CN117801975A - 具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117801975A
CN117801975A CN202211206788.2A CN202211206788A CN117801975A CN 117801975 A CN117801975 A CN 117801975A CN 202211206788 A CN202211206788 A CN 202211206788A CN 117801975 A CN117801975 A CN 117801975A
Authority
CN
China
Prior art keywords
streptococcus thermophilus
fermentation
extracellular polysaccharide
product
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211206788.2A
Other languages
English (en)
Inventor
吴佳鹏
王珊珊
乔莉苹
郭学平
黄思玲
徐小曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bloomage Biotech Co Ltd
Original Assignee
Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bloomage Biotech Co Ltd filed Critical Bloomage Biotech Co Ltd
Priority to CN202211206788.2A priority Critical patent/CN117801975A/zh
Publication of CN117801975A publication Critical patent/CN117801975A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株具有γ‑氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用，该嗜热链球菌能够产GABA和/或EPS，其中EPS中含有HA。本发明菌株筛选于藏灵菇中，其发酵液对DPPH和·OH均表现出较强的清除效率，具备很强的抗氧化性，弥补了市场上嗜热链球菌产品的不足，在食品、药品、化妆品领域有潜在的价值和广阔的应用前景。

Description

具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其 应用
技术领域
本发明涉及一种嗜热链球菌，具体涉及一种来自藏灵菇的、具有同时合成γ-氨基丁酸和胞外多糖能力的嗜热链球菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是一种重要的乳酸菌，主要从奶制品中分离得到，嗜热链球菌细胞呈球形或卵圆形，成对或链状排列。嗜热链球菌具有兼性厌氧、低GC含量、不产芽孢和过氧化氢酶阴性等特征，因其在牛奶、奶酪等发酵食品中长期安全运用，被美国食品和药品管理局普遍认为是食品安全级（Generally Regarded As Safe,GRAS）微生物。
γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸，由前体物质谷氨酸（L-Glu）或谷氨酸钠（L-MSG）经谷氨酸脱羧酶（GAD）催化产生，是动物神经中枢系统的主要抑制性递质，具有舒缓压力、改善睡眠以及提高人体记忆力等生理功能，是一种兼具药理作用和保健功能的新型功能因子，2009年被国家卫生部配准为新资源食品，具有良好的应用前景。目前，GABA的制备方法主要包括植物富集法、化学合成法及微生物合成法三类，相比较而言，植物富集法产量低、成本高且难度大，化学合成法反应复杂且安全性差，而微生物发酵合成法成本低、安全性较好且条件温和，适用于大规模生产制备，是较为理想的合成方法。乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中产生并分泌到胞外的次级代谢物的总称，一般为黏液或荚膜多糖等水溶性多糖，是一种天然高分子聚合物。EPS具有多种对人体健康有益的功能，如作为益生元调节肠道菌群、抗氧化、降低胆固醇等。透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种在人体内广泛存在的酸性多糖，具有优秀的保湿性、润滑性、粘弹性及生物相容性，目前已被应用于医药、整形美容、化妆品、日化用品等多个领域。
目前，市场上的益生菌产品主要存在以下不足：
1. 专利菌株主要集中在乳杆菌，目前可应用食品的乳杆菌有14种，而可应用于保健食品的仅有4种，如专利申请CN103937716A、CN111849836A和CN 113493753等。而嗜热链球菌的报道较少，与乳杆菌相比，嗜热链球菌具有更强的安全性，可用于食品和保健品中，有较大的应用前景。
