CN107794233A - 一种复合菌制剂及其制备方法和钻井废水的处理方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于微生物制剂领域，具体涉及一种复合菌制剂及其制备方法和钻井废水的处理方法。本发明公开了一种复合菌制剂，所述复合菌制剂包括克氏微球菌YL‑01、枯草芽孢杆菌ZJ‑02和解脂假丝酵母菌ZJ‑03，按干重百分比计，上述微生物的干重百分比含量依次为25％～50％、15％～35％和20％～40％，其中活菌数含量均为1010～1012个/g。本发明还公开了所述复合菌制剂的制备方法，及利用所述复合菌制剂处理钻井废水的方法。实验表明，本发明所述复合菌制剂对油田钻井废水中COD降解率高，降解效果好，处理过程没有二次污染，不存在污泥二次处置的问题，具有较好的应用前景。

Description

一种复合菌制剂及其制备方法和钻井废水的处理方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合菌制剂及其制备方法和钻井废水的处理方法。
背景技术
在石油开采的过程中，会产生大量的钻井废水。这些废水主要来源于废弃散落的泥浆、冲洗设备的动力用水、钻井过程中测试和作业产生的废水以及天然的降雨等。其中含有大量的泥沙、油类物质、重金属污染物和各种化学处理剂。如果不加处理直接外排钻井废水，将会给周围的生态环境带来很大的影响。因此研究钻井废水的处理方法，减少钻井废水的危害，有很重要的意义。
油田钻井废水成分复杂，主要特点是粘度高、胶体颗粒稳定性强、不易降解，属于高COD、高浊度、高含氧量的“三高废水”。针对这种难降解废水，常规的混凝-沉淀-过滤处理工艺已经很难将其达到回收和外排的标准，主要原因是有机物深度去除困难。为此，研究者们针对有机物的深度去除技术，开发了电絮凝技术、高级氧化技术等，利用上述物理化学法处理虽然可以实现有机物达标处理，但存在药剂用量大、成本高、有二次污染的缺陷。
在钻井废水处理中，环境微生物技术是最具有发展前景的技术，也是未来环境治理的主导技术，微生物处理技术具有低运行成本、应用范国广等优点。
张淑侠等在西安石油大学学报(自然科学版)发表了《采用复合菌剂处理深井聚磺钻井液废水技术研究》，该研究应用以活性污泥法处理工艺为主，辅助优选了复合菌剂HBS5，用于处理难降解聚磺类钻井液废水，24h后，COD去除率达87.5％～88.3％，但是存在污泥产生量大，需要二次处理的问题。冯栩等在环境工程学报期刊上发表了《钻井废水的生物强化处理》，研究从受钻井废水污染的土壤样品中筛选出7株菌株进行生物处理实验，并确定菌剂各组成菌株的最佳配比，制成复合微生物菌剂，对于进水COD为1369～1655mg/L的钻井废水，运行15d，复合菌剂对COD的降解率约为42％，但存在运行时间长的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中的钻井废水中有机物去除困难、需要二次处理的技术缺陷，提供了一种降解速度快、降解效果好、适应能力强的复合菌制剂及其制备方法和应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
本发明公开了一种复合菌制剂，按干重百分比计，包括以下组分：
克氏微球菌YL-01 25％～50％
枯草芽孢杆菌ZJ-02 15％～35％
解脂假丝酵母菌ZJ-03 20％～40％。
优选的，所述克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03的活菌数含量均为1010～1012个/g。
本发明公开了上述复合菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
a、分别将克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03接种于种子培养基中，在摇床上培养，得到3个种子液；
b、分别将步骤a得到的种子液接种于发酵培养基中，在摇床上培养，得到3个发酵液；
c、分别将步骤b得到的发酵液进行离心，倒掉上清液后收集菌体，冷冻干燥，粉碎，得到3种微生物固体菌剂；
d、分别称取步骤c中得到的3种微生物固体菌剂，混匀，得到复合菌制剂。
优选的，步骤a中所述种子培养基为：每1L含蛋白胨10～15g、酵母膏5～10g、葡萄糖1～2g、氯化钠1～5g、磷酸二氢钾1～3g、磷酸氢二钾0.5～1.5g、水补足，pH为6～8。
优选的，步骤a中所述种子液的培养条件为：接种量为体积百分比5％～10％，培养温度为25～37℃，培养时间为24～48h，转速为100～200rpm。
优选的，步骤b中所述发酵培养基为：每1L含酵母膏1～2g、硝酸铵0.5～2g、氯化钠0.01～0.2g、磷酸氢二钾0.05～2g、磷酸二氢钾0.05～1g、硫酸镁0.1～0.2g、氯化钙0.1～0.5g、水补足，pH为6～8。
优选的，步骤b中所述发酵液的培养条件为：接种量为体积百分比10％～20％，培养温度为25～37℃，培养时间为24～36h，转速为100～200rpm。
