CN103468614A - 一种餐厨垃圾分解菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种餐厨垃圾分解菌剂及其制备方法与应用。本发明所提供的餐厨垃圾分解菌剂，由以下重量份数的各物质混合而成：枯草芽孢杆菌30～50份、酿酒酵母10～30份、米曲霉10～30份、绿色木霉10～30份、黑曲霉10～30份。本发明将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、绿色木霉、黑曲霉的菌种进行高密度培养，再进行扩大培养，最后将培养得到的各单一菌体制备成干燥的菌粉，根据其用途采用合理配比，复合得到餐厨垃圾分解菌剂，用于餐厨垃圾的处理，具有以下优点：1、针对不同构成的餐厨垃圾可对单菌做合理配比，使得各个单菌相互协同降解餐厨垃圾；2、复合菌剂单个组分有效活菌数含量高，处理降解餐厨垃圾时用量少，成本低，使用方便，分解效果好。

Description

一种餐厨垃圾分解菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种餐厨垃圾分解菌剂，还涉及该餐厨垃圾分解菌剂的制备方法和应用。

背景技术

随着社会经济的快速发展以及城市化进程的加快，我国城市生活垃圾的产生量持续增加。生活垃圾中餐厨垃圾约占37%～62%，餐厨垃圾于普通垃圾相比其特点为：1、油脂含量高，粘性大；2、盐分含量高，微生物不易存活；3、堆放密度大，不易通风；4、含水率高；5、有机质含量高。餐厨垃圾处理不当就会腐烂变质，散发恶臭，传播细菌和病毒，滋生蚊蝇，污染环境。但从另一角度讲，餐厨垃圾具有丰富的营养元素、高有机物及无机盐含量，能合理处理会成为具有一定价值的资源。餐厨垃圾资源化处理对我国这样人均资源缺乏的发展中国家意义重大，也是我国面临的迫切问题。

目前，微生物技术在餐厨垃圾处理中的应用已成为重要的发展方向。好氧堆肥化技术与“就地处理”理念的结合是餐厨垃圾处理技术的重大突破。现有技术多采用60～80℃的高温工艺，设备运行费用高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种餐厨垃圾分解菌剂。

本发明所提供的餐厨垃圾分解菌剂，可由以下重量份数的各物质混合而成：枯草芽孢杆菌30～50份、酿酒酵母10～30份、米曲霉10～30份、绿色木霉10～30份、黑曲霉10～30份。

在本发明的实施例中，所述菌剂具体为如下四种的一种：

（I）由以下重量份数的各物质混合而成，枯草芽孢杆菌30份、酿酒酵母10份、米曲霉10份、绿色木霉10份、黑曲霉10份。

（II）由以下重量份数的各物质混合而成，枯草芽孢杆菌45份、酿酒酵母20份、米曲霉20份、绿色木霉15份、黑曲霉20份。

（III）由以下重量份数的各物质混合而成，枯草芽孢杆菌40份、酿酒酵母15份、米曲霉15份、绿色木霉25份、黑曲霉15份。

（IV）由以下重量份数的各物质混合而成，枯草芽孢杆菌50份、酿酒酵母30份、米曲霉30份、绿色木霉30份、黑曲霉30份。

所述菌剂中，所述枯草芽孢杆菌的有效含量为75亿cfu/g；所述酿酒酵母的有效含量为15亿cfu/g；所述米曲霉的有效含量为15亿cfu/g；所述绿色木霉的有效含量为7亿cfu/g；所述黑曲霉的有效含量为15亿cfu/g。

在本发明中，所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066；所述酿酒酵母具体为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219；所述米曲霉具体为米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119；所述绿色木霉具体为绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038；所述黑曲霉具体为黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106。以上各菌株均可从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得。

本发明的再一个目的是提供一种制备所述菌剂的方法。

本发明所提供的制备所述菌剂的方法，可包括如下步骤：

（1）将所述枯草芽孢杆菌、所述酿酒酵母、所述米曲霉、所述绿色木霉、所述黑曲霉分别单独进行菌株培养，将各菌株培养物干燥，获得各菌株单一菌粉；

（2）取如下重量份数的各菌株单一菌粉混合，得到所述菌剂：所述枯草芽孢杆菌的单一菌粉30～50份、所述酿酒酵母的单一菌粉10～30份、所述米曲霉的单一菌粉10～30份、所述绿色木霉的单一菌粉10～30份、所述黑曲霉的单一菌粉10～30份。

在上述方法中，步骤（1）中，对所述枯草芽孢杆菌进行菌株培养的培养基，溶剂为水，溶质及浓度如下：玉米粉10～15g/L（如10～13g/L或12～15g/L，具体如10g/L、12g/L、13g/L或15g/L）、葡萄糖3～8g/L（如3～5g/L，具体如3g/L、4g/L或5g/L）、豆饼粉18～22g/L（如18～20g/L，具体如18g/L或20g/L）、鱼粉3～8g/L（如3～4g/L，具体如3g/L或4g/L）、碳酸钙5～10g/L（如6～8g/L，具体如6g/L、7g/L或8g/L）、硫酸铵0.8～1.0g/L（如0.8～0.9g/L，具体如0.8g/L或0.9g/L）、磷酸氢二钾0.1～0.5g/L（如0.2～0.3g/L，具体如0.2g/L或0.3g/L）、硫酸镁0.1～0.3g/L（如0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L）、硫酸锰0.1～0.3g/L（如0.1g/L）；pH为自然pH。

在上述方法中，步骤（1）中，对所述酿酒酵母进行菌株培养的培养基为马铃薯葡萄糖培养基。所述马铃薯葡萄糖培养基的配方为：马铃薯200g煮汁，葡萄糖15g，用水定容至1L，pH为自然pH。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块加水煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。

在上述方法中，步骤（1）中，对所述米曲霉进行菌株培养的培养基是由原料混合物A和水按照质量比1:1～1:2（如1:1～1:1.8，具体如1:1、1:1.3、1:1.5或1:1.8）的比例混合而成，所述原料混合物A由以下重量份数的各物质组成：麸皮50～80份（如50～65份，具体如50份、55份、60份或65份）、玉米粉5～15份（如5～8份，具体如5份、6份或8份）、豆粕粉5～15份（如6～12份，具体如6份、8份、10份或12份）、磷酸氢二钾1～3份（如1份）、硫酸铵2～6份（如2～3份，具体如2份或3份）；pH为自然pH。

