KR101584380B1

KR101584380B1 - 혈중 요산치 저감작용을 갖는 유산균

Info

Publication number: KR101584380B1
Application number: KR1020107013967A
Authority: KR
Inventors: 히로시 츠보이; 노리코 가네코; 아키나 사토우; 아키노리 구메; 가츠노리 기무라
Original assignee: 가부시키가이샤 메이지
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-11-27
Publication date: 2016-01-21
Also published as: JPWO2009069704A1; CN102016004A; WO2009069704A1; US8389266B2; CN102016004B; US20100316618A1; JP5149305B2; EP2221360B1; EP2221360A4; KR20100109911A; CA2707187A1; EP2221360A1; HK1155481A1; CA2707187C

Abstract

음식품이나 의약품 용도에 적합하고, 혈중 요산치의 상승을 억제 가능한 유산균을 제공한다.
푸린체(purines) 존재하에서 각종 유산균을 배양하고, 그 푸린체의 소비량 및 그 푸린체 분해물의 생산량을 측정하여, 푸린체 분해능이 현저한 복수의 유산균을 선발하였다. 상기 선발에 의해 푸린체 분해능이 높다고 판단된 유산균을, 푸린체 함유 사료로 사육한 랫트에 경구투여하고, 당해 랫트의 일반상태 및 혈청 요산치를 측정하여, 유산균 투여에 따른 혈청 요산치로의 영향을 검토하였다. 그 결과, 혈청 요산치의 상승을 유의하게 억제하는 유산균:Lactobacillus gasseri OLL2922를 발견하였다.

Description

혈중 요산치 저감작용을 갖는 유산균{Lactic acid bacterium having effect of lowering blood uric acid level}

본 발명은 혈중 요산치 저감작용을 갖는 유산균 및 그의 이용방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 유산균을 포함하는 고요산혈증(hyperuricemia)의 예방 및/또는 치료용 식품 또는 의약품에 관한 것이다.

고요산혈증은, 환경 요인(생활습관)이나 유전적 요인에 의해, 요산 배설 저하나 요산 생산 과잉이 일어나, 혈중 요산이 과잉이 된 상태이다. 고요산혈증은 자각증상이 없는 경우도 있으나, 통풍, 신기능장애, 요로결석증, 동맥경화증이라는 심각한 합병증을 일으킨다. 고요산혈증의 대표적 합병증인 통풍은, 격통을 수반하는 급성 관절염이 주증상으로서 나타난다. 과거에는, 통풍은 「제왕의 병」이라 불리고 있어, 고기나 생선, 알코올 등을 빈번하게 많이 섭취하는 층의 「부자병」이었으나, 최근에는, 식생활의 변화에 의해 매년 증가경향에 있다. 현재 일본에 있어서의 통풍의 환자 수는 30~40만명, 고요산혈증의 환자 수는 600만명으로 추정되고 있어, 고요산혈증의 예방 및 치료로의 관심이 높아지고 있다.

고요산혈증의 예방 및 치료는, 식사요법, 운동요법, 의약품 및 이들의 조합으로 혈중의 요산치를 조절함으로써 행해진다. 특히, 섭취 칼로리 제한은 고요산혈증의 예방 및 치료방법으로서 가장 선택되는 방법 중 하나이나, 엄격한 칼로리 제한을 계속하는 것은 반드시 용이하지만은 않다. 이러한 상황을 개선하는 방법으로서, 푸린체(purines)를 분해하는 유산균, 효모 등의 미생물을 경구적으로(예를 들면 의약품, 음식품으로서) 섭취시켜서, 장관 내에서 식사로부터 섭취된 푸린체를 분해하고, 그 체내로의 흡수를 감소시켜, 혈청 요산치를 저감시키는 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). 유산균은 예부터 식품이나 의약품으로서 이용되고 있고, 인체로의 안전성도 높기 때문에, 유산균 섭취는 부작용의 우려가 적은, 고요산혈증을 예방·치료하기 위한 유효한 방법으로 될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이, 고요산혈증의 예방 및 치료법의 제1 선택은 식사요법으로, 요산치의 조절을 가능하게 하는 유산균을 식품으로서 섭취할 수 있다면, 매우 현실적이고 또한 유력한 신규 고요산혈증의 예방 및/또는 치료법으로 될 수 있다. 그러나, 상기 문헌에서 보고된, 푸린체 분해능을 갖는 유산균:락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)는 가스 생산능을 가지고 있어, 음식품이나 의약품으로의 응용이라는 관점에서는 반드시 적당한 균종이라고만은 할 수 없다.

