CN104087533A - 一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法。它解决了现有船舶餐厨垃圾处理能力差的问题。本微生物菌剂由以下质量分数的菌种原料混合而成：枯草芽孢杆菌15-35份、侧孢芽孢杆菌10-20份、解脂假丝酵母30-50份、绿色木霉10-20份、黑曲霉15-35份。其制备方法为：1)将上述各菌株分别进行单株培养，再进行活化培养及发酵；2)用载体进行吸附，各菌株获得单一菌粉；3)取得相应组分的各菌株单一菌粉，充分混合得到微生物菌剂。本发明可对单一干燥菌粉做合理配比，使各单菌相互协作。复合菌剂中各单一组分有效活菌数高，只需少量菌剂便可快速、充分地降解垃圾，成本低、使用方法简便。

Description

一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

随着世界经济的发展和海洋运输的加强，船舶垃圾产生量持续增加。餐厨垃圾作为船舶垃圾中的重要组成部分，具有高油脂、高蛋白质、高盐分含量等特质。由于舰艇船舶具有空间狭小、密闭性强等特殊的特点，餐厨垃圾若处理不当就会变质腐烂、滋生蚊蝇、散发恶臭甚至滋生细菌病毒。舰艇船舶上餐厨垃圾的处理已成为海洋运输中亟待解决的问题。

目前餐厨垃圾的主要处理方法有：物理法、化学法和生物法。物理法处理餐厨垃圾主要有超声波法、汽浮法、粗粒化法。化学法处理餐厨垃圾主要有氧化法和絮凝法。生物学方法的基本原理是微生物利用餐厨垃圾中部分有机物作为营养源进行增殖，在微生物增殖过程中将餐厨垃圾中的大分子物质转化为有用的小分子，从而达到餐厨垃圾减量和转化的目的。由于舰艇船舶空间的特殊性，以及生物法处理餐厨垃圾的效率高、成本低、无二次污染等特点，生物法已成为处理舰艇船舶餐厨垃圾的主要方法。利用微生物的新陈代谢，可快速、高效地降解餐厨垃圾，是餐厨垃圾无害化、减量化的一种理想的处理方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有的技术存在上述问题，提出了一种针对舰艇船舶餐厨垃圾高油脂、高蛋白质、高盐分含量等特质，提供所培养的微生物进行生物法高效处理的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂，所述菌剂由以下质量分数的菌种原料混合而成：枯草芽孢杆菌15-35份、侧孢芽孢杆菌10-20份、解脂假丝酵母30-50份、绿色木霉10-20份、黑曲霉15-35份。

一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的使用方法，将微生物菌剂与舰艇船舶餐厨垃圾按照质量比为1:300-500的比例充分混合，在温度为28-40℃下，发酵36-72h。

一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

1)、将枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉分别进行单株培养，然后将所获得的单株菌落按照10％的接种量接入液体培养基中进行活化培养，再将活化后的菌种接入装有体积比为60-75％培养基的发酵设备中进行发酵；

2)、将所得发酵液用载体进行吸附，制得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母的有效活菌数为5×10⁹个/克，制得绿色木霉、黑曲霉的有效活菌数为5×10⁸个/克，上述各菌株获得单一菌粉，吸附载体的各组分质量比为：硅藻土：麸皮：米糠＝1-1.5:0.5-1.5:2-3；

3)、取得枯草芽孢杆菌的单一菌粉15-35份、侧孢芽孢杆菌的单一菌粉10-20份、解脂假丝酵母的单一菌粉30-50份、绿色木霉的单一菌粉10-20份、黑曲霉的单一菌粉15-35份，将上述各菌株单一菌粉的质量份数进行充分混合得到微生物菌剂。

在上述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法中，所述枯草芽孢杆菌的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、可溶性淀粉15-35g/L、氯化钠4-6g/L，液体活化培养基的pH值为7.0-7.2；接种枯草芽孢杆菌的液体活化培养基在温度35-37℃、摇床转速为140-160r/min下，培养18-24h；

2)、将经步骤(1)活化所得的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为60-75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2-4％；发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、可溶性淀粉15-35g/L、氯化钠4-6g/L，发酵培养基的pH值为7.0-7.2；接种枯草芽孢杆菌的发酵培养基在温度35-37℃、搅拌转速为200-220r/min下，扩大培养24-40h，直至发酵罐中的枯草芽孢杆菌产孢率为80％以上，将发酵后的枯草芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得枯草芽孢杆菌的单一菌粉。

在上述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法中，所述侧孢芽孢杆菌的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、甘露醇15-25g/L、酵母膏5-10g/L、葡萄糖15-25g/L、氯化钠4-6g/L，液体活化培养基的pH值为7.0-7.2；接种侧孢芽孢杆菌的液体活化培养基在温度35-37℃、摇床转速为140-160r/min下，培养18-24h；

2)、将经步骤(1)活化所得的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为60-75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2-4％；发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、甘露醇15-25g/L、酵母膏5-10g/L、葡萄糖15-25g/L、氯化钠4-6g/L，发酵培养基的pH值为7.0-7.2；接种侧孢芽孢杆菌的发酵培养基在温度35-37℃、搅拌转速为200-220r/min下，扩大培养24-40h，直至发酵罐中的侧孢芽孢杆菌产孢率为80％以上，将发酵后的侧孢芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得侧孢芽孢杆菌的单一菌粉。