在上述方法中，步骤（1）中，对所述绿色木霉进行菌株培养的培养基是由原料混合物B和水按照质量比1:2～1:6（如1:2～1:4，具体如1:2、1:3、1:3.5、1:4）的比例混合而成，所述原料混合物B由以下重量份数的各物质组成：蘑菇渣60～80份（如60～70份，具体如60份、65份或70份）、麸皮2～8份（如2～6份，具体如2份、3份、5份或6份）、蔗糖1～3份（如1份）、磷酸氢二钾1～3份（如1～2份，具体如1份或2份）、硫酸镁1～3份（如1～2份，具体如1份或2份）；pH为自然pH。

在上述方法中，步骤（1）中，对所述黑曲霉进行菌株培养的培养基是由原料混合物C和水按照质量比1:1～1:3（如1:1～1:2，具体如1:1、1:1.5、1:1.8或1:2）的比例混合而成，所述原料混合物C由以下重量份数的各物质组成：麸皮20～40份（如22～35份，具体如22份、30份或35份）、稻草粉10～30份（如12～25份，具体如12份、18份、20份或25份）、硫酸铵1～5份（如1～3份，具体如1份、2份或3份）；pH为自然pH。

在上述方法中，步骤（1）中，对所述枯草芽孢杆菌进行菌株培养的条件为：温度36℃～40℃（如36℃～38℃，具体如36℃、37℃或38℃），发酵罐搅拌培养，转速200～220rpm（如200rpm），时间24～40h（如30～38h，具体如30h、32h、36h或38h）；

在上述方法中，步骤（1）中，对所述酿酒酵母进行菌株培养的条件为：温度30～32℃（如30℃），发酵罐搅拌培养，转速130～180rpm（如140～160rpm，具体如140rpm、150rpm或160rpm），时间60～84h（如60～66h，具体如60h、64h或66h）；

在上述方法中，步骤（1）中，对所述米曲霉进行菌株培养的条件为：温度28～30℃（如28～29℃，具体如28℃或29℃），固体发酵池培养，时间5～8天（如5～6天，具体如5天或6天）；

步骤（1）中，对所述绿色木霉进行菌株培养的条件为：温度28～30℃（如28℃），固体发酵池培养，时间5～8天（如5～7天，具体如5天、6天或7天）；

在上述方法中，步骤（1）中，对所述黑曲霉进行菌株培养的条件为：温度28～30℃（如28℃、30℃），固体发酵池培养，时间3～5天（如3～4天，具体如3天或4天）。

在上述方法中，步骤（1）中，用于干燥制备菌粉的各菌株培养物中的菌含量均大于等于10⁹个/mL。具体体现在：对于所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母而言，用于干燥制备菌粉的菌株培养物中的菌含量均需大于等于10⁹个/mL；对于所述米曲霉、所述绿色木霉和所述黑曲霉而言，用于干燥制备菌粉的菌株培养物中的菌株孢子的含量均需大于等于10⁹个/mL。

在上述方法的步骤（1）中，在所述“将所述枯草芽孢杆菌、所述酿酒酵母、所述米曲霉、所述绿色木霉、所述黑曲霉分别单独进行菌株培养”前，还包括对各菌株进行活化培养的步骤。

对所述枯草芽孢杆菌进行活化培养，其活化培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：葡萄糖15～20g/L（如16～18g/L，具体如16g/L、17g/L或18g/L）、蛋白胨10～15g/L（如10～13g/L，具体如10g/L、12g/L或13g/L）、氯化钠3～7g/L（如3～4g/L，具体如3g/L或4g/L）、牛肉膏0.3～0.8g/L（如0.3～0.5g/L，具体如0.3g/L、0.4g/L或0.5g/L）；pH为自然pH。对所述枯草芽孢杆菌进行活化培养的培养条件为：温度36～40℃（如37～38℃，具体如37℃或38℃）、摇瓶震荡培养，转速150～200rpm（如160～180rpm，具体如160rpm、170rpm或180rpm），时间24～32h（如24～30h，具体如24h、26h、28h或30h）。

对所述酿酒酵母进行活化培养，其活化培养基为WORT肉汤培养基。所述WORT肉汤培养基溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽浸粉15g/L、蛋白胨0.75g/L、麦芽糖12.75g/L、糊精2.75g/L、甘油2.5g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化铵1.0g/L；pH5.0±0.2。对所述酿酒酵母进行活化培养的培养条件为：温度28～30℃（如28℃、30℃）、摇瓶震荡培养，转速130～180rpm（如140～170rpm，具体如140rpm、150rpm、160rpm或170rpm），时间32～48h（如34～38h，具体如34h、36h或38h）。

对所述米曲霉进行活化培养，其活化培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：葡萄糖8～14g/L（如9～12h，具体如9g/L、10g/L或12g/L）、磷酸二氢钾1～3g/L（如1～2g/L，具体如1g/L或2g/L）、硫酸镁1～2g/L（如1g/L、2g/L）、硫胺素0.01～0.05g/L（如0.02～0.03g/L，具体如0.02g/L或0.03g/L）；pH为自然pH。对所述米曲霉进行活化培养的培养条件为：温度28～30℃（如28～29℃，具体如28℃或29℃）、摇瓶震荡培养，转速140～180rpm（如150～160rpm，具体如150rpm或160rpm），时间30～42h（如32～38h，具体如32h、36h或38h）。

对所述绿色木霉进行活化培养，其活化培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：羧甲基纤维素钠5～10g/L（如6～10g/L，具体如6g/L、8g/L、9g/L或10g/L）、蛋白胨2～8g/L（如3～6g/L，具体如3g/L、4g/L、5g/L或6g/L）、硫酸镁0.1～0.5g/L（如0.1～0.2g/L，具体如0.1g/L或0.2g/L）、氯化钙0.1～0.5g/L（如0.1g/L）、硫酸亚铁1～6mg/L（如2～3mg/L，具体如2mg/L或3mg/L）、硫酸锰1～6mg/L（如1mg/L）、硫酸锌2～6mg/L（如2mg/L）；pH为自然pH。对所述绿色木霉进行活化培养的培养条件为：温度28～30℃（如28℃）、摇瓶震荡培养，转速140～180rpm（如150～170rpm，具体如150rpm、160rpm或170rpm），时间54～72h（如54～68h，具体如54h、60h、64h或68h）。