2. 一些抗氧化益生菌产品为多种益生菌的组合，如专利申请CN105853303A和CN103582486A等，虽然多种菌株协同可产生较好的益生作用，但很难就某种有效成分进行专一优化，无法将其优势最大化。
3. 益生菌株主要应用于食品、医药领域，化妆品领域较少。
目前，关于γ-氨基丁酸、乳酸菌胞外多糖、透明质酸这三者都是采用不同的菌种发酵制备，至今未见能够同时发酵制备这三者的相关菌种和方法。如果研究得到一种安全性高的、能够同时生产γ-氨基丁酸、乳酸菌胞外多糖、透明质酸的嗜热链球菌，将可弥补市场上益生菌产品的不足，所得的发酵产品在食品、保健品、医药产品、化妆品等领域也会有较大的应用前景。
发明内容
本发明旨在提供一株来自藏灵菇的嗜热链球菌，该嗜热链球菌与现有其他嗜热链球菌相比能够产γ-氨基丁酸（GABA）和/或乳酸菌胞外多糖(EPS)，且乳酸菌胞外多糖中含有较高含量的透明质酸（HA），其发酵产品营养丰富，含有GABA、EPS和HA，具有较强的舒缓神经、抗氧化等功能，可以应用于食品、医药产品、化妆品等多个领域，丰富了抗氧化菌种资源库。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种嗜热链球菌（ Streptococcus thermophilus），命名为嗜热链球菌NX1，该嗜热链球菌NX1来源于宁夏藏灵菇。目前，该菌株已于2022年5月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）进行保藏，地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.24922。
经实验发现，嗜热链球菌NX1发酵所得的发酵液对DPPH和·OH均表现出较强的清除效率，具有强的抗氧化活性。
经实验发现，本发明嗜热链球菌NX1中具有HA代谢途径基因，嗜热链球菌NX1发酵液的EPS中含有透明质酸（HA），且透明质酸在乳酸菌胞外多糖中的含量大于等于12wt%，优选的，大于等于24wt%。基于透明质酸的自身性质，嗜热链球菌NX1发酵液具有优良的保湿性能。
基于本发明嗜热链球菌NX1所表现出的优异性能，本发明还提供了上述嗜热链球菌（ Streptococcus thermophilus）NX1在制备发酵产品中的应用。所述发酵产品指的是将嗜热链球菌NX1进行发酵所得的产品。所述发酵产品中含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖中的一种或两种。
优选的，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸。
优选的，发酵产品中同时含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸。
进一步的，所述发酵产品为嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液或者由嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液制备而成。
进一步的，本发明还提供了一种发酵产品，该发酵产品中包含嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）NX1。
进一步的，所述发酵产品中含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖中的一种或两种，优选的，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸。
进一步优选的，发酵产品中同时含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸。
优选的，透明质酸在乳酸菌胞外多糖中的含量大于等于12wt%，更优选的，大于等于24wt%。
进一步的，所述发酵产品为嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液或者由嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液制备而成，即该发酵产品直接为嗜热链球菌发酵得到的发酵液，或者是以嗜热链球菌发酵得到的发酵液为原料，将发酵液进行进一步的处理得到发酵产品。对发酵液进行处理的方式包括但不限于纯化、浓缩、过滤、醇沉、稀释、干燥等步骤。
进一步的，所述发酵产品为液态或固态。
