CN104830711B

CN104830711B - 一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺

Info

Publication number: CN104830711B
Application number: CN201510103087.XA
Authority: CN
Inventors: 杨彩梅; 刘秀婷; 羊春雨; 倪志兵; 刘金松
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: COFCO (BEIJING) FEED TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2015-03-09
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2035-03-09
Also published as: CN104830711A

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，包括步骤：一级培养，二级培养，圆盘培养，烘干及粉碎。本发明的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺具有圆盘发酵装置实现了机械化操作，入料、出料、培养过程中的翻料，均由机械实现操作，在整个操作过程中，人与物料不直接接触，避免了人为的污染；发酵过程中温度、湿度、氧的补充都可以进行严格控制，从而使益生菌的生长能在适宜的环境中进行，提高了解淀粉芽孢杆菌的发酵效率；减少了劳动强度，提高了劳动生产率；圆盘的底部可能通入热风，从而使发酵产物干燥，同时由于干燥温度可达80‑85℃，这样的高温可以对圆盘本身进行消毒，避免了可能存在的交叉污染。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺

技术领域

本发明属于饲料添加剂制剂领域，涉及解淀粉芽孢杆菌益生菌的固体发酵工艺。

背景技术

随着集约化养殖业的发展，抗生素在畜禽饲料中的用量越来越大，抗生素的药物残留和抗药性对人类健康的影响带来许多不良影响。饲用益生菌是近年来出现的一类新型饲料添加剂，它可直接饲喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防疾病、促进动物生长和提高饲料利用率的目的，其中芽孢杆菌是应用最广泛的一类饲用益生菌，因为芽孢杆菌以孢子形式存在，具有耐热、耐酸、耐胆盐的特性，在饲料制粒过程中损失较少，进入肠道后可以萌发为具有新陈代谢作用的益生菌群。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的益生菌，具有很强的抑制真菌和细菌的作用。2008年，欧盟已批准解淀粉芽孢杆菌作为饲料添加剂在肉鸡中使用，解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌，在发酵过程中能产生抑菌活性肽和淀粉酶、蛋白酶等，其发酵产物对抑制肠道有害菌、促进营养物质消化吸收有重要作用，申请号为201410380289.4的专利公布了一种解淀粉芽孢杆菌的液体发酵方法，由于解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌肽和淀粉酶等易溶于水，采用液体发酵的方法容易使这些活性成分随废水而排出，该专利通过膜过滤的方法提取解淀粉芽孢杆菌中的有效抑菌成分，但过程比较复杂，而且成本高，得率低。

固体发酵方法是目前认为比较理想的解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，因为固体发酵的过程不仅保存了菌体，而且解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌肽和淀粉酶等有效成分与菌体混合，用作饲料添加剂时不仅可以发挥菌体本身的作用，而且可以发挥代谢产物的作用，有利于解淀粉芽孢杆菌在动物体内发挥作用，但固体发酵过程中存在温度控制困难、产品发酵时间长、容易感染杂菌、发酵装置消毒困难、劳动强度大、人工成本高等问题。

发明内容

本发明针对解淀粉芽孢杆菌发酵过程中存在的问题，采用新的发酵工艺，解决解淀粉芽孢杆菌发酵过程中的温度控制、杂菌控制等问题，减少劳动强度。

本发明的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，包括如下步骤：

1)一级培养：取适量解淀粉芽孢杆菌接种于内含培养基I的三角瓶中，于培养摇床内培养，得到一级种子；

2)二级培养：取种子罐，并投入配制的培养基II，将步骤1)的一级种子投入种子罐中扩大培养18-20h，得到二级种子；

3)圆盘培养：取自制圆盘装置，放入固态培养基III，然后于培养基III上接种步骤2)的二级种子进行发酵，所述接种的二级种子重量为培养基III重量的1-5％；发酵24-36h后，检测转芽孢率，当转芽孢率大于85％时停止发酵，得到发酵产物；

4)烘干：调节自制圆盘装置的温度，并通入热风，使自制圆盘装置的温度达到80-85℃，将步骤3)的发酵产物进行烘干；

5)粉碎：将步骤4)烘干的发酵产物进行粉碎，过40-60目筛，利用辅料调配发酵产物，使解淀粉芽孢杆菌的含量为1×10⁹-1×10¹⁰cfu/g，即得解淀粉芽孢杆菌产品。

进一步的，所述步骤1)的解淀粉芽孢杆菌为保藏号为CGMCC No.9384的解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌菌液含量为50×10⁸cfu/mL。