在上述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法中，所述解脂假丝酵母的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的解脂假丝酵母接种至装有体积比为10-40％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：12Brix的麦芽汁，液体活化培养基的pH值自然；接种解脂假丝酵母的液体活化培养基在温度28-30℃、摇床转速为110-130r/min下，培养35-45h；

2)、将经步骤(1)活化所得的解脂假丝酵母接种至装有体积比为60-75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2-4％；发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：12Brix的麦芽汁，发酵培养基的pH值自然；接种解脂假丝酵母的发酵培养基在温度28-30℃、搅拌转速为140-180r/min下，扩大培养65-75h，将发酵后的解脂假丝酵母用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得解脂假丝酵母的单一菌粉。

在上述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法中，所述绿色木霉的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的绿色木霉接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蔗糖28-32g/L、硝酸钠2-4g/L、七水合硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化钾0.4-0.6g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L，液体活化培养基的pH值为6.0-6.5，接种绿色木霉的液体活化培养基在温度28-30℃、摇床转速为110-130r/min下，培养48-72h；

2)、将经步骤(1)活化所得的绿色木霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内；固体发酵培养基中各组分的组成为：玉米碎粒15-30份、稻壳25-35份、麸皮20-40份、蔗糖2-8份、七水合硫酸镁0.1-0.8份、尿素2-10份；接种绿色木霉的固体发酵培养基在28-30℃下发酵培养5-8天，直至绿色木霉的孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得绿色木霉的单一菌粉。

在上述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法中，所述黑曲霉的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的黑曲霉接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蔗糖28-32g/L、硝酸钠2-4g/L、七水合硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化钾0.4-0.6g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L，液体活化培养基的pH值为6.0-6.5；接种黑曲霉的液体活化培养基在温度28-30℃、摇床转速为110-130r/min下，培养45-60h；

2)、将经步骤(1)活化所得的黑曲霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内；固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒15-30份、黄豆饼粉20-25份、二水合硫酸锰0.1-0.5份、二水合硫酸锌0.2-0.8份、七水合硫酸镁0.1-0.8份、稻壳25-35份、麸皮10-20份、尿素2-8份；接种黑曲霉的固体发酵培养基在28-30℃下发酵培养3-5天，直至黑曲霉的孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得黑曲霉的单一菌粉。

与现有技术相比，本发明将枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉的菌株进行扩大培养，再进行高密度扩大培养，最后用载体吸附制得各菌株的单一干燥菌粉，根据其用途采用合理配比，复合得到用于降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂，用于舰艇船舶餐厨垃圾的处理，具有以下优点：

(1)针对不同组成的舰艇船舶餐厨垃圾可对单一干燥菌粉做合理配比，使各单菌相互协作，协同降解舰艇船舶餐厨垃圾。

(2)复合菌剂中各单一组分有效活菌数高，用于降解舰艇船舶餐厨垃圾时，只需少量菌剂便可快速、充分地降解舰艇船舶餐厨垃圾，故菌剂用量少、成本低、使用方法简便。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1.餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉进行单株培养和高密度扩大培养，最后将培养后得到的各单一菌体用载体吸附，制得各菌株的单一干燥菌粉，吸附载体各组分的质量比为：硅藻土：麸皮：米糠＝1:0.8:2.5。

1.枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为15％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、可溶性淀粉20g/L、氯化钠5g/L、pH7.0；在温度35℃摇床转速为140r/min下，培养22h；

(2)将活化所得的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为60％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为4％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、可溶性淀粉20g/L、氯化钠5g/L、pH7.0；在温度35℃搅拌转速为210r/min下，扩大培养24h，测得发酵罐中的枯草芽孢杆菌产孢率为85％，将发酵后的枯草芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得枯草芽孢杆菌单一菌粉。

(3)枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数的测定

①采集枯草芽孢杆菌单一菌粉不少于500g，从中称取10g，加入带玻璃珠的100ml无菌水中，静置20min后在200r/min的摇床上充分震荡30min,既得枯草芽孢杆菌单一菌粉的母液菌悬液。

②用无菌吸管吸取5ml上述母液菌悬液，加入45ml无菌水中，混匀既得1x10^-1稀释的菌悬液，按此法依次稀释，分别得1x10^-2、1x10^-3、1x10^-4、1x10^-5、1x10^-6、1x10^-7、1x10^-8、1x10^-9稀释的菌悬液(每个稀释度必须更换无菌吸管)。

③用1ml无菌吸管分别吸取稀释度为1x10^-7、1x10^-8、1x10^-9的菌悬液0.1ml，加至直径为9cm平皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于培养基表面，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照，于适宜条件下培养，每个稀释度取5个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。

④菌落计数，以平板上出现30-300个菌落数的平板为计数标准(丝状真菌为10-150个菌落数)；当只有一个稀释度其平均菌落数在30-300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度其平均菌落数均在30-300之间，则按两者菌落数之比值来决定，若其比值小于2，则计数两者的平均数，若比值大于2，则计数其中稀释度较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数；有效活菌数计算按式(1)计算：

$n=\frac{\stackrel{\mathrm{\ω}}{x}\×k\×v_1}{m\×v_2}\×{10}^8$    式(1)