또한, 본 출원의 발명에 관련된 선행기술문헌정보를 이하에 나타낸다.

특허문헌 1: WO2004/112809

비특허문헌 1: 일본 농예화학회 홈페이지 일본 농예화학회 연차대회 강연발표 데이터베이스(http://isbba.bioweb.ne.jp/jsbba_db/index.html)「일본 농예화학회 2004.03.30 일반강연, 이케나가 다케시, 구메무라 메구미 외: 식사성 고요산혈증 모델 랫트의 혈중 요산치에 미치는 유산균의 영향」

본 발명은 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 음식품이나 의약품 용도에 적합한, 고요산혈증의 예방 및/또는 치료가 가능한 유산균을 제공하는 것으로, 또한 동시에, 상기 유산균을 사용한 고요산혈증의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자 등은 예의 노력을 거듭하였다. 먼저, 이노신 및 구아노신 존재하에서 각종 유산균을 배양하고, 상기 뉴클레오시드의 소비량 및 분해물(히포크산틴, 구아닌)의 생산량을 측정하여, 뉴클레오시드 분해능이 현저한 복수의 유산균을 선발하였다. 상기 선발에 의해 뉴클레오시드 분해능이 높은 것으로 판단된 유산균을, 푸린체 함유 사료로 사육한 랫트에 경구투여하고, 당해 랫트의 일반상태 및 혈청 요산치를 측정하여, 유산균의 투여에 따른 혈청 요산치로의 영향을 관찰하였다. 그 결과, 혈청 요산치의 상승을 유의하게 억제하는 유산균:락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) OLL2922를 발견하였다. 또한 본 발명자 등은, 상기 유산균을 사용하여 요구르트를 조제하여, 상기 유산균이 요구르트를 포함하는 식품의 가공용으로서 적합한 것을 확인하였다. 본 발명의 유산균은, 혈청 요산치의 상승을 억제하기 때문에, 고요산치혈증이나 통풍의 예방 및/또는 치료용 의약품으로서 유효하게 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 유산균은, 그 혈청 요산치의 상승 억제효과가 경구투여에 의한 실험에서 확인되고 있으며, 또한 실제 식품가공에 적합한 것도 확인되고 있기 때문에, 식품으로서 이용할 수 있는 점에서 유용성이 현저히 높다. 즉, 본 발명은 고요산혈증의 예방 및/또는 치료가 가능한 유산균 및 그의 이용에 관한 것으로, 구체적으로는, 이하의 발명을 제공하는 것이다.

본 발명은 보다 구체적으로는 이하의 [1]~[14]를 제공하는 것이다.

[1] 수탁번호:NITE BP-462로서 기탁되어 있는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 유산균 OLL2922주.

[2] 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물을 포함하는, 혈중 요산치 상승 억제용 음식품 또는 의약품.

[3] 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물을 포함하는, 고요산혈증의 예방 및/또는 치료용 음식품 또는 의약품.

[4] 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물을 포함하는, 푸린체의 흡수를 억제하기 위한 음식품 또는 의약품.

[5] 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물을 투여하는 것을 특징으로 하는, 대상에 있어서 식품에 포함되는 푸린체의 섭취를 억제하는 방법.

[6] 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물을 투여하는 것을 특징으로 하는, 대상에 있어서 혈중 요산치 상승을 억제하는 방법.