进一步的，所述步骤1)的培养基I为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，为高温灭菌的pH为7.0且内含5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠的水基培养基；所述培养摇床内培养时间为18-20h。

进一步的，所述步骤2)的培养基II为扩大培养基，为高温灭菌的pH为7.0且内含20g/L葡萄糖、10g/L玉米粉、40g/L大豆粉、8g/L酵母粉、1g/L硅油(H201-100)、0.5g/L碳酸氢钙、0.015g/L氯化钙、1g/L硫酸铵、0.15g/L硫酸镁和0.15g/L硫酸锰的水基培养基，所述pH由NaHCO₃调节。

进一步的，所述步骤2)的扩大培养条件为温度37-39℃，搅拌，通气量为8-10m³/h。

进一步的，所述步骤3)的培养基III为固体发酵培养基，为高温灭菌后冷却至37℃的内含质量分数为45％酱油豆粕、15％米糠、0.12％硫酸镁、0.12％硫酸锰的水基培养基，pH自然。

进一步的，所述步骤3)的自制圆盘装置的直径为6-10m，高度为0.5-0.8m，圆盘的底部布满直径0.1-0.2mm的小孔，且圆盘下面连接有通风装置；所述步骤3)的发酵条件为：将自制圆盘装置放置于直径大于圆盘直径的密闭房间内，通过温控装置调节房间温度为37-42℃，湿度为60-90％，通风装置每隔4-5小时启动一次，对物料进行翻动，每次翻动时间为10-15分钟，所述密闭房间装有观察窗，通过观察窗监控发酵过程。

该圆盘下连接的通风装置，通风的温度可控制，通风有两个功能，一是可以通过通热风或冷风来控制物料温度，二是可以通过通风来对物料进行翻动。

进一步的，所述步骤1)的三角瓶含量为5L，内装2L培养基I；所述步骤2)的种子罐容量为500L，内装300L培养基II；所述步骤3)的自制圆盘装置上放入的培养基III料层厚度为200-300mm。

进一步的，所述步骤5)的辅料为轻质碳酸钙或玉米淀粉。

进一步的，所述高温灭菌条件为温度115-128℃，时间20-35min。

益生菌的发酵分为固体发酵和液体发酵，目前采用液体发酵方法的较多，液体发酵存在发酵速度快，发酵产量高，发酵产品杂菌率低等优点，但液体发酵过程中所有的原材料均需严格灭菌，灭菌过程稍有偏差就会导致发酵过程的失败，而且液体发酵设备成本高，益生菌在发酵过程中产生的很多产物如抑菌蛋白和酶类会溶于水，发酵结束后这些有效成分会随废水而排出体外，一方面减少了发酵产物的作用效果，另一方面增加了废水的处理成本。而益生菌传统的固体发酵多采用托盘法或固体发酵罐法，固体发酵法成本较低，但托盘法发酵过程存在温度不均匀，发酵过程中需要人工翻动，会造成人为污染，所以杂菌率较高，影响了发酵产品的性能，采用固体发酵罐法又存在成本较高，而且产量小的问题，为解决解淀粉芽孢杆菌发酵过程中存在的这些问题。

本发明所用解淀粉芽孢杆菌保藏号为：CGMCC No.9384，单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，时间为：2014年6月25日，名称为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

本发明提出了一种新的发酵方式，即用一种圆盘发酵装置来进行发酵，其优点主要表现在四个方面：

(1)圆盘发酵装置实现了机械化操作，入料、出料、培养过程中的翻料，均由机械实现操作，在整个操作过程中，人与物料不直接接触，避免了人为的污染；

(2)发酵过程中温度、湿度、氧的补充都可以进行严格控制，从而使解淀粉芽孢杆菌的生长能在适宜的环境中进行，提高了发酵效率；

(3)减少了劳动强度，提高了劳动生产率；

(4)圆盘的底部可通入热风，从而使发酵产物干燥，同时由于干燥温度可达80-85℃，这样的高温可以对圆盘本身进行消毒，避免了可能存在的交叉污染。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

本实施例的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，包括如下步骤：

1)一级培养：取3mL浓度为50×10⁸cfu/mL的解淀粉芽孢杆菌(保藏号为CGMCCNo.9384)接种于内含2L培养基I的5L三角瓶中，该培养基I为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，为内含5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠的水基培养基，之后调节pH为7.0并于121℃下高温灭菌30min，再放于培养摇床内培养18h，得到一级种子；