进一步的，本发明中，对嗜热链球菌NX1进行发酵得到发酵液的方式可以参照现有技术中的技术，例如将嗜热链球菌NX1进行种子培养得到足够的种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中进行培养。种子培养所用的培养基主要目的是为了菌种的快速生长，可以采用LM17培养基，也可以采用其他的含有碳源、氮源、无机盐等成分、适合于嗜热链球菌NX1生长的培养基，例如由胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖组成的培养基。对于发酵培养基，因为要满足同时合成GABA和EPS的要求，因此发酵培养基中需要添加谷氨酸钠和糖源成分，例如可以选择由乳清粉、氯化镁、磷酸氢二钾、谷氨酸钠、葡萄糖组成的培养基。
进一步的，在本发明某一具体实施方式中，提供了对嗜热链球菌NX1进行发酵得到发酵液的方法，在得到的最终发酵液中，γ-氨基丁酸的产量大于1.5 g/L，乳酸菌胞外多糖的产量大于0.6 g/L，透明质酸的含量大于145 mg/L，透明质酸在乳酸菌胞外多糖的占比为1/4。该发酵液因同时含有γ-氨基丁酸、乳酸菌胞外多糖和透明质酸，具有较好的舒缓神经、保湿性能，同时经验证还具有较强的抗氧化活性，对DPPH和·OH均表现出较强的清除效率。
进一步的，本发明还提供了上述嗜热链球菌NX1发酵产品作为抗氧化成分的应用。
进一步的，本发明上述嗜热链球菌NX1发酵产品在食品、药品、化妆品领域有潜在的价值和广阔的应用前景，因此本发明还提供了该嗜热链球菌NX1发酵产品在制备食品、药品、化妆品中的应用。
本发明还提供了一种具有抗氧化作用的产品，该产品中包括上述嗜热链球菌NX1发酵产品。
进一步的，本发明具有抗氧化作用的产品可以为食品、药品或化妆品。
本发明从藏灵菇中自行筛选得到了一株嗜热链球菌NX1，该菌株能够产GABA和/或EPS，其中EPS中含有HA，HA在EPS中的含量占比大于等于12%。本发明嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵产物中含有GABA、EPS和HA，对DPPH和·OH均表现出较强的清除效率，具备很强的抗氧化性，具有很好的保湿、舒缓神经、抗氧化活性，弥补了市场上嗜热链球菌产品的不足，在食品、药品、化妆品领域有潜在的价值和广阔的应用前景。
保藏信息
本发明所述嗜热链球菌（ Streptococcus thermophilus）NX1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.24922，保藏日期为2022年5月19日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为 葡萄糖标准曲线图。
图2为GABA标准品液相色谱图。
图3为嗜热链球菌NX1发酵液的液相色谱图。
图4为HA标准曲线图。
图5为同浓度的VC、VE、BHT和发酵液对DPPH的清除能力测定结果。
图6 为同浓度的VC、VE、BHT和发酵液对·OH的清除能力测定结果。
图7为嗜热链球菌NX1发酵液、EPS、GABA及EPS+GABA混合液对DPPH清除能力的测定结果。
图8为嗜热链球菌NX1发酵液、EPS、GABA及EPS+GABA混合液对·OH清除能力的测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例仅起到示例作用。
下述实施例中，如无特别说明，所述浓度均为质量百分浓度。
实施例1嗜热链球菌菌株的筛选
1.1嗜热链球菌菌株的筛选
在超净台将宁夏来源的藏灵菇加入LM17培养基中置于42℃静置培养12h后，得到藏灵菇发酵液。用无菌枪头吸取藏灵菇发酵液至无菌EP管，10倍梯度稀释至105，将101-105涂布LM17平板，42℃倒置培养24h，挑取白色圆形且过氧化氢酶阴性的菌落，镜检为球菌，反复划线确定纯菌落，接种到LM17培养基，取过夜培养的菌液1 mL，10000 rpm离心1 min，弃上清，收集菌体。加入80 μL溶菌酶（20 mg/mL），重悬菌体，37℃水浴20 min。按照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒步骤进行基因组提取。测序其16Sr DNA（青岛睿博兴科生物技术有限公司），与NCBI上的序列进行BLAST比对，最终筛选得到10株嗜热链球菌，将菌株分别命名为嗜热链球菌NX1-NX10，目前NX1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No. 24922。
上述LM17培养基配方为：蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏5 g/L，聚蛋白胨5 g/L，抗坏血酸0.5 g/L，β-甘油磷酸二钠19 g/L，七水合硫酸镁0.25 g/L，乳糖10 g/L。如需配置平板，加入2%的琼脂。
已报道嗜热链球菌HA代谢途径基因进行比对
