CN107988115A - 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法 - Google Patents

植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107988115A
CN107988115A CN201711441300.3A CN201711441300A CN107988115A CN 107988115 A CN107988115 A CN 107988115A CN 201711441300 A CN201711441300 A CN 201711441300A CN 107988115 A CN107988115 A CN 107988115A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plantarum
lactobacillus plantarum
fermentation
skin care
cgmcc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711441300.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107988115B (zh
Inventor
姚国强
其木格苏都
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Scitop Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Beijing Scitop Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Scitop Bio Tech Co ltd filed Critical Beijing Scitop Bio Tech Co ltd
Priority to CN201711441300.3A priority Critical patent/CN107988115B/zh
Publication of CN107988115A publication Critical patent/CN107988115A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107988115B publication Critical patent/CN107988115B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本申请提供一株植物乳杆菌以及用该植物乳杆菌制备的益生菌发酵液及其制备方法，所述植物乳杆菌在发酵后能够产生大量乳酸菌及护肤活性因子，可用于护肤品，制备所述益生菌发酵液的方法条件温和，原料来源广泛，制得的益生菌发酵液中含有乳酸菌活菌和护肤活性因子，如超氧化物歧化酶和透明质酸等，这些乳酸菌以及护肤活性因子均来源于可食用的菌类微生物，而绝无人工化学添加剂，因此，用本申请提供的方法制得的益生菌发酵液绿色健康，不会对皮肤造成伤害，适于用于护肤品。

Description

植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌菌株，使用该植物乳杆菌制备的复 合益生菌发酵液及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体重要的器官之一，是帮助宿主抵御致病菌入侵的第一道防线，是人体第四大 微生态体系。皮肤微生态系统由许多生理、形态不同的微环境“生态位”和生活在其中各种各 样的微生物群系组成。这些微生物群系以细菌为主，还包括少量的真菌、病毒和螨虫等。皮 肤常驻菌群的紊乱会导致过敏性皮炎，牛皮藓，痤疮等常见的皮肤疾病发生，并且在真皮层 或皮肤内部延伸导致多种组织发生病变。传统的治疗方法多使用抗生素，激素等药物，药物 的使用非但不能根治疾病，并且会导致较强的药物依赖性、耐药性和抗药性。
因此，亟需开发一种能够根治皮肤疾病，而且不易产生药物依赖性、耐药性和抗药性的 产品。
发明内容
本申请的目的之一是提供一种植物乳杆菌菌株；本申请的目的之二是将所述植物乳杆菌 菌株制备成益生菌发酵液用于护肤。
为达到上述目的，本申请是通过以下技术方案来实现的：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum C2，L.plantarum C2)通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基， 37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3 次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物 乳杆菌C2(Lactobacillus plantarum C2)，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14532；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏 时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum C2)具有如下生物学特性：菌 种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm， 乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6. 5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum C2)能够用于护肤。其在皮肤上能 够产生大量的有机酸从而降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体 免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力。而且，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上产 生过氧化氢、抗菌肽与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用。此外，所述植 物乳杆菌还可以在皮肤上代谢产生多种护肤活性因子，如超氧化物歧化酶、透明质酸等，从 而实现护肤的作用。
本申请还提供一种使用所述植物乳杆菌制备益生菌发酵液的方法，所述方法包括：
步骤1，将L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2四株菌株接 种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9 的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469 和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵。
