CN107674840A - 一种固态发酵生产杀虫真菌—米曲霉孢子的方法 - Google Patents

一种固态发酵生产杀虫真菌—米曲霉孢子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固态发酵生产杀虫真菌—米曲霉孢子的方法。该方法包括如下步骤：将米曲霉在固体培养基中进行培养，得到米曲霉分生孢子；将所述米曲霉分生孢子配制成米曲霉分生孢子接种液；采用喷雾的方式将所述米曲霉分生孢子接种液接种至固态发酵培养基中进行培养即可；固态发酵培养基由发酵基质和无机盐组成；发酵基质由营养物质和稻壳组成；每Kg固态发酵培养基中，营养物质、稻壳与无机盐的质量如下：850～880g营养物质；80～100g稻壳；15～25g无机盐。本发明固态发酵米曲霉的方法，采用的培养基的原料取材方便，质优价廉，充分保证了碳源、氮源、营养条件的供给；并且生产过程无废气、废渣、废水的排放，绿色环保，具有工厂化生产的潜力。

Description

一种固态发酵生产杀虫真菌—米曲霉孢子的方法
技术领域
本发明涉及一种米曲霉孢子的生产方法，具体涉及一种固态发酵生产杀虫真菌--米曲霉孢子的方法。
背景技术
米曲霉(Aspergillus oryzae XJ-1)是害虫的重要致病真菌，对蝗虫表现出优异的防治效果，并且遗传稳定性较好，对人、作物、家畜、禽均未发现有毒害，对天敌昆虫和资源昆虫安全，因此在防治害虫保护农作物中具有重要作用。
作为微生物杀虫剂，米曲霉的有效成分是分生孢子，目前只能通过固态发酵生产分生孢子，由于以往的固态发酵生产该菌的分生孢子的过程复杂、所用发酵基质成本高严重限制了该菌的规模化和商品化。基于此，需要提供一种可以显著降低生产成本从而提高米曲霉的商品化生产的米曲霉发酵工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种固态发酵生产米曲霉孢子的方法，该方法具有周期短、产量高、成本低的特点。
本发明首先提供一种固态发酵培养基，其由发酵基质和无机盐组成；
所述发酵基质由营养物质和稻壳组成；
每Kg所述固态发酵培养基中，所述营养物质、所述稻壳与所述无机盐的质量如下：
850～880g营养物质；
80～100g稻壳；
15～25g无机盐。
上述的固态发酵培养基中，所述营养物质由组分A、麦麸和豆粕组成，所述组分A为玉米淀粉或大米粉。
上述的固态发酵培养基中，所述组分A、所述麦麸与所述豆粕的质量比可为1：5～6：1.6～2.2，具体可为1：6：1.8。
上述的固态发酵培养基中，所述无机盐可为磷酸氢二钾。
上述的固态发酵培养基中，每Kg所述固态发酵培养基中，所述营养物质、所述稻壳与所述无机盐的质量具体可为：
880g营养物质；
100g稻壳；
20g无机盐。
上述的固态发酵培养基中，所述发酵基质的质量含水率可为50～60％，具体可为60％。
上述的固态发酵培养基中，所述稻壳主要起支撑作用，为米曲霉的生长提供空间，从而提供足够的氧气。
本发明提供的所述固态发酵培养基可固态发酵培养米曲霉孢子。
本发明进一步提供了一种固态发酵生产米曲霉孢子的喷雾接种方法，包括如下步骤：
(1)将米曲霉在固体培养基中进行培养，得到米曲霉分生孢子；
(2)将所述米曲霉分生孢子配制成米曲霉分生孢子接种液；
(3)采用喷雾的方式将所述米曲霉分生孢子接种液接种至所述固态发酵培养基中进行培养即可。
上述的喷雾接种方法中，步骤(1)中，所述固体培养基可为察氏琼脂(CA)固体培养基；
所述培养条件可为：32～35℃，相对湿度50％～60％，光照/黑暗为12/12。
上述的喷雾接种方法中，步骤(2)中，采用已灭菌的0.1％吐温80配制所述米曲霉分生孢子接种液，具体方法是：采用已灭菌0.1％吐温80冲洗所述固体培养基上长好的菌落，将其分生孢子冲洗下来，制成分生孢子母液；然后再用已灭菌0.1％吐温80将分生孢子母液稀释到相应浓度得到分生孢子接种液；
所述0.1％吐温80由1g吐温80加至1L水中得到，并在121℃条件下湿热灭菌20分钟后得到。
上述的喷雾接种方法中，所述米曲霉分生孢子接种液的浓度可为1.5～2×108个/mL，接种量可为5％～10％，指的是所述米曲霉分生孢子接种液与所述固态发酵培养基质量的比值；
上述的喷雾接种方法中，步骤(3)中，所述培养的条件可为：
温度为32～35℃；
相对湿度为50％～60％，
光照/黑暗为12/12。
步骤(3)中，采用喷雾器将所述米曲霉分生孢子接种液接种于所述固态发酵培养基中，并进行搅拌；
所述喷雾器的壶嘴与接种箱之间的距离低于20cm；
所述培养的时间为10天；米曲霉固态发酵生长曲线表明，产孢稳定期出现于发酵第6天至，从第7天开始进入衰亡期，产孢量开始下降，因此选择在第6天采收孢子。