[7] 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물을 투여하는 것을 특징으로 하는, 대상에 있어서 고요산혈증을 치료하는 방법.

[8] 음식품의 원료 또는 중간제품을 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물에 접촉시키는 공정을 포함하는, 푸린체가 저감화된 음식품의 제조방법.

[9] 혈중 요산치 상승 억제용 음식품 또는 의약품을 제조하기 위한, 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물의 사용.

[10] 고요산혈증의 예방 및/또는 치료용 음식품 또는 의약품을 제조하기 위한, 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물의 사용.

[11] 푸린체의 흡수를 억제하기 위한 음식품 또는 의약품을 제조하기 위한, 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물의 사용.

[12] 대상에 있어서 식품에 포함되는 푸린체의 섭취를 억제하기 위한, 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물.

[13] 대상에 있어서 혈중 요산치 상승을 억제하기 위한, 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물.

[14] 대상에 있어서 고요산혈증을 치료하기 위한, 상기 [1]에 기재된 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물.

도 1은 푸린체(이노신) 존재하에서 각종 유산균을 배양했을 때의, 각 유산균의 푸린체 분해능을 나타내는 도면이다. 푸린체 분해율이 높은 것으로 확인된 균주(별표)를, 모델 동물 실험대상으로 하였다.
도 2는 푸린체(구아노신) 존재하에서 각종 유산균을 배양했을 때의, 각 유산균의 푸린체 분해능을 나타내는 도면이다. 푸린체 분해율이 높은 것으로 확인된 균주(별표)를, 모델 동물 실험대상으로 하였다.
도 3은 각종 유산균의 푸린체 분해능을, (히포크산틴량+구아닌량)/5-브로모우라실량으로 평가한 도면이다.
도 4는 푸린체 분해능이 높은 유산균(L. fermentum, L. brevis)을 식사성 고요산혈증 모델 동물에 경구투여하고, 혈청 요산치를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 제1군:음성군, 제2군:대조군, 제3군:균체 투여군의 결과를 각각 나타낸다.
도 5는 L. gasseri OLL2922주 및 L. gasseri OLL2959주의 유전자 증폭산물의 비교를 나타내는 사진이다.

본 발명은 푸린체 분해능을 갖고, 가스 생산능을 갖지 않는 신규 Lactobacillus gasseri 유산균 OLL2922주에 관한 것이다. 본 발명은, 푸린체 분해능을 갖고, 가스 생산능을 갖지 않는 L. gasseri 유산균 OLL2922주가 본 발명자 등에 의해 처음 발견된 것을 토대로 하는 것이다.

Lactobacillus속은, 유산균의 대표적인 속의 하나로, 80종 이상의 종을 포함한다. Lactobacillus속에 포함되는 종의 예로서, Lactobacillus delbrueckii subsp. burgalicus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus helveticus subsp. jugurti, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus oris, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis를 들 수 있다. 본 발명의 Lactobacillus속 유산균은, 푸린체 분해능을 갖고, 가스 생산능을 갖지 않는 Lactobacillus속 유산균인 한 어느 종이어도 되나, 바람직하게는 Lactobacillus gasseri이고, 보다 구체적으로는 Lactobacillus gasseri OLL2922주(수탁번호:NITE BP-462)이다.

본 발명의 Lactobacillus gasseri(이하, 경우에 따라 「L. gasseri」로 약칭한다) 유산균 OLL2922주는, 푸린체 분해능을 갖고, 가스 생산능을 갖지 않는다고 하는 특징을 갖는 L. gasseri 유산균이다. 본 발명자 등은, 다수의 유산균에 대해서 푸린체 분해능 및 가스 생산능의 유무를 검토하여, L. gasseri OLL2922로 명명한 L. gasseri 유산균이, 푸린체 분해능을 갖고, 가스 생산능을 갖지 않는 것을 구체적으로 발견하였다. 또한 인 비보(in vivo) 실험에 의해, L. gasseri OLL2922가 혈중의 요산치 상승을 유의하게 억제하는 것을 규명하였다.

