CN112725216B

CN112725216B - 一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用

Info

Publication number: CN112725216B
Application number: CN202011250373.6A
Authority: CN
Inventors: 杨振泉; 刘慧敏; 郑香峰; 高璐; 饶胜其
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: CN112725216A

Abstract

本发明公开了一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2020359，保藏日期：2020年7月27日。本发明鼠李糖乳杆菌YZULr026具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力；具有高效降解嘌呤能力，菌株和鸟嘌呤在37℃纯水体系中孵育2h鸟嘌呤降解率高达87.85％；YZULr026具有独特的基因组结构，其中编码α‑半乳糖苷酶的基因序列Gene264与已发表序列的最高同源性为93.38％，存在28个碱基差异；利用菌株YZULr026制备微生物制剂，用于体内外减除食物中嘌呤含量以及预防高尿酸血症具有广阔应用前景。

Description

一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一株具有高效降解嘌呤能力的鼠李糖乳杆菌菌株及其在降解嘌呤的应用。

背景技术

嘌呤是组成核酸重要的碱基，以嘌呤核苷酸的形式参与人体代谢，具有供能、代谢调节、组成辅酶等重要作用。由于人体缺乏尿酸氧化酶，体内含有嘌呤的物质(鸟苷酸、鸟苷、鸟嘌呤等)最终被分解代谢为尿酸，当人体嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄异常时，血尿酸含量就会增加，引发高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)。高尿酸血症人群须严格控制饮食，减少外源性嘌呤摄入。研究显示富含嘌呤的食物包含肉、禽、鱼、海产品、蛋、大豆等高蛋白食品，严格控制这类食物的摄入不仅会造成营养素失衡，而且会导致生活质量下降。筛选食品级微生物在体内外减除食物中的外源性嘌呤物质是开发高尿酸血症人群专用食品的重要途径。考虑到微生物对食品品质和风味的影响以及食物在体内滞留时间，筛选获得的菌株不但能够快速、高效的降解基质中嘌呤，而且对消化道胃酸、胆汁酸盐等不利环境具有耐受性。

目前，预防和治疗HUA的主要方法是调节饮食和药物治疗。药物治疗主要是降尿酸药物，一般是根据患者HUA的类型而定。常见的药物有别嘌呤醇、非布索坦、丙磺舒、苯溴马隆、Lesinurad。但这些药物会引起过敏反应、腹泻、胃痛、头痛、皮疹、肾结石等副作用。高尿酸血症患者在进行药物治疗的同时也要严格控制饮食，尽可能的减少外源性嘌呤类物质的摄入。研究表明，富含嘌呤的食物主要有肉、禽、鱼、海产品、蛋、奶、干大豆等高蛋白食品；其次是一些鲜味物质，比如鸡精、味精、耗油。如果人们控制这些食物的摄入，不仅会造成营养素失衡，也无法享受这些食物带来的愉悦感，导致生活质量大幅下降，乳酸菌(Lactic acidbacteria,LAB)是指一群可发酵糖类并产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称。尽管乳酸菌降低血尿酸功能的菌株目前已有专利公开，例如专利(公开号CN108486007A，公开日2018年09月04日)公开了“一种用于降低血尿酸的干酪乳杆菌株、益生组合物及其应用”、专利(公开号CN107208029A，公开日2017年09月26日)公开了“具有嘌呤摄取能力的乳酸菌及其用途”、专利(公开号CN106460029A，公开日2017年02月22日)公开了“抑制嘌呤吸收的乳酸菌及其用途”，但是由于菌株属性不同，其降解特征和应用效果也有所不同，获得更多的嘌呤降解功效的自主知识产权的益生菌菌株，对于体内体外减除食品嘌呤，提高预防HUA的发生的效果具有重要意义。已公开专利筛选到可以降解嘌呤菌株是干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、加氏乳杆菌；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是公认的具有安全性的微生物，具有良好的消化道耐受性，在建立和维持宿主肠道免疫平衡方面有广泛的应用。目前鼠李糖乳杆菌中已有多个菌株被应用于制备食品发酵剂、肠道平衡调节剂等微生态制剂，然而，适用于体内外快速降解嘌呤物质的菌株仍然十分少见。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种具有快速、高效降解嘌呤物质的鼠李糖乳杆菌菌株，该菌株同时具有突出的耐酸、耐胆汁酸盐能力，适用于体内外减除食物中的外源性嘌呤物质，为开发高尿酸血症人群专用食品或微生物制剂提供新型菌株。

