CN115927107A - 不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 - Google Patents

不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 Download PDF

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顾瑞霞
宋曼溪
马文龙
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Abstract

本发明公开了一种不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用。所述的菌株为鼠李糖乳酪杆菌grx21，保藏编号为CGMCC No.26009。本发明的鼠李糖乳酪杆菌grx21可利用半乳糖且不可利用乳果糖，代谢速度快且存活率高，可用于去除热碱合成乳果糖体系中的副产物半乳糖，用于制备适用于半乳糖血症人群使用的高纯度乳果糖以及作为益生菌应用于食品或药品中。

Description

不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用。
背景技术
乳果糖又称乳酮糖、异构化乳糖，分子式C12H22O11。乳果糖不能被人体消化酶水解，在小肠内不被吸收，进入结肠后作为肠道微生物的碳源被利用，促进双歧杆菌、乳杆菌增殖，同时代谢生成乳酸和短链脂肪酸，酸化肠道环境，降低肠道还原电位，抑制沙门氏菌、梭菌等有害菌的生长；酸化的结肠环境，将自由扩散的NH3转化为NH4+，有效地治疗高血氨引发的肝性脑病。因此乳果糖常被作为益生元应用在食品和药品中。
然而，乳果糖在自然界中并不存在，一般是使用热碱催化乳糖异构而来。传统热碱法转化乳糖为乳果糖过程中伴随大量副产物半乳糖的存在，无法满足半乳糖血症患者的需要。半乳糖血症患者体内遗传性的碳水化合物代谢紊乱，摄入半乳糖会导致黄疸、肾脏等问题甚至死亡。工业上得到高纯度的乳果糖一般使用活性炭色谱柱采用乙醇连续洗脱的方式去除半乳糖或连续通过阴阳离子交换柱去除副产物半乳糖，操作繁琐、价格昂贵。
乳酸菌是发酵糖类产生乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌。部分乳酸菌如嗜热链球菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，因存在半乳糖-特异性磷酸转移酶系统可以将半乳糖磷酸化为半乳糖-6-磷酸，并运输到细胞内，通过EMP途径和塔格糖-6-磷酸途径将半乳糖分解代谢。文献1从44株嗜热链球菌中筛选得到7株具有利用半乳糖的能力的菌株，但嗜热链球菌对环境要求相对鼠李糖乳酪杆菌更为苛刻，低pH下生长迟缓，半乳糖消耗不完全(乳酸菌的乳糖/半乳糖代谢及其应用，张夙夙，山东大学，2020年5月学位论文)。文献2探究了干酪乳杆菌对半乳糖的利用情况，发现干酪乳杆菌产酸相对单一(Towards galactoseaccumulation in dairy foods fermented by conventional starter cultures:Challenges and strategiesQinglongWuTrends in Food Science&TechnologyVolume41,Issue 1,January 2015,Pages 24-36)。目前鲜少在菌株代谢中将对半乳糖及乳果糖进行比较的文献报道。利用乳酸菌代谢特异性，将热碱催化乳糖体系中半乳糖代谢完全用于制备高纯度乳果糖，筛选可代谢半乳糖、不利用乳果糖的乳酸菌，是一种绿色的、价格低廉的、适用于半乳糖血症人群使用的高纯度乳果糖制备方式。
同时，乳酸菌具有良好的免疫调节作用，通过刺激肠道黏膜促进淋巴细胞分化成浆细胞产生抗体，增强机体的免疫力；乳酸菌具备改善肠道功能的作用，主要通过代谢产物乳酸与有机酸等，直接抑制或杀死肠道致病菌以此调节肠道微生态菌群平衡。使用乳酸菌代谢热碱法催化乳糖体系中副产物半乳糖产生有机酸等益生物质，乳酸菌与半乳糖协同生产富含乳果糖、乳酸菌、有机酸的合生元。