本发明还公开了一种钻井废水的处理方法，将复合菌制剂投加到所述钻井废水中，混匀，振荡。
优选的，按g/L计，所述复合菌制剂与钻井废水的质量体积比例为8％～12％。即100L钻井废水中加入复合菌制剂8g～12g。
优选的，所述振荡的时间为12～48h，温度为30～35℃。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下优点：
(1)提供了一种用于去除钻井废水中有机物的复合菌制剂，无二次污染缺陷、不存在污泥二次处置的问题，绿色环保、成本低廉，具有较好的应用前景；同时，该复合菌制剂为固体制剂，具有便于运输、保存、有效期长的优点；
(2)复合菌制剂中的克氏微球菌和枯草芽孢杆菌分别为好氧菌和好氧兼性厌氧菌，他们能够高效降解C-H有机物链，而解脂假丝酵母菌在高糖、高碳、高渗透压的条件下可以保持高活性，同时剩余的酵母可以作为单细胞蛋白，为其它菌种提供能量，这三种菌之间相互依赖、协同共生，形成有机物高效降解链，以钻井废水中对COD影响最大的高分子有机物为食物，将其以食物的形式进行消耗，从而降低废水中的COD值，达到有机物深度去除的目的；
(3)实验表明，本发明所述复合菌制剂对油田钻井废水中COD降解率高，降解效果好，按1:(8～12)的比例(g/L)往钻井废水中投入复合菌制剂，混匀振荡后，钻井废水中测得的COD值迅速降低，12h时COD降解率达56％以上，而48h时COD降解率达90％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1实施例1的测序结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种复合菌制剂及其制备方法，所述复合菌制剂能迅速有效地降解钻井废水中的有机物质，绿色环保，成本低廉。
本发明公开的复合菌制剂主要由三种微生物的菌体组成，这3种微生物分别为克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03；按干重百分比计，以上3种微生物的含量依次为25％～50％、15％～35％和20％～40％。
其中，克氏微球菌YL-01是从油田井场石油污染土壤分离纯化得到，并鉴定为克氏微球菌Kocuria roseus，其余两种微生物菌株均可从市场上购买得到。
本发明公开的复合菌制剂中的克氏微球菌和枯草芽孢杆菌分别为好氧菌和好氧兼性厌氧菌，他们能够高效降解C-H有机物链，而解脂假丝酵母菌在高糖、高碳、高渗透压的条件下可以保持高活性，同时剩余的酵母可以作为单细胞蛋白，为其它菌种提供能量，这三种菌之间相互依赖、协同共生，形成有机物高效降解链，以钻井废水中对COD影响最大的高分子有机物为食物，将其以食物的形式进行消耗，从而降低废水中的COD值，达到有机物深度去除的目的。
本发明还公开了制备该复合菌制剂的方法，首先通过对上述微生物进行发酵获得其菌体，然后对菌体进行冻干，采用本领域常规技术手段进行粉碎，得到以上3种微生物固体菌剂，其中这3种微生物的固体制剂的活菌数均为1010～1012个/g；再将上述固体菌剂按上述比例进行混合，最后得到所述复合菌制剂，待用。
为了最大限度发挥不同微生物之间的互利共生的协同作用，以实现本发明复合菌制剂对钻井废水中高分子有机污染物快速有效的降解，在实验过程中对微生物的培养发酵温度、培养时间和转速进行了调整，还对发酵时的种子培养基、发酵培养基以及接种量进行了优化。
本发明还将该复合菌制剂应用于钻井废水中有毒高分子有机化合物的处理，发现按g/L计，复合菌制剂与钻井废水的质量体积比例为8％～12％添加，混匀振荡后，钻井废水中测得的COD值迅速降低，12h时COD降解率达56％以上，而48h时COD降解率达90％以上，表明该复合菌制剂能快速有效降解钻井废水中的高分子有机化合物，可作为一种钻井废水的处理制剂，绿色环保，成本低廉。
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
本发明实施例中的微生物菌株是：克氏微球菌YL-01(Kocuria roseus，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号CICC 10109)、枯草芽孢杆菌ZJ-02(Bacillussubtilis，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 1.3382)、解脂假丝酵母菌ZJ-03(Candida lipolytica，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 1457)。其中，除了克氏微球菌YL-01是从油田井场石油污染土壤分离纯化得到，其余两种微生物菌株均为市售。
实施例1克氏微球菌ZL-01的分离纯化
1、分离纯化
以油田井场石油污染土壤为取样源，对土壤中的细菌进行富集培养后，涂布于含有3％高分子有机化合物胍胶的固体培养基上，在40℃条件下培养7天后，在平板上挑取单菌落经过平板划线分离纯化后得到一株具有优良性状的菌株，并编号为YL-01。