本发明还提供所述鼠李糖乳杆菌菌株的微生物制剂及其应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026(Lactobacillus rhamnosus YZULr026)，经鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉武汉大学，保藏时间为2020年7月27日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020359。该菌株是发明人从西藏传统发酵乳制品分离株中筛选获得。

本发明中的鼠李糖乳杆菌YZULr026具有以下生物学特征：

(1)形态特征：鼠李糖乳杆菌YZULr026革兰氏染色结果为阳性，细胞呈短杆形，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。

(2)菌落特征：鼠李糖乳杆菌YZULr026在MRS培养基中生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。

(3)生理生化特征：过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、七叶苷；不发酵密二糖、绵子糖、木糖；可从纤维二糖、七叶苷、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。

(4)基因组特征：鼠李糖乳杆菌YZULr026基因组总长度为2884512bp，平均GC含量46.75％，通过生物信息学预测含有2966个基因，其中能够被注释的基因数为2236个，占预测基因数的75.4％。通过Blastn比对，YZULr026基因组中的基因与已发表序列的最高同源性在93.38％～100％之间，其中编码α-半乳糖苷酶的基因Gene264序列具有菌株特异性，该基因序列与现有菌株同源性最低(仅为93.38％)，存在28个碱基差异(分别为325:G/T；355:A/G；360:T/C；362:G/-；367:C/A；369:T/C；374:G/A；375:T/C；376:G/A；381:T/G；386:C/T；391:C/-；401:A/-；408:C/G；412:C/T；418:T/-；421:G/C；425:C/A；429:C/T；432:C/T；433:A/G；439:A/G；447:G/C；450:C/G；451:T/G；453:C/T；454:T/G；456:T/C)。

(5)菌株YZULr026具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力。

(6)菌株YZULr026具有快速降解鸟嘌呤能力，其活细胞或细胞破碎物与鸟嘌呤在37℃条件下作用2h，体系中鸟嘌呤降解率高达87.85％。

本发明所述的鼠李糖乳杆菌YZULr026在降解嘌呤中的应用。

其中，所述嘌呤包括黄嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。

作为优选，所述鼠李糖乳杆菌YZULr026用于体外减除食品及配料中嘌呤。

本发明所述的鼠李糖乳杆菌YZULr026生产的微生物制剂。

本发明所述的微生物制剂在用于催化水解嘌呤中的应用。

本发明所述的微生物制剂在制备用于体内减除嘌来预防高尿酸血症的制剂中的应用。

本发明经分离筛选获得一株具有高效降解鸟嘌呤能力的鼠李糖乳杆菌YZULr026，该菌株能在2h内将20μg/mL的鸟嘌呤降解至2.43μg/mL，降解率达87.85％，且该菌株具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力；YZULr026基因组中能够注释到GO信息的基因数是2189个，占所有编码基因(2966)的73.8％。能够注释到COG信息的基因数目为2236个，占所有编码基因(2966)的75.4％。其中Gene2919是鸟嘌呤脱氨酶(Guanine deaminase)(EC3.4.5.3)，具有催化水解鸟嘌呤的作用。将YZULr026应用于食品中，可降解食品中60％的鸟嘌呤。该菌株可以用于制备微生态制剂，在体内外降解食物中鸟嘌呤含量方面具有广阔的应用前景。

有益效果：由现有技术相比较，本发明的鼠李糖乳杆菌YZULr026具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力，有利于抵抗消化道胃酸、胆汁酸盐等不利环境。该菌株活细胞及细胞破碎物均具有快速高效降解鸟嘌呤能力，在非生长状态下，菌株和鸟嘌呤在37℃纯水体系中孵育2h鸟嘌呤降解率高达87.85％，有利于在不改变食品风味品质的条件下减除食品中的鸟嘌呤物质；也有利于食物成分在消化道滞留期间减少鸟嘌呤吸收。菌株YZULr026具有独特的核酸序列标志，有利于鉴别，具有独特的基因组结构，其中编码α-半乳糖苷酶的基因序列Gene264与已发表序列的最高同源性为93.38％，存在28个碱基差异；利用菌株YZULr026制备微生物制剂，可以用于体内外减除食物中嘌呤含量，同时可以开发高尿酸血症人群专用食品，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为高效降解嘌呤菌株的筛选。图中，降解能力以降解率表示，即作用后嘌呤残余浓度占体系中初始嘌呤浓度的百分比；数据为3次试验的平均值数据取平均值±标准差表示。