푸린체는 핵산을 구성하는 성분으로, 푸린 de novo 합성, 샐비지 회로, 식이 중의 핵단백질 등에 의해 생체에 공급되고, 불필요한 푸린체는 간장에 있어서 대사되어 배출된다. 요산은 인간, 고등영장류, 조류, 파충류 등에 있어서의 푸린체의 최종 대사산물이다.

본 명세서에 있어서 푸린체란, 푸린 골격을 갖는 화합물이다. 푸린체의 대표예로서, 푸린 뉴클레오티드(아데닐산, 데옥시아데닐산, 구아닐산, 데옥시구아닐산), 푸린 뉴클레오시드(아데노신, 데옥시아데노신, 구아노신, 데옥시구아노신), 푸린 염기(아데닌, 구아닌), 푸린 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 푸린 염기는, 핵산을 구성하는 외에, ATP, GTP, cAMP, cGMP, 보효소 A, FAD, NAD 등의 다양한 생체성분을 구성한다. 본 명세서에 있어서는, 푸린 골격을 갖는 한, 이러한 생체성분도 모두 푸린체에 포함된다.

생체 내에 있어서의 푸린체는, 요산으로 대사된다. 푸린체가 요산까지 이르는 대사경로는 널리 알려져 있다. AMP는 5'-뉴클레오티다아제에 의해 아데노신으로 되고, 아데노신은 이노신을 거쳐 히포크산틴으로 된다. GMP는 5'-뉴클레오티다아제에 의해 구아노신으로 된 후, 구아닌으로 된다. 히포크산틴은 크산틴옥시다아제에 의해, 또한 구아닌은 구아닌데아미나아제에 의해, 모두 크산틴으로 대사되고, 추가적으로 크산틴은 크산틴옥시다아제에 의해 요산으로 된다.

본 발명에 있어서 푸린체 분해능이란, 적어도 하나의 푸린체를 분해하는 능력을 말하고, 분해산물이 푸린 골격을 갖는지 여부는 상관없다. 즉, 어느 한 푸린체를 분해하여 푸린 골격을 갖지 않는 화합물로 하는 능력도, 어느 한 푸린체를 분해하여 다른 푸린체(푸린 골격을 갖는 화합물)로 하는 능력도, 본 발명에 있어서의 푸린체 분해능에 포함된다.

본 발명의 L. gasseri 유산균은, 공지 방법에 의해 분리할 수 있다. 예를 들면, 인간 등의 포유류의 분변(糞便)으로부터 균을 배양하여, 배양한 균의 형상, 생리학적 특징 등으로부터 L. gasseri 유산균을 분리하고, 푸린체 분해능의 유무를 검출하여, 푸린체 분해능을 갖고, 또한 가스 생산능을 갖지 않는 L. gasseri 유산균을 선별함으로써 단리 가능하다. 푸린체 분해능의 검출 및 가스 생산능의 검출은 공지 방법에 의해 가능하고, 푸린체 분해능은 후술하는 실시예 1을 예시할 수 있다. 또한, 가스 생산능에 대해서는, 시험관에 배지(락토바실러스의 경우에는 통상 MRS 배지를 사용) 및 더럼관(Durham tube)을 넣고, 121℃, 15분 오토클레이브하여, 충분히 생육한 배양액을 10 ㎕ 접종하고, 가장 바람직한 온도(균주에 따라 30~37℃)에서 1~3일간 배양한 후, 더럼관에 쌓이는 가스의 유무를 육안으로 관찰하는 방법 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 L. gasseri 유산균을 배양하는데는, 일반적으로 유산간균의 배양에 적합한 배지이면 되고, 글루코오스, 락토오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 트레할로오스, 수크로오스, 만노오스, 셀로비오스 등의 탄소원, 고기엑스(meat extract), 펩톤, 효모추출물(yeast extract), 카세인, 유청단백질 등의 질소원, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 등의 무기 영양소를 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 바람직한 예의 하나로서, Lactobacilli MRS Broth(Difco)를 들 수 있다. 배양조건은, 장내 유산균이 생육 가능한 조건이라면 특별히 제한은 없으나, 바람직한 조건으로서는, 예를 들면, pH 5.0-pH 8.0, 온도 20℃-45℃이고, 보다 바람직한 조건으로서는, 혐기성, pH 5.0-pH 7.0, 온도 30℃-40℃이다.