发明内容
本发明提供一种不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用。
本发明所述的不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)为grx21，已于2022年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26009，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述的鼠李糖乳酪杆菌grx21无法利用乳果糖，但可利用半乳糖。鼠李糖乳酪杆菌grx21在以乳果糖为唯一碳源的MRS培养基中与无糖培养基没有显著差异，几乎不生长；在MRS培养基中发酵24h，OD600为0.987，并代谢生成乳酸、乙酸、丁酸；以半乳糖为唯一碳源的MRS培养基中发酵24h，OD600为0.907，代谢生成乳酸、乙酸、丙酸、柠檬酸。
本发明还提供上述鼠李糖乳酪杆菌grx21在制备高纯乳果糖中的应用，具体方法为：将鼠李糖乳酪杆菌grx21接种至热碱催化乳糖制备乳果糖体系中，厌氧发酵一段时间后，分离乳果糖。
进一步地，本发明提供鼠李糖乳酪杆菌grx21在制备乳果糖合生元中的应用，具体方法为：将鼠李糖乳酪杆菌grx21接种至热碱催化乳糖制备乳果糖体系中，厌氧发酵一段时间后，收集发酵产物，得到乳果糖合生元。
本发明所述的乳果糖合生元为含有鼠李糖乳酪杆菌grx21、乳果糖、短链脂肪酸的乳果糖合生元。
本发明所述的短链脂肪酸为乳酸、乙酸、丙酸和γ-氨基丁酸。
本发明所述的热碱催化乳糖制备乳果糖体系为商业化的乳果糖的制备体系，为化学合成体系，还原性乳糖在碱性条件下，经热处理使乳糖单元上的葡萄糖被直接异构化成果糖，进而产生乳果糖。
更进一步地，本发明提供上述鼠李糖乳酪杆菌grx21作为益生菌在食品或药品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的鼠李糖乳酪杆菌grx21代谢半乳糖速度快，接种于MRS半乳糖培养基中，6h即可将半乳糖代谢完全。
(2)本发明的鼠李糖乳酪杆菌grx21在pH为3.0的人工胃液、0.2％胆盐培养基中的存活率均大于100％。同时在热碱催化乳糖生成乳果糖体系中，碳源高达200g/L的条件下，鼠李糖乳酪杆菌grx21仍可代谢其中的半乳糖，存活率高。
(3)本发明的鼠李糖乳酪杆菌grx21可利用半乳糖且不可利用乳果糖，可用于去除热碱合成乳果糖体系中的副产物半乳糖，用于制备适用于半乳糖血症人群使用的高纯度乳果糖。
附图说明
图1为实施例1中81株乳酸菌对乳果糖(a)、半乳糖(b)的利用情况。
图2为实施例1中菌株grx21代谢乳果糖、半乳糖情况。
图3为实施例1中菌株grx21在MRS固体培养基上的菌落形态图。
图4为实施例1中菌株grx21的光学显微镜观察形态图。
图5为实施例1中菌株grx21在MRS培养基、MRS-Gal培养基中分别发酵24h的产酸情况。
图6为实施例2中菌株grx21对热碱合成乳果糖体系中半乳糖、乳果糖的发酵情况。
图7为实施例2中菌株grx21在热碱合成乳果糖体系中代谢产酸情况。
具体实施方式
下面结合实施例、附图和表对本发明作进一步详述。
实施例1
不利用乳果糖、利用半乳糖乳酸菌的筛选
发明人从广西巴马长寿地区采集的样品中分离纯化得到革兰氏阳性菌株，经过镜检筛选出杆菌，采用细胞浊度测试，分别测定以乳果糖为唯一碳源的MRS培养基中600nm处吸光度值(OD600-Lu)和以半乳糖为唯一碳源的MRS培养基中600nm处吸光度值(OD600-Gal)，筛选不利用乳果糖、利用半乳糖的菌株。
1.乳酸菌在MRS培养基、乳果糖和半乳糖MRS培养基中的生长情况
MRS液体培养基：葡萄糖20.00g，醋酸钠5.00g，磷酸氢二钾2.00g，蛋白胨10.00g，吐温-80 1.00mL，牛肉膏10.00g，四水硫酸锰0.05g，酵母提取物5.00g，柠檬酸二铵2.00g，七水硫酸镁0.20g，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌15min。