2)二级培养：取500L种子罐，并投入配制的300L培养基II，该培养基II为扩大培养基，为内含20g/L葡萄糖、10g/L玉米粉、40g/L大豆粉、8g/L酵母粉、1g/L硅油(H201-100)、0.5g/L碳酸氢钙、0.015g/L氯化钙、1g/L硫酸铵、0.15g/L硫酸镁和0.15g/L硫酸锰的水基培养基，之后用NaHCO₃调节pH为7.0并于121℃下高温灭菌30min；将步骤1)的一级种子投入种子罐中于37℃下搅拌液体并保持通气量为10m³/h条件下扩大培养18h得到二级种子；

3)圆盘培养：取直径为6m，高度为0.8m的自制圆盘装置，圆盘的底部布满直径0.1mm的小孔，且圆盘下面连接有通风装置，在自制圆盘装置上放入料层厚度为300mm的固态培养基III，该培养基III为固体发酵培养基，为内含质量分数为45％酱油豆粕、15％米糠、0.12％硫酸镁、0.12％硫酸锰的水基培养基，pH自然，接着于115℃下高温灭菌20min后冷却至37℃，然后于培养基III上接种重量为培养基III的5％的步骤2)的二级种子进行发酵，将自制圆盘装置放置于直径大于圆盘直径的密闭房间内，通过温控装置调节房间温度为37℃，湿度为60％，通风装置每隔4小时启动一次，对物料进行翻动，每次翻动时间为10分钟，所述密闭房间装有观察窗，通过观察窗监控发酵过程；发酵24h后，检测转芽孢率，当转芽孢率大于85％时停止发酵，得到发酵产物；

4)烘干：调节自制圆盘装置的温度，并通入热风，使自制圆盘装置的温度达到80℃，将步骤3)的发酵产物进行烘干；

5)粉碎：将步骤4)烘干的发酵产物进行粉碎，过40目筛，利用辅料轻质碳酸钙调配发酵产物，使解淀粉芽孢杆菌的含量为1.0×10⁹cfu/g，即得解淀粉芽孢杆菌产品。

实施例2

1)一级培养：取3mL浓度为50×10⁸cfu/mL的解淀粉芽孢杆菌(保藏号为CGMCCNo.9384)接种于内含2L培养基I的5L三角瓶中，该培养基I为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，为内含5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠的水基培养基，之后调节pH为7.0并于121℃下高温灭菌30min，再放于培养摇床内培养20h，得到一级种子；

2)二级培养：取500L种子罐，并投入配制的300L培养基II，该培养基II为扩大培养基，为内含20g/L葡萄糖、10g/L玉米粉、40g/L大豆粉、8g/L酵母粉、1g/L硅油(H201-100)、0.5g/L碳酸氢钙、0.015g/L氯化钙、1g/L硫酸铵、0.15g/L硫酸镁和0.15g/L硫酸锰的水基培养基，之后用NaHCO₃调节pH为7.0并于128℃下高温灭菌35min；将步骤1)的一级种子投入种子罐中于37℃下搅拌液体并保持通气量为8m³/h条件下扩大培养20h得到二级种子；

3)圆盘培养：取直径为10m，高度为0.5m的自制圆盘装置，圆盘的底部布满直径0.2mm的小孔，且圆盘下面连接有通风装置，在自制圆盘装置上放入料层厚度为200mm的固态培养基III，该培养基III为固体发酵培养基，为内含质量分数为45％酱油豆粕、15％米糠、0.12％硫酸镁、0.12％硫酸锰的水基培养基，pH自然，接着于115℃下高温灭菌20min后冷却至37℃，然后于培养基III上接种重量为培养基III的1％的步骤2)的二级种子进行发酵，将自制圆盘装置放置于直径大于圆盘直径的密闭房间内，通过温控装置调节房间温度为37℃，湿度为90％，通风装置每隔5小时启动一次，对物料进行翻动，每次翻动时间为15分钟，所述密闭房间装有观察窗，通过观察窗监控发酵过程；发酵36h后，检测转芽孢率，当转芽孢率大于90％时停止发酵，得到发酵产物；

4)烘干：调节自制圆盘装置的温度，并通入热风，使自制圆盘装置的温度达到85℃，将步骤3)的发酵产物进行烘干；

5)粉碎：将步骤4)烘干的发酵产物进行粉碎，过60目筛，利用辅料玉米淀粉调配发酵产物，使解淀粉芽孢杆菌的含量为1.0×10¹⁰cfu/g，即得解淀粉芽孢杆菌产品。