在一种可能的实现方式中，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang 和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8:B.lactis V9:L.caseiZhang:L.plantarum C2＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，其 中，各菌种的用量以各菌种的活菌数量计。
进一步地，所用的培养基包括：
在一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的pH为4.5～7.0。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的温度为25℃～40℃。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，发酵的时间为20h～50h。
本申请还提供一种根据上述方法制备的益生菌发酵液，所述益生菌发酵液中，益生菌活 菌数为(5～7)×109CFU/mL，和/或超氧化物歧化酶为(95～98)U/mL，和/或透明质酸含量 为(107～110)μg/mL。
本申请提供的制备益生菌发酵液的方法反应条件温和，原料来源广泛，制得的益生菌发 酵液中乳酸菌活菌数量大，而且产生了数量可观的护肤活性因子，如超氧化物歧化酶和透明 质酸等，其中，乳酸菌能够降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机 体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力，还可以在皮肤上产生过氧化氢、抗菌肽 与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用，由于这些乳酸菌以及护肤活性因子 均来源于可食用的菌类微生物，而绝无人工化学添加剂，因此，用本申请提供的方法制得的 益生菌发酵液绿色健康，安全无残留，不会对皮肤造成伤害，适于用于护肤品，如可作为护 肤用化妆品的原料或配料使用，能够广泛应用于面膜、乳霜、香波等产品中，调理皮肤微生 态系统，维护皮肤健康。
具体实施方式
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum C2)通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基， 37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3 次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物 乳杆菌C2(Lactobacillus plantarum C2)，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14532；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏 时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum C2)具有如下生物学特性：菌 种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm， 乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6. 5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum C2)能够用于护肤。其在皮肤上能 够产生大量的有机酸从而降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体 免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力。而且，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上产 生过氧化氢、抗菌肽与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用。此外，所述植 物乳杆菌还可以在皮肤上代谢产生多种护肤活性因子，如超氧化物歧化酶、透明质酸等，从 而实现护肤的作用。
本申请还提供一种使用所述植物乳杆菌制备益生菌发酵液的方法，所述方法包括：
步骤1，将L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2四株菌株接 种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9 的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469 和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；其中，菌株L.plantarum P-8，菌 株B.lactis V9和菌株L.casei Zhang为现有技术已经公开的菌株，如中国专利CN105802876A 中所公开的。
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵。
在一种可能的实现方式中，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang 和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8:B.lactis V9:L.caseiZhang:L.plantarum C2 ＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，如1:2:1:1， 1:1:2:1，1:1:1:2或者1:2:2:1，最优选为1:2:2:1。本发明人发现，4株菌不同的发酵比例对混 合发酵中活菌数、活性物质含量(SOD、HA)影响较大，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的发酵比例为1:2:2:1发酵时有利于4株菌的生长和活性物质的积累， 具体请参见实施例12～15。
进一步地，本申请中所用的培养基包括：
优选为
如，
其中，基于1g计为1重量份。
本发明人发现，在培养基中加入不同量的胶原蛋白粉、乳清蛋白粉和酵母蛋白粉培养制 得的发酵液中乳酸菌的数量显著不同，当按照上述比例进行配比时制得的菌液中乳酸菌的活 菌数量最大，因此，本申请选择按照上述配比制备培养基，具体请参见实施例8～11。