以乳果糖为唯一碳源的MRS培养基(MRS-Lu)：将MRS培养基里的葡萄糖换成乳果糖，其余不变，121℃灭菌15min，备用。
以半乳糖为唯一碳源的MRS培养基(MRS-Gal)：将MRS培养基里的葡萄糖换成半乳糖，其余不变，121℃灭菌15min，备用。
无糖培养基：将MRS培养基里的葡萄糖去掉，其余不变，121℃灭菌15min，备用。
将菌株以3％的添加量分别接种至MRS-Lu培养基、MRS-Gal培养基中，37℃培养箱发酵，在0h、24h时取样，采用酶标仪测定发酵液在600nm处吸光度值(OD600)，记录乳酸菌在MRS-Lu、MRS-Gal培养基的生长情况，并以MRS培养基作为阳性对照、无糖培养基为阴性对照。
如图1所示，81株乳酸菌中有一株乳酸菌在MRS-Lu培养基OD600低于0.1，有8株菌在MRS-Gal培养基OD600高于0.8，筛选在MRS-Lu培养基OD600低于0.1、在MRS-Gal培养基OD600高于0.8的菌株一株，编号为1。进一步研究1号菌株在葡萄糖、乳果糖、半乳糖、无糖MRS培养基中的生长情况。结果表明，1号菌株在无糖MRS培养基与MRS-Lu培养基中几乎不生长，OD600-Lu仅为0.011，在MRS-Gal培养中生长较好，OD600-Gal为0.907。
2.乳酸菌发酵乳果糖、半乳糖能力评价
将1号菌株在MRS液体培养基中活化2代后，分别接入MRS-Lu培养基、MRS-Gal培养基中，37℃培养箱发酵，在0h、24h取1ml发酵上清液，8000r/min离心2min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤后用于HPLC检测，分析上清液中乳果糖、半乳糖的含量。
如图2所示，1号菌株在MRS-Lu MRS培养基中发酵24h，乳果糖含量从20g/L降低至19.262g/L；在MRS-Gal MRS培养基中发酵24h，半乳糖含量从20g/L降低至0g/L。
3.乳酸菌的鉴定
3.1形态观察和革兰氏染色
肉眼观察MRS固体平板上菌落特征，并挑取单菌落于载玻片上，经革兰氏染色后，通过生物学显微镜观察菌株形态。
如图3所示，菌落形态为乳白色，近圆形凸起且光滑，边缘整齐。如图4所示，经革兰氏染色后，革兰氏染色呈阳性，长杆状，无芽孢。
3.2菌株16S rDNA鉴定
(1)提取基因组：菌株活化后，取1ml菌液离心，选用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA；
(2)PCR扩增：以菌株基因组DNA为模板进行扩增，PCR扩增程序：95℃、5min；95℃、30s；55℃、15s；72℃、2min，30个循环后继续72℃延伸5min。
将PCR产物电泳检测后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果：其核苷酸长度在1500bp附近，将测序得到的序列与NCBI的GenBank数据库进行同源比对分析，16S rDNA序列与Lacticaseibacilusrhamnosus strain TMPC43372同源性达97.39％，因此，本发明菌株命名为鼠李糖乳酪杆菌grx21。
表1乳酸菌16S rDNA基因序列同源性比对结果
4.鼠李糖乳酪杆菌grx21发酵半乳糖代谢产物测定
将grx21在MRS培养基中活化2代后，分别接入MRS培养基、MRS-Gal培养基，37℃培养箱发酵，在0h、24h取1ml发酵上清液，8000r/min离心2min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤后用于HPLC检测，分析上清液中有机酸含量。
如图5所示，鼠李糖乳酪杆菌grx21在MRS培养基中发酵24h生成0.14g/L乳酸、2.10g/L乙酸、4.26g/L丁酸；在MRS-Gal培养基中发酵24h代谢生成0.12g/L乳酸、2.14g/L乙酸、4.96g/L丙酸、1.11g/L柠檬酸。
