CN113308394A - 鼠李糖乳杆菌微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌微生态制剂及其制备方法和应用，制备含有植物水提物的MRS培养基；培养鼠李糖乳杆菌SHA113，浓缩菌体；混合二氧化硅、脱脂奶粉与菌液，37℃烘干8 h，研磨，得到鼠李糖乳杆菌微生态制剂。本发明涉及的方法过程简单易操作，制备周期短，成本低；制备的微生态制剂活菌数可达9.80×1010 cfu/g，在模拟胃肠液中具有高存活率，4℃条件下，预计贮藏时间可达到1.44年，克服了喷雾干燥菌体存活率低和真空冷冻干燥成本高的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
微生态制剂是一类含有大量有益菌的活菌制剂，能促进或抑制微生物生长，主要作用于动物肠道，平衡和调节肠道微环境，适用范围广，包括医药保健领域、食品领域、饲料工业领域等。微生态制剂可以调节机体肠道微生态平衡，改善肠道屏障，增强免疫力，防治疾病，提高动物的生长性能，提高机体健康。微生态制剂具有作用机理独特、无副作用、无残留、无抗性等优点，具有广泛的应用前景。
微生态制剂的干燥方式多为喷雾干燥和真空冷冻干燥，这两种方式都各有劣势，喷雾干燥菌体存活率较低，真空冷冻干燥价格昂贵，且需要昂贵的仪器设备，制备成本高，周期长。二氧化硅可在饲料中作为抗结块剂使用，用于增加饲料流动性，有助于饲料中营养成分的均匀混合，能将饲料中的活性成分分开，避免其反应，能有效保证饲料中添加剂及预混料的质量，目前没有研究将二氧化硅用于微生态制剂的开发中。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠李糖乳杆菌微生态制剂及其制备方法和应用，采用食品级二氧化硅为载体，实现快速、低成本制备高活菌数微生态制剂，整个制备过程快速高效、操作方便，获得的鼠李糖乳杆菌微生态制剂活性高，稳定性好。
本发明所采用的技术方案为：
鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
所述方法包括以下步骤：
步骤一：制备含有植物水提物的MRS培养基；
步骤二：培养鼠李糖乳杆菌SHA113，浓缩菌体；
步骤三：混合二氧化硅、脱脂奶粉与菌液，37℃烘干8h，研磨，得到鼠李糖乳杆菌微生态制剂。
步骤一具体为：在2×MRS培养基中加入等体积料液比为1:100 的植物水提物。
步骤一中的植物水提物的植物选自黄芪、黄芩、桔梗和茶叶。
步骤二中，鼠李糖乳杆菌SHA113于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017838。
步骤二中，鼠李糖乳杆菌SHA113的培养条件为37℃培养16h。
步骤二中，浓缩菌体的过程为：对培养完成的鼠李糖乳杆菌 SHA113进行离心，弃去大部分上清，10倍浓缩菌体。
步骤三中，二氧化硅与菌液的质量体积比为2：9。
步骤三中，加入脱脂奶粉的含量为0.1g/L。
如所述的制备方法制得的鼠李糖乳杆菌微生态制剂。
如所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂作为饲料添加剂和食品用活性益生菌添加剂的应用。
本发明具有以下优点：
本发明涉及的方法过程简单易操作，制备周期短，成本低。制备的微生态制剂活菌数可达9.80×1010cfu/g，在模拟胃肠液中具有高存活率，4℃条件下，预计贮藏时间可达到1.44年，克服了喷雾干燥菌体存活率低和真空冷冻干燥成本高的缺点。
附图说明
图1为白炭黑吸水性检测装置和白炭黑吸水量与时间曲线。(A 为白炭黑吸水性检测装置，B为白炭黑吸水量与时间曲线)
图2为不同温度下微生态制剂烘干含水量与菌体存活率随时间变化关系。(A为70℃下微生态制剂烘干含水量与菌体存活率随时间变化关系，B为60℃下微生态制剂烘干含水量与菌体存活率随时间变化关系，C为50℃下微生态制剂烘干含水量与菌体存活率随时间变化关系，D为37℃下微生态制剂烘干含水量与菌体存活率随时间变化关系)
图3为不同植物水提物对菌体生长的影响及脱脂奶粉对微生态制剂制备过程中的影响。(A为菌体在不同浓度黄芪水提物中8h后的OD600，B为菌体在不同浓度黄芩水提物中8h后的OD600，C为菌体在不同浓度桔梗水提物中8h后的OD600，D为菌体在不同料液比茶叶水提物中8h后的OD600，E为加入不同浓度脱脂奶粉后微生态制剂中菌体烘干9h后的存活率)
图4为鼠李糖乳杆菌微生态制剂制备工艺流程图。
图5为微生态制剂各项指标结果。(A为微生态制剂在模拟胃液中0、1、2和3h的存活率，B为微生态制剂在模拟肠液中0、1、2 和3h的存活率，C为微生态制剂在不同温度下的加速实验，D为微生态制剂Arrhrnius图)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，首次采用食品级二氧化硅为载体，得到一种存活率高且制备成本低廉的新型微生态制剂，所述方法包括以下步骤：
步骤一：制备含有植物水提物的MRS培养基；
步骤二：培养鼠李糖乳杆菌SHA113，浓缩菌体；
步骤三：混合二氧化硅、脱脂奶粉与菌液，37℃烘干8h，研磨，得到鼠李糖乳杆菌微生态制剂。
步骤一具体为：在2×MRS培养基中加入等体积料液比为1:100 的植物水提物。植物水提物的植物选自黄芪、黄芩、桔梗和茶叶(为茶树采过饮用茶叶后的老叶子(绿色，尚未转黄)。
步骤二中，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SHA113于 2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M 2017838，是在玉米浆中定向选育得到的。鼠李糖乳杆菌SHA113的培养条件为37℃培养16h，在细菌培养箱中静置培养至稳定期。浓缩菌体的过程为：对培养完成的鼠李糖乳杆菌SHA113进行离心，弃去大部分上清，10倍浓缩菌体。
步骤三中，二氧化硅与菌液的质量体积比为2：9。步骤三中，加入脱脂奶粉的含量为0.1g/L(以菌液总体积为基准)。
上述方法得到的鼠李糖乳杆菌微生态制剂，活菌数为9.80×1010 cfu/g，在模拟胃液中3h时的存活率为224.67％，在模拟肠液中3h 时的存活率为68.2％，4℃条件下，预计贮藏时间可达到1.44年，克服了喷雾干燥菌体存活率低和真空冷冻干燥成本高的缺点，可用于饲料添加剂和食品用活性益生菌添加剂。
以下结合附图对本发明作进一步详细说明：
1.1材料：
乳酸菌细菌肉汤培养基(MRS培养基)购自北京奥博星生物技术有限公司，琼脂粉、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自北京索莱宝生物科技有限公司，二氧化硅购自天津龙华诚信粉体技术有限公司，脱脂奶粉购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司，茶叶受赠于茶叶厂，黄芪、黄芩和桔梗受赠于山西省太原市农业科学研究所。
1.2方法
1.2.1菌种活化
取少量保存于-80℃定向选育后的鼠李糖乳杆菌涂布于MRS固体培养基中，于37℃细菌培养箱中培养48h。待长出单菌落后，挑单菌落于5mL MRS肉汤培养基中，活化菌种，37℃细菌培养箱中静置培养48h，作为种子液，置于4℃冰箱中保存。
1.2.2二氧化硅吸水性测定
所使用二氧化硅粉末满足食品安全国家标准，能作为食品添加剂，二氧化硅吸水性能测定装置根据文献改装而成。如图1A所示，该装置由一个玻璃漏斗，10mL移液管和软管组合而成，将玻璃漏斗的下端固定在距台面34.5cm处的地方，在玻璃漏斗中放置一张折叠好的滤纸，将移液管的上端固定在距台面35cm处的地方，保持移液管略微的倾斜，用MRS培养基充满移液管和整个管路，使滤纸保持湿润的状态，但不滴水，且漏斗下端的液面恰好位于滤纸底部。准确称取4.00g白炭黑置于滤纸上，打开摄像头，记录移液管中液体在不同时间处的体积读数，移液管中液体的减少量即为二氧化硅吸收 MRS培养基的量。实验中温度保持在18～24℃，湿度保持在 40％～60％。
1.2.3干燥过程中菌体存活率和制剂含水量的变化
将1％的种子液接入MRS培养基中，37℃静置培养至稳定期。准确吸取18mL培养好的菌液置于一次性培养皿中，记一次性培养皿的重量为m1，向其中加入4g白炭黑，分别置于70℃、60℃、50℃、37℃烘箱中烘干。每隔一定时间称量鼠李糖乳杆菌微生态制的实时重量m2，准确称取鼠李糖乳杆菌制剂1g，加入9mL无菌PBS将制剂复溶，使用平板计数法得到制剂中的活菌数，按式(1)计算制剂在烘干过程中菌体的实时存活率。记鼠李糖乳杆菌微生态制剂恒重时为 m3，按式(2)计算制剂的实时含水量。
存活率＝(制剂中总活菌数/原始活菌数)×100％ 式(1)
含水量＝(m2-m3)/(m2-m1)×100％ 式(2)
1.2.4不同浓度植物水提物对菌体生长的影响
(1)中草药水提物的制备。取黄芪、黄芩和桔梗的根部，于40℃烘箱中烘干，称重，以10倍体积的超纯水浸泡1h，煎煮1h，8层纱布过滤。将滤渣以10倍体积的超纯水煎煮1h，8层纱布过滤，合并两次滤液。采用100℃水浴蒸发浓缩植物水提取物，得到黄芪生药浓度为1g/mL，黄芩生药浓度为0.4g/mL，桔梗生药浓度为0.4g/mL。将得到的植物水提物无菌过滤，4℃保存备用。
(2)茶叶水提物的制备。在100mL超纯水中加入不同质量的茶叶，料液比分别为1：1000，1：200，1：100，1：50，1：20和1： 10，85℃下水浴40min，8层纱布过滤除去茶叶渣，抽滤，无菌过滤， 4℃保存备用。
(3)植物水提物对菌体生长的影响。在MRS培养基中分别加入各植物水提物，使培养体系中黄芪生药终浓度为0、0.005、0.01、0.05、 0.1、0.15和0.25g/mL，黄芩和桔梗生药终浓度为0、0.04、0.08、0.12、 0.16和0.20。茶叶水提物按1:1的比例加入2×MRS培养基中，以相同体积的MRS培养基为对照。向各培养基中接入1％种子液，37℃静置培养，检测菌体8h时在600nm处的吸光度值。
1.2.5不同浓度脱脂奶粉对菌体存活率的影响
向含有1:100茶叶水提物的MRS培养基中加入1％的种子液，置于37℃细菌培养箱中静置培养至稳定期，准确吸取18mL菌液置于一次性培养皿中，记一次性培养皿的重量为m1，向其中加入4g白炭黑，再分别加入脱脂奶粉0，0.9，1.8，2.7和3.6g(即浓度为0，0.05，0.10，0.15和0.20g/mL)，混匀。为了更明显的看出脱脂奶粉对微生态制剂菌体存活率的影响，将样品置于37℃烘箱中9h，称量此时鼠李糖乳杆菌微生态制的实时重量m2，加入9mL无菌PBS将制剂复溶，使用平板计数法得到制剂中活菌数，根据公式(1)计算制剂在烘干过程中菌体的存活率。
1.2.6微生态制剂性质
(1)微生态制剂制备工艺
该微生态制剂的制备工艺如下，在2×MRS培养基中等体积加入料液比为1:100的茶叶水提物，向其中接入1％种子液，37℃细菌培养箱中静置培养至稳定期，取180mL菌液，8000rpm离心5min，倒掉大部分上清液，取18mL上清液重悬全部菌体，提高菌体密度，加入含有4g白炭黑和1.8g奶粉的一次性培养皿中，37℃烘箱烘干8 h，对得到的微生态制剂进行适当的研磨得到粉状制剂。
(2)微生态制剂活菌数测定和形态观察
准确称取1g微生态制剂，加入9mL无菌PBS，复溶制剂，适当稀释，使用平板计数法得到制剂中的活菌数。
(3)制剂在模拟胃肠液中的存活率
模拟胃液的配置。根据中国药典的方法，取浓盐酸234mL，加入超纯水定容至1000mL，得到稀盐酸，取该稀盐酸16.4mL，加入超纯水800mL，胃蛋白酶10g，均匀混合，用超纯水定容至1000mL，得到模拟胃液，置于4℃冰箱保存备用。
模拟肠液的配置。根据中国药典的方法，取磷酸二氢钾6.8g，加入适量超纯水溶解，加入0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.8，得到A液；取胰蛋白酶10g，加入适量超纯水溶解，得到B液。对A、 B进行混合，加入超纯水定容至1000mL，得到模拟肠液，置于4℃冰箱保存备用。
微生态制剂在模拟胃肠液中的存活率。取1g微生态制剂，分别加入模拟胃肠液至10mL，置于37℃培养箱中，分别于0h、1h、2h 和3h取样，使用平板计数法按式(3)计算菌体的存活率。