现有技术通常采用液-固双相发酵法生产米曲霉孢子，前期需要准备大量芽生孢子液，这不仅提高了生产成本，同时间接延长了发酵周期。本发明通过采用上述喷雾接种法解决了上述缺陷：使用由固态发酵培养基经固态发酵得到的分生孢子直接制备而成的接种液，不仅能使孢子均匀生长于发酵基质，充分提高基质生物质能的转化率，接种比例(指接种量)仅为2～5％，大幅节约了原始接种量，降低了接种液的生产成本。
如以活孢子作为产品的真菌发酵物不尽快加工处理，则不仅孢子活力会迅速下降，而且迅速发生的杂菌污染甚至有可能造成废品。基于此，本发明提供了一种米曲霉分生孢子粉的制备方法，包括如下步骤：
按照本发明上述方法生产米曲霉孢子；培养结束后，将长满菌丝的所述固态发酵培养基进行干燥处理；然后经粉碎即得到米曲霉分生孢子粉。
在烘箱中进行所述干燥处理；
所述干燥处理的温度可为30～32℃，时间可为48小时。
然后用小型粉碎机处理，最后将粉状物过筛收集到密封袋中，冷藏保存；
粉碎时间优选1分钟以内，防止温度过高杀死孢子。
本发明固态发酵米曲霉的方法，采用的培养基的原料取材方便，质优价廉，充分保证了碳源、氮源、营养条件的供给；并且生产过程无废气、废渣、废水的排放，绿色环保，具有工厂化生产的潜力。
附图说明
图1为本发明米曲霉固态发酵大量生产的工艺流程图，
图中，a表示菌种，b表示活化菌种，c表示分生孢子接种液，d表示固态发酵接种箱。
图2为本发明米曲霉固态发酵采用的生产车间的示意图。
图3为本发明米曲霉固态发酵喷射接种方法的示意图。
图4为A.oryzae XJ-1在固体培养基中发酵不同天数后产孢量的变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、固态发酵培养基的制备
按照1：6：1.8：1的质量比称取玉米淀粉、麦麸、豆粕和稻壳，经混合作为发酵基质，总质量为980g，调整其质量含水量为60％；按照每Kg发酵基质中添加20g磷酸氢二钾的量，搅拌均匀，最后分装到耐高温灭菌袋中，在121℃条件下湿热灭菌20分钟。
实施例2、接种液的制备
本发明所使用的菌种为米曲霉Aspergillus oryzae XJ-1。
将米曲霉在察氏琼脂(CA)固体培养基中进行固态培养(35℃，相对湿度60％，光照/黑暗为12/12)，得到米曲霉分生孢子，用0.1％无菌吐温80(由1g吐温80加入至1L水中得到)充分冲洗制成米曲霉分生孢子接种液，浓度为1×108个/mL。
实施例3、固态发酵培养米曲霉分生孢子
本发明固态发酵培养米曲霉分生孢子的工艺流程图如图1所示，生产车间的示意图如图2所示。
采用体积为20m2(底面积)×3m(高)的小型发酵车间，该发酵室生产能力为每批次30千克发酵物。
消毒灭菌：甲醛常用于接种室、培养室熏蒸灭菌，其用量为每立方米空间10ml。用下列方法使其挥发，即每立方米空间用甲醛溶液10ml，高锰酸钾5g。灭菌时，将称好的高锰酸钾放入容器内，然后注入甲醛溶液，立即关闭房门，熏蒸24小时后方可进入室内工作，以后每天进行半小时紫外线消毒。
温度控制：设定房间温度为35℃，通过空调调节，以温度计的变化为准。
湿度控制：设定房间相对湿度为60％，通过加湿器调节，以湿度计的变化为准。
通气控制：设定时段通风换气，每一小时通气15分钟，通过房间顶部通风扇进行调节。
物料供应：使用75L高压蒸汽灭菌锅，单次灭菌最多30千克发酵基质。
接种方法：如图3所示，采用镂空的塑料箱作为浅盘接种箱，接种箱的高度为20cm。每个接种箱可进行1kg基质发酵，发酵基质厚度约2cm。将纱布和基质从灭菌锅中取出后，趁热将纱布平铺在转移箱底部，随后也将基质趁热摊开在纱布上，防治基质散漏。待基质冷却至室温，将实施例2制备的米曲霉的分生孢子液用消毒处理后的喷雾器喷射接种于基质中(按每千克发酵基质5％的孢子量接种)，稍加搅拌即可，喷射时壶嘴离接种箱的高度低于20cm。
收获方法：根据每个接种箱的发酵速度，适时采收。经过10天左右培养(发酵曲线如图4所示)，即可收获分生孢子。
检测产孢率：按照产孢率检测方法，平均产孢4.1×1010个/g，显著高于现有方法。Lotong等人报道，用大米做培养基对米曲霉进行固体发酵的产孢数量级为109个/克干大米(Lotong N,Suwanarit P.1983.Production of soy sauce Koji mold spore inoculumin plastic bags.Appl.Environ.Microbiol.46:1224-1226.)；另外大米的成本明显高于本发明所用的麦麸等发酵基质的成本，因此本发明方法有着低成本高产量的优势。
将长满菌丝的发酵基质(连带接种箱)置于烘箱中干燥处理，干燥温度30℃，时长48小时。将干燥后的发酵基质从接种箱底部轻轻摘下，收集到密封袋中稍微捏碎，然后放进小型粉碎机中，粉碎时间为1分钟以内，防止温度过高杀死孢子，最后将粉状物经100目过筛，装于密封袋中，保存于0℃～10℃干燥环境中。
测定本实施例制备的孢子粉的萌发率均在95％以上。

