CN105166416A - 一种复合微生物饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种复合微生物饲料添加剂，其包括黑曲霉、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌以及寡糖，其质量分数比为50-60∶10-20∶10-20∶5-10。各菌种活细胞计数为：黑曲霉孢子数(1-10)*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌(1-10)*10⁹cfu/g，粪肠球菌(5-10)*10⁹cfu/g，总菌数≥3*10⁹cfu/g。本发明提供的复合微生物饲料添加剂具有良好的抗病效果，能够增强动物免疫力。寡糖的添加可提高动物免疫，预防传染病等。本发明菌剂均采用固体发酵方式制得，生产工艺及设备简单，易操作，生产原料来源广，价格低廉，从而大大降低了生产成本，同时变废为宝，减少环境污染，实现可持续发展。本发明复合微生物饲料添加剂的应用，显著提高仔猪的抗病能力，减少死亡率。这对于促进家禽养殖业的可持续发展具有重要意义。

Description

一种复合微生物饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种复合微生物饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

目前我国广泛使用的的饲料添加剂是药用饲料添加剂，药用饲料添加剂中往往添加抗生素或其他化学类药物，目的是抑制病原微生物的生长，从而实现抗病效果。但抗生素等药物的使用不仅杀死了病原微生物，同时也大大伤害了动物胃肠道自身正常微生物，导致动物肠道菌群失衡，免疫力降低。药用饲料添加剂长久使用会导致病原微生物抗药菌株的产生，不利于病原菌的彻底消除。另外，药用饲料添加剂的使用容易产生药物残留，人类食用该畜牧类产品时危害人类健康。以上种种，药用饲料添加剂的使用不符合绿色健康的可持续发展道路，非抗生素饲料添加剂的开发迫在眉睫。

克服药用饲料添加剂的缺点，微生物饲料添加剂应运而生。微生物饲料添加剂是农业部批准的饲料添加剂，通过改善动物肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，以提高动物健康水平、提高抗病能力、提高消化能力的一类产品。是有效解决，疾病泛滥、病菌耐药、免疫能力下降、成活率降低、养殖效益下降的有效手段，是畜牧业可持续发展的动力。微生态制剂有其他药物不可替代的优点，即“患病治病，未病防病，无病保健”的效果。即使健康动物也可以使用，以提高健康水平，而且对腹泻、便秘有双向调节作用。

微生物饲料添加剂主要包括中药微生态制剂和益生素类制剂。中药微生态制剂是中草药物加入农业部批准的有益微生物经发酵制成的生物制剂，产品为了保证有益菌的有效数量，需要保持一定的水分，所以不适合饲料厂加工、使用。另外，中草药成分复杂，不利于饲料添加剂的配制及生产。益生素类制剂是以枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌等多菌种发酵的一类微生物制剂的总称。目前公开使用的微生物制剂多为单一菌种或单纯的的酶制剂的组合，且大多采用液体发酵技术制成，工艺设备复杂，成本高。

发明内容

本发明为了解决上述提到的现有的药物饲料添加剂的缺点以及单一菌种微生物饲料添加剂的缺点，提供一种复合微生物饲料添加剂，采用固体发酵技术生产复合微生物饲料添加剂。生产工艺及设备简单，原料价格低廉，经济实用。

具体地，本发明提供一种复合微生物饲料添加剂，其包括黑曲霉、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌以及寡糖，其质量分数比为50-60∶10-20∶10-20∶5-10。

优选地，各菌种活细胞计数为：黑曲霉孢子数(1-10)*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌(1-10)*10⁹cfu/g，粪肠球菌(5-10)*10⁹cfu/g，总菌数≥3*10⁹cfu/g。