对所述黑曲霉进行活化培养，其活化培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：麸皮15～30g/L（如15～25g/L，具体如15g/L、18g/L、20g/L或25g/L）、葡萄糖20～40g/L（如22～26g/L，具体如22g/L、25g/L或26g/L）、硫酸铵1～5g/L（如1～3g/L，具体如1g/L、2g/L或3g/L）、氯化钙1～3g/L（如1g/L）、硫酸锰0.1～0.5g/L（如0.2g/L）、硫酸镁0.2～0.6g/L（如0.2～0.3g/L，具体如0.2g/L或0.3g/L）；pH为自然pH。对所述黑曲霉进行活化培养的培养条件为：温度28～30℃（如28℃、30℃）、摇瓶震荡培养，转速140～180rpm（如140～160rpm，具体如140rpm、150rpm或160rpm），时间40～60h（如40～48h，具体如40h、42h、44h或48h）。

在本发明中，所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066；所述酿酒酵母具体为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219；所述米曲霉具体为米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119；所述绿色木霉具体为绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038；所述黑曲霉具体为黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106。

所述菌剂在分解餐厨垃圾中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供一种利用所述菌剂分解餐厨垃圾的方法。

本发明所提供的利用所述菌剂分解餐厨垃圾的方法，具体可包括将待分解餐厨垃圾与所述菌剂按照质量比为50：0.15至50：0.25的比例混合，进行发酵的步骤。

在所述方法中，将所述待分解餐厨垃圾与所述菌剂混合进行发酵的条件具体可如下：发酵温度30-45℃（如38℃）、发酵时间24h～30h（如28h）、搅拌频率为每搅拌5min暂停35min～40min（如35min）。

在所述方法中，所述待分解餐厨垃圾中水的质量百分含量具体可为50%～60%（如55.02%）。

在本发明的一个实施例中，所述待分解餐厨垃圾（以干基计）中淀粉的质量百分含量为53.24%、粗蛋白的质量百分含量为16.43%、粗脂肪的质量百分含量为17.57%、粗纤维的质量百分含量为3.26%。更加具体的，所述待分解餐厨垃圾的主要成分含量为（以干基计）：淀粉53.24%、粗蛋白16.43%、粗脂肪17.57%、粗纤维3.26%、其他9.5%，各含量均为质量百分含量。

本发明将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、绿色木霉、黑曲霉的菌种进行高密度培养，再进行扩大培养，最后将培养得到的各单一菌体制备成干燥的菌粉，根据其用途采用合理配比，复合得到餐厨垃圾分解菌剂，用于餐厨垃圾的处理，具有以下优点：

1、针对不同构成的餐厨垃圾可对单菌做合理配比，使得各个单菌相互协同降解餐厨垃圾；

2、复合菌剂单个组分有效活菌数含量高，处理降解餐厨垃圾时用量少，成本低，使用方便，分解效果好。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066，购自沧州华雨药业；

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219，购自安琪酵母股份有限公司；

米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119，购自沂源康源生物科技有限公司；

绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038，购自盐城市神威生物菌种科技有限公司；

黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106，购自沂源康源生物科技有限公司。

以上各菌株均为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株。

蛋白胨、牛肉膏：购自河南省偃师市科益生物制品厂；

玉米粉、豆饼粉：购自天津市冠前化工经销部，产品编号分别为th2289和th0668；

麸皮、蘑菇渣：采用北京平谷区大华山镇后北宫村麸皮、蘑菇废料等原材料研磨加工而成；

稻草粉：购自亳州市保华药业有限公司；

鱼粉、豆粕粉：购自无棣县德大农业有限公司，产品编号分别为399182716和1099431816。

下述实施例中，在各菌株的活化培养过程中所用摇床为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司公司生产的HZQ-C空气浴振荡器；在各菌株的扩大培养过程中所用的发酵罐为由NBSC新布伦瑞克科学公司的发酵罐。

实施例1、餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、绿色木霉、黑曲霉的菌种进行高密度培养，再进行扩大培养，最后将培养得到的各单一菌体制备成干燥的菌粉。

1、枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

（1）枯草芽孢杆菌的活化培养

枯草芽孢杆菌活化培养基：葡萄糖18g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠3g/L和牛肉膏0.4g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养上的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066的菌种接种至装有体积比为16%的活化培养基的摇瓶（如果摇瓶容积为100mL，那么装活化培养基的量为16mL）中，在培养温度为37℃、摇瓶转速为170rpm的摇瓶中活化培养24h（菌悬液的OD600为1.95）。

（2）枯草芽孢杆菌的扩大培养及菌粉获得

枯草芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉12g/L、葡萄糖3g/L、豆饼粉18g/L、鱼粉4g/L、碳酸钙6g/L、硫酸铵0.9g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、硫酸镁0.1g/L和硫酸锰0.1g/L，余量为水；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的枯草芽孢杆菌菌液接种到装有体积比为50%的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1%，在培养温度为36℃、发酵罐搅拌转速为200rpm的发酵罐中扩大培养30h，直至发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）枯草芽孢杆菌单一菌粉中活菌含量测定

①系列稀释

称取固体样品10g（精确到0.01g），加入带玻璃珠的100mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液菌悬液（基础液）。

用5mL无菌移液管分别吸取5.0mL上述母液菌悬液加入45mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×10¹，1:1×10²，1:1×10³，1:1×10⁴，……稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。

②加样及培养

每个样品取3个连续适宜的稀释度，用0.5mL无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于琼脂表面。