5.鼠李糖乳酪杆菌grx21耐酸耐胆盐能力评价
将鼠李糖乳酪杆菌grx21在MRS液体培养基中活化2代后按3％接种量接种于pH为3.0的人工胃液中。混匀，37℃培养，分别于0、3h取样，用无菌水按1:10进行系列稀释，采用MRS固体培养基培养并活菌计数，计算菌株对pH3.0胃酸的耐受力。
将grx21在MRS液体培养基中活化2代后按3％的接种量接种到0.2％的胆盐培养基中，37℃培养3h后，采用MRS固体培养基培养并活菌计数，计算菌株对0.2％胆盐的耐受力。
结果表明：鼠李糖乳酪杆菌grx21在pH为3.0的人工胃液中，37℃培养3h，耐酸存活率为152.19％±2，大于100％，其具备很强的低pH耐受性；在0.2％胆盐培养基中，37℃培养3h，菌株存活率为108.34％±1，大于100％，其具备很强的胆盐耐受性。综上所述该菌株对消化道的耐受性尤其是低pH以及胆盐耐受性较高。
实施例2
1.鼠李糖乳酪杆菌grx21可用于制备乳果糖
实验前期，发明人在70℃、pH 12、反应50min的条件下，以热碱催化乳糖制备乳果糖，体系中生成67g/L乳果糖、64g/L副产物半乳糖，接入鼠李糖乳杆菌grx21发酵24h后，半乳糖含量为0.0g/L，而乳果糖含量保持不变。工业上得到高纯度的乳果糖一般使用活性炭色谱柱采用乙醇连续洗脱去除副产物半乳糖或通过连续阴阳离子交换柱去除半乳糖，价格昂贵且操作繁琐。grx21可用于乳果糖的制备，适用于半乳糖血症人群使用。
2.鼠李糖乳酪杆菌grx21可用于乳果糖合生元制备
将grx21在MRS培养基中活化2代，以10％的接种量转接至400mL MRS培养基中，37℃发酵24h，6000rpm离心15min，收集菌体细胞，用生理盐水洗涤3次，转接至热碱催化乳糖制备乳果糖体系中，使得菌体终浓度为10g/L，通入氮气维持厌氧环境，罐中溶氧率为2％，开始发酵。发酵过程中，pH下降，利用蠕动泵补充10mol/LNaOH，使pH恒定为7.5±0.1，37℃、100rpm发酵24h，如图6、7所示，经HPLC测定半乳糖被发酵完全，乳果糖无明显变化，同时代谢生成乳酸、乙酸、丙酸、γ-氨基丁酸，含量分别为4.08(g/L)、0.69(g/L)、14.21(g/L)、3.10(g/L)。此实施例可以得到富含鼠李糖乳酪杆菌grx21、乳果糖、短链脂肪酸的乳果糖合生元。
3.本发明菌株可制备成益生菌粉，应用于食品及药品
将该乳酸菌冷冻至-40℃～-60℃，冻干后制成粉末状，可将该粉末加入各种饮品或者食物中做为补充剂，也可应用于药品中。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)grx21，保藏编号为CGMCC No.26009，保藏时间为2022年11月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在制备高纯乳果糖中的应用，其特征在于，具体方法为：将鼠李糖乳酪杆菌grx21接种至热碱催化乳糖制备乳果糖体系中，厌氧发酵一段时间后，得到乳果糖。
3.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌grx21在制备乳果糖合生元中的应用，其特征在于，具体方法为：将鼠李糖乳酪杆菌grx21接种至热碱催化乳糖制备乳果糖体系中，厌氧发酵一段时间后，收集发酵产物，得到乳果糖合生元。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的乳果糖合生元为含有鼠李糖乳酪杆菌grx21、乳果糖、短链脂肪酸的乳果糖合生元。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的短链脂肪酸为乳酸、乙酸、丙酸、和γ-氨基丁酸。
6.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌grx21作为益生菌在食品或药品中的应用。
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