在KEGG Pathway（KEGG PATHWAY Database (genome.jp)查找已报道的嗜热链球菌HA代谢途径，得知嗜热链球菌具备完整的HA代谢通路的关键酶为hasB/Ugd：UDP-葡萄糖脱氢酶；hasC/galU：葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶；hasD/glmU：N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶。通过比对可知，筛选得到的大部分嗜热链球菌缺乏Ugd基因，因此可根据其保守序列设计引物探针ugdF/ugdR，扩增10株嗜热链球菌的基因组，PCR扩增反应体系：0.5 μL的ugdF、0.5 μL的ugdR，0.5 μL 的基因组DNA，12.5 μL Meibo 2×M5 Hiper plus Taq HiFiPCR mix DNA聚合酶，11.2 μL ddH2O。反应程序：95℃ 3min，95℃ 25s，55℃ 25s，72℃15s，32个循环；72℃ 5min；4℃保温。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中，只有嗜热链球菌NX1和NX2具备Ugd基因，鉴于HA具有优秀的保湿性、润滑性、粘弹性及生物相容性，我们选择具有完整HA代谢通路的嗜热链球菌NX1和NX2进行接下来的发酵和抗氧化性测定。
Ugd酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
Ugd酶的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
Ugd酶的DNA引物序列如下：
ugdF：tgttgcggataagattatgga
ugdR：actcacgatgtatttgtgagagatt
实施例2嗜热链球菌NX1和 NX2的发酵
将嗜热链球菌NX1和 NX2在LM17平板划线，挑取单菌落至LM17培养基中，37℃静置过夜培养后，以2%接种量分别转接至200 mL种子培养基中，培养至OD=0.2左右（约3.5-4h），将种子培养基全部接种至发酵培养基中，在200 rpm、40℃条件下培养48h，得到嗜热链球菌NX1和 嗜热链球菌NX2的发酵液。整个发酵培养过程中用40%氢氧化钠溶液控制pH为7，发酵过程中不通气。
上述种子培养基配方为：胰蛋白胨（OXOID）10 g/L，酵母粉（OXOID）2.5 g/L，葡萄糖（国药）3 g/L。
上述发酵培养基配方为：乳清粉（WANBANG）15 g/L, 氯化镁（国药）3 g/L，磷酸氢二钾（国药）4 g/L，谷氨酸钠（浙江一诺）20 g/L，葡萄糖（恒德宝）150 g/L。其中，葡萄糖单独灭菌后一次性加入发酵培养基中，整个发酵过程无需补糖。
实施例3嗜热链球菌NX1和NX2发酵液成分的检测
3.1采用苯酚-硫酸法检测发酵液中EPS，具体方法为：
3.1.1绘制葡萄糖标准曲线：
1）、配置葡萄糖标准溶液：精确称取干燥至恒重的葡萄糖100 mg至容量瓶中，加水精确定容至100 mL，摇匀后精确吸取10 mL该溶液，加水定容至100 mL。
2）、配置80%苯酚溶液：准确移取重蒸酚80 mL，蒸馏水定容至100 mL，既得80%苯酚溶液。
3）、配置6%苯酚溶液：将80%苯酚溶液加水稀释至6%，现用现配。
4）、葡萄糖标准曲线制作：分别吸取葡萄糖标准液0.0mL，0.4mL，0.8mL，1.2mL，1.6mL，2 mL于具塞试管中，各补水至2 mL，分别加入6%苯酚溶液1mL，混合均匀后快速悬空加入浓硫酸5 mL，即刻摇匀，室温反应20 min后于490nm测吸光度，以不加葡萄糖的试管做空白对照，结果如图1所示，以纵坐标为吸光度，横坐标为葡萄糖浓度，绘制葡萄糖标准曲线，根据标准曲线得到葡萄糖标准方程，y=0.008x+0.0095。
3.1.2检测发酵液中EPS：
用移液枪准确吸取5 mL实施例2的发酵液，加入15 mL无水乙醇醇沉，13000 rpm离心5 min，倒掉上清，加入10 mL纯化水，26℃、200 rpm溶解，得2×稀释液，将上述2×稀释液用纯化水稀释5倍，得10×稀释液，吸取2 mL10×稀释液，加入6%的苯酚溶液1 mL，混匀后快速加入浓硫酸5 mL（悬空加入），即刻摇匀，室温反应20 min后于490 nm测吸光度，以纯化水作为对照，纵坐标代入葡萄糖标准曲线y=0.008x+0.0095，计算嗜热链球菌NX1和 NX2发酵液中胞外多糖EPS含量。
经检测，嗜热链球菌NX1中EPS含量为0.61 g/L，嗜热链球菌NX2中EPS含量为0.14g/L。
3.2采用衍生法检测发酵液中GABA，具体方法为：
1）、制备衍生缓冲液（0.05 mol/L NaHCO3溶液）：称取4.2g NaHCO3，用纯化水定容至100 mL；
2）、制备衍生试剂（1% 2,4-二硝基氟苯—乙腈溶液）：吸取1 mL 2,4-二硝基氟苯，用乙腈定容至100 mL；
3）、衍生操作：向50 mL容量瓶中依次加入5 mL衍生缓冲液、5 mL实施例2的发酵液和2.5 mL衍生试剂，将容量瓶放于恒温水浴锅中，60℃ 水浴1h。水浴完成后，用纯水溶液定容至50 mL，即为待检样品溶液。
4）、液相检测
液相条件：A相：4.1g乙酸钠+60 μL冰乙酸，定容至1L；B相：乙腈。
色谱柱：C18 plus。