在一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的pH为4.5～7.0，优选为4.7～6.0，如5.0或 者5.5，最优选为5.0。本发明人发现，在发酵阶段，与不控制体系的pH相比，如果体系pH 保持在上述范围内，则制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对皮肤有益的活性物质积累较丰富， 因此，本发明选择在发酵阶段控制体系pH在上述范围内，具体请参见实施例16～19。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的温度为25℃～40℃，优选为28℃～38℃， 如30℃或者37℃。本发明人发现，在发酵阶段，如果体系的温度恒定在上述温度范围内，制 得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对皮肤有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在发 酵阶段使体系的温度恒定在上述温度范围内，具体请参见实施例24和25。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，发酵的时间为20h～50h，优选为24h～42h，如 30h和36h。本发明人发现，在发酵阶段，如果发酵时间在上述时间范围内，制得的发酵液中 乳酸菌活菌数以及对皮肤有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在发酵阶段使体系 的发酵时间在上述时间范围内，具体请参见实施例20～23。
在本申请中，所述制备益生菌发酵液的方法包括：
步骤1，将L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2四株菌株接 种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9 的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469 和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；其中，
菌株组合物的总接种量为2％，其中，L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.caseiZhang和L. plantarum C2的配比为1:2:2:1；
所述培养基包括以下重量比的组分：
其中，基于1g计为1重量份，
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵，其中，发酵温度为30℃，体系pH＝5.0，发酵时间为30h。
本申请还提供一种根据上述方法制备的益生菌发酵液，所述益生菌发酵液中，益生菌活 菌数为(5～7)×109CFU/mL，和/或超氧化物歧化酶为(95～98)U/mL，和/或透明质酸含量 为(107～110)μg/mL。
本申请提供的制备益生菌发酵液的方法反应条件温和，原料来源广泛，制得的益生菌发 酵液中乳酸菌活菌数量大，而且产生了数量可观的护肤活性因子，如超氧化物歧化酶和透明 质酸等，其中，乳酸菌能够降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机 体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力，由于这些乳酸菌以及护肤活性因子均来 源于可食用的菌类微生物，而绝无人工化学添加剂，因此，用本申请提供的方法制得的益生 菌发酵液绿色健康，不会对皮肤造成伤害，适于用于护肤品。
实施例
实施例1植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum C2)的分离、筛选与鉴定
1.材料与方法
1.1菌株来源、分离与鉴定
自四川省居民家庭采集自然发酵的泡菜样品，称取10g样品用90g无菌生理盐水稀释后， 取0.1mL涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色 镜检，选取革兰氏阳性菌株再划线于MRS固体培养基培养2-3次得到纯菌落。本菌株显微镜 下观察形态为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状；在MRS固体培养基上菌 落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑，无运动特性。
对分离到的菌株进行生理生化鉴定和16s rRNA分子鉴定，根据《伯杰细菌鉴定手册》， 使用细菌微量生化鉴定管(广东环凯微生物科技有限公司)进行鉴定，鉴定结果见表1。提 取该菌株的DNA样品，样品经上海美吉生物医药科技有限公司进行16s rRNA分子鉴定，分 子序列经NCBI数据库blastn比对，确认C2为植物乳杆菌，16s序列见本申请提供的序列表。
表1植物乳杆菌C2生化鉴定结果
实施例2植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum C2)的代谢产物测定
检测方法：
1.超氧化物歧化酶(SOD)的测定依照国标GB/T 5009.171-2003执行。
2.透明质酸(HA)含量测定
2-1.称取HA标准品，分别配制浓度为100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL、180μg/mL、200μg/mL HA标样。
2-2.称取NaCl，稀释制得浓度为0.2μg/mL NaCl溶液。取100mL样液加入2.5gCTAB， 制得25mg/mL CTAB溶液。
2-3.取10μL不同浓度标样各加入20μL CTAB溶液，充分混合，反应10min后，以CTAB溶液为空白，准确测定OD400值(400nm下测定的光密度)，绘制标准曲线。
2-4.取发酵液经4200r/min离心15min，去除菌体取上清液，加入2.5倍的无水乙醇，在4℃静置1h，离心去沉淀，加入所取上清液适当倍数体积的去离子水，振荡溶解，即制得样 液，取10μL加入离心管，取20μLCTAB加入离心管混合，反应10min测定OD400值。计算出样品中HA含量。
3.苯乳酸(PLA)和4-羟基苯乳酸含量测定
3.1取一定量的发酵液与1mol/L的盐酸以体积比1:4加入到离心管中，9000rpm离心 10min。吸取10ml上清液过0.22μm滤膜，过滤后即为待测样品。(当测定γ-氨基丁酸时则需 10000rpm离心5min,过滤后取10μL与90μL邻苯二甲醛溶液反应1min后上机)。
3.2苯乳酸、4-羟基苯乳酸色谱条件：色谱柱Waters HSS T3，柱温30℃，流动相分别为 (A)0.1％甲酸(B)甲酸乙腈溶液，梯度洗脱条件(0～2min，20％～50％B；2.1～3min，50％～95％B； 3～3.1min，95％～5％B；运行时间3.1min)，流速0.4mL/min，进样体积5.0μL。质谱检测采用 ESI正离子模式，毛细管电压2.5kv，锥孔电压40v，离子源温度100℃，脱溶剂气温度600℃， 锥孔气流量600L/h，脱溶剂气流量0L/h，并且以亮氨酸-脑啡肽[M-H＝554.2615]作为质量校正 轴的参比物。