本发明的另一个目的在于提供一种复合微生物饲料添加剂的方法，其包括以下步骤：

S1、采用固体发酵工艺制备黑曲霉、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌；

S2、采用酶解法制备寡糖；

S3、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌以及寡糖进行混合加工，得到成品。

优选地，S1中黑曲霉的制备方法具体包括以下步骤：

(1)制备一级菌种：

黑曲霉试管菌平板划线或是稀释涂平板，30℃恒温培养2-3d得单菌落，挑取单菌落孢子接种到麸皮试管中，30℃恒温培养2-3d至黑曲霉长到试管底部并变黑，得到试管菌；

(2)制备二级菌种：

接种试管菌到盛有麸皮培养基的三角瓶，30℃恒温培养24h，翻瓶，将结块打散继续培养，培养至48-60h停止培养，得到三角瓶菌种；

(3)扩大培养三级菌种：

三角瓶菌种加入两倍的灭菌水，混匀备用，接种三角瓶菌种到盛有麸皮培养基的罐头瓶中，30℃恒温培养24h，扣瓶，将结块打散继续培养，培养至48-60h停止培养；

(4)发酵床固体发酵生产黑曲霉制剂：

①投料、润料、蒸煮灭菌、降温、接种、厚层通风培养得到成品；

②干燥，粉碎，检测，包装。

优选地，枯草芽孢杆菌的制备方法具体如下所述：

(1)制备一级种子

甘油管保存的菌种LB固体培养基平板划线，37℃恒温培养24h，得单菌落。挑取单菌落到盛有LB液体培养基的PA瓶中，37℃震荡培养12h。

(2)制备二级种子

一级种子液按照1％接种到盛有300mLLB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃震荡培养12h，备用。

(3)发酵床固体发酵生产枯草芽孢杆菌

①投料(培养基原料定量配比)→润料(自来水)→蒸煮灭菌→降温→接种→厚层通风培养→成品

培养基主要成分为：麸皮，豆粕及辅料，培养基定量称重，严格配比，润料时添加的自来水体积在流量计下严格添加。所有设备用自来水严格清洗至无杂物。

所有原料在蒸煮锅内混匀，装料后旋紧进出口盖，蒸煮锅以一定的转速转动，培养基得以翻动，通入蒸气，达到一定温度后保温灭菌，保证灭菌条件：121℃，30min严格灭菌。所有的蒸汽灭菌的控制在电脑系统实时记录，相应的保证设施为压力传感器，温度传感器。

灭菌完成后，物料传输到摊凉机上进行降温。降温后传输到混料机上进行接种，接种完毕运用输送机将物料输送到发酵床上。

培养过程的管理：物料铺满发酵床后即进入培养环节，生长到一定阶段物料会结块，需通过翻曲机来进行翻料；在生长过程中，微生物的生长和繁殖需要氧气及水分，发酵温度需保持在35-40℃左右，每个发酵床对应一个空调室来控制发酵室和物料的温度和湿度。

培养过程的结束：物料进行培养24-48h后，培养过程完成。

②干燥，粉碎，检测，包装

培养完成后运用在线烘干，通60℃以下的热风将物料干燥至水分含量为10％左右。干燥完成后进行粉碎，检测，包装。

粪肠球菌采取固体发酵制成，具体工艺如下：

①一级种制备

甘油管保存菌种MRS固体平板划线，37℃恒温培养24h，得单菌落。挑取单菌落到盛有MRS液体培养基的PA瓶中，37℃静置培养12h。

②二级种制备

一级种子液按照1％接种到盛有300mLMRS液体培养基的500mL三角瓶中，37℃静置培养12h，备用。

③浅盘发酵

按照1-5％接种量将二级种子液均匀接种于粪肠球菌固体发酵培养基中，培养基装于不锈钢浅盘中，厚度6-8cm。37℃静止发酵36-48h，45-50℃烘干粉碎，100目过筛得成品。