将制备的解淀粉芽孢杆菌产品应用于相关检测，检测内容及结果如下：

1、固体发酵产品质量检测

将通过液体发酵方法、传统的固体发酵方法和本发明的新型固体发酵技术生产的，未经后处理的解淀粉芽孢杆菌进行了产品质量检测。

表1 不同发酵方法生产的解淀粉芽孢杆菌产品质量检测报告

表1结果表明：与液体发酵产品和传统固体发酵产品相比，本发明的固体发酵产品中有效活菌数含量更高，杂菌率更低，其中有害菌(大肠杆菌和霉菌)明显降低。说明利用本发明的固体发酵工艺可提高产品中有效活菌数，降低杂菌率，有效抑制有害菌(如大肠杆菌、霉菌)的产生。

2、不同发酵工艺生产的产品的抑菌效果

将通过液体发酵方法、传统的固体发酵方法和本发明的新型固体发酵技术生产的，解淀粉芽孢杆菌分别接种于固体培养基上，37℃培养24h，用牛津杯法测定不同方法生产的解淀粉芽孢杆菌对不同细菌的抑菌作用，试验结果如表2。

表2 不同发酵方法生产的解淀粉芽孢杆菌产品抑菌效果

注：同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表2的结果表明：不同发酵工艺生产的解淀粉芽孢杆菌均对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌有一定的抑制作用，其中固体发酵产品的抑菌作用强于液体发酵产品，原因在于固体发酵的产品保留了发酵过程中产生的抑菌物质，所以具有较强的抑菌作用；而液体发酵过程中，一些溶于水的抑菌成分随废水而排出，影响了其抑菌效果。

3、解淀粉芽孢杆菌制剂在断奶仔猪上的应用

选取21日龄断奶的仔猪180头，分为3个处理组，每个组6个重复，每个重复10头，空白对照组饲喂基础日粮(基础日粮不添加抗生素和益生菌)，抗生素组在基础日粮中添加10mg/kg硫酸粘杆菌素+50mg/kg杆菌肽锌，解淀粉芽孢杆菌组在基础日粮中添加100mg/kg解淀粉芽孢杆菌(通过实施例1方法生产的解淀粉芽孢杆菌制剂，含量为1.0×10⁹cfu/g)，试验期21天。实验期间观察各组猪群采食和饮水情况，记录耗料量，测定断奶后21天的体重，计算平均日增重、平均日采食量和料重比；试验结束时收集直肠取粪，用平板菌落计数法进行大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌活菌计数，结果用每克肠道内容物中细菌个数的对数(lg cfu/g)表示。实验结果如表3和表4。

表3 解淀粉芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生长性能的影响

组别	空白对照组	抗生素组	解淀粉芽孢杆菌组
				平均始重(kg)	7.04	6.98	6.95
平均末重(kg)	11.37	12.13	12.25
				平均日增重(g)	206^b	245^a	252^a
平均日采食量(g)	336	385	398
				料重比	1.63^a	1.57^b	1.58^b

注：同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表3的结果表明：与空白对照组相比，添加本发明的解淀粉芽孢杆菌可提高断奶仔猪的平均日增重，降低料重比，解淀粉芽孢杆菌组与抗生素组生长性能和料重比无显著差异。

表4 解淀粉芽孢杆菌制剂对断奶仔猪粪便微生物菌群的影响

组别	空白对照组	抗生素组	解淀粉芽孢杆菌组
				大肠杆菌(lg cfu/g)	8.45^a	7.13^b	7.35^b
乳酸杆菌(lg cfu/g)	8.86^b	7.82^c	9.85^a
				双歧杆菌(lg cfu/g)	9.12^b	8.46^c	10.33^a

注：同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表4的结果表明：添加解淀粉芽孢杆菌制剂能显著降低断奶仔猪粪便大肠杆菌数量，提高乳酸杆菌和双歧杆菌数量，有利于肠道微生物菌群平衡。

4、复合微生物制剂在肉鸡上的应用

试验选用540羽1日龄艾维因肉仔鸡(公母各半)，随机分成3组，每组6个重复，每个重复30羽；试验1组为空白对照组，饲喂基础日粮，不添加抗生素和益生菌，试验2组为抗生素对照组，日粮中添加硫酸粘杆菌素10mg/kg+杆菌肽锌50mg/kg，试验3组在基础日粮中添加解淀粉芽孢杆菌100mg/kg(通过实施例1方法生产的解淀粉芽孢杆菌制剂，含量为1.0×10⁹cfu/g)。试验分1-21日龄和22-42日龄两个阶段。