每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于适宜的条件下培养。

③菌落识别

根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。

④菌落计数

以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准（丝状真菌为10～150个菌落数），统计有效活菌数目。当只有一个稀释度，其有效菌平均菌落数在20～300之间时，则以该菌落数计算。若有两个稀释度，其有效菌平均菌落数均在20～300之间时，应按两者菌落总数之比值（稀释度大的菌落总数×10与稀释度小的菌落总数之比）决定，若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。有效活菌数按式（1）计算：

$n_m=\stackrel{\‾}{x}{\mathrm{kv}}_1/\left(m_0{v}_2\right)\×{10}^{-8}$    式（1）

式中：

n_m—质量有效活菌数，亿cfu/g。

—有效菌落平均数，个。

k—稀释倍数。

v₁—基础液体积，mL。

v₂—菌悬液加入量，mL。

m₀—样品量，g。

枯草芽孢杆菌有效活菌数测定所用固体培养基平板为牛肉膏蛋白胨培养基，其成分：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏3.0g/L、氯化钠(NaCl)5.0g/L、琼脂18.0g/L、pH7.2～7.5。

经测定步骤（2）所得枯草芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数为75亿cfu/g。

2、酿酒酵母单一菌粉的制备

（1）酿酒酵母的活化培养

酿酒酵母活化培养基为WORT肉汤培养基，WORT肉汤培养基溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽浸粉15g/L、蛋白胨0.75g/L、麦芽糖12.75g/L、糊精2.75g/L、甘油2.5g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化铵1.0g/L、pH5.0±0.2。

将纯化培养的斜面培养基上的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219菌种接种至装有体积比为18%的培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为140rpm的摇瓶中活化培养34h（菌悬液的OD560为2.48）。

（2）酿酒酵母的扩大培养及菌粉获得

酿酒酵母发酵培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：马铃薯200g煮汁，葡萄糖15g，用水定容至1L，pH为自然pH。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块加水煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。

将步骤（1）活化培养好的酿酒酵母菌液接种到装有体积比为50%培养基的发酵罐内，接种量为体积比1%，在培养温度为30℃、发酵罐搅拌转速为140rpm的发酵罐内扩大培养60h，直至发酵罐中酿酒酵母含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的酿酒酵母单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）酿酒酵母单一菌粉中活菌含量测定

酿酒酵母菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为麦芽汁琼脂培养基，成分为：12波林麦芽汁（Brix）1000mL、琼脂18.0g，pH5.4。

经测定步骤（2）所得的酿酒酵母单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

3、米曲霉单一菌粉的制备

（1）米曲霉的活化培养

米曲霉活化培养基：葡萄糖9g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1g/L、硫胺素0.02g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119菌种接种至装有体积比为18%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为150rpm的摇瓶中活化培养32h（菌丝干重为2.21g/100mL菌悬液）。

（2）米曲霉的扩大培养及菌粉获得

米曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1（料水比1:1）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮50份、玉米粉5份、豆粕粉6份、磷酸氢二钾1份、硫酸铵2份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的米曲霉菌液接种到装有体积比为50%发酵培养基的固体发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为28℃条件下扩大培养6d，直至发酵物料中米曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）米曲霉单一菌粉中活菌含量测定

米曲霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为马丁氏培养基，成分为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.0g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0g/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L、蛋白胨5.0g/L、1%(w/v)孟加拉红水溶液3.3mL/L、氯霉素0.1g/L、琼脂18.0g/L。

经测定步骤（2）所得的米曲霉单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

4、绿色木霉单一菌粉的制备

（1）绿色木霉的活化培养

绿色木霉活化培养基：羧甲基纤维素钠6g/L、蛋白胨3g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸锰1mg/L、硫酸锌2mg/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038菌种接种至装有体积比为20%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为150rpm的摇瓶中活化培养54h（菌丝干重为4.46g/100mL菌悬液）。

（2）绿色木霉的扩大培养及菌粉获得

绿色木霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:2（料水比1:2）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：蘑菇渣60份、麸皮2份、蔗糖1份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁1份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的绿色木霉菌液接种到装有体积比为40%发酵培养基的固体发酵池内，体积接种量为2%，在培养温度为28℃条件下扩大培养5d，直至发酵物料中绿色木霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）绿色木霉单一菌粉中活菌含量测定

绿色木霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为PDA培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

经测定步骤（2）所得的绿色木霉单一菌粉的有效活菌数为7亿cfu/g。

5、黑曲霉单一菌粉的制备

（1）黑曲霉的活化培养

黑曲霉活化培养基：麸皮15g/L、葡萄糖22g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.2g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106菌种接种至装有体积比为18%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为140rpm的摇瓶中活化培养40h（菌丝干重为8.05g/100mL菌悬液）。

（2）黑曲霉的扩大培养及菌粉获得

黑曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1（料水比1:1）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮22份、稻草粉12份、硫酸铵1份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的黑曲霉菌液接种到装有体积比为45%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为2%，在培养温度为28℃条件下扩大培养3d，直至发酵物料中黑曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）黑曲霉单一菌粉中活菌含量测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为察氏培养基，成分为硝酸钠（NaNO₃）3.0g/L，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）1.0g/L，硫酸镁（MgSO₄）0.5g/L，氯化钾（KCl）0.5g/L，硫酸亚铁（FeSO₄）0.01g/L，蔗糖30.0g/L，琼脂15.0g/L。

经测定步骤（2）所得的黑曲霉单一菌粉的有效活菌数为15亿cfu/g。

二、餐厨垃圾分解菌剂的制备

将步骤一得到的各单一菌粉，按枯草芽孢杆菌单一菌粉30份、酿酒酵母单一菌粉10份、米曲霉单一菌粉10份、绿色木霉单一菌粉10份、黑曲霉单一菌粉10份的重量比混合，得到餐厨垃圾分解菌剂。

实施例2、餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、绿色木霉、黑曲霉的菌种进行高密度培养，再进行扩大培养，最后将培养得到的各单一菌体制备成干燥的菌粉。

1、枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

（1）枯草芽孢杆菌活化培养基：葡萄糖16g/L、蛋白胨12g/L、氯化钠4g/L、牛肉膏0.3g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养上的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066菌种接种至装有体积比为20%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为38℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养26h（菌悬液的OD600为2.05）。