图2为菌株YZULr026对鸟嘌呤的降解特征。附图A为孵育时间对鸟嘌呤降解能力的影响；附图B为嘌呤初始浓度对菌株降解能力的影响；附图C为孵育温度对菌株降解嘌呤能力的影响；附图D为热灭活对菌株降解嘌呤能力的影响；附图E为菌株细胞超声破壁产物降解嘌呤能力测定结果。图中数据为3次试验的平均值数据取平均值±标准差表示，*表示具有显著性差异(*P＜0.05，**P<0.01)。

图3为菌株YZULr026的菌落及革兰氏染色形态。图中A为菌株YZULr026的菌落形态，B为菌株YZULr026的革兰氏染色形态。

图4为YZULr026的16S rDNA序列比对结果。图中，Query：为测定的YZULr026的16SrDNA序列；Subjct：为GenBank数据库中同源性最高的菌株的16S rDNA序列。

图5为菌株YZULr026全基因组图谱。图中由外到内第一圈是正链的nc RNA的分布情况，第二圈是正链的COG基因注释分布，第三圈是负链的COG基因注释分布，第四圈是负链的nc RNA，第五圈是GC含量，第六圈是GC skew值，紫色表示小于0，绿色表示大于0。

图6为菌株YZULr026 Gene264的Blastn搜索比对结果。图中，Query：为YZULr026Gene264的序列；Sbjet：为GenBank数据库中最高同源性菌株的相应序列。

图7为鼠李糖乳杆菌Gene264序列的系统发育树。系统发育树的构建采用的是靴带值邻近连接树法，自展分析设置为1000次重复。

图8为菌株YZULr026耐酸能力测定结果。图中数据为3次试验的平均值数据取平均值±标准差表示，*表示具有显著性差异(*P＜0.05，**P<0.01)。

图9为菌株YZULr026耐胆汁酸盐能力测定结果。图中数据为3次试验的平均值数据取平均值±标准差表示，*表示具有显著性差异(*P＜0.05，**P<0.01)。

图10为菌株YZULr026应用于啤酒中鸟嘌呤减除的效果。图中数据为3次试验的平均值数据取平均值±标准差表示，*表示具有显著性差异(*P＜0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。

实施例1

高效降解嘌呤菌株的筛选

从西藏传统发酵食品(酸奶、泡菜、甜醅)中分离得到的50株菌株，活化3次后，接种MRS培养基，37℃厌氧培养24h，取1mL 1×10⁷CFU/mL的菌培养液，8000r/min，4℃离心10min，收集菌体。并用1mL无菌超纯水重悬洗涤菌体2-3次。向菌体中分别加入750μL 20μg/mL的黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤反应液，对照样品中添加超纯水，涡旋混匀，37℃120r/min培养2h，应用液相色谱法测定样品中嘌呤含量。

具体测定过程为：培养后取样，8000r/min，4℃离心10min取上清；上清通过0.22μm微孔滤膜过滤，用HPLC测定滤过液中嘌呤的残余浓度。HPLC色谱条件为：色谱柱采用C18色谱柱，250×4.6mm，5μm；柱温为室温；流动相：V(甲醇)∶V(50mmol/L乙酸铵溶液)＝10:90；流速1.0mL/min；进样量：20μL。建立嘌呤浓度与峰面积标准曲线，计算反应体系中残余嘌呤浓度。以未加入菌体的嘌呤溶液为空白对照。

实施结果如图1所示。结果显示50株分离株中有43株(占总数的86％)对鸟嘌呤有降解作用，但降解率具有显著菌株差异性(在5.44-87.85％之间)，平均降解率仅为28％。其中，其中1株菌株对鸟嘌呤降解能力显著高于其它菌株(P<0.01)，2h降解率达到87.85％；同时对黄嘌呤和次黄嘌呤也具有一定的降解能力，2h降解率分别达到23.14％和12.17％，将该菌株命名为YZULr026。