γ-氨基丁酸色谱条件：色谱柱ZORBAX Elipse AAA C18 column(3.5gym,4.6x150mm)， 柱温35℃，流动相分别为(A)磷酸氢二钠(B)甲醇乙腈水溶液(45：45：10)，梯度洗脱 A相97％，B相3％，流速2.0mL/min。
检测结果：将L.plantarum C2菌种接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代2次取其培养液依照实施例2的方法进行超氧化物歧化酶(SOD)、透明质酸(HA)、苯乳 酸(PLA)和4-羟基苯乳酸含量的检测，监测结果见表1。
表1 L.plantarum C2菌株代谢产物含量测定
本申请以下实施例中所述益生菌为：
L.plantarum P-8的保藏编号为：CGMCC No.6312
B.lactis V9的保藏编号为：CGMCC No.5470
L.casei Zhang的保藏编号为：CGMCC No.5469
L.plantarum C2的保藏编号为：CGMCC No.14532。
本申请以下实施例中所用原料的来源为：
MRS液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司，250g/瓶；
TPY液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司，250g/瓶。
(一)菌种的活化
1.L.plantarum P-8，L.casei Zhang和L.plantarum C2的活化
冷冻干燥保存的菌株L.plantarum P-8，L.casei Zhang和L.plantarum C2菌种接种于MRS 液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代2次。
2.B.lactis V9的活化
冷冻干燥保存的菌株B.lactis V9菌种接种于TPY液体培养基中，37℃恒温厌氧培养24h， 传代2次。
(二)活菌计数方法
采用倾注平板计数法，具体操作步骤为：依据GB 4789.35-2016方法
实施例3～7不同菌株的筛选
实验方法：向培养基中接种不同的菌株，总接种量均为2％，在37℃发酵24h，分别测定 体系中代谢产物，结果如下表2所示：
表2不同菌株的筛选结果
由表1可知，不同菌株在相同的培养基质中，产生的乳酸菌活菌数不同，此外产生的对 皮肤有益的活性物质如超氧化物歧化酶和透明质酸的积累不同，在L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的组合物混合发酵时效果最佳，所以，本申请选用L. plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的组合物作为发酵菌种。
实施例8～11发酵培养基的筛选
实验方法：基础培养基配方如下：大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉40g，蔗糖50g为主要成 分，蒸馏水1L，pH 7.0，添加或不添加胶原蛋白粉、乳清蛋白粉和酵母蛋白粉，具体地，向 发酵培养基中加入蒸馏水1L，调节培养基的pH＝7.0，向培养基中接种L.plantarum P-8，B. lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的组合物(1:1:1:1)，总接种量为2％，在37℃发 酵24h，测定体系中代谢产物，结果如下表3所示：
表3不同发酵培养的筛选结果
由表3可知，以大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉为基础的培养基，添加胶原蛋白粉、乳清蛋 白粉和酵母蛋白粉混合发酵，可获得较高的活菌数，因此，本申请优选发酵培养基为大豆分 离蛋白粉/脱脂大豆粉40g，蔗糖50g，胶原蛋白粉5g，乳清蛋白粉5g，酵母蛋白粉5g，蒸馏 水1L，pH＝7.0，并且以下实施例采用所述优选发酵培养基作为实验基础。
实施例12～15菌株组合物中各菌株发酵比例的筛选
实验方法：将菌株组合物接种于培养基中，在37℃发酵24h，分别测定体系中代谢产物， 结果如下表4所示：
表4不同菌株配比的筛选结果
由表4可知，4株菌不同的发酵比例对混合发酵中活菌数、活性物质含量(SOD、HA)影 响较大，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的发酵比例为1:2:2:1 发酵时有利于4株菌的生长和活性物质的积累，因此，本申请优选L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的发酵比例为1:2:2:1，并且，以下实施例采用该比例。
实施例16～19 pH条件的筛选
实验方法：将菌株组合物接种于培养基中，总接种量为2％，在37℃发酵24h，在实施例 17～19中，用流加10mol/L NaOH溶液的方式保持体系pH值恒定，分别测定体系中代谢产物， 结果如下表5所示：
表5不同pH条件的筛选结果
由表5可知，发酵时体系的pH对益生菌混合发酵液中益生菌活菌数及对皮肤有益的活 性物质积累(SOD、HA)的存在显著差异，经优化发现当L.plantarum P-8，B.lactisV9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种量为2％(1:2:2:1)，通过流加10mol/L NaOH溶液控制pH＝5.0， 37℃发酵24h时其混合发酵液中活菌数、超氧化物歧化酶活性和透明质酸含量最高，在本申 请中选择保持体系pH恒定为5.0，优选通过流加10mol/L NaOH溶液保持体系恒定。并且， 在以下实施例中，采用该条件。
实施例20～23发酵时间的筛选
实验方法：将菌种组合物接种于培养基中，总接种量为2％，在37℃恒pH5.0发酵24h， 通过流加10mol/L NaOH溶液控制pH值，分别测定体系中代谢产物，结果如下表6所示：
表6不同发酵时间的筛选结果
由表6可知，随着发酵时间的延长，混合发酵液中益生菌活菌数有所提高，有益于皮肤 的代谢产物逐渐积累。但随着发酵时间的逐渐延伸，发酵液中营养物质和环境的恶化，益生 菌生长停止并呈下降趋势，有益代谢产物积累也停止，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2于37℃恒pH5.0发酵30h时，混合发酵液中益生菌活菌含量、超氧 化物歧化酶和透明质酸含量最高。因此，本申请选择发酵时间为30h，在以下实施例中采用 该发酵时间。
实施例24～25发酵温度的筛选
实验方法：将菌种组合物接种于培养基中，总接种量为2％，在37℃下，通过流加10mol/L NaOH溶液保持体系pH恒定为5.0，发酵30h，分别测定体系中代谢产物，结果如下表7所 示：
表7不同发酵温度的筛选结果
由表7可知，不同培养温度下，菌株自身的代谢活性酶不同，由表6可知，低温长时发 酵更有利于代谢产物的积累，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2于30℃恒pH5.0发酵30h时，混合发酵液中益生菌活菌含量、超氧化物歧化酶和透明质酸 含量最高，混合发酵液中乳酸菌活菌数为6.48×109CFU/mL，超氧化物歧化酶(SOD)为 95.7U/mL，透明质酸含量为107.9μg/mL。
因此，本申请优选发酵温度为30℃。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理 解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对 本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。 本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京科拓恒通生物技术股份有限公司
<120> 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tctgtcactt aggcggctgg ttcctaaaag gttaccccac cgactttggg tgttacaaac 60
tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact 180
gagaatggct ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa 360
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt 480
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga 600
atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat 660
cgtttacggt atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct 720
cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg 780
catttcaccg ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc 840
cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc 900
tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca 1020
gatatgttct tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc 1080
gttgctccat cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1140
tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat 1200
tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg 1260
atagccgaag ccatctttca aactcggacc atgcggtcca agttgttatg cggtattagc 1320
atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt 1380
tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag agttcgtcga 1440
ctgcattata gcaccccgca c 1461

Claims (10)

1.一株分离的植物乳杆菌菌株(L.plantarum C2)，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.14532。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株用于制备护肤品的用途。
3.一种制备益生菌发酵液的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1，将L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2四株菌株接种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactisV9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCCNo.5469和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8的活菌数量:B.lactis V9的活菌数量:L.casei Zhang的活菌数量:L.plantarum C2的活菌数量＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所用的培养基包括：
其中，基于1g计为1重量份。
6.根据权利要求3至5任一项所述的方法，其特征在于，体系的pH为4.5～7.0。
7.根据权利要求3至6任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2中，体系的温度为25℃～40℃。
8.根据权利要求3至7任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2中，发酵的时间为20h～50h。
9.根据权利要求8所述方法制备的益生菌发酵液，其特征在于，所述益生菌发酵液中，
益生菌活菌数为(5～7)×109CFU/mL，和/或
超氧化物歧化酶为(95～98)U/mL，和/或
透明质酸含量为(107～110)μg/mL。
10.根据权利要求9所述的益生菌发酵液用于护肤的用途。
CN201711441300.3A 2017-12-27 2017-12-27 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法 Active CN107988115B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711441300.3A CN107988115B (zh) 2017-12-27 2017-12-27 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711441300.3A CN107988115B (zh) 2017-12-27 2017-12-27 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107988115A true CN107988115A (zh) 2018-05-04