（2）枯草芽孢杆菌的扩大培养及菌粉获得

枯草芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉10g/L、葡萄糖4g/L、豆饼粉20g/L、鱼粉3g/L、碳酸钙7g/L、硫酸铵0.8g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.1g/L，余量为水；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的枯草芽孢杆菌菌液接种到装有体积比为60%的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2%，在培养温度为38℃、发酵罐搅拌转速为200rpm的发酵罐中扩大培养32h，直至发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）枯草芽孢杆菌单一菌粉中活菌含量测定

测定方法同实施例1步骤一1（3）所述。

经测定步骤（2）所得的枯草芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数为75亿cfu/g。

2、酿酒酵母单一菌粉的制备

（1）酿酒酵母的活化培养

酿酒酵母活化培养基为WORT肉汤培养基，WORT肉汤培养基溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽浸粉15g/L、蛋白胨0.75g/L、麦芽糖12.75g/L、糊精2.75g/L、甘油2.5g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化铵1.0g/L、pH5.0±0.2。

将纯化培养的斜面培养基上的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219菌种接种至装有体积比为20%的培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃、摇瓶转速为150rpm的摇瓶中活化培养36h（菌悬液的OD560为2.51）。

（2）酿酒酵母的扩大培养及菌粉获得

酿酒酵母发酵培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：马铃薯200g煮汁，葡萄糖15g，用水定容至1L，pH为自然pH。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块加水煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。

将步骤（1）活化培养好的酿酒酵母菌液接种到装有体积比为60%培养基的发酵罐内，接种量为体积比2%，所述活化培养和发酵时的培养基为麦芽汁马铃薯蔗糖培养基，在培养温度为30℃、发酵罐搅拌转速为150rpm的发酵罐内扩大培养66h，直至发酵罐中酿酒酵母含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的酿酒酵母单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）酿酒酵母单一菌粉中活菌含量测定

酿酒酵母菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为麦芽汁琼脂培养基，成分为：12波林麦芽汁（Brix）1000mL、琼脂18.0g、pH5.4。

经测定步骤（2）所得的酿酒酵母单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

3、米曲霉单一菌粉的制备

（1）米曲霉的活化培养

米曲霉活化培养基：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1g/L、硫胺素0.02g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119菌种接种至装有体积比为20%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养36h（菌丝干重为2.24g/100mL菌悬液）。

（2）米曲霉的扩大培养及菌粉获得

米曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1.3（料水比1:1.3）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮55份、玉米粉8份、豆粕粉8份、磷酸氢二钾1份、硫酸铵3份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的米曲霉菌液接种到装有体积比为55%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为2%，在培养温度为28℃条件下扩大培养5d，直至发酵物料中米曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）米曲霉单一菌粉中活菌含量测定

米曲霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为马丁氏培养基，成分为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.0g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0g/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L、蛋白胨5.0g/L、1%(w/v)孟加拉红水溶液3.3mL/L、氯霉素0.1g/L、琼脂18.0g/L。

经测定步骤（2）所得的米曲霉单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

4、绿色木霉单一菌粉的制备

（1）绿色木霉的活化培养

绿色木霉活化培养基：羧甲基纤维素钠8g/L、蛋白胨4g/L、硫酸镁0.1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸锰1mg/L、硫酸锌2mg/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038菌种接种至装有体积比为18%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养60h（菌丝干重为4.49g/100mL菌悬液）。

（2）绿色木霉的扩大培养及菌粉获得

绿色木霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:3（料水比1:3）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：蘑菇渣65份、麸皮3份、蔗糖1份、磷酸氢二钾2份、硫酸镁1份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的绿色木霉菌液接种到装有体积比为50%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为28℃条件下扩大培养6d，直至发酵物料中绿色木霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）绿色木霉单一菌粉中活菌含量测定

绿色木霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为PDA培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

经测定步骤（2）所得的绿色木霉单一菌粉的有效活菌数为7亿cfu/g。

5、黑曲霉单一菌粉的制备

（1）黑曲霉的活化培养

黑曲霉活化培养基：麸皮18g/L、葡萄糖26g/L、硫酸铵2g/L、氯化钙1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.3g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106菌种接种至装有体积比为20%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养42h（菌丝干重为8.10g/100mL菌悬液）。

（2）黑曲霉的扩大培养及菌粉获得

黑曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1.5（料水比1:1.5）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮30份、稻草粉18份、硫酸铵2份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的黑曲霉菌液接种到装有体积比为50%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为30℃条件下扩大培养4d，直至发酵物料中黑曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）黑曲霉单一菌粉中活菌含量测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为察氏培养基，成分为硝酸钠（NaNO₃）3.0g/L，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）1.0g/L，硫酸镁（MgSO₄）0.5g/L，氯化钾（KCl）0.5g/L，硫酸亚铁（FeSO₄）0.01g/L，蔗糖30.0g/L，琼脂15.0g/L。

经测定步骤（2）所得的黑曲霉单一菌粉的有效活菌数为15亿cfu/g。

二、餐厨垃圾分解菌剂的制备

将步骤一得到的各单一菌粉，按枯草芽孢杆菌单一菌粉45份、酿酒酵母单一菌粉20份、米曲霉单一菌粉20份、绿色木霉单一菌粉15份、黑曲霉单一菌粉20份的重量比混合，得到餐厨垃圾分解菌剂。

实施例3、餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、绿色木霉、黑曲霉的菌种进行高密度培养，再进行扩大培养，最后将培养得到的各单一菌体制备成干燥的菌粉。

1、枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

（1）枯草芽孢杆菌的活化培养

枯草芽孢杆菌活化培养基：葡萄糖18g/L、蛋白胨12g/L、氯化钠3g/L和牛肉膏0.5g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养上的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066菌种接种至装有体积比为25%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为37℃、摇瓶转速为180rpm的摇瓶中活化培养28h（菌悬液的OD600为2.06）。

（2）枯草芽孢杆菌的扩大培养及菌粉获得

枯草芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉13g/L、葡萄糖5g/L、豆饼粉20g/L、鱼粉3g/L、碳酸钙8g/L、硫酸铵0.9g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.1g/L，余量为水；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的枯草芽孢杆菌菌液接种到装有体积比为65%的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为3%，在培养温度为37℃、发酵罐搅拌转速为200rpm的发酵罐中扩大培养36h，直至发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）枯草芽孢杆菌单一菌粉中活菌含量测定