进样量：10 μL。
柱温：35℃。
流速：0.8 mL/min。
检测波长：360 nm。
时间：30min。
方式：梯度洗脱，梯度洗脱方式见下表1。
将GABA标准品配成浓度0.25 g/L的标准品溶液，将标准品溶液按照上述色谱条件进行检测，得到色谱图，如图2所示，GABA标准品的出峰时间为13.27s。将待测样品溶液按照上述色谱条件进行检测，所得色谱图如图3所示，经计算，嗜热链球菌NX1中GABA的含量为1.6 g/L，嗜热链球菌NX2中GABA的含量为0.77g/L。
发酵液中HA含量的测定
3.3.1采用酶解法检测发酵液中HA，具体方法为：
HA标准曲线制作：精确称取0.2 g HA干粉，精确吸取10 mL纯化水，26℃，200 rpm溶解。摇匀后精确吸取10 mL该HA溶液，加水定容至100 mL。分别吸取HA溶液0.0mL，0.4mL，0.8mL，1.2mL，1.6mL，2 mL于试管中，各补水至2 mL，加入8 mL 5mM的PBS缓冲液，分别取3mL HA溶液和100 uL HA酶，混合均匀；42℃处理1h；酶解完成后煮沸2 min，在232 nm处检测吸光度，如图4所示，以纵坐标为吸光度，横坐标为HA含量，绘制HA标准曲线。
3.3.2发酵液中HA含量的检测，具体方法为：
用移液枪准确吸取5 mL实施例2的发酵液，加入15 mL无水乙醇醇沉，13000 rpm离心5 min，倒掉上清，加入10 mL纯化水，26℃，200 rpm溶解，得2×稀释液，再用移液枪取2mL2×稀释液，加入8mL 5mM的PBS缓冲液，得10×稀释液。
实验组：取3 mL HA10×稀释液和100 uL HA酶，混合均匀；42℃处理1h；酶解完成后煮沸2 min。共设两组平行。
对照组：取3 mL HA10×稀释液100 uL 纯化水，混合均匀；42℃处理1h；酶解完成后煮沸2 min。
吸光度测定：在232 nm处检测，所得吸光度带入标准曲线，计算发酵液中HA含量。代入标准曲线公式y=11.502x-0.0192，经计算，嗜热链球菌NX1 中HA含量平均为147 mg/L，而嗜热链球菌NX2中未检出HA，推测是由于HA产量太低，无法检测到，或者是合成途径中相关基因不表达导致的。
实施例4嗜热链球菌NX1和NX2发酵液抗氧化性能测试
4.1嗜热链球菌NX1和NX2发酵液与常见抗氧化剂抗氧化能力的测定
样品：①以EPS含量为标准，将发酵液稀释至10-200 μg/mL。
②同浓度的抗氧化剂VC、VE和BHT(二丁基羟基甲苯)的水溶液。
DPPH的清除能力的测定：分别以10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mLEPS浓度的嗜热链球菌发酵液和相同浓度的VC、VE和BHT比较抗氧化能力，取50 µL各样品溶液与250 µL浓度为25 µM的DPPH-乙醇溶液充分混匀，在室温下避光反应30 min，在517nm下测反应液的吸光度。根据吸光度计算清除率，清除率计算公式如下：
清除率（%）=[1-（A-A1）/A0]×100
A：样品组吸光度值；A1试剂空白吸光度值，即以等体积的无水乙醇代替DPPH溶液。A0：样品空白吸光度值，即以等体积蒸馏水代替样品溶液。
·OH的清除能力的测定：样品及浓度同上。取150 µL各样品溶液与150 µL 9 mM的FeSO4.7H2O溶液、150 µL 9 mM的乙醇-水杨酸溶液充分混匀，再加入150 µL 8.8 mM的H2O2溶液，于37℃反应30 min，在510 nm下测反应液的吸光度。根据吸光度计算清除率，清除率计算公式如下：
清除率（%）=[1-（A-A1）/A0]×100
A：样品组吸光度值；A1：试剂空白吸光度值，即以等体积的蒸馏水代替FeSO4.7H2O溶液；A0：样品空白吸光度值，即以等体积蒸馏水代替样品溶液。
抗氧化能力实验结果
采用上述方式对不同浓度的VC、VE、BHT和发酵液的DPPH和·OH清除能力进行测定，结果如图5和图6所示。从图中可以看出，嗜热链球菌NX1发酵液、嗜热链球菌NX2发酵液、VE、VC和BHT对DPPH和·OH的清除率均显示出剂量依赖性，随着浓度的增加清除能力增加。从DPPH和·OH的清除能力看，嗜热链球菌NX1发酵液对DPPH和·OH的清除能力稍优于VC，嗜热链球菌NX2发酵液对DPPH和·OH的清除能力不如VC，嗜热链球菌NX1发酵液对DPPH和·OH的清除能力明显优于嗜热链球菌NX2发酵液。仅以EPS为定量标准，当嗜热链球菌NX1发酵液稀释到EPS浓度为200 µg/mL时，对DPPH具有80%以上的清除率，对·OH仍具有70%以上的清除率。由此可见，嗜热链球菌NX1发酵液具备较强的抗氧化能力，效果优于嗜热链球菌NX2发酵液，且与常见的强抗氧化剂可媲美。
实施例5嗜热链球菌NX1和NX2发酵液与纯品EPS和GABA抗氧化能力比较