优选地，所述固体发酵工艺采取的培养基包括麸皮培养基以及粪肠球菌固体发酵培养基。

优选地，所述麸皮培养基包括麸皮、玉米芯、豆粕、酒糟、磷酸二氢钾以及水，其质量比为16∶2∶1∶1∶0.1∶25。

优选地，所述粪肠球菌固体发酵培养基包括麸皮、玉米粉、豆粕、无机盐、磷酸盐以及水，其质量比为60∶20∶20∶1∶0.5∶500。

优选地，所述复合微生物饲料添加剂应用于畜禽养殖业。

本发明具有以下优势：1)本发明提供的复合微生物饲料添加剂具有良好的抗病效果，可替代抗生素，消除抗生素使用带来的不良效果。2)本发明采用复合微生物替代单一菌种微生物，三类微生物都是目前国内外认可的安全益生微生物，具有协同抗病原菌的作用，来自原核及真核的复合微生物在动物肠道内具有更强的环境适应能力，可快速增殖定位发挥益生菌的作用，从而维持动物肠道菌群平衡，增强动物免疫力。3)本发明所添加的寡糖在人体及动植物中已有研究报道，具有很好的抗病原菌，抗真菌，及抗肿瘤效果，寡糖的添加可提高动物免疫，预防传染病等。寡糖溶于水，更容易被胃肠道吸收，快速释放到血液中起作用。4)本发明菌剂均采用固体发酵方式制得，生产工艺及设备简单，易操作，生产原料来源广，价格低廉，从而大大降低了生产成本，同时变废为宝，减少环境污染，实现可持续发展。5)本发明复合微生物饲料添加剂的应用，显著提高仔猪的抗病能力，减少死亡率。这对于促进家禽养殖业的可持续发展具有重要意义。

具体实施方式

本发明所用菌株都可以通过相应的保藏中心获得，通过相对应的保藏编号可以查询到相应的菌种保藏中心。

本发明涉及的黑曲霉、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌，均采取固体发酵制得。成品菌数分别为：黑曲霉孢子数(1-10)*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌(1-10)*10⁹cfu/g，粪肠球菌(5-10)*10⁹cfu/g，复合微生物饲料添加剂使三种菌按一定比例复配而成，总菌数≥3*10⁹cfu/g。

黑曲霉菌剂采用固体发酵法制备而成，具体工艺如下：

①一级菌种的制备

黑曲霉试管菌平板(PDA固体培养基)划线或是稀释涂平板，30℃恒温培养2-3d得单菌落。挑取单菌落孢子接种到麸皮试管中，30℃恒温培养2-3d至黑曲霉长到试管底部并变黑。

②二级种的制备

用接种铲接种试管菌一铲到盛有麸皮培养基的三角瓶，三角瓶装样量20-25g，为保证充足的供氧，采用两层报纸封口。30℃恒温培养24h，翻瓶，将结块打散继续培养，培养至48-60h停止培养。

③罐头瓶扩大培养三级菌种

三角瓶菌种加入两倍的灭菌水，混匀备用。用接种勺接种三角瓶菌种一勺到盛有麸皮培养基的罐头瓶中，装样量约1/4-1/5，两层报纸封口。30℃恒温培养24h，扣瓶，将结块打散继续培养，培养至48-60h停止培养。

④发酵床固体发酵生产黑曲霉制剂

1.投料(培养基原料定量配比)→润料(自来水)→蒸煮灭菌→降温→接种→厚层通风培养→成品。

所有原料在蒸煮锅内混匀，装料后旋紧进出口盖，蒸煮锅以一定的转速转动，培养基得以翻动，通入蒸气，达到一定温度后保温灭菌，保证灭菌条件：121℃，30min严格灭菌。灭菌完成后，物料传输到摊凉机上进行降温。降温后传输到混料机上进行接种，接种完毕运用输送机将物料输送到发酵床上。

培养过程的管理：物料铺满发酵床后即进入培养环节，生长到一定阶段物料会结块，需通过翻曲机来进行翻料；在生长过程中，微生物的生长和繁殖需要氧气及水分，发酵温度需保持在28-33℃左右，每个发酵床对应一个空调室来控制发酵室和物料的温度和湿度。