采用网上平养，每个重复一栏，各栏饲养条件基本一致，自由采食，自由饮水，24小时光照，保持鸡舍内通气良好。试验期间每天观察鸡只的健康状况，记录耗料量和死亡情况，在第21天和第42天清晨逐只空腹称重。测定指标为平均日增重、平均日采食量、料重比和存活率。在21日龄和42日龄时每个重复收集粪便20g左右，置于无菌培养皿中，混匀。采用平板菌落计数法进行大肠杆菌、双歧杆菌活菌计数。结果用每克肠道内容物中细菌个数的对数(lg cfu/g)表示。试验结果如表5和表6。

表5 解淀粉芽孢杆菌制剂对肉鸡生长性能的影响

注：同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表5的结果表明：在肉鸡整个生长阶段，与对照组相比，添加抗生素和解淀粉芽孢杆菌组均能显著提高肉鸡平均日增重、降低料重比，解淀粉芽孢杆菌组与抗生素组平均日增重、料重比无显著差异，表明在肉鸡饲料中添加解淀粉芽孢杆菌能起到与抗生素基本一致的效果，因此解淀粉芽孢杆菌具有替代抗生素的作用。

表6 解淀粉芽孢杆菌制剂对肉鸡粪便微生物菌群的影响

(单位：lg cfu/g)

注：同行肩标含相含不同字母表示差异显著(P<0.05)。

由表6的结果表明：添加解淀粉芽孢杆菌制剂能显著降低肉鸡粪便大肠杆菌数量，提高双歧杆菌数量，有利于肠道微生物菌群平衡。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：

1)一级培养：取适量解淀粉芽孢杆菌接种于内含培养基I的三角瓶中，于培养摇床内培养，得到一级种子,所述培养基I为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，为高温灭菌的pH为7.0且内含5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠的水基培养基；所述培养摇床内培养时间为18-20h；解淀粉芽孢杆菌为保藏号为CGMCC No.9384的解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌菌液含量为50×10⁸cfu/mL；

2)二级培养：取种子罐，并投入配制的培养基II，将步骤1)的一级种子投入种子罐中扩大培养18-20h，得到二级种子,培养基II为扩大培养基，为高温灭菌的pH为7.0且内含20g/L葡萄糖、10g/L玉米粉、40g/L大豆粉、8g/L酵母粉、1g/L硅油、0.5g/L碳酸氢钙、0.015g/L氯化钙、1g/L硫酸铵、0.15g/L硫酸镁和0.15g/L硫酸锰的水基培养基，所述pH由NaHCO₃调节,扩大培养条件为温度37-39℃，搅拌，通气量为8-10m³/h；

3)圆盘培养：取自制圆盘装置，自制圆盘装置的直径为6-10m，高度为0.5-0.8m，圆盘的底部布满直径0.1-0.2mm的小孔，且圆盘下面连接有通风装置；放入固态培养基III，然后于培养基III上接种步骤2)的二级种子进行发酵，所述接种的二级种子重量为培养基III重量的1-5％；发酵24-36h后，检测转芽孢率，当转芽孢率大于85％时停止发酵，得到发酵产物,培养基III为固体发酵培养基，为高温灭菌后冷却至37℃的内含质量分数为45％酱油豆粕、15％米糠、0.12％硫酸镁、0.12％硫酸锰的固态培养基，pH自然；

2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，其特征在于：所述步骤3)的发酵条件为：将自制圆盘装置放置于直径大于圆盘直径的密闭房间内，通过温控装置调节房间温度为37-42℃，湿度为60-90％，通风装置每隔4-5小时启动一次，对物料进行翻动，每次翻动时间为10-15分钟，所述密闭房间装有观察窗，通过观察窗监控发酵过程。

3.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，其特征在于：所述步骤1)的三角瓶含量为5L，内装2L培养基I；所述步骤2)的种子罐容量为500L，内装300L培养基II；所述步骤3)的自制圆盘装置上放入的培养基III料层厚度为200-300mm。

4.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，其特征在于：所述步骤5)的辅料为轻质碳酸钙或玉米淀粉。

5.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌饲料添加剂的固体发酵工艺，其特征在于：所述高温灭菌条件为温度115-128℃，时间20-35min。