5.1制备EPS粗品：用移液枪准确吸取上述5 mL实施例2的发酵液，沸水浴对发酵液灭活，冷却至室温，13000 rpm离心5 min，去除菌体，上清液加入80%（w/v）三氯乙酸溶液至终浓度为4%（w/v），充分搅拌，在40℃静置24h，，13000 rpm离心30min，去除残留的变性蛋白；向上清液中加入15 mL无水乙醇静置24h醇沉，13000 rpm离心30 min，去除沉淀并用适当的去离子水复溶，在8000-14000 Da的透析袋中透析48h，每6h换一次水，将透析液真空冷冻干燥后得EPS粗品。
5.2配制样品溶液：
①稀释的嗜热链球菌NX1发酵液：将实施例2中的嗜热链球菌NX1发酵液稀释6100倍，得到稀释的嗜热链球菌NX1发酵液，其中EPS含量为 100 ug/mL，GABA 含量为262ug/mL。
②EPS溶液：将醇沉得到的EPS粗品用蒸馏水配制得到浓度为362ug/mL的水溶液。
③GABA溶液：将GABA纯品用蒸馏水配制得到浓度为362 ug/mL的水溶液。
④EPS+GABA混合液：将醇沉所得的EPS粗品和GABA纯品混合，用蒸馏水配制得到EPS终浓度为100 ug/mL、GABA终浓度为262 ug/mL的水溶液。
5.3 DPPH的清除能力的测定：取50 µL各样品溶液，与250 µL浓度为25 µM的DPPH-乙醇溶液充分混匀，在室温下避光反应30 min，在517 nm下测反应液的吸光度。根据吸光度计算清除率，清除率计算公式如下：
清除率（%）=[1-（A-A1）/A0]×100
A：样品组吸光度值；A1试剂空白吸光度值，即以等体积的无水乙醇代替DPPH溶液。A0：样品空白吸光度值，即以等体积蒸馏水代替样品溶液。
5.4 ·OH的清除能力的测定：取150 µL各样品溶液，与150 µL 9 mM的FeSO4.7H2O溶液、150 µL 9 mM的乙醇-水杨酸溶液充分混匀，再加入150 µL 8.8 mM的H2O2溶液，于37℃反应30 min，在510 nm下测反应液的吸光度。根据吸光度计算清除率，清除率计算公式如下：
清除率（%）=[1-（A-A1）/A0]×100
A：样品组吸光度值；A1：试剂空白吸光度值，即以等体积的蒸馏水代替FeSO4.7H2O溶液；A0：样品空白吸光度值，即以等体积蒸馏水代替样品溶液。
5.5实验结果
采用上述方式对各样品的DPPH和·OH清除能力进行测定，结果如图7和图8所示。从图中可以看出，EPS溶液与EPS+GABA混合液相比抗氧化能力相似，这说明EPS和GABA在抗氧化能力方面无明显增效作用。而从本发明稀释的嗜热链球菌NX1发酵液的抗氧化效果看，发酵液的抗氧化效果明显优于EPS溶液、GABA溶液和EPS+GABA混合溶液，在抗氧化能力方面有了极大的提升，表现出了明显的增效作用。

Claims (10)

1.一种嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）NX1，其特征是：其保藏编号为CGMCC No. 24922。
2.权利要求 1所述的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）NX1在制备发酵产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述发酵产品中含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖中的一种或两种，优选的，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸；进一步优选的，发酵产品中同时含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述发酵产品为嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液或者由嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液制备而成。
5.一种发酵产品，其包含权利要求1所述的嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）NX1。
6.根据权利要求5所述的发酵产品，其特征是：所述发酵产品中含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖中的一种或两种，优选的，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸；进一步优选的，发酵产品中同时含有γ-氨基丁酸和乳酸菌胞外多糖，所述乳酸菌胞外多糖中含有透明质酸。
7.根据权利要求5或6所述的发酵产品，其特征是：其为嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液或由嗜热链球菌NX1发酵得到的发酵液为原料制成；优选的，所述发酵产品为液态或固态。
8.权利要求5-7中任一项所述的发酵产品作为抗氧化成分的应用。
9.权利要求5-7中任一项所述的发酵产品在制备食品、药品、化妆品中的应用。