实施例2

菌株YZULr026鸟嘌呤降解特征

取100μL菌株YZULr026保藏液(对数期)接种于5mL MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h，连续传代3次，培养液活菌数(CFU/mL)应用平板稀释涂布法进行测定。将活化的菌株培养液，以体积比2％的接种量接种于新鲜MRS液体培养基中，厌氧培养至平稳期。调整YZULr026菌液浓度为10⁷CFU/mL取1mL于离心管中，8000r/min，4℃离心10min，收集菌体，用超纯水清洗2-3次。(1)向菌体中加入750μL 20μg/mL的嘌呤反应液，涡旋混匀，于37℃，120r/min振荡温育5h，分别在0、1、2、3、4、5h取样分析；(2)向菌体内加入浓度为10、20、50、100、200μg/mL的嘌呤反应液，涡旋混匀；37℃孵育2h，取样分析；(3)向收集的菌体中加入750μL 20μg/mL的嘌呤反应液，涡旋混匀，分别置于18℃、25℃、37℃，120r/min振荡温育2h，取样分析；(4)将收集的菌体于70℃水浴30min热灭活，分别向活细胞和热致死细胞内加入750μL 20μg/mL的嘌呤反应液，涡旋混匀，37℃，120r/min振荡温育2h，取样分析；(5)将收集的菌体进行超声细胞破壁处理(300W，工作时间5s，间隔时间5s，180个循环)，然后4℃，8000rpm/min离心10min，分别收集上清和沉淀(破壁组分)，取500μL上清液加入500μL 40μg/mL嘌呤混匀，使嘌呤的终浓度为20μg/mL；取沉淀物加入750μL 20μg/mL的嘌呤混匀，37℃，120r/min振荡温育2h，取样分析游离鸟嘌呤含量变化。采集的样品通过8000r/min，4℃离心10min取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，滤过液用HPLC检测游离鸟嘌呤浓度(检测条件同实施例1)。每个样品设置三个平行，试验以未加菌体成分的嘌呤溶液为空白对照。

实施结果显示菌株YZULr026在2h内将鸟嘌呤从20μg/mL降至2.43μg/mL；在2-5h内对鸟嘌呤的降解趋于稳定，其含量显著低于对照组(图2A)；菌株YZULr026在2h内能够将10μg/mL和20μg/mL反应液中鸟嘌呤降解至0.21μg/mL和2.43μg/mL，降解率高于80％；但鸟嘌呤浓度为50-200μg/mL时，YZULr026对鸟嘌呤的降解效率随着浓度的增加而减少(图2B)；菌株YZULr026在18℃、25℃和37℃对鸟嘌呤的降解作用显著。18℃时将20μg/mL鸟嘌呤降解至8.66μg/mL；25℃时将20μg/mL鸟嘌呤降解至3.30μg/mL；37℃时将20μg/mL鸟嘌呤降解至2.43μg/mL；且18℃、25℃、37℃时对鸟嘌呤的降解差异极显著，37℃为最佳降解温度(图2C)；菌株YZULr026经热灭活处理后对鸟嘌呤的降解作用显著低于活细胞(图2D)；菌株YZULr026上清和沉淀对鸟嘌呤都有显著的降解作用，在2h内将20μg/mL的鸟嘌呤降解至0.05μg/mL，降解率达到90％以上(图2E)，表明菌株YZULr026对鸟嘌呤的降解是胞内酶降解和细胞壁吸附共同作用的结果。

实施例3

菌株YZULr026生理生化鉴定

将获得的菌株YZULr026划线接种MRS固体培养基，37℃，厌氧培养24h，挑取平板上的单菌落涂片，固定，滴加结晶紫染液，染色1min，水洗；滴加碘液，作用1min，水洗；滴加95％乙醇脱色15-20s，水洗；番红复染1min，水洗；镜检并记录菌株的细胞形态。同时挑取单菌落进行过氧化氢酶试验，吲哚、硫化氢和氨，硝酸盐还原，精氨酸水解、以及糖发酵试验。

实施结果显示菌株为革兰氏阳性杆菌(图3)，过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、七叶苷；不发酵密二糖、绵子糖、木糖；可从纤维二糖、七叶苷、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。根据《常用细菌系统鉴定手册》中乳酸菌的相应指标比对鉴定，符合鼠李糖乳杆菌特征。

