一种复合菌剂及其发酵餐厨垃圾制备有机液体肥料的应用
(一)技术领域
本发明涉及餐厨垃圾、废弃食品等有机废弃物的环保处理领域,特别涉及利用几种分泌不同酶的微生物,针对性的对餐厨垃圾底物进行降解,降解后的产物可以成为优质的肥料,应用于农业生产、园林绿化等。
(二)背景技术
在餐厨垃圾的危害日益突出的情况下,如何对餐厨垃圾进行有效的资源化、减量化、无害化处理,是面临的重点问题之一。
餐厨垃圾是丰富的有机质资源。我国餐厨垃圾主要包括米和面粉类食物残余、蔬菜、植物油、动物油、肉骨、鱼刺等,物理状成固液混合态,且相当粘稠;化学成分复杂,主要包括水、蛋白质、脂类、淀粉、纤维素和无机盐等,富含磷、氮、钙、钾及各种微量元素,这些营养成分可制作成优质的作物肥料,实现资源循环再利用。
利用微生物对餐厨垃圾进行分解转化生产有机肥是餐厨垃圾处理和资源化利用的有效方法,相关的专利较多(CN102018000311917,CN201110365608.0,CN201610962513.X,CN201611130234.3,CN201710187692.9,CN201710460386.8,CN201710520705.X,CN201710866093.X,CN201810203621.8,CN201711082487.2,CN201810349092.2)。但是,这些专利方法中,鲜有充分考虑餐厨垃圾底物特征和处理成本方面特点、有针对性的选用菌种并组成复合菌剂进行肥料化利用。我国餐厨垃圾理化特点是总有机质含量高于65%以上,其中淀粉含量高、油脂含量高、水分含量高。符瞰等研究报道某城市餐厨垃圾中粗蛋白、粗脂肪和粗纤维含量分别达到13.46%、 17.30%和6.56%(符瞰等,沿海旅游城市餐厨垃圾特性及处理方法分析,中国沼气, 2013,25(2):11-14)。因此,对餐厨垃圾高效资源化利用的微生物分解转化生产肥料过程中,选择对应的底物分解能力较强的菌种是关键,此外还应尽可能降低处理过程的耗能等成本。
好氧堆肥是餐厨垃圾处理和资源化利用的常用方式之一,但其需要好氧微生物,过程中需要翻堆,劳动力、能源等成本较高,而且发酵过程中会产生高温,不能用酵母等中低温菌发酵。
酵母菌可以在有氧和低氧甚至缺氧条件下都可以发酵有机物,广泛应用于食品、饲料等行业,也可以应用于有机废弃物的处理。乳酸菌为主要菌或组成菌制成的微生物制剂应用于秸秆腐熟、除臭、土壤改良等方面,在微生物肥料行业,以乳酸菌(主要是乳杆菌)作为有效菌的产品越来越多(杨小红,等.应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌[J].微生物学通报,2014,41(04):674-680.)。
因此,针对我国餐厨垃圾含油脂、蛋白、淀粉等比较高的特点,本发明利用降解脂肪能力较强解脂耶氏酵母,以及产朊假丝酵母等微生物产生丰富的水解酶,对餐厨垃圾进行高效分解,并利用厌氧能力强的乳酸菌进一步低成本发酵产生有机酸、氨基酸等液体肥料。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种复合菌剂及其发酵餐厨垃圾制备有机液体肥料的应用,本发明选用了几种特殊功能的酵母菌株并和乳酸菌配伍成复合菌种,充分利用各菌株产生不同的酶和对不同的氧气含量耐受性进行阶段协同发酵,从而对餐厨垃圾进行彻底降解,产生富含氨基酸、有机酸、矿质元素的有机液体肥。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种复合菌剂,所述复合菌剂由如下体积配比的菌悬液组成:解脂耶氏酵母菌菌悬液20~30份、葡萄牙棒孢酵母菌菌悬液10~20份、产朊假丝酵母菌菌悬液15~25份,植物乳杆菌菌悬液35~55份。
进一步,所述复合菌剂由如下体积配比的菌悬液组成:OD600值0.5~0.8的解脂耶氏酵母菌菌悬液20~30份、OD600值0.5~0.8的葡萄牙棒孢酵母菌菌悬液10~20份、 OD600值0.5~0.8的产朊假丝酵母菌菌悬液15~25份,OD600值0.3~0.6的植物乳杆菌菌悬液35~55份。
更进一步,优选所述复合菌剂由如下体积配比的菌悬液组成:OD600值0.8的解脂耶氏酵母菌菌悬液25份、OD600值0.8的葡萄牙棒孢酵母菌菌悬液15份、OD600值 0.8的产朊假丝酵母菌菌悬液15份,OD600值0.6的植物乳杆菌菌悬液45份。
更进一步,优选所述复合菌剂由如下体积配比的菌悬液组成:OD600值0.6的解脂耶氏酵母菌菌悬液20份、OD600值0.6的葡萄牙棒孢酵母菌菌悬液15份、OD600值 0.6的产朊假丝酵母菌菌悬液25份,OD600值0.4的植物乳杆菌菌悬液40份。
进一步,所述解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CICC32187,用于生产单细胞蛋白等;所述葡萄牙棒孢酵母为葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)CICC 32908,用于降解多糖等;所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母(Candidautilis)CICC 1768,生长速度快,用于发酵产生氨基酸、谷胱甘肽、核苷酸等。所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 21801,可以发酵果蔬、谷物制作乳酸菌菌剂等,厌氧发酵为主。
进一步,所菌悬液是将各自的发酵液离心,用无菌水或灭菌的YPD液体培养基配制成相应OD值的菌悬液。
进一步,所述菌悬液采用通常的酵母菌和乳酸菌培养条件,无特殊要求,优选按如下方法制备:
(1)菌种活化:
分别将解脂耶氏酵母,葡萄牙棒孢酵母,产朊假丝酵母接种至YPD固体培养基, 30℃条件下培养2天,分别获得各自活化菌体;
将植物乳杆菌接种至MRS固体培养基,35℃条件下培养4天,获得活化的菌体;
YPD液体培养基组成:葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,溶剂为去离子水,pH自然;YPD固体培养基是向YPD液体培养基加入琼脂粉15g/L;
MSR液体培养基组成:蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母膏5g/L,葡萄糖5g/L,乙酸钠5g/L,柠檬酸二胺2g/L,1g/L Tween 80,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L, MnSO4·H2O0.05g/L,CaCO3 20g/L,溶剂为去离子水,pH6.8,MSR固体培养基是向MSR液体培养基添加琼脂15g/L;
(2)种子培养:在无菌条件下,将步骤(1)活化的解脂耶氏酵母,葡萄牙棒孢酵母,产朊假丝酵母菌体分别接种至YPD液体培养基,30℃、150r/min摇床培养1 天,获得相应的酵母菌种子液;在无菌条件下,将步骤(1)活化的植物乳杆菌接种至MSR液体培养基,35℃条件下培养2天,获得植物乳杆菌种子液;
(3)发酵培养:按体积浓度10%的接种量,分别将步骤(2)各个酵母菌种子液和乳杆菌种子液各自接种至装有300L发酵培养基的500L发酵罐中;酵母菌发酵罐采用YPD液体培养基作为发酵培养基,在通气、30℃、150r/min条件下发酵培养24h,发酵液离心,沉淀用无菌水或灭菌的YPD液体培养基配制成OD600达到0.5~0.8的菌悬液,获得相应的酵母菌菌悬液;植物乳杆菌采用MSR液体培养基作为发酵培养基,在30℃条件下静置培养48-60h,每1h可以轻摇促进菌体和培养基混合,需要搅拌,但不需要通气,发酵液离心,沉淀用无菌水或灭菌的YPD液体培养基配制成OD600达到0.3~0.6的菌悬液,获得植物乳杆菌菌悬液。
本发明还提供一种复合菌剂在发酵餐厨垃圾制备有机液体肥料中的应用,所述的应用为:将餐厨垃圾制成浆液,加入复合菌剂,在25~35℃下搅拌发酵7~10天,成为半成熟液肥,继续贮存15~30天以后获得有机液体肥料;所述复合菌剂体积添加量以浆液体积计为1-2L/吨。
进一步,所述浆液按如下方法制备:将餐厨垃圾中不易分解和粉碎的物体,塑料、大骨头、筷子、勺子、碎玻璃、牙签等剔除后,粉碎至粒径小于等于3cm,然后利用制浆机进行制浆,获得固含量3-8%的浆液。
进一步,所述有机液肥中还可以根据不同作物、不同土壤、不同施肥方式等需求进行功能提升、剂型加工等处理,开发成系列有机肥料,比如添加有生物防治能力的植物病原菌抑菌剂,所述抑菌剂包括木霉、细黄链霉菌;所述100L有机液肥中添加 50~100g木霉孢子粉,所述木霉孢子粉活菌孢子数1x108/克以上。
发酵过程中,可以打开盖子观察颜色气味,如果有臭气,可以补加复合菌剂, 0.05~0.15L/50L桶。如果温度低于15℃,可以延长发酵时间至25天,获得有机液肥,总养分(N+P2O5+K2O)≥58.8g/L,有机质含量≥26.9g/L,可应用于蔬菜生产。
本发明通过浆泵把池内的有机垃圾浆液及渗滤液等操作环境中的混合物液体,分别输送到不同的发酵容器进行发酵。发酵容器可以是不锈钢容器、水泥池、塑料桶等,根据处理量和实际条件决定,容器进行普通的加盖封口就行,不需要密封。按照处理量的每个发酵容器处理的有机废弃物量以及发酵过程中气味(是否有臭气产生),还可以添加微生物菌剂,在餐厨垃圾的收运、存放等过程中,加入菌剂,酵母菌可以充分生长,发挥分解作用,同时还可以除臭,减少整个过程中的污染。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:
针对餐厨垃圾淀粉、脂肪、蛋白以及含水率高(氧气供应不足)的特点,本发明选择产淀粉酶、脂肪酶的酵母菌(在有氧和无氧的环境中都能生长,是兼性厌氧菌) 和乳酸菌(厌氧菌,产生有机酸、氨基酸)配伍形成复合菌,进行液体有机肥的生产。餐厨垃圾在收运、存放、预处理等阶段均可和复合菌剂混合。从发酵处理过程来看,分两个阶段。第一阶段,餐厨垃圾在收运、分拣等预处理过程中主要由酵母菌发酵,产生的不同酶系对餐厨垃圾底物进行分解。第二阶段,餐厨垃圾在厌氧条件下由乳酸菌作用进行进一步发酵产生有机酸、氨基酸、低分子可吸收营养物质、活性物质等。
餐厨垃圾经过本发明提供的组合菌种和发酵处理后,氨基酸态氮含量从1.86%提高到4.89%,比发酵前显著提高,并且富含酵母菌、乳酸菌等多种有益微生物及其分泌的营养物,作为液体肥料促进植物的吸收并提高养分水平。有机液体肥料中总蛋白的含量从发酵前21.08g/L提高到24.31g/L,氨基酸态氮含量从1.86%提高到4.89%,效果显著。总酵母菌数达7.89×1010cfu/mL,液体有机肥的总养分(N+P2O5+K2O)≥ 60g/L,有机质含量≥28.0g/L。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CICC 32187,购自中国工业微生物菌种保藏中心,菌株保藏编号CICC 32187;葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)CICC32908,购自中国工业微生物菌种保藏中心,菌株保藏编号CICC 32908;产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC 1768,购自中国工业微生物菌种保藏中心,菌株保藏编号 CICC1768;乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 21801,购自中国工业微生物菌种保藏中心,菌株保藏编号CICC 21801。
实施例1复合微生物菌剂处理餐厨垃圾制作液体有机肥
1、菌液培养
(1)菌种活化:
分别将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CICC 32187,葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)CICC 32908,产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC 1768接种至YPD固体培养基,30℃条件下培养2天,分别获得各自活化菌体;
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 21801接种至MRS固体培养基,35℃条件下培养4天,获得活化的菌体。
YPD液体培养基组成:葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,溶剂为去离子水,pH自然;YPD固体培养基是向YPD液体培养基加入琼脂粉15g/L。培养基在121℃下灭菌20min。
MSR液体培养基组成:蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母膏5g/L,葡萄糖5g/L,乙酸钠5g/L,柠檬酸二胺2g/L,1g/L Tween 80,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L, MnSO4·H2O0.05g/L,CaCO3 20g/L,溶剂为去离子水,pH6.8,MSR固体培养基是向MSR液体培养基添加琼脂15g/L。培养基在121℃下灭菌20min。
(2)种子培养:在无菌条件下,将步骤(1)活化的解脂耶氏酵母,葡萄牙棒孢酵母,产朊假丝酵母菌体分别接种至YPD液体培养基,30℃、150r/min摇床培养1 天,通过显微镜检测、气味、颜色观察等等段检查没有发现污染,获得相应的酵母菌种子液。在无菌条件下,将步骤(1)活化的植物乳杆菌接种至MSR液体培养基,35℃条件下培养2天,获得植物乳杆菌种子液;
(3)发酵培养:按体积浓度10%的接种量,分别将步骤(2)各个酵母菌种子液和乳杆菌种子液接种至装有300L发酵培养基的500L发酵罐中;酵母菌发酵罐采用 YPD液体培养基作为发酵培养基,在通气、30℃、150r/min条件下发酵培养24h,离心,沉淀用无菌水配制成OD600达到0.8,获得相应的酵母菌菌悬液;植物乳杆菌采用MSR液体培养基作为发酵培养基,在30℃条件下静置培养,每1h可以轻摇促进菌体和培养基混合,需要搅拌,但不需要通气,发酵培养48h,离心,沉淀用无菌水配制成OD600达到0.6,获得植物乳杆菌菌悬液。
2、复合菌剂混配
复合菌剂体积配比:OD600值0.8的解脂耶氏酵母菌菌悬液25份(即25ml)、 OD600值0.8的葡萄牙棒孢酵母菌菌悬液15份(15ml)、OD600值0.8的产朊假丝酵母菌菌悬液15份(15ml)、OD600值0.6的植物乳杆菌菌悬液45份(45ml)。
3、餐厨垃圾处理
首先将餐厨垃圾中不易分解和粉碎的物体,塑料、大骨头、筷子、勺子、碎玻璃、牙签等剔除后,粉碎至粒径小于等于3cm,然后利用制浆机进行制浆,获得含固率 3~8%的浆液,浆液是餐厨垃圾除去非有机质部分后的破碎物,含水率86%,含有大分子的蛋白质、油脂、淀粉等。将浆液加入发酵容器(50立方米,塑料材质,带有盖,轻盖方式),该容器配有搅拌轴,可以促进物料和菌的充分混合。按照每吨浆液添加 1.5L复合菌剂的量加入步骤2的复合菌剂,发酵容器和室内环境温相近,环境温度控制在25~30℃。
浆液通过发酵容器发酵10天,成为半成熟液肥,继续贮存15天以后,就成为完全发酵好的有机液体肥料,其中总蛋白的含量从发酵前21.08g/L提高到24.31g/L,氨基酸态氮含量从1.86%提高到4.89%,效果显著。总酵母菌数达7.89×1010cfu/mL,液体有机肥的总养分(N+P2O5+K2O)≥60g/L,有机质含量≥28.0g/L。可应用于蔬菜生产。
对单菌降解餐厨垃圾转化为液体肥料的主要指标也进行了研究,分别用与复合菌剂等量的OD600值0.8的解脂耶氏酵母菌菌悬液、OD600值0.8的葡萄牙棒孢酵母菌菌悬液、OD600值0.8的产朊假丝酵母菌菌悬液、OD600值0.6的植物乳杆菌菌悬液,采取和复合菌剂相同的处理方法分别处理餐厨垃圾,处理的原料为同一批,处理前总蛋白21.08g/L,氨基酸态氮含量1.86%,处理后测定主要指标,结果显示复合菌剂在提高粗蛋白、氨基酸含量方面效果最佳(表1)。此外,复合菌因为含有酵母菌和乳酸菌等不同功能的微生物,处理后的餐厨垃圾液体无臭味,还有淡酸香味,效果显著优于其他单菌处理。
表1不同菌剂及组合处理餐厨垃圾后总蛋白和氨基酸态氮的含量变化
实施例2、复合菌剂发酵餐厨垃圾制作有机液体肥
1、复合菌剂按实施例1方法制备
复合菌剂体积配比:OD600值0.6的解脂耶氏酵母菌悬液20份、OD600值0.6的葡萄牙棒孢酵母菌悬液15份、OD600值0.6的产朊假丝酵母菌悬液25份,OD600值0.4 的植物乳杆菌悬液40份。
2、餐厨垃圾处理
餐厨垃圾浆液的制备同实施例1,按照每吨浆液加入1.5L复合菌剂的量添加步骤1的复合菌剂。
将浆液和复合菌剂加入带有螺口密封盖的塑料桶(食品级)进行发酵,容器盖子不要拧的太紧,保持可以透气状态。每天通过平晃1~2次塑料桶来促进物料和菌的充分混合,平晃的时候盖子拧紧,以免漏出液体。
塑料桶放置在通风处,避免太阳直晒,环境温度控制在20~35℃发酵10天。发酵过程中,可以打开盖子观察颜色气味,如果有可闻到的臭气,可以补加复合菌剂, 0.05~0.15L/30L桶。如果温度低于15℃,可以延长发酵时间至25天,获得有机液肥,总养分(N+P2O5+K2O)≥58.8g/L,有机质含量≥26.9g/L,可应用于蔬菜生产。
3、功能有机肥制作
针对蔬菜的苗期猝倒病,比如黄瓜、茄子、辣椒等,在苗期受土壤土传病原菌的侵染,容易引起猝倒、根腐等病害。需要用生物防治的办法,需要添加有生物防治能力的有益微生物木霉、细黄链霉菌等。本案例中,我们选取绿色木霉。
在上述发酵完成的有机液肥中,加入商业化绿色木霉孢子粉(购自广州市微元生物科技有限公司),1x108/克以上的活菌孢子数。在100L步骤2的有机液肥中添加 80g孢子粉,自然温度(25-30℃)下搅拌活化12小时后,即可应用于蔬菜生产。最佳施用方法作为基肥施入土壤,施用量10L/亩,这样可以提前让木霉等生防菌繁殖,抑制病原菌的生长,从而降低发病率。在防治黄瓜枯萎病的应用中,不添加木霉的发病率为20%,添加木霉的发病率为5%,防效显著。黄瓜枯萎病防治具体方法:在黄瓜苗栽种前,每亩施用15L上述含木霉孢子粉的液体有机肥随水灌溉,翻土10cm覆盖,种植。
实施例3、两种菌组合和四种菌组合发酵剂处理餐厨垃圾生产的液体有机肥营养液促进番茄生长的应用效果比较
1、单菌培养方法按实施例1方法制备
两种复合菌剂体积配比,以酵母菌+乳酸菌的组合进行设计,三个组合:
A:OD600值0.6的解脂耶氏酵母菌悬液20份、OD600值0.4的植物乳杆菌悬液40 份。
B:OD600值0.6的葡萄牙棒孢酵母菌悬液15份、OD600值0.4的植物乳杆菌悬液 40份。
C:OD600值0.6的产朊假丝酵母菌悬液25份,OD600值0.4的植物乳杆菌悬液40 份。
D:OD600值0.6的解脂耶氏酵母菌悬液20份、OD600值0.6的葡萄牙棒孢酵母菌悬液15份、OD600值0.6的产朊假丝酵母菌悬液25份,OD600值0.4的植物乳杆菌悬液40份。
2、餐厨垃圾处理
餐厨垃圾浆液的制备同实施例1,按照每吨浆液分别加入步骤1四个组合的1.5L复合菌剂。
将浆液和复合菌剂加入带有螺口密封盖的塑料桶(食品级)进行发酵,容器盖子不要拧的太紧,保持可以透气状态。每天通过平晃1~2次塑料桶来促进物料和菌的充分混合,平晃的时候盖子拧紧,以免漏出液体。
塑料桶放置在通风处,避免太阳直晒,环境温度控制在20~35℃发酵10天。发酵过程中,可以打开盖子观察颜色气味,如果有臭气,可以补加复合菌剂,0.05~0.15L/50L桶。如果温度低于15℃,可以延长发酵时间至25天,获得有机液肥,可应用于蔬菜生产。4个组合的菌剂处理后获得的有机肥总养分和优质含量差别不显著,但D组的总菌数显著高于其他组。D组的总养分(N+P2O5+K2O)≥58.8g/L,有机质含量≥26.9g/L;D组的总菌数为3.68x108个/mL,A组的总菌数为1.33x107个/mL, B组的总菌数为6.18x107个/mL,C组的总菌数为2.54x107个/mL。
3、应用效果比较
发酵处理后的液体有机肥作为营养液,应用于番茄促苗,进行效果比较。处理方法:选取发芽后生长苗岭20天,株高相同的番茄苗,分成三组,每组3 0株,对应一个处理,通过液体培养法进行试验。每组30株放在一个育苗盘,下面盛有上述菌剂处理后的液体营养,幼苗根部浸入。三个处理分别对应施用上述三个组合的菌剂处理的餐厨垃圾液体有机肥,施用量和方法:发酵处理后的液体肥用水稀释10倍后,作为液体培养液处理番茄,处理用量均为2L稀释液,番茄幼苗根部浸入。室温处理20 天后测定株高,进行比较促生效果。重复三次。结果发现4种菌组合的复合菌剂(处理D)促进番茄苗生长的效果显著高于其他3种菌的组合,结果见表1:
表1不同菌种组合处理的餐厨垃圾液体有机肥促进番茄幼苗的生长效果
菌种组合处理 |
平均株高(cm) |
差异显著性(p≤0.05) |
A |
20.82 |
bcd |
B |
21.38 |
bc |
C |
21.03 |
b |
D |
25.17 |
a |
字母abcd用来标注差异性显著,含有其中相同字母的为无显著差异,没有共同字母的为差异显著。