2、菌种鉴定
(1)培养特征
将克氏微球菌YL-01接种在胍胶琼脂培养基上，培养2天后长出橙色菌落，细胞为近球形且成对出现，菌落形状为近圆形，边缘整齐呈凸起状；为耗氧细菌，生长温度为33～37℃。
(2)采用16S rRNA对菌株进行鉴定
按照上海生工生物工程技术服务有限公司的DNA抽提试剂盒说明书描述的方法对克氏微球菌YL-01的RNA进行提取；所用到的引物为27F和1492R，其序列分别如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，
1492R：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件为：
95℃预变性5min；
96℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸1.5min，30个循环；
72℃延伸10min。
取5μL扩增产物做1.5％琼脂糖凝胶电泳，以TaKaRa DNA Marker DL2000作为扩增产物分子量的参照，并设一空白作为阴性对照；将回收纯化的PCR扩增产物送去测序，测序结果如图1所示。
将所得基因序列通过BLAST与Genbank中的16S rDNA序列进行同源性比较，可知YL-01为克氏微球菌Kocuria roseus。其中具体比对方法为所得基因序列使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。登陆http://www.ncbi.ulm.nih.gov，将所得基因序列通过BLAST与Genbank中的16srRNA序列进行同源性比较，使用数据库为GenBank+EMBL+PDB+DDBJ。
实施例2：一种复合菌制剂的制备
1、实验材料
种子培养基：每1L含10g蛋白胨、5g酵母膏、1g葡萄糖、1g氯化钠、1g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、水补足，氢氧化钠调节培养基pH为6。
发酵培养基：每1L含1g的酵母膏、0.5g的硝酸铵、0.01g的氯化钠、0.05g的磷酸氢二钾、0.05g的磷酸二氢钾、0.1g的硫酸镁，0.1g的氯化钙、水补足，氢氧化钠调节培养基pH为6。
2、制备
(1)分别将克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03按体积比为5％的接种量接种于种子培养基中，在摇床上25℃下100rpm培养24h，得到种子液。
(2)分别将步骤(1)得到的种子液按体积比为10％的接种量接种于发酵培养基中，在摇床上25℃下100rpm培养24h，得到发酵液。
(3)分别将步骤(2)得到的发酵液进行离心，倒掉上清液，收集菌体，冷冻干燥，粉碎，得到上述3种微生物固体菌剂。其中，这3种微生物的固体制剂的活菌数分别为克氏微球菌YL-01为2.1×1010个/g、枯草芽孢杆菌ZJ-02为3.5×1010个/g和解脂假丝酵母菌ZJ-03为1.8×1010个/g。
(4)按干重百分比计，分别称取25％克氏微球菌YL-01固体菌剂、35％的枯草芽孢杆菌ZJ-02和40％的解脂假丝酵母菌ZJ-03，混合均匀，得到复合微生物菌剂，待用。
实施例3：一种复合菌制剂的制备方法
1、实验材料
种子培养基每1L含15g蛋白胨、10g酵母膏、2g葡萄糖、5g氯化钠、3g磷酸二氢钾、1.5g磷酸氢二钾、水补足，氢氧化钠调节培养基pH为8。
发酵培养基每1L含2g的酵母膏、2g的硝酸铵、0.2g的氯化钠、2g的磷酸氢二钾、1g的磷酸二氢钾、0.2g的硫酸镁，0.5g的氯化钙、水补足，氢氧化钠调节培养基pH为8。
2、制备
(1)分别将克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03按体积比为10％的接种量接种于种子培养基中，在摇床上37℃下200rpm培养48h，得到种子液。
(2)分别将步骤(1)得到的种子液按体积比为20％的接种量接种于发酵培养基中，在摇床上37℃下200rpm培养36h，得到发酵液。
(3)分别将步骤(2)得到的发酵液进行离心，倒掉上清液，收集菌体，冷冻干燥，粉碎，得到上述3种微生物固体菌剂。其中，这3种微生物的固体制剂的活菌数均为克氏微球菌YL-01为3.1×1012个/g、枯草芽孢杆菌ZJ-02为7.9×1011个/g和解脂假丝酵母菌ZJ-03为5.4×1012个/g
(4)按干重百分比计，分别称取50％的克氏微球菌YL-01，15％的枯草芽孢杆菌ZJ-02和35％的解脂假丝酵母菌ZJ-03，混合均匀，得到复合微生物菌剂，待用。
实施例4：一种复合菌制剂的制备方法
1、实验材料
种子培养基：每1L含12g蛋白胨、8g酵母膏、1.5g葡萄糖、2.5g氯化钠、1.5g磷酸二氢钾、1g磷酸氢二钾、水补足，氢氧化钠调节培养基pH为7。
发酵培养基：每1L含1.5g的酵母膏、1g的硝酸铵、0.1g的氯化钠、1g的磷酸氢二钾、0.5g的磷酸二氢钾、0.15g的硫酸镁，0.25g的氯化钙、水补足，氢氧化钠调节培养基pH为7。