10.一种具有抗氧化作用的产品，其特征是：包括权利要求5-7中任一项所述的发酵产品；优选的，所述具有抗氧化作用的产品为食品、药品或化妆品。
CN202211206788.2A 2022-09-30 2022-09-30 具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用 Pending CN117801975A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211206788.2A CN117801975A (zh) 2022-09-30 2022-09-30 具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211206788.2A CN117801975A (zh) 2022-09-30 2022-09-30 具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117801975A true CN117801975A (zh) 2024-04-02

Family

ID=90428553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211206788.2A Pending CN117801975A (zh) 2022-09-30 2022-09-30 具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117801975A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110144304B (zh) 干酪乳杆菌菌株及其应用
CN102533588B (zh) 一株产胞外多糖的短乳杆菌及其应用
CN110734880B (zh) 源于广西巴马具有高产维生素B能力的植物乳杆菌Bama06及其用途
CN113832058A (zh) 乳双歧杆菌BLa80在制备降血脂和调节肠道菌群的药物或食品中的应用
CN114642686B (zh) 一种复合益生菌及其延缓衰老和抗氧化的作用
CN115521889B (zh) 一株产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌WL02及其用途
CN113444664B (zh) 一株产γ-氨基丁酸短乳杆菌及其应用
CN109679864B (zh) 一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
CN107988115A (zh) 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法
CN114657095A (zh) 一株发酵乳杆菌ncu001464
CN112725216B (zh) 一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用
CN110982759A (zh) 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及其应用
CN104231106B (zh) 一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用
CN111944712B (zh) 一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌和应用
CN116574664A (zh) 长双歧杆菌胞外多糖在促进乳酸菌增殖方面的应用
CN115927107A (zh) 不利用乳果糖、可利用半乳糖的鼠李糖乳酪杆菌及其应用
CN112715964B (zh) 一种螺旋藻寡糖及其在制备调节肠道健康功能制剂中的应用
CN103571779A (zh) 一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基、菌株及生产方法
CN117801975A (zh) 具有γ-氨基丁酸和胞外多糖合成能力的嗜热链球菌及其应用
CN109456898A (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用
CN115725451A (zh) 屎肠球菌fua027及其产尿石素a的方法及应用
CN113209141A (zh) 一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物及其应用
CN117084411B (zh) 一种提高乳蛋白水解物抗氧化活性的方法及鼠李糖乳杆菌发酵产品
CN116790434B (zh) 戊糖乳杆菌及其在制备糖代谢调节剂中的应用
CN115895978B (zh) 一株柠檬明串珠菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination