CN103060247A - 调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调整禽畜肠道菌群结构的益生菌及其制备方法，是由产朊假丝酵母、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌等6种菌组成，经过三级液体发酵，再将扩大培养发酵菌液与饲料麦麸均匀混合，进行固体发酵，低温干燥而制备的调整禽畜肠道菌群结构的益生菌菌剂。该菌剂能调整禽畜肠道菌群结构，促进益生菌生长，抑制有害菌生长，可以取代抗生素，提高饲料利用率，明显降低禽畜排泄物的臭味，改善养殖生态环境和周边环境，高效、无毒、无残留。可广泛应用于禽畜饲料添加剂，预防禽畜肠道疾病和呼吸道疾病。

Description

调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂及制备方法
技术领域
    本发明涉及一种调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂及制备方法，具体说，是一种调整禽畜肠道菌群结构、取代抗生素预防禽畜肠道疾病及呼吸道疾病的益生菌菌剂及其制备方法。
背景技术
现在已有不少关于养殖业为了防止禽畜发病滥用抗生素、滥用兽药的报道，不仅养殖成本增加，而且导致牛奶、鸡蛋和各种肉产品品质下降，不健康风险增加、严重影响养殖业的持续发展。但是，在养殖业中由于多是集约式养殖，养殖环境和周边环境质量差，禽畜容易产生呼吸道、肠道疾病，市场迫切需要一种无残留、无毒性、成本低的饲料添加剂，取代抗生素、有害兽药，以保证养殖禽畜健康生长，从而提高禽畜产品的品质和质量。益生菌菌剂正是无残留、无毒性，以调整禽畜肠道菌群结构为目标，而达到预防肠道疾病和呼吸道疾病的目的。在养殖周期内，除了必要的免疫外，可以不用抗生素和兽药。  
发明内容
本发明的目的是提供一种调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂及制备方法，该菌剂能调整禽畜肠道菌群结构，促进益生菌生长，抑制有害菌生长，可以提高饲料利用率，能明显降低禽畜排泄物的臭味，改善养殖生态环境和周边环境，高效、无毒、无残留，能广泛应用于禽畜饲料添加剂，预防禽畜肠道疾病和呼吸道疾病。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：这种调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂，由产朊假丝酵母（Candida utilis）、粪链球菌（Streptococcus feacalis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）6种菌组成，经过三级液体发酵，再将扩大培养发酵菌液与麦麸均匀混合，经固体发酵，低温干燥而制备的调整禽畜肠道菌群结构的益生菌菌剂。
这种调整禽畜肠道菌群益生菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
（1）按微生物发酵工程工艺，先将斜面保存产朊假丝酵母菌种用马铃薯培养基PDA活化，经三级逐级扩大培养，制备成产朊假丝酵母的一级种子菌液；同理，粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌5种细菌分别用牛肉膏蛋白胨培养基活化，经过三级逐级扩大培养，制备成粪链球菌等5种细菌的一级种子菌液；
（2）将产朊假丝酵母和粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌5种细菌的一级种子菌液用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基进行二级、三级扩大培养；
所述二级扩大培养条件： 将热带假丝酵母和粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌5种细菌的一级种子液等体积混合，按接种量质量比1:10 的6种菌的一级种子混合菌液，温度30℃，转速100-200r/min，,压力0.05MPa，发酵20-24h， 在无菌条件下抽取10mL发酵液，稀释100倍，检查波长660nm吸光值OD，OD达到0.6-0.8后，再转入三级扩大培养阶段；
所述三级扩大培养条件：按接种量质量比1:10二级扩大培养液，温度28-30℃，转速200-300r/min，压力0.05MPa，发酵20-24h, 抽取10mL发酵液，稀释100倍，检查波长660nmOD值，OD达到0.6-0.8后，停止培养，有效菌菌落数用平板稀释法在1*1010cfu.mL-1以上，cfu-菌落数。
这种调整禽畜肠道菌群益生菌菌剂的制备方法，所述玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基组成按质量份数为：玉米粉20-30份，豆粕1-2份，马铃薯10-20份，蔗糖2份，氯化钠0.5份，磷酸氢二钾0.5份，硝酸钾10份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.002份，自来水1000份，用过饱和氢氧化钙调节pH值7.4-7.6。
这种调整禽畜肠道菌群益生菌菌剂的制备方法，所述菌剂所用菌种安全、可靠，购买于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，都是农业部饲料添加剂允许使用菌种。发酵生产过程中全部用不锈钢发酵罐完成，无废气、废物、废水产生，无重金属污染。产品作为饲料添加剂，符合农业部有关饲料添加剂的标准要求。
本发明的有益效果是：这种微生物菌剂高效、无毒、无残留，能广泛应用于禽畜饲料添加剂，预防禽畜肠道疾病和呼吸道疾病。实验发现，该益生菌菌剂中，产朊假丝酵母与粪链球菌配合，还有降解饲料中黄曲霉毒素、烟曲霉毒素、呕吐毒素和玉米霉烯酮等霉菌毒素的效果。该菌剂能调整禽畜肠道菌群结构，促进益生菌生长，抑制有害菌生长，所以，可以提高饲料利用率，能明显降低禽畜排泄物的臭味，改善养殖生态环境和周边环境。 该产品是有效菌的活性菌剂。有效菌菌落数达到1*1010cfu.g-1，符合农业部有关饲料添加剂的标准要求。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
菌剂的制备：
1、按微生物发酵工程常规工艺，先将斜面保存产朊假丝酵母菌种用马铃薯培养基活化，经试管（约10mL）-三角瓶（约100mL）-大三角瓶（约1000mL）逐级扩大培养，制备成产朊假丝酵母的一级种子菌液；同理粪链球菌等5种细菌分别用牛肉膏蛋白胨培养基活化，经过试管-三角瓶-大三角瓶逐级扩大培养，制备成粪链球菌等5种细菌的一级种子菌液。
2、将产朊假丝酵母和粪链球菌等5种细菌的一级种子菌液用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养液进行二级、三级扩大培养。
3、二级扩大培养条件（30L发酵罐）：将产朊假丝酵母和粪链球菌等6种的一级种子液等体积混合（1:1:1:1:1:1），接种量质量比1:10的6种菌的一级种子混合菌液，温度30℃，转速100-200r/min,压力0.05Mpa，发酵20-24h，在无菌条件下，抽取10mL发酵液，稀释100倍，检查波长660nm吸光值（OD），OD达到0.6-0.8后，再转入三级扩大培养阶段。
4、三级扩大培养条件（300L发酵罐）：接种量质量比1:10二级扩大培养液，温度30℃，转速200-300r/min,压力0.05Mpa，发酵20-24h, 在无菌条件下，抽取10mL发酵液，稀释100倍，检查波长660nm吸光值，达到0.6-0.8后，停止培养。有效菌菌落数1*1010cfu.mL-1以上（平板稀释法）。
所述牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏5g,蛋白胨10g，氯化钠5g,蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4.
所述马铃薯培养基（PDA）配方：马铃薯200g,去皮、去残，切成碎片或丝，加水1000mL，小火煮20-30min,过滤，滤液补足1000mL，加入20g蔗糖，自然pH值。
所述玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基配方：玉米粉20-30g,豆粕1-2g，马铃薯10-20g（去皮、去残），蔗糖2g，氯化钠0.5g,磷酸氢二钾0.5g,硝酸钾10g，硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.002g,自来水1000mL,用过饱和氢氧化钙调节pH值7.4-7.6.
     5、固体发酵
将上述三级液体扩大培养的菌液，以质量比为1:20加于饲料麦麸上，在转筒内边搅拌边混合，混合均匀后，在28-30℃，转筒1-2r/min条件下，发酵24-48h,取样检查菌落数达到1*1010cfu.mL-1以上要求后，在40-45℃下，低温干燥20-24h.测定含水率达20%，合格后，分装于具聚乙烯内衬的包装袋内，防潮、防暴晒，室温保存。有效期暂定1年。
所述粪链球菌(Streptococcus feaculis,ACCC10180)，产朊假丝酵母（Candida tropicalis,ACCC20059）,枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis,ACCC10619）,纳豆芽孢杆菌（Bucillus natto,ACCC10614）,植物乳杆菌（Lactoacillus plantarum,ACCC11016）,沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonasplustris,ACCC10649）等6株菌菌种均购于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心（ACCC）。
所述产朊假丝酵母-粪链球菌等6株菌组成的固体菌剂的制备：
1、按微生物发酵工程工艺，先将斜面保存产朊假丝酵母菌种用马铃薯培养基（PDA）活化，经三级逐级扩大培养，制备成热带假丝酵母的一级种子菌液；同理，粪链球菌等5株细菌分别用牛肉膏蛋白胨培养基活化，经过三级逐级扩大培养，制备成粪链球菌等5种细菌的一级种子菌液。
所述马铃薯培养基（PDA）配方：马铃薯200g,去皮、去残，切成碎片或丝，加水1000mL，小火煮20-30min,过滤，滤液补足1000mL，加入20g蔗糖，自然pH值。
所述牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏5g,蛋白胨10g，氯化钠5g,蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4.
2、将热带假丝酵母与粪链球菌等6株细菌的一级种子各菌液等体积混合，用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基进行二级、三级扩大培养；
所述二级扩大培养条件：将热带假丝酵母和粪链球菌等6种的一级种子液等体积混合，按接种量质量比1:10的6种菌的一级种子混合菌液，温度30℃，转速100-200r/min,压力0.05MPa，发酵20-24h,检查660nm波长吸光值，吸光值达到0.6-0.8后，再转入三级扩大培养阶段；
所述三级扩大培养条件：按接种量质量比1:10二级扩大培养液，温度30℃，转速200-300r/min,压力0.05MPa，发酵20-24h,检查660nm波长吸光值，吸光值达到0.6-0.8后，停止培养,有效菌菌落数1*1010cfu.mL-1以上。
3、根据权利要求2所述的益生菌的制备方法，其特征在于，所述玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基组成按质量份数为：玉米粉20-30份,豆粕1-2份，马铃薯10-20份，蔗糖2份，氯化钠0.5份,磷酸氢二钾0.5份,硝酸钾10份，硫酸镁0.5份,硫酸亚铁0.002份,自来水1000份，用过饱和氢氧化钙调节pH值7.4-7.6。
4、固体发酵过程
将上述三级液体扩大培养的菌液，以质量比为1:20加于饲料麦麸上，在转筒内边搅拌边混合，混合均匀后，在28-30℃，转筒1-2r/min条件下，发酵24-48h,取样检查菌落数达到1*1010cfu.mL-1以上要求后，在40-45℃下，低温干燥20-24h.测定含水率达20%，合格后，分装于具聚乙烯内衬的包装袋内，防潮、防暴晒，室温保存。有效期暂定1年。
实施例1：
1、先将斜面保存产朊假丝酵母菌种用马铃薯培养基（PDA）活化，经三级逐级扩大培养，制备成产朊假丝酵母的一级种子菌液；同理，粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌等5种细菌分别用牛肉膏蛋白胨培养基活化，经过三级逐级扩大培养，制备成粪链球菌等5种细菌的一级种子菌液（共5000mL），在无菌条件下转 入  二级发酵扩大培养。
2、二级扩大培养用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基，共60L，在30℃，转速100-200r/min,0.05Mpa条件下，发酵24h；在无菌条件下取样检查，抽取10mL发酵液，稀释100倍，在波长660nm下测定吸光值（OD），OD值达到0.5-0.7后，转入三级扩大培养。
3、三级扩大培养扩大到600L，用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基培养，将二级扩大培养的菌液以质量比1:10转入三级扩大培养液，在30℃，转速200-300r/min,0.05Mpa条件下，发酵24h；在无菌条件下取样检查，抽取10mL发酵液，稀释100倍，在波长660nm下测定吸光值（OD），OD值达到0.6-0.8后，转入固体发酵阶段。
所述玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基组成按质量份数为：玉米粉20-30份,豆粕1-2份，马铃薯10-20份，蔗糖2份，氯化钠0.5份,磷酸氢二钾0.5份,硝酸钾10份，硫酸镁0.5份,硫酸亚铁0.002份,自来水1000份，用过饱和氢氧化钙调节pH值7.4-7.6。
4、固体发酵，将三级液体扩大培养的菌液以质量比1:20加入到饲料麦麸上，在转筒内边加边转动，使菌液与麦麸充分混合，在30℃，转筒1-2r/min条件下，发酵48h,取样检查菌落数达到1*1010cfu.mL-1以上要求后，在45℃下，低温干燥20-24h.测定含水率达20%，合格后，分装于具聚乙烯内衬的包装袋内，防潮、防暴晒，室温保存。有效期暂定1年。
实施例2：
1、同实施例1一样将产朊假丝酵母与粪链球菌等6种菌分别逐级活化、扩大培养后，将各菌的菌液等体积混合，作为一级发酵种子液（共5400mL），在无菌条件下转入二级发酵扩大培养。
2、二级扩大培养用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基，共50L，在30℃，转速100-200r/min,0.05Mpa条件下，发酵24h；在无菌条件下取样检查，抽取10mL发酵液，稀释100倍，在波长660nm下测定吸光值（OD），OD值达到0.5-0.7后，转入三级扩大培养。
3、三级扩大培养扩大到500L，用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基培养，将二级扩大培养的菌液转入三级扩大培养液，在30℃，转速200-300r/min,0.05Mpa条件下，发酵24h；在无菌条件下取样检查，抽取10mL发酵液，稀释100倍，在波长660nm下测定吸光值（OD），OD值达到0.6-0.8后，转入固体发酵阶段。
4、固体发酵，将三级液体扩大培养的菌液以质量比1:20加入到饲料麦麸上，在转筒内边加边转动，使菌液与麦麸充分混合，在30℃，转筒1-2r/min条件下，发酵40h,取样检查菌落数达到1*1010cfu.mL-1以上要求后，在45℃下，低温干燥24h.测定含水率达20%，合格后，分装于具聚乙烯内衬的包装袋内，防潮、防暴晒，室温保存。有效期暂定1年。
本发明制备的益生菌菌剂的特性和特点：
1、用益生菌调整禽畜肠道菌群结构，促进有益菌生长，抑制有害菌滋生，提高鸡群免疫力，预防肠道疾病和呼吸道疾病。在整个饲养周期内不使用抗生素，促进禽畜群健康生长。
2、由于益生菌降解了饲料抗性因子和饲料中霉菌毒素，所以可以提高饲料的转化、利用率，便于养殖禽畜对饲料的养分吸收，提高饲料利用率8%-12%。
3、益生菌在禽畜道内降解了含氮、含硫化合物，所以禽畜的排泄物含氨量明显减少，养殖场（舍）内臭味显著减弱，改善养殖场（舍）和周边的生态环境，进一步预防禽畜群呼吸道疾病。
4、由于禽畜群茁壮、健康生长，无须使用抗生素和兽药，产肉、产蛋率必然提高，鸡蛋的硬度增加、亮度变光鲜，“软蛋”率、破损率减少。无抗生素残留、无药残留隐患，鸡蛋、肉质品质提高。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不以实施例来限定本发明的专利范围。
本发明使用菌种是通过中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心购得,购得的菌种包括：
    ACCClll619    Bacillussubtilis    枯草芽孢杆菌；
    ACCC 10614    Bacillusmttto    纳豆芽胞杆菌；
    ACCC 10649  Rhodol~seudomonaspalustris  沼泽红假单胞菌：
    ACCC 10180  Streptococcus和acalLv    粪链球菌；
    ACCC 11016  Lactobacilhtsphmtarum    植物乳杆菌；
    ACCC 20059    Candidaufilis    产朊假丝酵母。

Claims (4)

1.一种调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂，其特征在于：由产朊假丝酵母（Candida utilis）、粪链球菌（Streptococcus feacalis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）6种菌组成，经过三级液体发酵，再将扩大培养发酵菌液与麦麸均匀混合，经固体发酵，低温干燥而制备的调整禽畜肠道菌群结构的益生菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的调整禽畜肠道菌群益生菌菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）按微生物发酵工程工艺，先将斜面保存产朊假丝酵母菌种用马铃薯培养基（PDA）活化，经三级逐级扩大培养，制备成产朊假丝酵母的一级种子菌液；同理，粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌5种细菌分别用牛肉膏蛋白胨培养基活化，经过三级逐级扩大培养，制备成粪链球菌等5种细菌的一级种子菌液；
（2）将产朊假丝酵母和粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌5种细菌的一级种子菌液用玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基进行二级、三级扩大培养；
所述二级扩大培养条件： 将热带假丝酵母和粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌5种细菌的一级种子液等体积混合，按接种量质量比1:10 的6种菌的一级种子混合菌液，温度30℃，转速100-200r/min，,压力0.05MPa，发酵20-24h， 在无菌条件下抽取10mL发酵液，稀释100倍，检查波长660nm吸光值OD，OD达到0.6-0.8后，再转入三级扩大培养阶段；
所述三级扩大培养条件：按接种量质量比1:10二级扩大培养液，温度28-30℃，转速200-300r/min，压力0.05MPa，发酵20-24h, 抽取10mL发酵液，稀释100倍，检查波长660nmOD值，OD达到0.6-0.8后，停止培养，有效菌菌落数用平板稀释法在1*1010cfu.mL-1以上，cfu-菌落数。
3.根据权利要求2所述的调整禽畜肠道菌群益生菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述玉米粉-豆粕-马铃薯-蔗糖培养基组成按质量份数为：玉米粉20-30份，豆粕1-2份，马铃薯10-20份，蔗糖2份，氯化钠0.5份，磷酸氢二钾0.5份，硝酸钾10份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.002份，自来水1000份，用过饱和氢氧化钙调节pH值7.4-7.6。
4.根据权利要求2所述的调整禽畜肠道菌群益生菌菌剂的制备方法，其特征在于：发酵生产过程中全部用不锈钢发酵罐完成。
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