CN103468630B - 一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，包括培养基制备、益生菌菌种活化、益生菌菌悬液的制备、益生菌固态发酵、益生菌孢子粉干燥、益生菌高孢粉抽提及粉碎和益生菌孢子粉成品质检及包装共7个步骤，该方法采用固态发酵制备益生菌孢子粉，降低了生产过程中杂菌的污染率，发酵过程能耗低；产物浓度高，提取工艺简单；整个生产过程零废液排放；该方法采用集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器，简化操作工序，缩短了生产周期，节约能耗，提高生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌发酵生产技术领域，尤其是涉及一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法。
背景技术
益生菌是指当摄入充足的数量后,能对宿主产生一种或多种由论证的功能性健康益处的活的微生物，主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、丙酸菌、芽孢杆菌、埃希氏菌以及酵母属等。
益生菌能促进机体微生物菌群和酶的平衡以及刺激特异性和非特异性的免疫机制,达到预防某些疾病、促进发育、增强体质、延缓衰老和延长寿命的目的。
CN 103146616 A公开了一种制备复合乳酸菌制剂的方法及应用。所述方法包括农副产品废渣预处理、菌株扩大培养、复合菌株液态培养、复合菌株液固态偶联发酵。该发明克服了当前益生菌饲料添加剂产品存在的性能稳定性差、生产成本高的问题，其不仅使复合乳酸菌制剂产品中的菌株竞争力增强，宿主定植率得到提高，而且，该方法能大幅度减小成本，并有效利用农副产品废渣资源，使其成为饲料添加剂成分中的重要组成部分，在一定程度上解决了资源浪费和环境污染等突出问题，可成功应用于饲料方面。但该方法发酵效率低，成本高，得到的复合乳酸菌制剂的活菌总数仅达7. 8~8. 5 × 109 cfu/ml，无法满足市场的要求。
CN 103211085 A公开了一种饲用高效复合益生菌剂及制备方法，属于生物技术领域。所述的复合益生菌剂由地衣芽抱杆菌(Baci11us1icheniformis),嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)、酿酒酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)分别发酵培养后按比例混合而成，有效微生物数目达到8~120×108CFU/mL；所述复合益生菌剂菌株间配伍科学合理，能杀死或抑制动物体内的病原菌，促进饲料的消化吸收，能大大减少饲料中抗生素的使用。但该方法制备工艺复杂，且益生菌含量偏低。
目前，益生菌制剂应用于养殖生产，然而，在制备工艺上大部分采用液态发酵制备，发酵控制条件苛刻，生产成本高，少数采用固态发酵制备的工艺复杂，得到的益生菌含量低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，缩短发酵周期、降低生产能耗，提高益生菌的发酵效率，得到含菌量高的复合型益生菌。
本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，包括以下步骤：
a）培养基制备：
茄子瓶培养基：组成成分为马铃薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖或蔗糖2%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、琼脂1.5~2%、pH为6.5~7.0；
种子扩大培养的培养基：组成成分为米糠7~10%或麦麸2~10%、花生粕或豆粕2~5%、蛋白胨0.5~1.0%、蔗糖2%、琼脂2%，pH为6.0~7.0；
固体发酵培养基：由稻壳和麦麸组成，组成比例为3:7~5:5，固体培养基的含水率为50% wt～60% wt，pH自然；
b）益生菌菌种活化：将冷冻管中的菌体或斜面培养保存的菌种转接至茄子瓶内培养；
c）益生菌种悬液的制备：将步骤b）培养好的细菌或真菌按1:100~1:50的接种量转接至种子罐中进行固态培养，罐压为0.05MPa，通风量为0.1~0.2vvm，搅拌速度为0.1~0.2rpm，细菌在34~39℃培养24~36h后转至适量的无菌水中，使菌悬液含菌量在1.0~1.5×107cfu/g；真菌在25~30℃培养44~60h至适量的无菌水中，使菌悬液含菌量在3.0~5.0×106cfu/g；
d）益生菌固态发酵培养：
将步骤c）得到的细菌菌悬液按固体发酵培养基的重量1~2%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.02~0.05MPa，通风量为0.2~0.25vvm，搅拌速度为0.8~1.2rpm，培养温度为34~39℃，物料湿度控制在55~65%，45~55h内每4h取样检测物料的含菌量，当含菌量≥5.0×109cfu/g且活菌率高于95%时，停止发酵；
将步骤c）得到的真菌菌悬液按固体发酵培养基的重量2~4%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.02~0.05MPa，通风量为0.2~0.25vvm，搅拌速度为0.8~1.2rpm，培养温度为25~30℃，物料湿度控制在55~65%，57~66h内每2h取样检测物料的活菌量，当活菌量≥5.0×108cfu/g且活菌率高于95%时，停止发酵；
e）益生菌孢子粉干燥及粉碎:在发酵结束后，将发酵罐的温度调至60℃、搅拌速度调至3~5rpm，干燥至孢子粉的含水率低于12%，并通过提高搅拌速度进行粉碎；
f）益生菌孢子粉抽提：采用旋风分离集孢器进行抽提得到孢子粉，然后根据所需的含孢量，并在孢子粉中加入填充料，混合，再根据益生菌孢子粉的配方将细菌和真菌孢子粉按重量比例为8:2~5:5进行混合过筛得到益生菌孢子粉；
g）益生菌孢子粉成品质检及包装。
进一步，步骤a）中的茄子瓶培养基和种子扩大培养的培养基在121℃，0.1MPa灭菌15~20min，固态发酵培养基在90~95℃，灭菌60~80min，备用。
进一步，步骤b)中益生菌活化培养条件为：细菌在32±1℃静置培养24h，真菌在25±1℃静置培养48h。
进一步，步骤c)中菌悬液含菌量采用血球计数板直接计数法进行计数。
优选，步骤c)中细菌的培养时间为24~28h，真菌的培养时间为48~56h。
进一步，步骤d)中的发酵罐为集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器, 简称卧式固态生物反应器，所述卧式固态生物反应器为双锥圆筒卧式固态生物反应器，卧式固态生物反应器带有双向S型螺旋搅拌桨；卧式固态生物反应器顶部依次设有料液进口、排气口、压力表和进气口，卧式固态生物反应器底部设有排污口，卧式固态生物反应器前端右上侧设有进料口，卧式固态生物反应器前端左下侧设有出料口，进料口和出料口均设有视窗；卧式固态生物反应器外侧设有夹套，夹套的下侧设有进水口，夹套的上侧设有出水孔；卧式固态生物反应器中部连有湿度计、pH计、溶氧电极和温度计。
进一步，步骤d)~g)中物料的含菌量的检测方法为：用500m1或250ml三角瓶装100ml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的营养液经高压灭菌冷却后，放待测益生菌孢子粉0.lg或孢子粉4mg，置于140rpm摇床上28℃±1℃培养24h，再用无菌水进行梯度稀释后，取样制片镜检，镜检时用血球计数板进行计数，记录每个中格发芽孢子(孢子膨胀比原孢大1倍或芽长度大于孢子半径的)与未发芽孢子数，含菌量(×108／g)= （4个中格孢子总数×4×10×稀释倍数）／100；
活菌率：物料的活菌率(%)=发芽孢子数／（发芽孢子数+未发芽孢子数）×100%。
进一步，步骤f) 益生菌孢子粉抽提操作为：先打开旋风分离集孢器的抽风机开关进行抽风，使集孢器内形成负压，然后打开进料口投入步骤e）所得的益生菌孢子粉，关闭进料口后，启动集孢器，用正、反方向交替搅拌扬孢6～8min，得到孢子粉，打开残渣出口，将残渣排出即可。
进一步，步骤b）~e）中的所述益生菌中的细菌为益生菌中的细菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和双歧杆菌(Bifidobacterium)中的一种或多种，益生菌中的真菌为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae Hansen)或/和米曲霉(Aspergillus Orvzae)。
进一步，该方法发酵得到的益生菌孢子粉以0.05~0.15%的剂量添加到兽禽类饲料，或以0.10~0.20%的剂量添加到兽禽饮水中。
本发明一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法的有益效果：
1）方法采用固态发酵制备益生菌孢子粉，降低了生产过程中杂菌的污染率，发酵过程能耗低；
2）固态发酵过程采用稻壳和麦麸作为培养基，在发酵结束后还可以作为益生菌的吸附载体，减少益生菌孢子粉制备过程中填充料的用量；
3）产物浓度高，提取工艺简单；
4）整个生产过程零废液排放；
5）该方法采用集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器，简化操作工序，缩短了生产周期，节约能耗，提高生产效率；
附图说明
图1---为本发明一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法采用的集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
参照图1：集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器（简称卧式固态生物反应器）1，为双锥圆筒卧式固态生物反应器，公称容积为3000L，装料系数为0.6~0.70；卧式固态生物反应器1带有双向S型螺旋搅拌桨1-1；卧式固态生物反应器1顶部依次设有料液进口1-2、排气口1-3、压力表1-4和进气口1-5，卧式固态生物反应器1底部设有排污口1-6，卧式固态生物反应器1前端右上侧设有进料口1-7，卧式固态生物反应器1前端左下侧设有出料口1-8，进料口1-7和出料口1-8均设有视窗1-9；卧式固态生物反应器1外侧设有夹套1-10，夹套1-10的下侧设有进水口1-101，夹套110的上侧设有出水孔1-102；卧式固态生物反应器1中部连有湿度计、pH计、溶氧电极和温度计。
物料的含菌量的检测方法为：用500m1或250ml三角瓶装100ml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的营养液经高压灭菌冷却后，放待测益生菌孢子粉0.lg或孢子粉4mg，置于140rpm摇床上28℃±1℃培养24h，再用无菌水进行梯度稀释后，取样制片镜检，镜检时用血球计数板进行计数，记录每个中格发芽孢子(孢子膨胀比原孢大1倍或芽长度大于孢子半径的)与未发芽孢子数，含菌量(×108／g)= （4个中格孢子总数×4×10×稀释倍数）／100。
活菌率：物料的活菌率(%)=发芽孢子数／（发芽孢子数+未发芽孢子数）×100%。
物料湿度的测定方法：先将玻皿在120℃干燥箱内烘干，15min后取出称重(用万分之一的分析天平)，再称5g孢子粉于皿内，在l20℃干燥箱内定温烘2h，取出立即将样品和玻皿，一起称重，每个样品做三个重复，取其平均值， 按公式：物料湿度(％)=[（5-烘干后重量）／5] ×100%进行计算物料湿度。
实施例1：
a）培养基制备：
茄子瓶培养基：组成成分为马铃薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、琼脂2.0%、pH为7.0，121℃，0.1MPa灭菌15min，备用；
种子扩大培养的培养基：组成成分为米糠10%、花生粕5%、蛋白胨1.0%、蔗糖2%、琼脂2%，pH为6.5，121℃，0.1MPa灭菌20min，备用；
固体发酵培养基：由稻壳和麦麸组成，组成比例为3:7，固体培养基的含水率为60% wt，pH自然，95℃灭菌60min，备用；
b）益生菌菌种活化：将冷冻管中或斜面培养保存的枯草芽孢杆菌枯草亚种CICC20822（Bacillus subtilis subsp. subtilis）、植物乳杆菌CICC21790 (Lactobacillus plantarum) 以及酿酒酵母 CICC31830(Saccharomyces cerevisiae Hansen)转接至茄子瓶内静置培养，细菌在34±1℃静置培养24h，真菌在27℃±1℃静置培养48h；
c）益生菌种悬液的制备：将步骤b）培养好的细菌或真菌按1:100的接种量转接至种子罐中进行固态培养，罐压为0.05MPa，通风量为0.1vvm，搅拌速度为0.2rpm，细菌在34±1℃培养36h后转至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在1.15×107 cfu/g；真菌在27℃±1℃培养54h至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在3.0×106cfu/g；
d）益生菌固态发酵：
将灭菌好的固体发酵培养基放入集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器内，然后分别发酵步骤c)中的细菌和真菌;
将步骤c）得到的细菌菌悬液按固体发酵培养基的重量2.0%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.02MPa，通风量为0.2vvm，搅拌速度为1.0rpm，培养温度控制在34±1℃，物料湿度控制在56±1.0%，枯草芽孢杆菌枯草亚种在48h取样检测物料的含菌量时，含菌量为6.5×109cfu/g，活菌率为95.2%时，48h停止发酵；
相同发酵条件下，植物乳杆菌在46h取样检测物料的含菌量时，含菌量为7.2×109cfu/g，活菌率为96.4%时，46h停止发酵；
将步骤c）得到的酿酒酵母菌悬液按固体发酵培养基的重量4.0%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.02MPa，通风量为0.2vvm，搅拌速度为0.8rpm，培养温度为27±1℃，物料湿度控制在60±1.0%，酿酒酵母在58h取样检测物料的活菌量时，活菌量为6.5×108cfu/g，活菌率为96.7%时，58h停止发酵；
e）益生菌孢子粉干燥及粉碎:在发酵结束后，将发酵罐的温度调至60±1℃、搅拌速度调至5rpm，干燥12h后，孢子粉的含水率为11.70%，然后，通过提高搅拌速度至20rpm进行粉碎；
f）益生菌孢子粉抽提：采用旋风分离集孢器进行抽提得到孢子粉，先打开旋风分离集孢器的抽风机开关进行抽风，使集孢器内形成负压，然后打开进料口投入步骤e）所得的益生菌孢子粉，关闭进料口后，启动集孢器，用正、反方向交替搅拌扬孢6～8min，得到孢子粉，打开残渣出口，将残渣排出即可；然后根据所需的含孢量，在抽提得到的孢子粉中加入填充料，混合，然后将细菌和真菌的孢子粉按重量5:5进行混合得到益生菌孢子粉；
g）益生菌成品质检及包装：对益生菌孢子粉的含菌量、活菌率及含水率进行检测，并将益生菌孢子粉按规定规格进行包装，包装袋内应放孢子粉使用说明书，包装外贴有标签。标签内容包括益生菌孢子粉的含菌量、活菌率及含水率、细度、生产日期、检验人、使用方法、毛重、净重、有效期等。
通过该生产方法得到含4.55×1010cfu/g枯草芽孢杆菌枯草亚种、5.13×1010cfu/g植物乳杆菌和5.21×109cfu/g酿酒酵母，含水率为11.70%的益生菌孢子粉。
实施例2：
a）培养基制备：
茄子瓶培养基：葡萄糖改用蔗糖，其他同实施例1；
种子扩大培养的培养基：组成成分为麦麸7%、豆粕3.0%、蛋白胨0.7%、蔗糖2%、琼脂2%，pH为7.0，121℃，0.1MPa灭菌20min，备用；
固体发酵培养基：由稻壳和麦麸组成，组成比例为5:5，固体培养基的含水率为50% wt，pH自然，90℃灭菌80min，备用；
b）益生菌菌种活化：将冷冻管中或斜面培养保存的枯草芽孢杆菌枯草亚种CICC20822（Bacillus subtilis subsp. subtilis）以及酿酒酵母CICC31380 (Saccharomyces cerevisiae Hansen)和米曲霉CICC41383(Aspergillus Orvzae)转接至茄子瓶内静置培养，细菌在39±1℃静置培养24h，真菌在25℃±1℃静置培养48h；
c）益生菌种悬液的制备：将步骤b）培养好的细菌或真菌按1:80的接种量转接至种子罐中进行固态培养，罐压为0.05MPa，通风量为0.2vvm，搅拌速度为0.2rpm，细菌在39±1℃培养24h后转至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在1.5×107 cfu/g；真菌在25℃±1℃培养60h至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在5.0×106 cfu/g；
d）益生菌固态发酵：
将灭菌好的固体发酵培养基放入集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器内，然后分别发酵步骤c)中的细菌和真菌；
将步骤c）得到的枯草芽孢杆菌枯草亚种菌悬液按固体发酵培养基的重量1.0%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.03MPa，通风量为0.25vvm，搅拌速度为1.2rpm，培养温度控制在39±1℃，物料湿度控制在65±1.0%，枯草芽孢杆菌枯草亚种52h取样检测物料的含菌量时，含菌量为8.4×109cfu/g，活菌率为95.8%时，52h停止发酵；
将步骤c）得到的真菌菌悬液按固体发酵培养基的重量2.0%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.03MPa，通风量为0.23vvm，搅拌速度为1.0rpm，培养温度为25±1℃，物料湿度控制在57±1.0%，酿酒酵母在61h取样检测物料的含菌量时，含菌量为6.9×108cfu/g，活菌率为96.1%时，61h停止发酵；
相同发酵条件下，米曲霉在65h取样检测物料的活菌量时，活菌量为6.5×108cfu/g，活菌率为97.3%时，65h停止发酵；
e）益生菌孢子粉干燥及粉碎:在发酵结束后，将发酵罐的温度调至60±1.0℃、搅拌速度调至5rpm，干燥8h后，孢子粉的含水率为11.45%，然后，通过提高搅拌速度至15rpm进行粉碎；
f）益生菌孢子粉抽提：同实例1，然后将细菌和真菌的孢子粉按重量6:4进行混合得到益生菌孢子粉；
g）益生菌成品质检及包装：同实例1。
通过该生产方法得到含5.89×1010cfu/g枯草芽孢杆菌枯草亚种、5.92×109cfu/g酿酒酵母和5.21×109cfu/g米曲霉，含水率为11.45%的益生菌孢子粉。
实施例3：
a）培养基制备：
茄子瓶培养基：同实施例1；
种子扩大培养的培养基：组成成分为麦麸10%、豆粕5.0%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、琼脂2%，pH为6.8，121℃，0.1MPa灭菌20min，备用；
固体发酵培养基：由稻壳和麦麸组成，组成比例为4:6，固体培养基的含水率为55% wt，pH自然，92℃灭菌70min，备用；
b）益生菌菌种活化：将冷冻管中或斜面培养保存的枯草芽孢杆菌枯草亚种CICC20822（Bacillus subtilis subsp. subtilis）、植物乳杆菌CICC21790(Lactobacillus plantarum)和双歧杆菌CICC6185(Bifidobacterium Breve)以及酿酒酵母CICC31380 (Saccharomyces cerevisiae Hansen)和米曲霉CICC41383(Aspergillus Orvzae)转接至茄子瓶内静置培养，细菌在36±1℃静置培养24h，真菌在28℃±1℃静置培养48h；
c）益生菌种悬液的制备：将步骤b）培养好的细菌或真菌按1:50的接种量转接至种子罐中进行固态培养，罐压为0.05MPa，通风量为0.2vvm，搅拌速度为0.15rpm，细菌在36±1℃培养28h后转至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在1.30×107 cfu/g；真菌在28℃±1℃培养48h至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在4.50×106 cfu/g；
d）益生菌固态发酵：
将灭菌好的固体发酵培养基放入集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器内，然后分别发酵步骤c)中的细菌和真菌；
将步骤c）得到的细菌菌悬液按固体发酵培养基的重量1.5%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.05MPa，通风量为0.23vvm，搅拌速度为0.8rpm，培养温度控制在36±1℃，物料湿度控制在60±1.0%，枯草芽孢杆菌枯草亚种在52h取样检测物料的含菌量时，含菌量为6.7×109cfu/g，活菌率为95.6%时，52h停止发酵；
相同发酵条件下，植物乳杆菌在45h取样检测物料的含菌量时，含菌量为5.95×109cfu/g，活菌率为97.5%时，45h停止发酵；
相同发酵条件下，双歧杆菌在50h取样检测物料的含菌量时，含菌量为7.35×109cfu/g，活菌率为96.3%时，50h停止发酵；
将步骤c）得到的真菌菌悬液按固体发酵培养基的重量3.0%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.05MPa，通风量为0.25vvm，搅拌速度为0.8rpm，培养温度为28℃±1℃，物料湿度控制在64±1.0%，酿酒酵母在61h取样检测物料的含菌量时，含菌量为6.45×108cfu/g，活菌率为97.0%时，61h停止发酵；
相同发酵条件下，米曲霉在65h取样检测物料的活菌量时，活菌量为5.80×108cfu/g，活菌率为97.8%时，65h停止发酵；
e）益生菌孢子粉干燥及粉碎:在发酵结束后，将发酵罐的温度调至60±1.0℃、搅拌速度调至5rpm，干燥10h后，孢子粉的含水率为11.85%，然后，通过提高搅拌速度至18rpm进行粉碎；
f）益生菌孢子粉抽提：同实例1，然后将细菌和真菌的孢子粉按重量8:2进行混合得到益生菌孢子粉；
g）益生菌成品质检及包装：同实例1。
通过该生产方法得到含4.69×1010cfu/g枯草芽孢杆菌枯草亚种、4.16×1010cfu/g植物乳杆菌、5.27×1010cfu/g双歧杆菌、5.13×109cfu/g酿酒酵母和4.78×109cfu/g米曲霉，含水率为11.85%的益生菌孢子粉。
实施例4：
a）培养基制备：
茄子瓶培养基：葡萄糖改用蔗糖，其他同实施例1；
种子扩大培养的培养基：组成成分为麦麸7%、豆粕3.0%、蛋白胨0.7%、蔗糖2%、琼脂2%，pH为7.0，121℃，0.1MPa灭菌20min，备用；
固体发酵培养基：由稻壳和麦麸组成，组成比例为5:5，固体培养基的含水率为50% wt，pH自然，90℃灭菌80min，备用；
b）益生菌菌种活化：将冷冻管中或斜面培养保存的枯草芽孢杆菌枯草亚种CICC20822（Bacillus subtilis subsp. subtilis）、植物乳杆菌CICC21790(Lactobacillus plantarum)、双歧杆菌CICC6185(Bifidobacterium Breve)以及米曲霉CICC41383(Aspergillus Orvzae)转接至茄子瓶内静置培养，细菌在37±1℃静置培养24h，真菌在30℃±1℃静置培养48h；
c）益生菌种悬液的制备：将步骤b）培养好的细菌或真菌按1:60的接种量转接至种子罐中进行固态培养，罐压为0.05MPa，通风量为0.15vvm，搅拌速度为0.10rpm，细菌在37±1℃培养26h后转至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在1.35×107 cfu/g；真菌在30℃±1℃培养44h至适量的无菌水中，并采用血球计数板直接计数法进行计数，使菌悬液含菌量在4.75×106 cfu/g；
d）益生菌固态发酵：
将灭菌好的固体发酵培养基放入集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器内，然后分别发酵步骤c)中的细菌和真菌；
将步骤c）得到的细菌菌悬液按固体发酵培养基的重量1.2%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.04MPa，通风量为0.22vvm，搅拌速度为1.2rpm，培养温度控制在37±1℃，物料湿度控制在62±1.0%，枯草芽孢杆菌枯草亚种48h取样检测物料的含菌量时，含菌量为8.7×109cfu/g，活菌率为96.5%时，48h停止发酵；
相同发酵条件下，植物乳杆菌在46h取样检测物料的含菌量时，含菌量为7.85×109cfu/g，活菌率为96.8%时，46h停止发酵；
相同发酵条件下，双歧杆菌在52h取样检测物料的含菌量时，含菌量为6.94×109cfu/g，活菌率为97.1%时，52h停止发酵；
将步骤c）得到的米曲霉菌悬液按固体发酵培养基的重量2.5%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.04MPa，通风量为0.23vvm，搅拌速度为0.8rpm，培养温度为30±1℃，物料湿度控制在65±1.0%，米曲霉在62h取样检测物料的活菌量时，活菌量为7.15×108cfu/g，活菌率为96.4%时，62h停止发酵；
e）益生菌孢子粉干燥及粉碎:在发酵结束后，将发酵罐的温度调至60±1.0℃、搅拌速度调至5rpm，干燥8h后，孢子粉的含水率为11.27%，然后，通过提高搅拌速度至15rpm进行粉碎；
f）益生菌孢子粉抽提：同实例1，然后将细菌和真菌的孢子粉按重量6:4进行混合得到益生菌孢子粉；
g）益生菌成品质检及包装：同实例1。
通过该生产方法得到含6.09×1010cfu/g枯草芽孢杆菌枯草亚种、5.47×1010cfu/g植物乳杆菌、4.95×1010cfu/g双歧杆菌和5.36×109cfu/g米曲霉，含水率为11.27%的益生菌孢子粉。
Claims (9)
1.一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）培养基制备：
茄子瓶培养基：组成成分为马铃薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖或蔗糖2%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、琼脂1.5~2%、pH为6.5~7.0；
种子扩大培养的培养基：组成成分为米糠7~10%或麦麸2~10%、花生粕或豆粕2~5%、蛋白胨0.5~1.0%、蔗糖2%、琼脂2%，pH为6.0~7.0；
固体发酵培养基：由稻壳和麦麸组成，组成比例为3:7~5:5，固体培养基的含水率为50% wt～60% wt，pH自然；
b）益生菌菌种活化：将冷冻管中的菌体或斜面培养保存的菌种转接至茄子瓶内培养；
c）益生菌种悬液的制备：将步骤b）培养好的细菌或真菌按1:100~1:50的接种量转接至种子罐中进行固态培养，罐压为0.05MPa，通风量为0.1~0.2vvm，搅拌速度为0.1~0.2rpm，细菌在34~39℃培养24~36h后转至适量的无菌水中，使菌悬液含菌量在1.0~1.5×107cfu/g；真菌在25~30℃培养44~60h至适量的无菌水中，使菌悬液含菌量在3.0~5.0×106cfu/g；
d）益生菌固态发酵培养：
将步骤c）得到的细菌菌悬液按固体发酵培养基的重量1~2%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.02~0.05MPa，通风量为0.2~0.25vvm，搅拌速度为0.8~1.2rpm，培养温度为34~39℃，物料湿度控制在55~65%，45~55h内每2h取样检测物料的含菌量，当含菌量≥5.0×109cfu/g且活菌率高于95%时，停止发酵；