2、制备
(1)分别将克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03按体积比为7％的接种量接种于种子培养基中，在摇床上32℃下150rpm培养36h，得到种子液。
(2)分别将步骤(1)得到的种子液按体积比为15％的接种量接种于发酵培养基中，在摇床上35℃下150rpm培养30h，得到发酵液。
(3)分别将步骤(2)得到的发酵液进行离心，倒掉上清液，收集菌体，冷冻干燥，粉碎，得到上述3种微生物固体菌剂。其中，这3种微生物的固体制剂的活菌数均为克氏微球菌YL-01为8.5×1011个/g、枯草芽孢杆菌ZJ-02为1.3×1012个/g和解脂假丝酵母菌ZJ-03为4.3×1011个/g。
(4)按干重百分比计，分别称取45％的克氏微球菌YL-01，35％的枯草芽孢杆菌ZJ-02和20％的解脂假丝酵母菌ZJ-03，混合均匀，得到复合微生物菌剂，待用。
实施例5本发明复合菌制剂对页岩气压裂返排液中有机物的处理效果
COD是以化学方法测量水样中需要被氧化的还原性物质的量，COD值减少的幅度可反映出水样中有机物被降解的情况。
取油田某井钻井废水，按g/L计，复合菌制剂与钻井废水质量体积比为10％(即100L钻井废水中加入复合菌制剂10g)的投加量将实施例2得到的复合菌剂加入到钻井废水中，混合均匀后，在35℃下150rpm摇床振荡12h，以后每隔12h测定钻井废水中的COD含量，
保持其他条件不变，仅改变实施例3、实施例4中复合菌制剂的投加量分别为8％和12％，振荡温度分别为30℃和33℃，测定COD值。结果见表1。
表1复合菌制剂对钻井废水中COD的处理效果
如表1结果显示，随着降解时间的延长，本发明复合菌制剂对钻井废水中有机物的降解率逐渐增加，特别是降解时间为12～24h时，本发明复合菌制剂对COD具有很高的初始降解速率，当降解时间为36h时，COD基本达到平衡值，表明，本发明公开的本发明复合菌制剂对钻井废水中COD降解效果良好，降解率较快，达到平衡的降解时间较短，且处理过程没有二次污染，不存在污泥二次处置的问题。

Claims (10)

1.一种复合菌制剂，其特征在于，按干重百分比计，包括：
克氏微球菌YL-01 25％～50％
枯草芽孢杆菌ZJ-02 15％～35％
解脂假丝酵母菌ZJ-03 20％～40％。
2.根据权利要求1所述的复合菌制剂，其特征在于，所述克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03的活菌数含量均为1010～1012个/g。
3.如权利要求1或2所述的一种复合菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、分别将克氏微球菌YL-01、枯草芽孢杆菌ZJ-02和解脂假丝酵母菌ZJ-03接种于种子培养基中，在摇床上培养，得到3个种子液；
b、分别将步骤a得到的种子液接种于发酵培养基中，在摇床上培养，得到3个发酵液；
c、分别将步骤b得到的发酵液进行离心，倒掉上清液后收集菌体，冷冻干燥，粉碎，得到3种微生物固体菌剂；
d、分别称取步骤c中得到的3种微生物固体菌剂，混匀，得到复合菌制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a中所述种子培养基为：每1L含蛋白胨10～15g、酵母膏5～10g、葡萄糖1～2g、氯化钠1～5g、磷酸二氢钾1～3g、磷酸氢二钾0.5～1.5g、水补足，pH为6～8。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a中所述种子液的培养条件为：接种量为体积百分比5％～10％，培养温度为25～37℃，培养时间为24～48h，转速为100～200rpm。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b中所述发酵培养基为：每1L含酵母膏1～2g、硝酸铵0.5～2g、氯化钠0.01～0.2g、磷酸氢二钾0.05～2g、磷酸二氢钾0.05～1g、硫酸镁0.1～0.2g、氯化钙0.1～0.5g、水补足，pH为6～8。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b中所述发酵液的培养条件为：接种量为体积百分比10％～20％，培养温度为25～37℃，培养时间为24～36h，转速为100～200rpm。
8.一种钻井废水的处理方法，其特征在于，将权利要求1或2所述复合菌制剂投加到所述钻井废水中，混匀，振荡。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，按g/L计，所述复合菌制剂与钻井废水的质量体积比例为8％～12％。
10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述振荡的时间为12～48h，温度为30～35℃。
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