式中：

n-质量有效活菌数，单位为亿每克(亿/克)；

-有效菌落平均数，单位为个；

k-稀释倍数；

v₁-基础液体积，单位为毫升(ml)；

m-样品量，单位为克(g)；

v₂-菌悬液加入量，单位为毫升(ml)。

枯草芽孢杆菌有效活菌数测定所用固体培养基为营养琼脂培养基，所述营养琼脂培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L，pH7.0。

经测定所得枯草芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数含量为60亿/克。

2.侧孢芽孢杆菌单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为10％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨8g/L、牛肉膏3g/L、甘露醇20g/L、酵母膏7g/L、葡萄糖18g/L、氯化钠4g/L、pH7.0；在温度35℃摇床转速为160r/min下，培养20h；

(2)将经活化所得的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为65％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为3％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨8g/L、牛肉膏3g/L、甘露醇20g/L、酵母膏7g/L、葡萄糖18g/L、氯化钠4g/L、pH7.0；在温度35℃搅拌转速为200r/min下，扩大培养32h，测得发酵罐中的侧孢芽孢杆菌产孢率为85％，将发酵后的侧孢芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得侧孢芽孢杆菌单一菌粉。

(3)侧孢芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定

侧孢芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，侧孢芽孢杆菌有效活菌数测定所用固体培养基为CM₃营养琼脂培养基，所述CM₃营养琼脂培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：牛肉膏1g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L，pH7.0。

经测定所得侧孢芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数含量为65亿/克。

3.解脂假丝酵母单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的解脂假丝酵母接种至装有体积比为25％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质为浓度为12Brix的麦芽汁，pH自然；在温度28℃摇床转速为120r/min下，培养35h；

(2)将经活化所得的解脂假丝酵母接种至装有体积比为75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为4％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为12Brix的麦芽汁，pH自然；在温度28℃搅拌转速为140r/min下，扩大培养72h，将发酵后的解脂假丝酵母用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得解脂假丝酵母单一菌粉。

(3)解脂假丝酵母单一菌粉有效活菌数测定

解脂假丝酵母单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，解脂假丝酵母有效活菌数测定所用固体培养基为酵母菌培养基，所述酵母菌培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：葡萄糖200g/L、酵母粉4g/L、尿素2g/L、琼脂粉20g/L，pH4.5。

经测定所得解脂假丝酵母单一菌粉中有效活菌数含量为55亿/克。

4.绿色木霉单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的绿色木霉接种至装有体积比为10％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蔗糖30g/L、硝酸钠2g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、氯化钾0.5g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾1g/L、pH6.2，在温度28℃摇床转速为130r/min下，培养48h；

(2)将经活化所得的绿色木霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内，所述固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒18份、稻壳30份、麸皮35份、蔗糖5份、七水合硫酸镁0.5份、尿素5份；在28℃下发酵培养7天，直至孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得绿色木霉单一菌粉。

(3)绿色木霉单一菌粉有效活菌数测定

绿色木霉单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，绿色木霉有效活菌数测定所用固体培养基为PDA培养基，所述PDA培养基，各组分浓度为：马铃薯浸取液1L、葡萄糖20g、琼脂粉15g，pH自然；其中马铃薯浸取液的制备方法为：称取马铃薯200g，洗净去皮后切成小块，加蒸馏水1000ml煮沸半个小时，后经双层纱布过滤，将滤液补足1000ml，既得所述马铃薯浸取液。

经测定所得绿色木霉单一菌粉中有效活菌数含量为6亿/克。

5.黑曲霉单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的黑曲霉接种至装有体积比为15％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蔗糖28g/L、硝酸钠3g/L、七水合硫酸镁0.4g/L、氯化钾0.4g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾1.2g/L、pH6.5，在温度30℃摇床转速为120r/min下，培养55h；

(2)将经活化所得的黑曲霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内，所述固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒15份、黄豆饼粉22份、二水合硫酸锰0.2份、二水合硫酸锌0.5份、七水合硫酸镁0.5份、稻壳35份、麸皮15份、尿素4份；在30℃下发酵培养5天，直至孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得黑曲霉单一菌粉。

(3)黑曲霉单一菌粉有效活菌数测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，黑曲霉有效活菌数测定所用固体培养基为PDMA培养基，所述PDMA培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：马铃薯浸取液500ml、2Brix麦芽汁500ml、葡萄糖20g、微生物B₁0.05g、琼脂粉20g/L，pH5.5。

经测定所得黑曲霉单一菌粉中有效活菌数含量为5亿/克。

实施例2.餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉进行单株培养和高密度扩大培养，最后将培养后得到的各单一菌体用载体吸附，制得各菌株的单一干燥菌粉，吸附载体各组分的质量比为：硅藻土：麸皮：米糠＝1.2:0.6:2。

1.枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为10％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨12g/L、牛肉膏4g/L、可溶性淀粉15g/L、氯化钠5g/L、pH7.2；在温度37℃摇床转速为160r/min下，培养24h；

(2)将活化所得的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为65％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为3％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨12g/L、牛肉膏4g/L、可溶性淀粉15g/L、氯化钠5g/L、pH7.2；在温度37℃搅拌转速为200r/min下，扩大培养36h，测得发酵罐中的枯草芽孢杆菌产孢率为90％，将发酵后的枯草芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得枯草芽孢杆菌单一菌粉。