CN107988115B CN107988115B (zh) 2020-06-23

Family

ID=62042775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711441300.3A Active CN107988115B (zh) 2017-12-27 2017-12-27 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107988115B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019118346A (ja) * 2018-01-08 2019-07-22 北京科拓恒通生物技術股▲フェン▼有限公司 プロバイオティクス組成物、スキンケアエッセンスとマスク及びその製造方法
CN111466573A (zh) * 2020-04-13 2020-07-31 金华银河生物科技有限公司 一种高活性乳酸菌代谢物质的浓缩提取工艺
TWI700365B (zh) * 2018-11-14 2020-08-01 弘光科技大學 新穎乳酸菌菌株及其用於治療或/及預防皮膚疾病之用途
WO2020177456A1 (zh) * 2019-03-05 2020-09-10 山东安华生物医药股份有限公司 一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用
CN114836343A (zh) * 2022-04-19 2022-08-02 河北科技大学 一种植物乳杆菌p10及其应用
CN114908020A (zh) * 2022-05-31 2022-08-16 仁和全域(上海)大健康研究院有限公司 一种抗幽门螺旋杆菌感染的植物乳杆菌及其在食用本草酵素产品中的应用
CN115624517A (zh) * 2022-10-27 2023-01-20 内蒙古科拓生物有限公司 一种益生菌后生元制品及其在促进皮肤健康中的应用

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010143885A (ja) * 2008-12-22 2010-07-01 Asahi Breweries Ltd 乳酸菌およびそれらを用いた飲食物又は化粧品
CN101864375A (zh) * 2010-01-15 2010-10-20 吉林省农业科学院 一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用
CN102851259A (zh) * 2011-06-28 2013-01-02 花王株式会社 抗氧化剂的制造方法
CN103027231A (zh) * 2013-01-01 2013-04-10 蒋常德 一种复合益生菌发酵中草药活性保健液及其制备方法
JP2013245170A (ja) * 2012-05-23 2013-12-09 Nippon Menaade Keshohin Kk ヒアルロン酸合成促進剤及び皮膚外用剤
CN104586735A (zh) * 2014-12-09 2015-05-06 美嘉乐(上海)生物科技有限公司 干酪乳杆菌发酵大米制备发酵产物滤液的方法及其应用
CN104845904A (zh) * 2015-02-27 2015-08-19 河北科技大学 一种植物乳杆菌菌株及其应用
CN105176875A (zh) * 2015-10-10 2015-12-23 塔里木大学 一种植物乳杆菌及其应用
US20160004298A1 (en) * 2008-04-07 2016-01-07 Mohammad A. Mazed Chemical Compositon And Its Devlivery For Lowering The Risks Of Alzheimer's Cardiovascular And Type -2 Diabetes Diseases
CN105802876A (zh) * 2016-03-24 2016-07-27 北京科拓恒通生物技术开发有限公司 一种复合益生菌发酵苜蓿嫩芽粉制剂及其制备方法和应用
CN106176556A (zh) * 2016-08-31 2016-12-07 张进 一种祛痘控油美白面霜
CN106309309A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 江苏微康生物科技有限公司 牛奶发酵产物滤液及其制备方法和应用
CN106399192A (zh) * 2016-10-25 2017-02-15 江苏微康生物科技有限公司 一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用
CN107227277A (zh) * 2017-07-17 2017-10-03 浙江鸣食品股份有限公司 一种植物乳杆菌e680及其应用

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160004298A1 (en) * 2008-04-07 2016-01-07 Mohammad A. Mazed Chemical Compositon And Its Devlivery For Lowering The Risks Of Alzheimer's Cardiovascular And Type -2 Diabetes Diseases
JP2010143885A (ja) * 2008-12-22 2010-07-01 Asahi Breweries Ltd 乳酸菌およびそれらを用いた飲食物又は化粧品
CN101864375A (zh) * 2010-01-15 2010-10-20 吉林省农业科学院 一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用
CN102851259A (zh) * 2011-06-28 2013-01-02 花王株式会社 抗氧化剂的制造方法
JP2013245170A (ja) * 2012-05-23 2013-12-09 Nippon Menaade Keshohin Kk ヒアルロン酸合成促進剤及び皮膚外用剤
CN103027231A (zh) * 2013-01-01 2013-04-10 蒋常德 一种复合益生菌发酵中草药活性保健液及其制备方法
CN104586735A (zh) * 2014-12-09 2015-05-06 美嘉乐(上海)生物科技有限公司 干酪乳杆菌发酵大米制备发酵产物滤液的方法及其应用
CN104845904A (zh) * 2015-02-27 2015-08-19 河北科技大学 一种植物乳杆菌菌株及其应用
CN105176875A (zh) * 2015-10-10 2015-12-23 塔里木大学 一种植物乳杆菌及其应用
CN105802876A (zh) * 2016-03-24 2016-07-27 北京科拓恒通生物技术开发有限公司 一种复合益生菌发酵苜蓿嫩芽粉制剂及其制备方法和应用
CN106309309A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 江苏微康生物科技有限公司 牛奶发酵产物滤液及其制备方法和应用
CN106176556A (zh) * 2016-08-31 2016-12-07 张进 一种祛痘控油美白面霜
CN106399192A (zh) * 2016-10-25 2017-02-15 江苏微康生物科技有限公司 一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用
CN107227277A (zh) * 2017-07-17 2017-10-03 浙江鸣食品股份有限公司 一种植物乳杆菌e680及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANGEUN KIM等: "Effects of Oral Intake of Kimchi-Derived Lactobacillus plantarum K8 Lysates on Skin Moisturizing", 《J. MICROBIOL. BIOTECHNOL.》 *
武晋海: "《天津冬菜发酵技术的研究》", 31 May 2016, 山西科学技术出版社 *
邵丽: "产胞外多糖乳杆菌的筛选及其多糖的分离、结构和生物活性研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019118346A (ja) * 2018-01-08 2019-07-22 北京科拓恒通生物技術股▲フェン▼有限公司 プロバイオティクス組成物、スキンケアエッセンスとマスク及びその製造方法
TWI700365B (zh) * 2018-11-14 2020-08-01 弘光科技大學 新穎乳酸菌菌株及其用於治療或/及預防皮膚疾病之用途
WO2020177456A1 (zh) * 2019-03-05 2020-09-10 山东安华生物医药股份有限公司 一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用
CN111466573A (zh) * 2020-04-13 2020-07-31 金华银河生物科技有限公司 一种高活性乳酸菌代谢物质的浓缩提取工艺
CN114836343A (zh) * 2022-04-19 2022-08-02 河北科技大学 一种植物乳杆菌p10及其应用
CN114836343B (zh) * 2022-04-19 2024-03-15 河北科技大学 一株能高产γ-氨基丁酸且拮抗有害菌的植物乳杆菌P10及其应用
CN114908020A (zh) * 2022-05-31 2022-08-16 仁和全域(上海)大健康研究院有限公司 一种抗幽门螺旋杆菌感染的植物乳杆菌及其在食用本草酵素产品中的应用
CN115624517A (zh) * 2022-10-27 2023-01-20 内蒙古科拓生物有限公司 一种益生菌后生元制品及其在促进皮肤健康中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107988115B (zh) 2020-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107988115B (zh) 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法
JP6713065B2 (ja) プロバイオティクス組成物、スキンケアエッセンスとマスク及びその製造方法
CN108728382B (zh) 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用
EP4053262A1 (en) Lactobacillus casei producing short-chain fatty acids, cultivation method therefor and application thereof
CN113444664B (zh) 一株产γ-氨基丁酸短乳杆菌及其应用
CN111100810B (zh) 一株植物乳杆菌dnb1及其胞外多糖和应用
CN113980848B (zh) 一种戊糖片球菌sbc5及其应用
CN111849836B (zh) 一种具有抗氧化的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN115039885A (zh) 一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌及其益生菌组合物、发酵液和应用
CN105132321B (zh) 一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法
CN113604395B (zh) 一株可发酵石斛且其发酵液可改善皮肤质量的植物乳杆菌
CN110777097A (zh) 一株强耐酸性乳酸杆菌菌株及其筛选、发酵工艺
CN112126599B (zh) 一种瑞士乳杆菌的高密度培养方法、高活力菌粉的制备及其应用
CN108018248B (zh) 一种具有调节抗生素引起的菌群结构紊乱的干酪乳杆菌
CN110878273B (zh) 一株短双歧杆菌及其在制备共轭脂肪酸中的应用
CN111454863A (zh) 一种发酵乳杆菌及其在制备具有抗衰老功能的乳酸菌发酵液中的应用
CN114480214A (zh) 一株西藏阿里牦牛奶疙瘩中分离的副干酪乳杆菌及应用
CN114032190B (zh) 一株可发酵石斛且其发酵液可有效修复日光皮炎的罗伊氏乳杆菌
CN114645001A (zh) 一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用
CN111676170B (zh) 一株发酵乳杆菌及其在制备共轭脂肪酸中的应用
KR102094768B1 (ko) 류코노스톡 메센테로이데스 cjnu 0705 균주 및 이의 용도
CN104877940A (zh) 一株嗜热链球菌
CN1793325A (zh) 芳香型直投式酸奶发酵剂
CN113717887B (zh) 一种鹅源植物乳杆菌及其应用
CN114645003A (zh) 一株副干酪乳杆菌及其在制备皮肤抑菌和抗炎的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant