对副干酪乳杆菌的研究较多，但是现有的副干酪乳杆菌对于胃肠道消化系统的抗性较弱，耐酸和耐胆碱能力较差，在产酸能力和抑菌效果的提高上都需要进一步研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145及其应用。本发明提供的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145具有极好的产酸能力、耐胃酸能力和耐胆盐能力，具有适应机体胃肠的生理生化能力，同时还具有极好的抑菌效果，可增强机体免疫能力，对于预防及治疗微生物早期感染有明显的效果。
本发明的技术方案是：
本发明提供了一株副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145，已于2023年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023438，分类学命名为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)；其16S rRNA如核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，所述的16S rRNA全序列已上传NCBI，序列号为：OQ608445.1。
进一步地，本发明提供一种副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在制备具有抑菌作用的药品中的应用。
更进一步地，所述的抑菌作用中抑制的病原菌包括蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌。
更进一步地，所述蜡样芽孢杆菌的保藏编号为BNCC 192974，鲍曼不动杆菌的保藏编号为BNCC 337173，金黄色葡萄球菌的保藏编号为BNCC 186335，福氏志贺氏菌的保藏编号为BNCC 186377，均购自山东省振昂科学仪器有限公司。
进一步地，本发明还提供了一种所述的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在制备预防或治疗便秘的药品中的应用。
进一步地，本发明还提供了一种所述的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在制备具有耐胃酸、耐胆碱的药品中的应用。
进一步地，本发明还提供了一种所述的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在制备调节及增强机体免疫功能的药品中的应用。
本发明提供的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的产酸能力强，在MRS培养基中37℃培养16小时pH可达4.68。
本发明的另一技术方案为，提供一种菌剂，所述菌剂包含上述的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145或其发酵产物。
进一步地，所述菌剂中副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的活菌数为500~3000亿CFU/g。
进一步地，所述菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明中通过对副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145进行菌体生长状态观察、温度耐受能力评价、产酸能力评价、耐酸能力评价、耐胆盐能力评价及其菌液和发酵物对多株致病菌的抑菌效果进行研究分析得出本发明提供的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145生长繁殖能力极强、产酸能力强、耐酸能力强、对胆盐有很高的耐受能力，其菌液及发酵产物对微生物早期感染有明显的作用，可有效抑制蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌的生长。最后本发明对副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145进行全基因组测序，为后续副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的深入研究提供便捷。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145筛选自东北酸菜，在MRS固体培养基上生长良好，生长繁殖能力，产酸能力强，且耐酸能力强，同时对胆盐有很高的耐受能力，可以有效提高对胃肠道环境的耐受能力。
（2）本发明筛选的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145具有优异的抑菌作用，能够要针对微生物感染早期症状治疗，对蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌的抑制作用较强。
（3）本发明筛选的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的菌液及其发酵产物可以有效调节肠道菌群，预防或治疗便秘，从而达到调节及增强机体的免疫功能方面的作用。
生物保藏说明：
副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145，已于2023年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023438，分类学命名为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)。
附图说明
图1为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的生长形态图；
图2为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的16S rRNA进行PCR扩增反应，所得PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：2K plus II DNA marker；1，2，3，4：副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的16S rRNA PCR扩增产物；
图3为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145单克隆菌体PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M：2K plus II DNA marker；a：单克隆抗体PCR产物；
图4为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的遗传进化树；
图5为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145发酵液的抑菌效果图；其中A为蜡样芽孢杆菌BNCC 192974，B为鲍曼不动杆菌BNCC 337173，C为金黄色葡萄球菌BNCC 186335，D为福氏志贺氏菌BNCC 186377；
图6为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145全基因组图谱；
图7为编码基因通用数据库注释共有和特有注释统计图；
图8为PFAM结构域统计图；
图9为GO注释结果分类图；
图10为KEGG pathway结果分类图；
图11为COG结果分类图；
图12为NR物种分布图；
图13为TCDB结果分类图。
实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
以下实施例和对比例中，未作特别说明的试剂为常规试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买，所用方法，如无特殊说明，均为现有技术。
本发明所述菌株分离自东北酸菜发酵液（购自辽宁省锦州市黑山县），所述MRS固体培养基（型号为CM188）、MRS液体培养基（型号CM187）、LB固体培养基（型号CM159）均购自北京陆桥技术股份有限公司。
实施例1： 副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的分离、纯化与鉴定
（1）副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的分离与纯化
此菌株来源于购买自辽宁省锦州市黑山县的东北酸菜发酵液中，取1 g酸菜发酵液于9 mL生理盐水中溶解，稀释至10-5~10-9涂布于MRS固体培养基中37 ℃倒置培养20 h，获得单菌落；挑取单菌落在MRS固体培养基中进行三区划线，37 ℃倒置培养20 h对最终得到的单菌落进行16s rRNA测序，得到纯化的菌株。
本发明副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在MRS固体培养基上生长的照片如图1所示，肉眼观察菌落形态为乳白色、较小、圆形，菌落直径为1~3 mm，表面光滑且边缘整齐。
（2）副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的16SrRNA全测序鉴定
挑取已经纯化的菌株，用改良的SDS-碱裂解法得菌株DNA片段。用16S引物27F-PBACS和1541R-PBACS对菌株的16S rRNA进行PCR扩增反应。所述PCR扩增反应的体系：DNA模板1 μL，27F-PBACS引物、1541R-PBACS引物各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O9.5 μL，反应总体积25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，执行31个循环，72 ℃后延伸10 min。所述引物序列如表1所示。
。
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，结果显示，运用此对引物对菌株进行PCR，扩增效果好。后进行胶回收，胶回收产物基因重组到GB05-dir中，于含有卡那霉素的固体LB培养基37 ℃倒置培养12 h后挑取单克隆菌体，用16S引物T7-Elong和T7-TermElong对所得单克隆抗体进行PCR扩增反应（95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，执行31个循环，72 ℃后延伸10 min），所述引物序列如表2所示。将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示基因重组产物运用16S引物扩增效果好，可进行下一步实验，如图3所示。
将PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，菌株的16S rRNA的核苷酸序列为SEQID NO：1：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT。经BLAST基因比对，为一株副干酪乳杆菌，命名为BIGTREE-B101145，其16S rRNA序列已上传NCBI，序列号为OQ608445.1。
作遗传进化树对副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145进行比对，结果如图4所示。（3）副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145碳水化合物发酵试验
选用HBI-G11乳酸菌生化鉴定条(购自青岛海博生物技术有限公司)鉴定副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145对11种碳水化合物的反应情况。结果如表3所示，由表3可知，副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145在11种碳水化合物发酵试验中，能够利用、分解并代谢七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠10种碳水化合物。
。
实施例2：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的菌株生长状态评价
用竹签将MRS固体培养基上副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养24 h。移液枪吸取1 ml发酵液，8000 rpm离心1 min，弃上清液，留菌体，称量计算得湿重。55 ℃烘干12 h再次称量计算得干重，试验结果如表4所示。称量所得的菌体的干重仍有2.88×10
−3
±0.0005 g/ml，由此可得副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145有较强的生长能力，可进行大量繁殖。
。
实施例3：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillusparacasei）BIGTREE-B101145的温度耐受能力评价
用竹签将MRS固体培养基上副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养24 h。分别对37℃、45℃、55℃时的菌液加热2 min、3 min、4 min，将菌液稀释至10-6、10-7、10-8、10-9，分别取100 μL涂布至固体MRS培养基37℃厌氧培养16 h~20 h。对平板单菌落进行计数，试验结果如表5所示。
由表5可知，副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145在55℃加热4 min仍然有大量活菌存在，可见，副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145有较好的耐高温性。
。
实施例4：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的产酸能力评价
用竹签将MRS固体培养基上副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养，分别于16 h、20 h、24 h取菌液3580 rpm离心15 min后测量其上清液pH，试验结果如表6所示。
由表6可知，副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145在厌氧培养16 h时就可达较强酸性，pH可达4.68，可见副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145有较强的产酸能力。
。
实施例5：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillusparacasei）BIGTREE-B101145的耐酸能力评价
配置人工胃液（8.2 ml稀盐酸，400 ml双蒸水，5 g胃蛋白酶，摇匀后加双蒸水定容至500 ml，取一定量的溶液调pH至2.57、3.37、4.24。用0.45 μm滤膜除菌，放至4℃冰箱保存备用）。用竹签将MRS固体培养基上副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养20 h。取60 ml菌液3580 rpm离心15 min，倒掉上清液，用1.5 ml生理盐水重悬菌体。取4支离心管，分别加入6 ml人工胃液，后分别加入200 μl重悬菌液混匀。于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min稀释至10-6、10-7、10-8、10-9，分别取100 μL溶液涂布至固体MRS培养基培养16 h后对平板单菌落进行计数并计算存活率，试验结果如表7所示。由表7可知，副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145在pH为2.57的人工胃液于150 min时仍有75.36%的存活率。由此可见副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145有较强的耐酸能力，对于胃液有一定的耐受能力。
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实施例6：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillusparacasei）BIGTREE-B101145的胆盐耐受能力评价
配置人工肠液（3.4 g磷酸二氢钾，250 ml双蒸水水溶，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至6.8，加2.5 g胰蛋白酶，摇匀后加双蒸水定容至500 ml，取一定量的溶液加入一定量牛胆盐，配置成胆盐浓度分别为0.03%、0.1%、0.2%、0.3%的人工肠液。用0.45 μm滤膜除菌，放至4℃冰箱保存备用）。用竹签将MRS固体培养基上副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm厌氧培养16~20 h。取60 ml菌液3580 rpm离心15 min，倒掉上清液，用1.5 ml生理盐水重悬菌体。取4支离心管，分别加入6 ml人工肠液，后分别加入200 μl重悬菌液混匀。于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min稀释至10-6、10-7、10-8、10-9，分别取100 μL溶液涂布至固体MRS培养基培养16 h后对平板单菌落进行计数并计算存活率，试验结果如表8所示。
由表8可知，副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145在胆盐浓度为0.3%时仍有较高的存活率。可说明副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145对胆盐有较高的适应能力。
。
实施例7：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillusparacasei）BIGTREE-B101145发酵液抑菌效果评价
用竹签将MRS固体培养基上副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的单菌落接种至新鲜灭菌完全冷却的MRS液体培养基中，37℃，100 rpm·min-1厌氧培养16 h。取一定量菌液，8000 rpm离心1 min，收集上清液。另取一定量菌液备用。分别取蜡样芽孢杆菌（BNCC192974）、鲍曼不动杆菌（BNCC337173）、金黄色葡萄球菌（BNCC186335）、福氏志贺氏菌（BNCC186377）离心后的菌液，用LB固体培养基按5%的菌浓度（即每100 ml固体培养基加入5 ml的菌液）进行混菌，倒至LB固体培养基上，待混菌平板稍干后均匀放置直径为8.0 mm的牛津杯，静止5 min，加入200 μL未离心的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BIGTREE-B101145菌液，放4℃冰箱静置4 h，后37℃正置培养15 h后观察并记录抑菌直径，如图5和表9所示，图5为副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145发酵液的抑菌效果图，其中A为对蜡样芽孢杆菌，B为鲍曼不动杆菌，C为金黄色葡萄球菌，D为福氏志贺氏菌；
结果表明副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145发酵产物对4株致病菌有较强的抑菌效果。
。
实施例8：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillusparacasei）BIGTREE-B101145全基因组测定
经二代测序、三代测序及基因组组装获得副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145基因组完成图，图6为该菌的可视化基因组图，该菌基因组大小为3102338 bp，GC比为46.38%，其基因组含2938个CDS、59个tRNA、15个rRNA、一个tmRNA和32个misc_RNA不含质粒。图6中由外到内依次为：第一圈，基因组序列信息；第二圈，基因组序列的GC含量曲线，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均GC含量；虚线展示了参考基因组的平均GC含量；第三圈，基因组序列的GC skew曲线，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均GC含量；虚线展示了GC skew为0的参考线；第四圈，二代测序深度及覆盖度信息，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均测序深度，反应出不同区域的reads覆盖情况；虚线展示了整体水平的平均reads覆盖度；第五圈，三代测序深度及覆盖度信息，以2000bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均测序深度，反应出不同区域的reads覆盖情况；虚线展示了整体水平的平均reads覆盖度；第六圈，展示了参考基因组中的基因编码区（CDS）以及非编码RNA区（rRNA、tRNA），以内外两层表示，外层代表正链，内层代表负链。实施例9：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145通用数据库基因组功能注释分析
（1）通用数据库注释比例统计
本发明为获得全面的基因功能信息，进行了八大数据库的基因功能注释，包括：UniProt、KEGG及KEGG Pathway、GO、Pfam、COG、TIGERfams、RefSeq、NR。将预测得到的基因序列与COG、KEGG、Uniprot、Refseq等功能数据库做 BLAST+（Version：2.11.0+）比对，得到基因功能注释结果。使用软件hmmer（Version：3.3.2）基于Pfam、TIGERFAM数据库进行功能注释。注释统计结果如表10所示。编码基因通用数据库注释共有和特有注释如图7所示，图中左侧为通用数据库基因注释统计；右侧为共有和特有统计，横坐标是根据黑点所在位置对应的左侧的数据库，纵坐标代表着该菌株在横坐标的各数据库组合中所含的基因数目。据图可得，副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145菌株所含较多的基因片段都能在各大通用数据库中获得全面的基因功能信息，且能获得的基因功能信息较多，对该菌株各基因研究提供的基础。例如第一列为所有通用数据库共有统计，上方为数目统计，下方为共有或特有数据库的的标注。
。
（2）Pfam结构域分类
Pfam数据库是同源蛋白家族数据库，是一个蛋白质结构域家族的集合，包括了一万六千多个蛋白质家族。蛋白质一般是由一个或多个功能区域组成，这些功能区域通常称作结构域（domain）。在不同的蛋白质中结构域以不同的组合出现，形成了蛋白质的多样性，识别出蛋白质中的结构域对于了解蛋白质的功能有重要意义。
基于Pfam结构域的注释，对每个结构域注释的基因进行统计汇总，并将注释最多的前20个结构域绘图展示，结果如图8所示，Pfam数据库是一系列蛋白质家族的集合，其中每一个蛋白家族都以多序列比对和隐马尔科夫模型的形式来表示。图中横坐标是蛋白质家族的名称，纵坐标是比对到该蛋白质家族的基因的数。基于Pfam结构域的注释，对每个结构域注释的基因进行统计汇总，并将注释最多的前20个结构域绘图展示。
由图8可知，通过与Pfam同源蛋白家族数据库进行比对，发现副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145菌株中含有较多结构域，并对注释最多的前20个结构域绘图展示，这些结构域对蛋白质分子功能的研究提供了研究依据。（3）Gene Ontology 分类
Gene Ontology（简称 GO）是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（controlled vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。
将 GO（Gene Ontology）注释信息经简化后得到 GOslim 分类，将基因的功能从细胞组分、分子功能、生物学过程三个方面进行汇总统计后，选取每个分类下前 20 个注释最多的 GOslim 的二级分类进行绘图，结果如图9所示，图中横坐标为GO各分类内容，纵坐标为基因数目。此图展示的是在全部基因背景下GO各二级功能的基因富集的情况，体现此背景下各二级功能的地位。图9展示了副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145中基因和基因产物的功能以及显示该功能基因的数量，显示了个功能的强弱，为后续深入研究提供了研究的方向。（4）KEGG Pathway 分类
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径（Pathway）以及这些基因产物功能的主要公共数据库，利用 KEGG 可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为。
本发明对BIGTREE-B101145基因组做 KEGG 注释后，根据它们参与的 KEGG 代谢通路进行分类，结果如图10所示，图中横坐标为Pathway分类下注释的基因数目；纵坐标为Pathway分类，不同颜色代表所属的不同的大分类，该图展示了副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145各基因产物在细胞中的代谢途径的方式。其中从上往下，1~2行的分类为有机体系统；3~14行的分类为代谢；15~18行的分类为基因信息处理；19~20行的分类为生长环境信息；21~23行的分类为细胞过程。
（5）COG 分类
COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）是对基因产物进行直系同源分类的数据库，每个COG 蛋白都被假定来自祖先蛋白，COG 数据库是基于细菌、藻类、真核生物具有完整基因组的编码蛋白、系统进化关系进行构建的，将 Unigene 和 COG 数据库进行比对，预测gene 可能的功能并对其做功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。COG 分为 26 个 group，将 COG 注释的基因按 COG 的 group 进行分类，将副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145的基因产物根据COG数据库进行比对统计，从而预测该菌株基因可能的功能并对其做功能分类统计，结果如图11所示，图中横坐标为COG各分类内容，纵坐标为基因数目。在不同的功能类中，基因所占多少反映对应时期和环境下代谢或者生理偏向等内容，可以结合研究对象在各个功能类别的分布作出科学的解释。
（6）NR注释
NR数据库：非冗余蛋白质的氨基酸序列数据库，包含 SwissProt、 PIR（ProteinInformation Resource）、PRF（Protein Research Foundation）、PDB（Protein Data Bank）蛋白质数据库非冗余的数据以及从 GenBank 和 RefSeq的 CDS 数据翻译来的蛋白质数据。对副干酪乳杆菌（
Lacticaseibacillus paracasei
）BIGTREE-B101145通过NR数据库进行非冗余蛋白质的氨基酸进行比对，其中乳酸杆菌占比最大，分布情况如图12所示。图中不同颜色代表不同的物种。实施例10：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145专有数据库注释
本发明为个性化分析BIGTREE-B101145，对其进行专有数据库注释，包括ARDB数据库注释、基于CAZy数据库的碳水化合物酶注释、病原与宿主互作分析、耐药基因注释、细胞色素P450注释、VFDB注释、信号肽预测、TCDB转运蛋白注释。
本发明所述BIGTREE-B101145全基因组经专有数据库注释后发现：于ARDB数据库注释到1个抗性基因bacitracin，此外还包括12个药物作用靶点；于病原与宿主互作数据库中未注释到完全匹配的基因序列；于CARD数据库未注释到耐药基因；细胞色素P450注释得到4个基因序列；于VFDB数据库未注释到完全匹配的毒力因子；碳水化合物酶注释结果如表11所示，展示了该菌的对碳水化合物代谢的活性；乳酸片球菌HP-B1099全基因组信号肽预测结果如表12所示，跨膜蛋白及分泌蛋白预测结果如表13所示；TCDB（对膜转运蛋白（Membrane Transport Protein）进行分类的一个数据库）膜转运蛋白注释结果如图13所示，从BIGTREE-B101145菌株中找到含有跨膜螺旋的蛋白，即为跨膜蛋白，图13中横坐标为TCDB各分类内容，纵坐标为基因数目。根据各数据分析可得，BIGTREE-B101145含抗性基因少，无耐药基因且在VFDB中无完全匹配的毒力因子，该菌株具有一定的安全性且为菌株的广泛应用提供了理论基础；该菌株含有药物作用靶点多，利于药物的研发和应用。
。/>
。
。
实施例11：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillusparacasei）BIGTREE-B101145小鼠黑便排出速率、粪便含水量的影响
选取无特定病原体的雄性小鼠，经过7天适应期后，随机分组，包括空白对照组（每天两次灌胃无菌DMEM 培养基0.5 mL）、模型组（灌胃等体积使用生理盐水溶解的盐酸洛哌丁胺）、干预组（灌胃等体积溶于DMEM完全培养基的副干酪乳杆菌 BIGTREE-B101145 添加量为1011CFU）、阳性对照组（灌胃等体积胃酚酞悬液），各组灌胃体积均为0.5 mL，共灌胃28天。
实验期间，饲养环境严格控制环境温度为25±1℃和湿度为50%±2%的12小时光照、12小时黑夜环境中。实验期间，小鼠自由进食进水。
（1）小鼠首粒黑便排出速率测定
在小鼠灌胃的第28天进行首粒黑便排出速率检测，实验方法如下：给空白组小鼠灌胃0.5 mL体积盐酸洛哌丁胺，一小时后，空白对照组、模型组、干预组及阳性对照组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每只小鼠首粒黑便排出时间。以模型组最后一只小鼠的首粒黑便排出时间为终止时间，分析各组在缓解便秘方面的差异。
实验结果如表14所示，可以看出干预组明显比其他组首粒排黑便时间更短。
。
（2）小鼠粪便含水量的测定
实验期间，固定时间收集小鼠粪便，将各组中的小鼠单独放置在铺有干净滤纸的鼠笼中，收集小鼠的粪便于无菌干燥1.5 mL离心管中，记录各组小鼠的排便粒数、粪便湿重，采用冷冻干燥法获得粪便干重，计算粪便含水量。
粪便含水量计算公式：粪便含水量（%）=（粪便湿重-粪便干重）/粪便湿重×100%
试验结果如表15所示，干预组较模型组的粪便含水量有较大提升；在15~28天仍能维持较高的粪便含水量。
。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一株副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）BIGTREE-B101145，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023438。
2.一种根据权利要求1所述的一株副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在制备具有抑菌作用的药品中的应用，其特征在于，抑菌作用中抑制的病原菌包括蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌。
3.一种根据权利要求1所述的一株副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145在制备预防或治疗便秘的药品中的应用。
4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145或其发酵液。
5.根据权利要求4所述的一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中副干酪乳杆菌BIGTREE-B101145的活菌数为500~3000亿CFU/g。
6.根据权利要求4所述的一种菌剂，其特征在于，所述菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
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