培养过程的结束：物料进行培养48-72h后，培养过程完成。

2.干燥，粉碎，检测，包装

(1)培养完成后运用在线烘干，通60℃以下的热风将物料干燥至水分含量为10％左右。

(2)干燥完成后进行粉碎，检测，包装

本发明试管及三角瓶所用麸皮固体培养基为：麸皮16g，玉米芯3g，豆粕1g，硝酸铵0.2g，磷酸二氢钾0.1g，自来水25mL。

本发明罐头瓶及发酵床所用麸皮培养基为：麸皮16g，玉米芯2g，豆粕1g，酒糟1g，磷酸二氢钾0.1g，自来水25mL。

粪肠球菌采取固体发酵制成，具体工艺如下：

①一级种制备

甘油管保存菌种MRS固体平板划线，37℃恒温培养24h，得单菌落。挑取单菌落到盛有MRS液体培养基的PA瓶中，37℃静置培养12h。

②二级种制备

一级种子液按照1％接种到盛有300mLMRS液体培养基的500mL三角瓶中，37℃静置培养12h，备用。

③浅盘发酵

按照1-5％接种量将二级种子液均匀接种于粪肠球菌固体发酵培养基中，培养基装于不锈钢浅盘中，厚度6-8cm。37℃静止发酵36-48h，45-50℃烘干粉碎，100目过筛得成品。

本发明所用MRS培养基配方(1L)：蛋白胨10g，酵母粉4g，牛肉粉8g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温801mL，PH6.5，115℃，30min。MRS固体培养基：在液体培养基中加入2％琼脂。

本发明所用粪肠球菌固体发酵培养基配方：麸皮60g，玉米粉20g，豆粕20g，某无机盐1g，磷酸盐0.5g，自来水(121℃灭菌20min)500mL。

枯草芽孢杆菌采用固体发酵生产，其制备方法如下：

①一级种子制备

甘油管保存的菌种LB固体培养基平板划线，37℃恒温培养24h，得单菌落。挑取单菌落到盛有LB液体培养基的PA瓶中，37℃震荡培养12h。

②二级种制备

一级种子液按照1％接种到盛有300mLLB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃震荡培养12h，备用。

③发酵床固体发酵生产枯草芽孢杆菌：

投料(培养基原料定量配比)→润料(自来水)→蒸煮灭菌→降温→接种→厚层通风培养→成品

培养基主要成分为：麸皮，豆粕及辅料

培养基定量称重，严格配比，润料时添加的自来水体积在流量计下严格添加。所有设备用自来水严格清洗至无杂物。

所有原料在蒸煮锅内混匀，装料后旋紧进出口盖，蒸煮锅以一定的转速转动，培养基得以翻动，通入蒸气，达到一定温度后保温灭菌，保证灭菌条件：121℃，30min严格灭菌。灭菌完成后，物料传输到摊凉机上进行降温。降温后传输到混料机上进行接种，接种完毕运用输送机将物料输送到发酵床上。

培养过程的管理：物料铺满发酵床后即进入培养环节，生长到一定阶段物料会结块，需通过翻曲机来进行翻料；在生长过程中，微生物的生长和繁殖需要氧气及水分，发酵温度需保持在35-40℃左右，每个发酵床对应一个空调室来控制发酵室和物料的温度和湿度。

培养过程的结束：物料进行培养24-48h后，培养过程完成。

干燥，粉碎，检测，包装。培养完成后运用在线烘干，通60℃以下的热风将物料干燥至水分含量为10％左右。干燥完成后进行粉碎，检测，包装。

下面通过实施例的方式进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不仅仅局限于下述实施例，而是由本发明的说明书和权利要求书限定。