实施例4

菌株YZULr026的16S rDNA基因测序鉴定

采用细菌基因组DNA快速抽提取试剂盒B518225(生工生物工程股份有限公司)进行细菌DNA提取。以实验菌株的基因组DNA为模板，进行16S rDNA PCR扩增。用于16S rDNA的PCR扩增引物为：上游为(SEQ ID NO.1)5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和下游为(SEQ IDNO.2)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’进行扩增，PCR反应体系为：2μL模板(50ng/μL)、4μLdNTPs(25mmol/L)、上下游引物(10pmol/μL)各1.5μL、10×Buffer5μL、MgCl₂(25mmol/L)5μL、Tag酶(5U/μL)0.3μL、加ddH₂O补足至50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1.5min，35次循环；72℃延伸10min。PCR产物委托上海生物工程有限公司测序，所得结果在基因库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行Blastn比对。测定结果显示YZULr026的16S rDNA扩增片段长度为1442bp，其序列为(SEQ IDNO.3)：5’-CTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAACTCGTTCGACTGCA-3’。通过Blastn搜索比对，在GenBank数据库中，同源性最高的菌株为Lactobacillus rhamnosus strain 2795(GenBank编号：MT611795.1)，序列相似度为100％(图4)。

实施例5

菌株YZULr026的全基因组测序

将菌株YZULr026在MRS液体培养基中连续活化2代，取1mL菌液于1.5mL离心管中，8000rpm离心10min，取菌体委托美吉生物(上海)有限公司进行全基因组序列测定。测序通过Illumina Hiseq Xten平台，采用Illumina公司的Paired-End技术构建小片段和大片段基因组文库，利用SOAPdenovo2.04序列组装软件组装序列。将获得的序列用Barrnap 0.4.2软件预测rRNA，tRNA scan-SE v1.3.1预测tRNA。将预测的基因蛋白通过blastp与KEGG数据库、COG数据库等进行比对，注释基因功能。

实施结果如图5所示。图中由外到内第一圈是正链的nc RNA的分布情况，第二圈是正链的COG基因注释分布，第三圈是负链的COG基因注释分布，第四圈是负链的nc RNA，第五圈是GC含量，第六圈是GC skew值，紫色表示小于0，绿色表示大于0。菌株YZULr026染色体基因组序列总长度(Genome Size)为2884512bp，共预测2966个基因，平均GC含量46.75％。YZULr026基因组中能够注释到GO信息的基因数是2189个，占所有编码基因(2966)的73.8％。能够注释到COG信息的基因数目为2236个，占所有编码基因(2966)的75.4％。通过Blastn搜索比对，基因Gene264具有明显菌株特异性，与已发表序列最高同源性仅为93.38％(图6所示)，存在28个碱基差异(325:G/T；355:A/G；360:T/C；362:G/-；367:C/A；369:T/C；374:G/A；375:T/C；376:G/A；381:T/G；386:C/T；391:C/-；401:A/-；408:C/G；412:C/T；418:T/-；421:G/C；425:C/A；429:C/T；432:C/T；433:A/G；439:A/G；447:G/C；450:C/G；451:T/G；453:C/T；454:T/G；456:T/C)。

实施例6

菌株YZULr026基因Gene264序列的独特性

依据Gene264序列设计引物，Fa(SEQ ID NO.4)：GACCAGAAACCTGCACATAAG；Rb(SEQID NO.5)：GCAGAGCGTGAACAGGAGC。由上海生工生物工程股份有限公司合成。扩增产物大小为359bp。其序列为(SEQ ID NO.6)：5’-GACCAGAAACCTGCACATAAGGACCTGGGACGCAATGGCCAAAGCCCGGCCATCACGCCCCAGGCCACTTATGCTCCGGTTTCTAACCGGGCTGGCTCACGCTCTGCTCTGAAACGCGTTCACAGTCGCAGAAATCTGCGTGTAAGTACCTCAGCCGCAATGGACAAAGCCCCGGCCATCACGTCTGAGGCCACTTACACTCCGATTTCTAAGCGCGCCTGTTCACGCTCTGCTCTGAAACGCGTTCACAGTCGCAGACATCTGCGTGTAAGTACCTCAGCCGCAATGGCCAAAGCCCCGGCCATCACGTCTGAGGCCACCTACACTCCGATTTCTAAGCGCTCCTGTTCACGCTCTGC-3’。PCR反应体系为25μL，即加入12.5μL 2×Taq Master Mix，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，加水至25μL。混匀后，按以下PCR条件扩增：94℃预变性5min，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环，72℃后延伸10min。根据gene264序列进行比对，构建系统发育树。

实施结果如图7所示，结果显示鼠李糖乳杆菌YZULr026的Gene264序列单独形成一个分支，具有独特性。该结果同时显示Gene264在鼠李糖乳杆菌种内不同菌株之间存在高度多样性，是鼠李糖乳杆菌菌株鉴别的新型核酸标志物。

结合菌株YZULr026形态和生理生化特征、16S rDNA基因序列、全基因组序列、以及Gene264序列特征，将菌株YZULr026初步鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的新的菌株，命名为鼠李糖乳杆菌YZULr026(Lactobacillus rhamnosus YZULr026)。将该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2020359；保藏日期：2020年7月27日。

实施例7

菌株YZULr026耐酸能力

将鼠李糖乳杆菌YZULr026在MRS液体培养基中连续活化2代，取10⁹CFU/mL的菌液100μL接种于pH值为2.0、3.0、4.0的5mLMRS液体培养基中，37℃厌氧培养，分别在0h、2h、4h、6h取样，采用稀释涂布平板法测定活菌数，以接种常规MRS液体培养基为对照，比较YZULr026在酸性条件下的存活能力，实验重复3次。

实施结果如图8所示，结果显示在pH 2.0的酸性培养基中，菌株YZULr026在2h内活菌数由7.69lg CFU/mL降到4.48lg CFU/mL，4h后降到3.48lg CFU/mL。在pH 3.0和pH 4.0的酸性培养基中，菌株YZULr026在6h内活菌数没有显著下降，表明菌株YZULr026对酸性条件具有良好的耐受能力。

实施例8

菌株YZULr026耐胆汁酸盐能力

将菌株YZULr026菌株接种MRS液体培养基，连续活化2代。取10⁹CFU/mL的菌100μL接种于胆盐含量为1g/L、3g/L、5g/L的5mL的MRS液体培养基，37℃厌氧培养，分别在0h、2h、4h、6h取样，采用稀释涂布平板法测定活菌数。以接种常规MRS液体培养基为对照，比较YZULr026在胆盐中的存活能力，实验重复3次。

实施结果如图9所示，结果表明，菌株YZULr026在胆盐浓度为1g/L的培养基中存活良好；而在胆盐浓度为3g/L和5g/L培养基中活菌数显著下降，2h内分别由7.69lg CFU/mL下降到6.91lg CFU/mL和5.56lg CFU/mL，6h后分别降到5.98lg CFU/mL和4.11lg CFU/mL。结果表明菌株YZULr026能够耐受1g/L的胆盐环境，具备在肠道内存活并发挥作用的能力。

实施例9

菌株YZULr026在食品嘌呤减除中的应用效果

取市售听装啤酒(500mL装)200mL于500mL三角瓶中，铝箔密封，置于超声波池内，用40-90KHz超声波脱气处理15min，形成脱气啤酒。取10mL的脱气啤酒，加入10mL 40μg/mL的鸟嘌呤，形成添加游离鸟嘌呤的啤酒。取1mL 1×10⁷CFU/mL菌株YZULr026培养物，8000r/min，4℃离心10min，收集菌体，用超纯水清洗2-3次。菌体中分别加入750μL的脱气啤酒(啤酒处理1)与添加游离鸟嘌呤的脱气啤酒(啤酒处理2)，涡旋混匀，37℃摇床培养2h。培养物通过8000r/min，4℃离心10min取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，滤过液用HPLC检测残余鸟嘌呤浓度。以未加入菌体的啤酒样品作为空白对照(CK)。

实施结果如附图10所示。在啤酒处理1中，图中数据显示脱气啤酒中游离鸟嘌呤含量为12.74μg/mL(CK组)；脱气啤酒与无嘌呤降解活性的菌株LBP3-2(实施例1中分离的50株菌株中对鸟嘌呤没有降解作用的一株菌株)作用2h(阴性对照组)，游离鸟嘌呤达到55.64μg/mL，显著高于CK组(P<0.01)，表明菌株LBP3-2作用使啤酒中的鸟苷降解为游离鸟嘌呤残留在啤酒中；脱气啤酒与菌株YZULr026作用2h，游离鸟嘌呤含量仅为10.9μg/mL，显著低于CK组(P<0.05)，结果显示YZULr026能够大量降解啤酒中的游离鸟嘌呤。在啤酒处理2中，在10mL脱气啤酒中添加等体积40μg/mL的鸟嘌呤，再次测试菌株的减除效果。测定结果显示空白对照(CK)组中游离鸟嘌呤含量测定为20μg/mL，菌株LBP3-2处理组中游离鸟嘌呤含量为46.6μg/mL，显著高于CK组(P<0.01)；菌株YZULr026处理组中游离鸟嘌呤含量仅为7.9μg/mL，显著低于空白对照(CK)(P<0.01)。实施结果表明通过鼠李糖乳杆菌YZULr026处理能够有效减除高嘌呤食品中的鸟嘌呤。通过菌株YZULr026降解食品中的嘌呤，降低了肠道对嘌呤的吸收量，从而降低血液中尿酸水平，可以来预防高尿酸血症。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1442

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)

<400> 3

cttagacggc tcgctcccta aaagggttac gccaccggct tcgggtgtta caaactctca 60

tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg 120

cgattactag cgattccgac ttcgtgtagg cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa 180

tggctttaag agattagctt gacctcgcgg tctcgcaact cgttgtacca tccattgtag 240

cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300

ggtttgtcac cggcagtctt actagagtgc ccaactaaat gctggcaact agtcataagg 360

gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc 420

accacctgtc attttgcccc cgaaggggaa acctgatctc tcaggtgatc aaaagatgtc 480

aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc 540

gggcccccgt caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggaatgct 600

taatgcgtta gctgcggcac tgaagggcgg aaaccctcca acacctagca ttcatcgttt 660

acggcatgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctacc catgctttcg agcctcagcg 720

tcagttacag accagacagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattt 780

caccgctaca catggagttc cactgtcctc ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg 840

cacttcctcg gttaagccga gggctttcac atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct 900

ttacgcccaa taaatccgga taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg 960

tagttagccg tggctttctg gttggatacc gtcacgccga caacagttac tctgccgacc 1020

attcttctcc aacaacagag ttttacgacc cgaaagcctt cttcactcac gcggcgttgc 1080

tccatcagac ttgcgtccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg 1140

gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatca acctctcagt tcggctacgt atcattgcct 1200

tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa tacgccgcgg gtccatccaa aagcgatagc 1260

ttacgccatc tttcagccaa gaaccatgcg gttcttggat ttatgcggta ttagcatctg 1320

tttccaaatg ttatccccca cttaagggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc 1380

actcgttcaa aattaaatca agatgcaagc acctttcaat aatcagaact cgttcgactg 1440

ca 1442

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaccagaaac ctgcacataa g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagagcgtg aacaggagc 19

<210> 6

<211> 359

<212> DNA

<213> 基因Gene264(Gene264)

<400> 6

gaccagaaac ctgcacataa ggacctggga cgcaatggcc aaagcccggc catcacgccc 60

caggccactt atgctccggt ttctaaccgg gctggctcac gctctgctct gaaacgcgtt 120

cacagtcgca gaaatctgcg tgtaagtacc tcagccgcaa tggacaaagc cccggccatc 180

acgtctgagg ccacttacac tccgatttct aagcgcgcct gttcacgctc tgctctgaaa 240

cgcgttcaca gtcgcagaca tctgcgtgta agtacctcag ccgcaatggc caaagccccg 300

gccatcacgt ctgaggccac ctacactccg atttctaagc gctcctgttc acgctctgc 359

Claims

1.一株降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）YZULr026，保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址：中国武汉；保藏编号：CCTCC NO：M 2020359；保藏日期：2020年7月27日。

2.一种权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌YZULr026在降解嘌呤中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述嘌呤包括黄嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌YZULr026用于体外减除食品及配料中嘌呤。

5.一种利用权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌YZULr026生产的微生物制剂。

6.一种权利要求5所述的微生物制剂在用于催化水解嘌呤中的应用。

7.一种权利要求5所述的微生物制剂在制备用于体内减除嘌呤来预防高尿酸血症的制剂中的应用。