存活率(％)＝[t h后存活菌落数(log cfu/mL)/原始菌落数(log cfu/mL) 式(3)
(4)加速贮藏实验
将微生态制剂分别置于45℃、50℃和55℃中水浴10h进行加速贮藏实验，每2h取样，利用平板计数法计算活菌数，在同一温度下微生态制剂满足一级反应动力学方程(式4)。对不同温度，不同时间点下微生态制剂活菌数进行线性拟合，得到该微生态制剂在不同温度下的速率常数k，速率常数k与绝对温度T之间满足Arrhrnius方程(式5)。以不同温度下的k值与T之间的关系推测该微生态制剂在不同温度下的速率常数，推测制剂在其他温度下的贮藏时间。
lgNt-lgN0＝kt 式(4)
lgk＝lgk0-(Ea/2.303R)/T 式(5)
式中：
N0表示微生态制剂在0h时的活菌数(cfu/g)；
Nt表示微生态制剂在t时刻的活菌数(cfu/g)；
k、k0表示速率常数；
t表示取样时间；
Ea表示反应活化能；
R表示理想气体常数；
T表示绝对温度。
2实验结果
2.1二氧化硅吸水性
将视频进行分析，在前30s，每10s读取一次移液管中的数据，后每30s读取一次移液管中的数据，绘制二氧化硅时间-吸水量曲线，如图1B所示，360s时，二氧化硅吸收MRS培养基的量达到最大值 4.5mL。
2.2干燥过程中菌体存活率和制剂含水量的变化
2.2.1 70℃下微生态制剂含水量与菌体存活率的变化
在70℃时，鼠李糖乳杆菌微生态制剂中含水量随烘干时间的延长而减少，鼠李糖乳杆菌的存活率逐渐下降(图2A)。在220min时，微生态制剂达到恒重，含水量为0％，此时菌体的存活率仅为0.76％。通过对该曲线的分析，70℃不是本研究中微生态制剂的最佳烘干温度
2.2.2 60℃下微生态制剂含水量与菌体存活率的变化
在60℃时，鼠李糖乳杆菌微生态制剂中含水量随烘干时间的延长而减少，鼠李糖乳杆菌的存活率逐渐下降(图2B)。在300min时，微生态制剂达到恒重，含水量为0％，此时菌体的存活率仅为5.33％。通过对该曲线的分析，60℃不是本研究中微生态制剂的最佳烘干温度。
2.2.3 50℃下微生态制剂含水量与菌体存活率的变化
在50℃时，鼠李糖乳杆菌微生态制剂中含水量随烘干时间的延长而减少，鼠李糖乳杆菌的存活率逐渐下降，但未出现明显的下降(图 2C)。在440min时，微生态制剂达到恒重，含水量为0％，此时菌体的存活率仅为1.36％。通过对该曲线的分析，50℃不是本研究中微生态制剂的最佳烘干温度。
2.2.4 37℃下微生态制剂的变化
在37℃时，鼠李糖乳杆菌微生态制剂中含水量随烘干时间的延长而减少，但是鼠李糖乳杆菌的存活率并不是呈现逐渐下降的趋势，而是，先增加，保持一个稳定的存活率，而后突然下降(图2D)。该微生态制剂在前120min时，菌体的存活率一直处于上升的状态，从100％上升至120min的271.75％。此后微生态制剂中菌体存活率一直保持一个较高的水平，在480min时，菌体存活率为279.11％，微生态制剂含水量为23.50％。而在520min时，菌体的存活率较前面有显著的下降，降为91.99％。结合前面的实验进行分析，该微生态制剂最佳的制备工艺为37℃，烘干8h(即480min)。
2.3植物水提物对菌体生长的影响
2.3.1不同浓度黄芪水提物对菌体生长的影响
不同浓度黄芪水提物对驯化后菌体生长的影响如图3A所示。黄芪生药浓度为0.005g/mL和0.01g/mL时，能促进菌体的生长；当黄芪生药浓度在0.05g/mL-0.25g/mL时，会显著抑制菌体的生长。
2.3.2不同浓度黄芩水提物对菌体生长的影响
不同浓度黄芩水提物对驯化后菌体生长的影响如图3B所示，黄芩生药浓度为0.04g/mL时，对菌体生长具有显著的促进作用；当黄芪生药浓度在0.08g/mL-0.20g/mL时，对菌体的生长几乎没有明显的影响。
2.3.3不同浓度桔梗水提物对菌体生长的影响
不同浓度桔梗水提物对驯化后菌体生长的影响如图3C所示，桔梗生药浓度为0.04g/mL-0.20g/mL时，对驯化后菌体的生长没有显著的影响。
2.3.4不同料液比茶叶水提物对菌体生长的影响
不同料液比茶叶水提物对驯化后菌体生长的影响如图3D所示，而当茶叶水提物料液比为1：100时，茶叶水提物对菌体的生长显示出显著的促进作用。
对上述植物水提物进行综合分析，黄芪生药浓度为0.01g/mL、黄芩生药浓度为0.04g/mL以及料液比为1：100的茶叶水提物都能明显的促进菌体的生长，进一步对数据进行分析，将显著性差异改为 p<0.001时，仅黄芪和茶叶水提物对菌体生长表现出促进作用，其中茶叶水提物对菌体的促进效果更为明显，且本次实验所使用的茶叶较黄芪更为廉价，综合考虑，后续实验选择料液比为1：100的茶叶水提物最优，以此提高菌体的活性和生长速度，增加微生态制剂中的活性成分。
2.4脱脂奶粉对微生态制剂活性的影响
图3E为加入不同浓度脱脂奶粉后微生态制剂中菌体的存活率，加入脱脂奶粉后，微生态制剂中菌体的存活率得到了显著的提高，当脱脂奶粉浓度为0.1g/mL时，菌体的存活率最高，达到了251.95％。
2.5微生态制剂的性质
2.5.1微生态制剂的活菌数及形态
微生态制剂的制备工艺流程图如图4，制剂中鼠李糖乳杆菌活菌数为9.80×1010cfu/g，微生态制剂呈微黄色，颗粒均匀，流动性良好，形态均匀一致。
2.5.2微生态制剂在模拟胃液中的存活率
图5A为微生态制剂在模拟胃液中0、1、2、3h的存活率，在2 h时菌体的存活率高达272.33％，而在3h时略微有所下降，为 224.67％。
2.5.3微生态制剂在模拟肠液中的存活率
图5B为微生态制剂在模拟肠液中0、1、2、3h的存活率，在3 h时菌体的存活率为68.2％，甚至略高于1h时的存活率。
2.5.4加速贮藏实验结果
图5C为微生态制剂在45，50，55℃下10h内菌体活菌数与时间的拟合曲线，图5D为根据微生态制剂在不同温度下的k值得到的 Arrhrnius图。根据图中数据分析，该微生态制剂在25℃、4℃、-18℃下，贮藏时间分别为56天，1.44年和22.52年。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
所述方法包括以下步骤：
步骤一：制备含有植物水提物的MRS培养基；
步骤二：培养鼠李糖乳杆菌SHA113，浓缩菌体；
步骤三：混合二氧化硅、脱脂奶粉与菌液，37℃烘干8 h，研磨，得到鼠李糖乳杆菌微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤一具体为：在2×MRS培养基中加入等体积料液比为1:100的植物水提物。
3.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤一中的植物水提物的植物选自黄芪、黄芩、桔梗和茶叶。
4.根据权利要求3所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤二中，鼠李糖乳杆菌SHA113于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017838。
5.根据权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤二中，鼠李糖乳杆菌SHA113的培养条件为37℃培养16 h。
6.根据权利要求5所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤二中，浓缩菌体的过程为：对培养完成的鼠李糖乳杆菌SHA113进行离心，弃去大部分上清，10倍浓缩菌体。
7.根据权利要求6所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤三中，二氧化硅与菌液的质量体积比为2：9。
8.根据权利要求7所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：
步骤三中，加入脱脂奶粉的含量为0.1 g/L。
9.如权利要求8所述的制备方法制得的鼠李糖乳杆菌微生态制剂。
10.如权利要求9所述的鼠李糖乳杆菌微生态制剂作为饲料添加剂和食品用活性益生菌添加剂的应用。
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