Claims (10)

1.一种固态发酵培养基，由发酵基质和无机盐组成；
所述发酵基质由营养物质和稻壳组成；
每Kg所述固态发酵培养基中，所述营养物质、所述稻壳与所述无机盐的质量如下：
850～880g营养物质；
80～100g稻壳；
15～25g无机盐。
2.根据权利要求1所述的固态发酵培养基，其特征在于：所述营养物质由组分A、麦麸和豆粕组成，所述组分A为玉米淀粉或大米粉；
所述发酵基质的质量含水率为50～60％。
3.根据权利要求2所述的固态发酵培养基，其特征在于：所述组分A、所述麦麸与所述豆粕的质量比为1：5～6：1.6～2.2；
所述无机盐为磷酸氢二钾。
4.权利要求1-3中任一项所述固态发酵培养基在发酵生产米曲霉孢子中的应用。
5.一种固态发酵生产米曲霉孢子的喷雾接种方法，包括如下步骤：
(1)将米曲霉在固体培养基中进行培养，得到米曲霉分生孢子；
(2)将所述米曲霉分生孢子配制成米曲霉分生孢子接种液；
(3)采用喷雾的方式将所述米曲霉分生孢子接种液接种至权利要求1-3中任一项所述固态发酵培养基中进行培养即可。
6.根据权利要求5所述的喷雾接种方法，其特征在于：步骤(2)中，采用0.1％吐温80配制所述米曲霉分生孢子接种液；
所述0.1％吐温80由1g吐温80加入至1L水中得到。
7.根据权利要求5或6所述的喷雾接种方法，其特征在于：所述米曲霉分生孢子接种液的浓度为1.5～2×108个/mL。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的喷雾接种方法，其特征在于：步骤(3)中，采用喷雾器将所述米曲霉分生孢子接种液接种于所述固态发酵培养基中，并进行搅拌；
所述喷雾器的壶嘴与接种箱之间的距离低于20cm；
所述培养的时间为10天。
9.一种米曲霉分生孢子粉的制备方法，包括如下步骤：按照权利要求5-8中任一项所述方法生产米曲霉孢子；培养结束后，将长满菌丝的所述固态发酵培养基进行干燥处理；然后经粉碎即得到米曲霉分生孢子粉。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：在烘箱中进行所述干燥处理；所述干燥处理的温度为30～32℃，时间为48小时。
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