实施例1

一种复合微生物饲料添加剂，由以下质量分数的原料组成：黑曲霉菌剂60份，枯草芽孢杆菌20份，粪肠球菌15份，寡糖5份。

复合微生物饲料添加剂中各菌种活细胞计数为：黑曲霉孢子数3*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌10*10⁹cfu/g，粪肠球菌10*10⁹cfu/g，总菌数5*10⁹cfu/g。

实施例2

一种复合微生物饲料添加剂，由以下质量分数的原料组成：黑曲霉菌剂50份，枯草芽孢杆菌20份，粪肠球菌20份，寡糖10份。

复合微生物饲料添加剂中各菌种活细胞计数为：黑曲霉孢子数4*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌10*10⁹cfu/g，粪肠球菌5*10⁹cfu/g，总菌数3*10⁹cfu/g。

实施例3

一种复合微生物饲料添加剂，由以下质量分数的原料组成：黑曲霉菌剂55，枯草芽孢杆菌15，粪肠球菌20，寡糖10。

复合微生物饲料添加剂中各菌种活细胞计数为：黑曲霉孢子数5*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌9*10⁹cfu/g，粪肠球菌10*10⁹cfu/g。

对上述实施例1-3所得复合微生物饲料添加剂分别进行效果测试，投料对象是22日龄健康断奶的仔猪，共100头，随机分为4组，每组25头。对照组喂全价配合饲料；实验组1喂添加实施例1复合微生物饲料添加剂的配合饲料；实验组2喂添加实施例2复合微生物饲料添加剂的配合饲料；实验组3喂添加实施例3复合微生物饲料添加剂的配合饲料。全都不进行抗生素等药物的防控，日粮及其他饲养管理方法完全相同，饲喂30d，结果如表1所示。由表可知，饲喂本发明公布的复合微生物饲料添加剂能显著提高猪的免疫力及抗病力，同时对猪的日增重效果明显，这大大节约了养猪业的生产成本。

表1饲喂复合微生物饲料添加剂的仔猪生长效果

注：腹泻率＝{总腹泻次数/(试验猪头数*试验天数)}*100％

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：其包括黑曲霉、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌以及寡糖，其质量分数比为50-60∶10-20∶10-20∶5-10。

2.根据权利要求1所述的复合微生物饲料添加剂，其特征在于：各菌种活细胞计数为：黑曲霉孢子数(1-10)*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌(1-10)*10⁹cfu/g，粪肠球菌(5-10)*10⁹cfu/g，总菌数≥3*10⁹cfu/g。

3.根据权利要求1所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

S1、采用固体发酵工艺制备黑曲霉、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌；

S2、采用酶解法制备寡糖；

S3、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌以及寡糖进行混合加工，得到成品。

4.根据权利要求3所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：黑曲霉的具体制备方法如下所述：

(1)制备一级菌种；

(2)制备二级菌种；

(3)扩大培养三级菌种；

(4)发酵床固体发酵生产黑曲霉制剂。

5.根据权利要求3所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌的具体制备方法如下所述：

(1)制备一级种子；

(2)制备二级种子；

(3)发酵床固体发酵生产枯草芽孢杆菌。

6.根据权利要求3所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：粪肠球菌的具体制备方法如下所述：

(1)制备一级种子；

(2)制备二级种子；

(3)浅盘固体发酵生产粪肠球菌。

7.根据权利要求3所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述固体发酵工艺采取的培养基包括麸皮培养基以及粪肠球菌固体发酵培养基。

8.根据权利要求7所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述麸皮培养基包括麸皮、玉米芯、豆粕、酒糟、磷酸二氢钾以及水，其质量比为16∶2∶1∶1∶0.1∶25。

9.根据权利要求7所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述粪肠球菌固体发酵培养基包括麸皮、玉米粉、豆粕、无机盐、磷酸盐以及水，其质量比为60∶20∶20∶1∶0.5∶500。

10.根据权利要求1所述的复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述复合微生物饲料添加剂应用于畜禽养殖业。