测定方法同实施例1步骤一1（3）所述。

经测定步骤（2）所得的枯草芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数为75亿cfu/g。

2、酿酒酵母单一菌粉的制备

（1）酿酒酵母的活化培养

酿酒酵母活化培养基为WORT肉汤培养基，WORT肉汤培养基溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽浸粉15g/L、蛋白胨0.75g/L、麦芽糖12.75g/L、糊精2.75g/L、甘油2.5g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化铵1.0g/L、pH5.0±0.2。

将纯化培养的斜面培养基上的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219菌种接种至装有体积比为25%的培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养38h（菌悬液的OD560为2.52）。

（2）酿酒酵母的扩大培养及菌粉获得

酿酒酵母发酵培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：马铃薯200g煮汁，葡萄糖15g，用水定容至1L，pH为自然pH。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块加水煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。

将步骤（1）活化培养好的酿酒酵母菌液接种到装有体积比为60%培养基的发酵罐内，接种量为体积比3%，在培养温度为30℃、发酵罐搅拌转速为160rpm的发酵罐内扩大培养64h，直至发酵罐中酿酒酵母含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的酿酒酵母单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）酿酒酵母单一菌粉中活菌含量测定

酿酒酵母菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为麦芽汁琼脂培养基，成分为：12波林麦芽汁（Brix）1000mL、琼脂18.0g、pH5.4。

经测定步骤（2）所得的酿酒酵母单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

3、米曲霉单一菌粉的制备

（1）米曲霉的活化培养

米曲霉活化培养基：葡萄糖12g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁2g/L、硫胺素0.02g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119菌种接种至装有体积比为25%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为29℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养38h（菌丝干重为2.26g/100mL菌悬液）。

（2）米曲霉的扩大培养及菌粉获得

米曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1.5（料水比1:1.5）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮60份、玉米粉份、豆粕粉10份、磷酸氢二钾1份、硫酸铵2份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的米曲霉菌液接种到装有体积比为55%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为29℃条件下扩大培养6d，直至发酵物料中米曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）米曲霉单一菌粉中活菌含量测定

米曲霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为马丁氏培养基，成分为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.0g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0g/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L、蛋白胨5.0g/L、1%孟加拉红水溶液3.3mL/L、氯霉素0.1g/L、琼脂18.0g/L。

经测定步骤（2）所得的米曲霉单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

4、绿色木霉单一菌粉的制备

（1）绿色木霉的活化培养

绿色木霉活化培养基：羧甲基纤维素钠9g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸亚铁3mg/L、硫酸锰1mg/L、硫酸锌2mg/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038菌种接种至装有体积比为25%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为170rpm的摇瓶中活化培养64h（菌丝干重为4.51g/100mL菌悬液）。

（2）绿色木霉的扩大培养及菌粉获得

绿色木霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:3.5（料水比1:3.5）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：蘑菇渣65份、麸皮5份、蔗糖1份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁1份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的绿色木霉菌液接种到装有体积比为55%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为28℃条件下扩大培养7d，直至发酵物料中绿色木霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）绿色木霉单一菌粉中活菌含量测定

绿色木霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为PDA培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

经测定步骤（2）所得的绿色木霉单一菌粉的有效活菌数为7亿cfu/g。

5、黑曲霉单一菌粉的制备

（1）黑曲霉的活化培养

黑曲霉活化培养基：麸皮20g/L、葡萄糖25g/L、硫酸铵3g/L、氯化钙1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.2g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106菌种接种至装有体积比为25%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃、摇瓶转速为150rpm的摇瓶中活化培养44h（菌丝干重为8.12g/100mL菌悬液）。

（2）黑曲霉的扩大培养及菌粉获得

黑曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1.8（料水比1:1.8）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮30份、稻草粉20份、硫酸铵3份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的黑曲霉菌液接种到装有体积比为55%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为4%，在培养温度为30℃条件下扩大培养4d，直至发酵物料中黑曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）黑曲霉单一菌粉中活菌含量测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为察氏培养基，成分为硝酸钠（NaNO₃）3.0g/L，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）1.0g/L，硫酸镁（MgSO₄）0.5g/L，氯化钾（KCl）0.5g/L，硫酸亚铁（FeSO₄）0.01g/L，蔗糖30.0g/L，琼脂15.0g/L。

经测定步骤（2）所得的黑曲霉单一菌粉的有效活菌数为15亿cfu/g。

二、餐厨垃圾分解菌剂的制备

将步骤一得到的各单一菌粉，按枯草芽孢杆菌单一菌粉40份、酿酒酵母单一菌粉15份、米曲霉单一菌粉15份、绿色木霉单一菌粉25份、黑曲霉单一菌粉15份的重量比混合，得到餐厨垃圾分解菌剂。

实施例4、餐厨垃圾分解菌剂的制备

一、各菌株单一菌粉的制备

分别对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、绿色木霉、黑曲霉的菌种进行高密度培养，再进行扩大培养，最后将培养得到的各单一菌体制备成干燥的菌粉。

1、枯草芽孢杆菌单一菌粉的制备

（1）枯草芽孢杆菌的活化培养

枯草芽孢杆菌活化培养基：葡萄糖17g/L、蛋白胨13g/L、氯化钠3g/L和牛肉膏0.5g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养上的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066菌种接种至装有体积比为30%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为37℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养30h（菌悬液的OD600为2.08）。

（2）枯草芽孢杆菌的扩大培养及菌粉获得

枯草芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉15g/L、葡萄糖3g/L、豆饼粉20g/L、鱼粉3g/L、碳酸钙8g/L、硫酸铵0.8g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L和硫酸锰0.1g/L，余量为水；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的枯草芽孢杆菌菌液接种到装有体积比为60%的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为3%，在培养温度为37℃、发酵罐搅拌转速为200rpm的发酵罐中扩大培养38h，直至发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）枯草芽孢杆菌单一菌粉中活菌含量测定

测定方法同实施例1步骤一1（3）所述。

经测定步骤（2）所得的枯草芽孢杆菌单一菌粉中有效活菌数为75亿cfu/g。

2、酿酒酵母单一菌粉的制备

（1）酿酒酵母的活化培养

酿酒酵母活化培养基为WORT肉汤培养基，WORT肉汤培养基溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽浸粉15g/L、蛋白胨0.75g/L、麦芽糖12.75g/L、糊精2.75g/L、甘油2.5g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、氯化铵1.0g/L、pH5.0±0.2。

将纯化培养的斜面培养基上的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219菌种接种至装有体积比为30%的培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃、摇瓶转速为170rpm的摇瓶中活化培养36h（菌悬液的OD560为2.50）。

（2）酿酒酵母的扩大培养及菌粉获得

酿酒酵母发酵培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：马铃薯200g煮汁，葡萄糖15g，用水定容至1L，pH为自然pH。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块加水煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。

将步骤（1）活化培养好的酿酒酵母菌液接种到装有体积比为65%培养基的发酵罐内，接种量为体积比3%，在培养温度为30℃、发酵罐搅拌转速为160rpm的发酵罐内扩大培养66h，直至发酵罐中酿酒酵母含量≥10⁹个/mL，然后将发酵得到的酿酒酵母单菌经过浓缩、干燥得到单一的菌粉。

（3）酿酒酵母单一菌粉中活菌含量测定

酿酒酵母菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为麦芽汁琼脂培养基，成分为：12波林麦芽汁（Brix）1000mL、琼脂18.0g、pH5.4。

经测定步骤（2）所得的酿酒酵母单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

3、米曲霉单一菌粉的制备

（1）米曲霉的活化培养

米曲霉活化培养基：葡萄糖12g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁2g/L、硫胺素0.03g/L，，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119菌种接种至装有体积比为30%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为150rpm的摇瓶中活化培养38h（菌丝干重为2.26g/100mL菌悬液）。

（2）米曲霉的扩大培养及菌粉获得

米曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:1.8（料水比1:1.8）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮65份、玉米粉6份、豆粕粉12份、磷酸氢二钾1份、硫酸铵2份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的米曲霉菌液接种到装有体积比为60%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为28℃条件下扩大培养6d，直至发酵物料中米曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）米曲霉单一菌粉中活菌含量测定

米曲霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为马丁氏培养基，成分为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.0g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0g/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L、蛋白胨5.0g/L、1%孟加拉红水溶液3.3mL/L、氯霉素0.1g/L、琼脂18.0g/L。

经测定步骤（2）所得的的米曲霉单一菌粉中有效活菌数为15亿cfu/g。

4、绿色木霉单一菌粉的制备

（1）绿色木霉的活化培养

绿色木霉活化培养基：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨6g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸锰1mg/L、硫酸锌2mg/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038菌种接种至装有体积比为30%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为28℃、摇瓶转速为160rpm的摇瓶中活化培养68h（菌丝干重为4.52g/100mL菌悬液）。

（2）绿色木霉的扩大培养及菌粉获得

绿色木霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:4（料水比1:4）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：蘑菇渣70份、麸皮6份、蔗糖1份、磷酸氢二钾1份、硫酸镁2份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的绿色木霉菌液接种到装有体积比为55%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为3%，在培养温度为28℃条件下扩大培养7d，直至发酵物料中绿色木霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）绿色木霉单一菌粉中活菌含量测定

绿色木霉菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为PDA培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

经测定步骤（2）所得的绿色木霉单一菌粉的有效活菌数为7亿cfu/g。

5、黑曲霉单一菌粉的制备

（1）黑曲霉的活化培养

黑曲霉活化培养基：麸皮25g/L、葡萄糖22g/L、硫酸铵3g/L、氯化钙1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.3g/L，余量为水；pH为自然pH。

将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106菌种接种至装有体积比为30%的活化培养基的摇瓶中，在培养温度为30℃、摇瓶转速为150rpm的摇瓶中活化培养48h（菌丝干重为8.14g/100mL菌悬液）。

（2）黑曲霉的扩大培养及菌粉获得

黑曲霉发酵培养基：由如下原料混合物和水按照质量比1:2（料水比1:2）的比例混合而成，所述原料混合物由以下重量份数的各物质组成：麸皮35份、稻草粉25份、硫酸铵3份；pH为自然pH。

将步骤（1）活化培养好的黑曲霉菌液接种到装有体积比为55%发酵培养基的发酵池内，体积接种量为4%，在培养温度为30℃条件下扩大培养4d，直至发酵物料中黑曲霉孢子含量≥10⁹个/mL，然后将发酵物料低温干燥、粉碎得到单一菌粉。

（3）黑曲霉单一菌粉中活菌含量测定

黑曲霉单一菌粉中有效活菌含量的测定与枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数的测定方法、步骤相同。其中，所用的固体平板培养基为察氏培养基，成分为硝酸钠（NaNO₃）3.0g/L，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）1.0g/L，硫酸镁（MgSO₄）0.5g/L，氯化钾（KCl）0.5g/L，硫酸亚铁（FeSO₄）0.01g/L，蔗糖30.0g/L，琼脂15.0g/L。

经测定步骤（2）所得的黑曲霉单一菌粉的有效活菌数为15亿cfu/g。

二、餐厨垃圾分解菌剂的制备

将步骤一得到的各单一菌粉，按枯草芽孢杆菌单一菌粉50份、酿酒酵母单一菌粉30份、米曲霉单一菌粉30份、绿色木霉单一菌粉30份、黑曲霉单一菌粉30份的重量比混合，得到餐厨垃圾分解菌剂。

实施例5、利用实施例1-4制备的菌剂分解餐厨垃圾

本实施例取实施例1-4制备的四种菌剂，分别接种至实际采集的餐厨垃圾中，考察菌剂在实际餐厨垃圾中发生的作用，测试指标选择餐厨垃圾的减量率。

一、实验方法

供试餐厨垃圾：初始含水量55.02%，主要成分含量为（以干基计）淀粉53.24%、粗蛋白16.43%、粗脂肪17.57%、粗纤维3.26%、其他9.5%。均为质量百分含量。

取供试餐厨垃圾4份，50公斤/份，取实施例1-4制备的四种菌剂，0.15公斤/种。将一份餐厨垃圾对应一份菌剂，一起放入餐厨垃圾处理机（由山东名流实业集团有限公司根据具体处理量需要进行加工生产）中，混合均匀后进行发酵反应，其中，发酵参数如下：温度38℃、搅拌频率5min/35min（每搅拌5min停35min）。待发酵反应28h结束后，测定物料减量率。实验重复三次。

二、实验结果

1、采用实施例1制备的菌剂接种实验结果；

（1）通过测定处理前后餐厨垃圾的重量计算得出垃圾的减量率为90.23%；

（2）通过测定淀粉减量率为98.62%、粗蛋白减量率90.21%、粗脂肪减量率89.02%、粗纤维减量率89.45%。

2.采用实施例2制备的菌剂接种实验结果；

（1）通过测定处理前后餐厨垃圾的重量计算得出垃圾的减量率为89.65%；

（2）通过测定淀粉减量率为94.02%、粗蛋白减量率95.23%、粗脂肪减量率98.63%、粗纤维减量率87.23%。

3.采用实施例3制备的菌剂接种实验结果；

（1）通过测定处理前后餐厨垃圾的重量计算得出垃圾的减量率为86.03%；

（2）通过测定淀粉减量率为93.12%、粗蛋白减量率89.96%、粗脂肪减量率88.75%、粗纤维减量率99.53%。

4.采用实施例4制备的菌剂接种实验结果；

（1）通过测定处理前后餐厨垃圾的重量计算得出垃圾的减量率为87.22%；

（2）通过测定淀粉减量率为89.64%、粗蛋白减量率98.42%、粗脂肪减量率99.62%、粗纤维减量率95.62%。

在具体的餐厨垃圾处理过程中可根据垃圾中淀粉、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的含量不同，有针对性的选择实施例1-4中的菌剂。

Claims (10)

1.一种餐厨垃圾分解菌剂，由以下重量份数的各物质混合而成：枯草芽孢杆菌30～50份、酿酒酵母10～30份、米曲霉10～30份、绿色木霉10～30份、黑曲霉10～30份。

2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066；或

所述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219；或

所述米曲霉为米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119；或

所述绿色木霉为绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038；或

所述黑曲霉为黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106。

3.制备权利要求1或2所述菌剂的方法，包括如下步骤：

（1）将所述枯草芽孢杆菌、所述酿酒酵母、所述米曲霉、所述绿色木霉、所述黑曲霉分别单独进行菌株培养，将各菌株培养物干燥，获得各菌株单一菌粉；

（2）取如下重量份数的各菌株单一菌粉混合，得到所述菌剂：所述枯草芽孢杆菌的单一菌粉30～50份、所述酿酒酵母的单一菌粉10～30份、所述米曲霉的单一菌粉10～30份、所述绿色木霉的单一菌粉10～30份、所述黑曲霉的单一菌粉10～30份。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，对所述枯草芽孢杆菌进行菌株培养的培养基，溶剂为水，溶质及浓度如下：玉米粉10～15g/L、葡萄糖3～8g/L、豆饼粉18～22g/L、鱼粉3～8g/L、碳酸钙5～10g/L、硫酸铵0.8～1.0g/L、磷酸氢二钾0.1～0.5g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、硫酸锰0.1～0.3g/L；

或

步骤（1）中，对所述酿酒酵母进行菌株培养的培养基为马铃薯葡萄糖培养基；

或

步骤（1）中，对所述米曲霉进行菌株培养的培养基是由原料混合物A和水按照质量比1:1～1:2的比例混合而成，所述原料混合物A由以下重量份数的各物质组成：麸皮50-80份、玉米粉5～15份、豆粕粉5～15份、磷酸氢二钾1～3份、硫酸铵2～6份；

或

步骤（1）中，对所述绿色木霉进行菌株培养的培养基是由原料混合物B和水按照质量比1:2～1:6的比例混合而成，所述原料混合物B由以下重量份数的各物质组成：蘑菇渣60～80份、麸皮2～8份、蔗糖1～3份、磷酸氢二钾1～3份、硫酸镁1～3份；

或

步骤（1）中，对所述黑曲霉进行菌株培养的培养基是由原料混合物C和水按照质量比1:1～1:3的比例混合而成，所述原料混合物C由以下重量份数的各物质组成：麸皮20～40份、稻草粉10～30份、硫酸铵1～5份。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，对所述枯草芽孢杆菌进行菌株培养的条件为：温度36℃～40℃，发酵罐搅拌培养，转速200～220rpm，时间24～40h；

或

步骤（1）中，对所述酿酒酵母进行菌株培养的条件为：温度30～32℃，发酵罐搅拌培养，转速130～180rpm，时间60～84h；

或

步骤（1）中，对所述米曲霉进行菌株培养的条件为：温度28～30℃，固体发酵池培养，时间5～8天；

或

步骤（1）中，对所述绿色木霉进行菌株培养的条件为：温度28～30℃，固体发酵池培养，时间5～8天；

或

步骤（1）中，对所述黑曲霉进行菌株培养的条件为：温度28～30℃，固体发酵池培养，时间3～5天。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，用于干燥制备菌粉的各菌株培养物中的菌含量均大于等于10⁹个/mL。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10066；或

所述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1219；或

所述米曲霉为米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2119；或

所述绿色木霉为绿色木霉（Trichoderma viride）CICC13038；或

所述黑曲霉为黑曲霉（Aspergillus niger）CICC2106。

8.权利要求1或2所述的菌剂在分解餐厨垃圾中的应用。

9.利用权利要求1或2所述菌剂分解餐厨垃圾的方法，包括将待分解餐厨垃圾与权利要求1或2所述的菌剂按照质量比为50：（0.15～0.25）的比例混合，进行发酵的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，将所述待分解餐厨垃圾与所述菌剂混合进行发酵的条件如下：发酵温度30-45℃、发酵时间24h～30、搅拌频率为每搅拌5min暂停35min～40min分钟；或

所述方法中，所述待分解餐厨垃圾中水的质量百分含量为50%～60%。