(3)枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数的测定

测定方法同实施例1步骤1(3)所述。

经测定枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数含量为70亿/克。

2.侧孢芽孢杆菌单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为15％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨9g/L、牛肉膏4g/L、甘露醇15g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠5g/L、pH7.2；在温度37℃摇床转速为140r/min下，培养24h；

(2)将经活化所得的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为60％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨9g/L、牛肉膏4g/L、甘露醇15g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠5g/L、pH7.2；在温度37℃搅拌转速为210r/min下，扩大培养28h，测得发酵罐中的侧孢芽孢杆菌产孢率为90％，将发酵后的侧孢芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得侧孢芽孢杆菌单一菌粉。

(3)侧孢芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定

侧孢芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，侧孢芽孢杆菌有效活菌数测定所用固体培养基为CM₃营养琼脂培养基，所述CM₃营养琼脂培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：牛肉膏1g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L，pH7.0。

经测定所得侧孢芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数含量为55亿/克。

3.解脂假丝酵母单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的解脂假丝酵母接种至装有体积比为35％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质为浓度为12Brix的麦芽汁，pH自然；在温度30℃摇床转速为110r/min下，培养40h；

(2)将经活化所得的解脂假丝酵母接种至装有体积比为60％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为3％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为12Brix的麦芽汁，pH自然；在温度30℃搅拌转速为160r/min下，扩大培养68h，将发酵后的解脂假丝酵母用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得解脂假丝酵母单一菌粉。

(3)解脂假丝酵母单一菌粉有效活菌数测定

解脂假丝酵母单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，解脂假丝酵母有效活菌数测定所用固体培养基为酵母菌培养基，所述酵母菌培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：葡萄糖200g/L、酵母粉4g/L、尿素2g/L、琼脂粉20g/L，pH4.5。

经测定所得解脂假丝酵母单一菌粉中有效活菌数含量为62亿/克。

4.绿色木霉单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的绿色木霉接种至装有体积比为15％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蔗糖29g/L、硝酸钠3g/L、七水合硫酸镁0.4g/L、氯化钾0.5g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾1.2g/L、pH6.0，在温度29℃摇床转速为120r/min下，培养56h；

(2)将经活化所得的绿色木霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内，所述固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒25份、稻壳25份、麸皮30份、蔗糖4份、七水合硫酸镁0.6份、尿素3份；在29℃下发酵培养8天，直至孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得绿色木霉单一菌粉。

(3)绿色木霉单一菌粉有效活菌数测定

绿色木霉单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，绿色木霉有效活菌数测定所用固体培养基为PDA培养基，所述PDA培养基，各组分浓度为：马铃薯浸取液1L、葡萄糖20g、琼脂粉15g，pH自然；其中马铃薯浸取液的制备方法为：称取马铃薯200g，洗净去皮后切成小块，加蒸馏水1000ml煮沸半个小时，后经双层纱布过滤，将滤液补足1000ml，既得所述马铃薯浸取液。

经测定所得绿色木霉单一菌粉中有效活菌数含量为5.5亿/克。

5.黑曲霉单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的黑曲霉接种至装有体积比为10％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蔗糖31g/L、硝酸钠2g/L、七水合硫酸镁0.4g/L、氯化钾0.5g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾0.8g/L、pH6.3，在温度28℃摇床转速为110r/min下，培养48h；

(2)将经活化所得的黑曲霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内，所述固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒20份、黄豆饼粉25份、二水合硫酸锰0.3份、二水合硫酸锌0.5份、七水合硫酸镁0.6份、稻壳25份、麸皮10份、尿素5份；在28℃下发酵培养4天，直至孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得黑曲霉单一菌粉。

(3)黑曲霉单一菌粉有效活菌数测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，黑曲霉有效活菌数测定所用固体培养基为PDMA培养基，所述PDMA培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：马铃薯浸取液500ml、2Brix麦芽汁500ml、葡萄糖20g、微生物B₁0.05g、琼脂粉20g/L，pH5.5。

经测定所得黑曲霉单一菌粉中有效活菌数含量为6.5亿/克。

实施例3.餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉进行单株培养和高密度扩大培养，最后将培养后得到的各单一菌体用载体吸附，制得各菌株的单一干燥菌粉，吸附载体各组分的质量比为：硅藻土：麸皮：米糠＝1.5:0.5:3。

1.枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为20％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨8g/L、牛肉膏2g/L、可溶性淀粉30g/L、氯化钠6g/L、pH7.1；在温度36℃摇床转速为150r/min下，培养20h；

(2)将活化所得的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨8g/L、牛肉膏2g/L、可溶性淀粉30g/L、氯化钠6g/L、pH7.1；在温度36℃搅拌转速为210r/min下，扩大培养32h，测得发酵罐中的枯草芽孢杆菌产孢率为95％，将发酵后的枯草芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得枯草芽孢杆菌单一菌粉。

(3)枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数的测定

测定方法同实施例1步骤1(3)所述。

经测定枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数含量为55亿/克。

2.侧孢芽孢杆菌单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为18％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨11g/L、牛肉膏2g/L、甘露醇25g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖25g/L、氯化钠5g/L、pH7.1；在温度36℃摇床转速为150r/min下，培养22h；

(2)将经活化所得的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为70％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为4％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蛋白胨11g/L、牛肉膏2g/L、甘露醇25g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖25g/L、氯化钠5g/L、pH7.1；在温度36℃搅拌转速为210r/min下，扩大培养30h，测得发酵罐中的侧孢芽孢杆菌产孢率为85％，将发酵后的侧孢芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得侧孢芽孢杆菌单一菌粉。

(3)侧孢芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定

侧孢芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，侧孢芽孢杆菌有效活菌数测定所用固体培养基为CM₃营养琼脂培养基，所述CM₃营养琼脂培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：牛肉膏1g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L，pH7.0。

经测定所得侧孢芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数含量为60亿/克。

3.解脂假丝酵母单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的解脂假丝酵母接种至装有体积比为15％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质为浓度为12Brix的麦芽汁，pH自然；在温度29℃摇床转速为120r/min下，培养45h；

(2)将经活化所得的解脂假丝酵母接种至装有体积比为70％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2％，所述发酵培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为12Brix的麦芽汁，pH自然；在温度29℃搅拌转速为170r/min下，扩大培养75h，将发酵后的解脂假丝酵母用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得解脂假丝酵母单一菌粉。

(3)解脂假丝酵母单一菌粉有效活菌数测定

解脂假丝酵母单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，解脂假丝酵母有效活菌数测定所用固体培养基为酵母菌培养基，所述酵母菌培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：葡萄糖200g/L、酵母粉4g/L、尿素2g/L、琼脂粉20g/L，pH4.5。

经测定所得解脂假丝酵母单一菌粉中有效活菌数含量为55亿/克。

4.绿色木霉单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的绿色木霉接种至装有体积比为20％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蔗糖28g/L、硝酸钠4g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、氯化钾0.6g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾0.9g/L、pH6.5，在温度30℃摇床转速为110r/min下，培养72h；

(2)将经活化所得的绿色木霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内，所述固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒25份、稻壳25份、麸皮25份、蔗糖3份、七水合硫酸镁0.4份、尿素7份；在30℃下发酵培养5天，直至孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得绿色木霉单一菌粉。

(3)绿色木霉单一菌粉有效活菌数测定

绿色木霉单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，绿色木霉有效活菌数测定所用固体培养基为PDA培养基，所述PDA培养基，各组分浓度为：马铃薯浸取液1L、葡萄糖20g、琼脂粉15g，pH自然；其中马铃薯浸取液的制备方法为：称取马铃薯200g，洗净去皮后切成小块，加蒸馏水1000ml煮沸半个小时，后经双层纱布过滤，将滤液补足1000ml，既得所述马铃薯浸取液。

经测定所得绿色木霉单一菌粉中有效活菌数含量为5亿/克。

5.黑曲霉单一菌粉的制备

(1)将经纯化后的试管斜面上的黑曲霉接种至装有体积比为20％的液体活化培养基的三角瓶中，所述液体活化培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：蔗糖30g/L、硝酸钠4g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、氯化钾0.6g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾1g/L、pH6.0，在温度29℃摇床转速为130r/min下，培养60h；

(2)将经活化所得的黑曲霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内，所述固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒30份、黄豆饼粉20份、二水合硫酸锰0.5份、二水合硫酸锌0.8份、七水合硫酸镁0.2份、稻壳20份、麸皮20份、尿素2份；在28℃下发酵培养5天，直至孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得黑曲霉单一菌粉。

(3)黑曲霉单一菌粉有效活菌数测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌数的测定与枯草芽孢杆菌单一菌粉有效活菌数测定方法、步骤相同；其中，黑曲霉有效活菌数测定所用固体培养基为PDMA培养基，所述PDMA培养基，溶剂为蒸馏水，溶质浓度为：马铃薯浸取液500ml、2Brix麦芽汁500ml、葡萄糖20g、微生物B₁0.05g、琼脂粉20g/L，pH5.5。

经测定所得黑曲霉单一菌粉中有效活菌数含量为5.5亿/克。

实例4.利用实例1-3制备的菌剂分解舰艇船舶餐厨垃圾

本实例取用实例1-3制得的三种菌剂，分别接种至实际采集的舰艇船舶餐厨垃圾中，观察菌剂在实际应用中发挥的作用，测定所选取舰艇船舶餐厨垃圾指标的减量率。

一、实验方法

供试舰艇船舶餐厨垃圾：初始含水量为52.01％，主要成分含量(以干基计)为淀粉45.45％、蛋白质20.37％、脂肪19.52％、纤维素2.69％、其他11.97％；上述含量均为质量百分数。

取供试舰艇船舶餐厨垃圾3份，每份100公斤，取实例1-3中制备的餐厨垃圾菌剂250g/种；一份菌剂对应一份供试餐厨垃圾，一起放入餐厨垃圾集成处理设备中，混合均匀后在35℃下发酵48h；待发酵结束后测定供试舰艇船舶餐厨垃圾中各组分的减量率，实验重复3次。

二、餐厨垃圾中各组分检测方法

1.餐厨垃圾中含水量测定

(1)称取餐厨垃圾样品20g(精确到0.01g)，放入已知质量的铝盒中，盖好盒盖，称量铝盒加餐厨垃圾的质量；

(2)揭开盒盖，在80℃的烘箱中将铝盒烘干至恒重，取出后放入干燥器内冷却至室温；

(3)从干燥器内取出铝盒，盖好盒盖，称量铝盒加烘干餐厨垃圾的质量，餐厨垃圾含水量按式(2)计算：

   式(2)

式中：

m-烘干后的质量，单位为克(g)

m₂-烘干前质量，单位为克(g)

(4)平行测定的结果用算术平均值表示

(5)平行测定结果相差，水分小于5％的不得超过0.2％，水分为5-25％的不得超过0.3％，水分大于15％的大颗粒不得超过0.7％。

2.餐厨垃圾中淀粉含量测定(旋光法)

(1)耗酸量的测定

①称取约2.5g制备好的餐厨垃圾试样(精确到1mg)，定量转移到50ml锥形瓶中，加入25ml水，震荡至形成均匀的悬浊液；

②将酸度计的电极置于悬浊液中，用滴定管滴加0.31mol/L的盐酸至pH为3.0±0.1,剧烈振摇悬浊液，并静置2min，检查试料所消耗盐酸是否平衡，如果在此过程中，pH升高超过3.1，再用滴定管滴加0.31mol/L盐酸，必要时可多次滴加盐酸，直到不需要更多的盐酸为止；

③根据所用盐酸的体积计算出试料的耗酸量。

(2)总旋光度测定

①称取约2.5g制备好的试样(m₁)，精确到1mg，定量转移到干燥的100ml容量瓶中，加25ml0.31mol/L盐酸，震摇至形成均匀地悬浊液，再加入25ml0.31mol/L盐酸；

②加入适量浓度的盐酸，补偿试样的耗酸量，使容量瓶中内容物的体积变化不超过1ml；

③将容量瓶浸入沸水浴中，在前3min，用力震摇容量瓶，以避免结块并使悬浊液受热均匀，震摇时容量瓶不能离开沸水浴；15min±5s后，取出容量瓶，立即加入温度不超过10℃的水30ml，转动容量瓶，在流水中冷却至20℃左右，加入5ml0.25mol/L的亚铁氰化钾，震摇1min，加入5ml0.5mol/L的乙酸锌溶液，震摇1min，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，过滤，弃去初始的数毫升溶液，用旋光仪或糖度计测定绿叶的旋光度(α1)；

(3)乙醇溶解物旋光度测定

①称取5g制备好的试样(m2),精确至1mg，定量转移到100ml干燥的容量瓶中，加40ml乙醇，震摇至形成均匀地悬浊液，然后再加40ml乙醇；

②加入适当浓度的盐酸以补充试样的耗酸量，使瓶中内容物的体积变化不超过1ml；

③用力震摇，在室温下静置1h，在此期间至少每隔10min震摇一次，用乙醇稀释至刻度，混匀，过滤，弃去最初数毫升溶液，吸取50ml滤液于100ml容量瓶中，加入2ml浓盐酸用力震摇，将容量瓶与冷凝器相连，并将其浸入费水浴中，15min±5s后，从沸水浴中取出容量瓶，立即加入温度不超过10℃的水30ml，转动容量瓶并在冷水中冷至20℃左右，加5ml0.25mol/L的亚铁氰化钾溶液，震摇1min，加5ml0.5mol/L的乙酸锌溶液，震摇1min，用水稀释至刻度，摇匀，过滤弃去最初数毫升滤液，用旋光仪或糖度计测定滤液的旋光度(α₂),餐厨垃圾中淀粉含量按式(3)计算：

$W=\frac{2000}{{\mathrm{\α}}_D^{20}}\×{(\frac{2.5{\mathrm{\α}}_1}{m_1}-\frac{5{\mathrm{\α}}_2}{m_2})}_{\×10}$    式(3)

式中：

W-试样中淀粉含量，单位为％；

α₁-总旋光度的数值；

α₂-乙醇溶解物的旋光度值；

m₁-测定总旋光度的试料的质量，单位为克(g)；

m₂-测定乙醇溶解物旋光度时试料的质量，单位为克(g)；

-在波长为589.3nm处测定纯淀粉比旋度的值。

用同一方法，对同一试样，在同一实验室内，由同一操作人员用相同的设备，在短时间内得到的两个独立的试验结果之差的绝对值的重复性限不超过5％，再现性限不大于5％。

3.餐厨垃圾中蛋白质含量的测定

(1)试样处理

称取充分混匀的餐厨垃圾试样0.2g-2g，精确至0.001g，移入干燥的100ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20ml硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上；小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5-1h；取下放冷，小心加入20ml水,放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用；同时做试剂空白试验；

(2)测定

组装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加1g/L甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾；向接收瓶内加入10ml20g/L硼酸溶液及1-2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2-10ml餐厨垃圾试样处理液由小玻璃杯注入反应室；以10ml水洗涤小玻璃杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻璃塞；将10ml400g/L氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气；夹紧螺旋夹，开始蒸馏；蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min；然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶；以0.05mol/L硫酸滴定至终点，同时作试剂空白，餐厨垃圾中蛋白质含量按式(4)计算：

$X=\frac{(V_1-V_2)\×c\×0.0140}{m\×V_3/100}\×F\×100$    式(4)