将步骤c）得到的真菌菌悬液按固体发酵培养基的重量2~4%转接至固体发酵培养基中，罐压为0.02~0.05MPa，通风量为0.2~0.25vvm，搅拌速度为0.8~1.2rpm，培养温度为25~30℃，物料湿度控制在55~65%，57~66h内每2h取样检测物料的活菌量，当活菌量≥5.0×108cfu/g且活菌率高于95%时，停止发酵；
e）益生菌孢子粉干燥及粉碎:在发酵结束后，将发酵罐的温度调至60℃、搅拌速度调至3~5rpm，干燥至孢子粉的含水率低于12%，并通过提高搅拌速度进行粉碎；
f）益生菌孢子粉抽提：采用旋风分离集孢器进行抽提得到孢子粉，然后根据所需的含孢量，并在孢子粉中加入填充料，混合，再根据益生菌孢子粉的配方将细菌和真菌孢子粉按重量比例为8:2~5:5进行混合过筛得到益生菌孢子粉；
g）益生菌孢子粉成品质检及包装；
步骤d)中所述的发酵罐为集发酵、干燥粉碎为一体的卧式固态生物反应器，简称卧式固态生物反应器，所述卧式固态生物反应器为双锥圆筒卧式固态生物反应器，卧式固态生物反应器带有双向S型螺旋搅拌桨；卧式固态生物反应器顶部依次设有料液进口、排气口、压力表和进气口，卧式固态生物反应器底部设有排污口，卧式固态生物反应器前端右上侧设有进料口，卧式固态生物反应器前端左下侧设有出料口，进料口和出料口均设有视窗；卧式固态生物反应器外侧设有夹套，夹套的下侧设有进水口，夹套的上侧设有出水孔；卧式固态生物反应器中部连有湿度计、pH计、溶氧电极和温度计。
2.如权利要求1所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，其特征在于，所述步骤a）中的茄子瓶培养基和种子扩大培养的培养基在121℃，0.1MPa灭菌15~20min，固态发酵培养基在90~95℃，灭菌60~80min，备用。
3.如权利要求1所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，步骤b)中所述的益生菌活化培养条件为：细菌在32±1℃静置培养24h，真菌在25±1℃静置培养48h。
4.如权利要求1所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，步骤c)中所述的菌悬液含菌量采用血球计数板直接计数法进行计数。
5.如权利要求1所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，所述步骤c)中细菌的培养时间为24~28h，真菌的培养时间为48~56h。
6.如权利要求1所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，所述步骤d)~g)中物料的含菌量的检测方法为：用500m1或250ml三角瓶装100ml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的营养液经高压灭菌冷却后，放待测益生菌孢子粉0.lg或孢子粉4mg，置于140rpm摇床上28℃±1℃培养24h，再用无菌水进行梯度稀释后，取样制片镜检，镜检时用血球计数板进行计数，记录每个中格发芽孢子(孢子膨胀比原孢大1倍或芽长度大于孢子半径的)与未发芽孢子数，含菌量(×108／g)= （4个中格孢子总数×4×10×稀释倍数）／100；
活菌率：物料的活菌率(%)=发芽孢子数／（发芽孢子数+未发芽孢子数）×100%。
7.如权利要求1所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，步骤f) 所述的益生菌孢子粉抽提操作为：先打开旋风分离集孢器的抽风机开关进行抽风，使集孢器内形成负压，然后打开进料口投入步骤e）所得的益生菌孢子粉，关闭进料口后，启动集孢器，用正、反方向交替搅拌扬孢6～8min，得到孢子粉，打开残渣出口，将残渣排出即可。
8.如权利要求1~7任一项所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，其特征在于，步骤b）~e）中的所述益生菌中的细菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和双歧杆菌(Bifidobacterium)中的一种或多种，益生菌中的真菌为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae Hansen)或/和米曲霉(Aspergillus Orvzae)。
9.如权利要求1~7任一项所述一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法，其特征在于，所述方法发酵得到的益生菌孢子粉以0.05~0.15%的剂量添加到兽禽类饲料，或以0.10~0.20%的剂量添加到兽禽饮水中。
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