式中：

X-餐厨垃圾试样中蛋白质的含量，单位为％；

V₁-餐厨垃圾试样消耗硫酸滴定液的体积，单位为毫升(ml)；

V₂-试剂空白消耗硫酸滴定液的体积，单位为毫升(ml)；

V₃-吸取消化液的体积，单位为毫升(ml)；

c-硫酸滴定液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；

m-餐厨垃圾试样的质量，单位为克(g)；

F-氮换算为蛋白质的系数。

在测定时，重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

4.餐厨垃圾中脂肪含量的测定

(1)将装有处理后餐厨垃圾试样的滤纸筒放入脂肪抽提器的体筒内，连接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶内容积的2/3处，于水浴上加热，使石油醚不断回流提取6-12h；

(2)去下接收瓶，回收石油醚，待接收瓶内石油醚剩1-2ml时在水浴上蒸干，再于100±5℃的烘箱内干燥2h，放于干燥器内冷却30min后称量，重复以上操作直至恒重；餐厨垃圾中脂肪含量按式(5)计算：

$X=\frac{m_1-m_0}{m_2}\×100$    式(5)

式中：

X-餐厨垃圾试样中脂肪的含量，单位为％；

m₁-接收瓶和脂肪的质量，单位为克(g)；

m₀-接收瓶的质量，单位为克(g)；

m₂-餐厨垃圾试样的质量，单位为克(g)。

在测定时，重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

5.餐厨垃圾中纤维素含量的测定

(1)精确称取2g餐厨垃圾试样，精确至0.0001g，用定型滤纸包好并用棉线捆牢，进行苯醇抽提，同时另取试样侧额定水分，最后将试样包风干；

(2)打开风干的滤纸包，将全部餐厨垃圾试样移入综合纤维素测定仪的250ml锥形瓶中，加入65ml蒸馏水，0.5ml冰醋酸，0.6g亚氯酸钠，摇匀，扣上25ml锥形瓶，置于75℃恒温水浴中加热1h，加热过程中经常旋转并摇动锥形瓶，到达1h后，不必冷却溶液，再加入0.5ml冰醋酸及0.6g亚氯酸钠，摇匀，继续在75℃水浴中加热1h，如此重复进行直至试样变白为止；

(3)从水浴中取出锥形瓶放入冰水浴中冷却，用已恒重的1G2玻璃滤器抽吸过滤，用蒸馏水反复洗涤至滤液不呈酸性反应为止，最后用丙酮洗涤3此，吸干滤液取下滤器，并用蒸馏水将滤器外部洗净，置于105±2℃烘箱中烘干至恒重；餐厨垃圾试样中纤维素的含量按照式(6)计算：

$X=\frac{m_1-m_2}{m_0}\×100$    式(6)

式中：

X-餐厨垃圾试样中综纤维素的含量，单位为％；

m₁-烘干后综纤维素质量，单位为克(g)；

m₀-绝干试样质量，单位为克(g)

m₂-综纤维素中灰分的质量，单位为克(g)。

同时进行两次测定，取其算术平均值为测定结果，两次测定计算值之间误差不应超过0.4％。

三、实验结果

1.采用实例1菌剂的实验结果

(1)经测定，处理前后供试舰艇船舶餐厨垃圾以质量计的减量率为86.75％；

(2)经上述检测方法测定，供试舰艇船舶餐厨垃圾中淀粉减量率为96.42％、蛋白质减量率为88.23％、脂肪减量率为91.96％、纤维素减量率为84.51％。

2.采用实例2菌剂的实验结果

(1)经测定，处理前后供试舰艇船舶餐厨垃圾以质量计的减量率为91.37％；

(2)经上述检测方法测定，供试舰艇船舶餐厨垃圾中淀粉减量率为89.20％、蛋白质减量率为92.54％、脂肪减量率为90.73％、纤维素减量率为95.62％。

3.采用实例3菌剂的实验结果

(1)经测定，处理前后供试舰艇船舶餐厨垃圾以质量计的减量率为95.29％；

(2)经上述检测方法测定，供试舰艇船舶餐厨垃圾中淀粉减量率为91.73％、蛋白质减量率为86.39％、脂肪减量率为88.74％、纤维素减量率为90.51％。

上述实例为针对此次试验所提供的舰艇船舶餐厨垃圾而设定的较优配比，在实际应用中可根据舰艇船舶餐厨垃圾中淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素含量的不同，针对性的调整菌剂中各菌种单一菌粉的用量。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (8)

1.一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂由以下质量分数的菌种原料混合而成：枯草芽孢杆菌15-35份、侧孢芽孢杆菌10-20份、解脂假丝酵母30-50份、绿色木霉10-20份、黑曲霉15-35份。

2.根据权利要求1所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，将微生物菌剂与舰艇船舶餐厨垃圾按照质量比为1:300-500的比例充分混合，在温度为28-40℃下，发酵36-72h。

3.根据权利要求1所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

1)、将枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉分别进行单株培养，然后将所获得的单株菌落按照10％的接种量接入液体培养基中进行活化培养，再将活化后的菌种接入装有体积比为60-75％培养基的发酵设备中进行发酵；

2)、将所得发酵液用载体进行吸附，制得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解脂假丝酵母的有效活菌数为5×10⁹个/克，制得绿色木霉、黑曲霉的有效活菌数为5×10⁸个/克，上述各菌株获得单一菌粉，吸附载体的各组分质量比为：硅藻土：麸皮：米糠＝1-1.5:0.5-1.5:2-3；

3)、取得枯草芽孢杆菌的单一菌粉15-35份、侧孢芽孢杆菌的单一菌粉10-20份、解脂假丝酵母的单一菌粉30-50份、绿色木霉的单一菌粉10-20份、黑曲霉的单一菌粉15-35份，将上述各菌株单一菌粉的质量份数进行充分混合得到微生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、可溶性淀粉15-35g/L、氯化钠4-6g/L，液体活化培养基的pH值为7.0-7.2；接种枯草芽孢杆菌的液体活化培养基在温度35-37℃、摇床转速为140-160r/min下，培养18-24h；

2)、将经步骤(1)活化所得的枯草芽孢杆菌接种至装有体积比为60-75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2-4％；发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、可溶性淀粉15-35g/L、氯化钠4-6g/L，发酵培养基的pH值为7.0-7.2；接种枯草芽孢杆菌的发酵培养基在温度35-37℃、搅拌转速为200-220r/min下，扩大培养24-40h，直至发酵罐中的枯草芽孢杆菌产孢率为80％以上，将发酵后的枯草芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得枯草芽孢杆菌的单一菌粉。

5.根据权利要求3所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述侧孢芽孢杆菌的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、甘露醇15-25g/L、酵母膏5-10g/L、葡萄糖15-25g/L、氯化钠4-6g/L，液体活化培养基的pH值为7.0-7.2；接种侧孢芽孢杆菌的液体活化培养基在温度35-37℃、摇床转速为140-160r/min下，培养18-24h；

2)、将经步骤(1)活化所得的侧孢芽孢杆菌接种至装有体积比为60-75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2-4％；发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏2-4g/L、甘露醇15-25g/L、酵母膏5-10g/L、葡萄糖15-25g/L、氯化钠4-6g/L，发酵培养基的pH值为7.0-7.2；接种侧孢芽孢杆菌的发酵培养基在温度35-37℃、搅拌转速为200-220r/min下，扩大培养24-40h，直至发酵罐中的侧孢芽孢杆菌产孢率为80％以上，将发酵后的侧孢芽孢杆菌用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得侧孢芽孢杆菌的单一菌粉。

6.根据权利要求3所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述解脂假丝酵母的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的解脂假丝酵母接种至装有体积比为10-40％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：12Brix的麦芽汁，液体活化培养基的pH值自然；接种解脂假丝酵母的液体活化培养基在温度28-30℃、摇床转速为110-130r/min下，培养35-45h；

2)、将经步骤(1)活化所得的解脂假丝酵母接种至装有体积比为60-75％的发酵培养基的发酵罐内，接种量为2-4％；发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：12Brix的麦芽汁，发酵培养基的pH值自然；接种解脂假丝酵母的发酵培养基在温度28-30℃、搅拌转速为140-180r/min下，扩大培养65-75h，将发酵后的解脂假丝酵母用载体进行吸附，直至有效活菌数达到5×10⁹个/克，即得解脂假丝酵母的单一菌粉。

7.根据权利要求3所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述绿色木霉的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的绿色木霉接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蔗糖28-32g/L、硝酸钠2-4g/L、七水合硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化钾0.4-0.6g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L，液体活化培养基的pH值为6.0-6.5，接种绿色木霉的液体活化培养基在温度28-30℃、摇床转速为110-130r/min下，培养48-72h；

2)、将经步骤(1)活化所得的绿色木霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内；固体发酵培养基中各组分的组成为：玉米碎粒15-30份、稻壳25-35份、麸皮20-40份、蔗糖2-8份、七水合硫酸镁0.1-0.8份、尿素2-10份；接种绿色木霉的固体发酵培养基在28-30℃下发酵培养5-8天，直至绿色木霉的孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得绿色木霉的单一菌粉。

8.根据权利要求3所述的降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述黑曲霉的单一菌粉的制备包括以下步骤：

1)、将经纯化后的试管斜面上的黑曲霉接种至装有体积比为10-20％的液体活化培养基的三角瓶中；液体活化培养基的溶剂为蒸馏水，溶质组分及其浓度为：蔗糖28-32g/L、硝酸钠2-4g/L、七水合硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化钾0.4-0.6g/L、四水合硫酸亚铁微量、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L，液体活化培养基的pH值为6.0-6.5；接种黑曲霉的液体活化培养基在温度28-30℃、摇床转速为110-130r/min下，培养45-60h；

2)、将经步骤(1)活化所得的黑曲霉接种至装有固体发酵培养基的固体发酵池内；固体发酵培养基的各组分的组成为：玉米碎粒15-30份、黄豆饼粉20-25份、二水合硫酸锰0.1-0.5份、二水合硫酸锌0.2-0.8份、七水合硫酸镁0.1-0.8份、稻壳25-35份、麸皮10-20份、尿素2-8份；接种黑曲霉的固体发酵培养基在28-30℃下发酵培养3-5天，直至黑曲霉的孢子数达到5×10⁸个/克，然后将发酵产物直接破碎，即得黑曲霉的单一菌粉。