본 발명의 「푸린체 분해능을 갖고, 가스 생산능을 갖지 않는 L. gasseri 유산균 OLL2922주」는, 본 발명자 등에 의해 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터에 기탁되었다. 이하에, 기탁을 특정하는 내용을 기재한다.

(1) 기탁기관명: 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터

(2) 연락처: 일본국 치바켄 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 우편번호 292-0818 전화번호 0438-20-5580

(3) 수탁번호: NITE BP-462

(4) 식별을 위한 표시: Lactobacillus gasseri OLL2922주

Lactobacillus gasseri OLL2922주(수탁번호: NITE BP-462)는, 그람양성 간균으로, Lactobacilli MRS Agar, Difco 상에서의 콜로니 형태는 원형, 담황색, 편평상이다. 생리학적 특징으로서는, 호모젖산발효형식, 45℃에서의 발육성을 갖는다. 균체 증식에 있어서는 배양 중의 배지의 pH는 6.0~7.0으로 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명자 등은 후술하는 바와 같이, 본 발명의 L. gasseri 유산균을 모델 동물에 경구투여하고, 그 유산균에 혈중 요산치의 상승을 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 L. gasseri 유산균은, 혈중 요산치의 상승 억제를 위해, 또는 고요산혈증의 예방 및/또는 치료를 위해 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 L. gasseri 유산균의 푸린체 분해능을 이용하여, 본 발명의 유산균이 투여된 대상의 체내에 있어서, 식품에 포함되는 푸린체의 섭취를 억제할 수 있다.

본 발명에 있어서 「대상」이란, 혈중 요산치가 상승하고 있거나, 또는 그러한 우려가 있는 생물체, 또는 고요산혈증을 발증하고 있거나, 또는 그러한 우려가 있는 생물체 등을 들 수 있다. 본 발명의 L. gasseri 유산균이 투여되는 생물체는 특별히 한정되는 것은 아니나, 동물(예를 들면, 인간, 가축동물종, 야생동물)을 포함한다.

본 발명의 L. gasseri 유산균은, 혈중 요산치 상승 억제용 음식품 또는 의약품, 고요산치혈증의 예방 및/또는 치료용 의약품 또는 음식품의 제조에 사용할 수 있다.

본 발명의 L. gasseri 유산균을 사용하여 만드는 음식품은, 카테고리나 종류에 제한은 없고, 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 건강식품, 개호용 식품(nursing care food)이어도 되며, 또한, 과자, 유산균음료, 치즈나 요구르트 등의 유제품, 조미료 등이어도 된다. 음식품의 형상에 대해서도 제한은 없고, 고형, 액상, 유동식상, 젤리상, 정제상, 과립상, 캡슐상 등, 통상 유통 가능한 모든 음식품 형상을 취할 수 있다. 상기 음식품의 제조는, 당업자의 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 상기 음식품의 제조에 있어서는, 유산균 생육을 방해하지 않는 한, 당질, 단백질, 지질, 식물섬유, 비타민류, 생체 필수 미량금속(황산망간, 황산아연, 염화마그네슘, 탄산칼륨 등), 향료나 기타 배합물을 첨가하는 것도 가능하다.

본 발명의 L. gasseri 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물은, 상기와 같이 유제품·발효유를 포함하는 일반 음식품으로 가공할 수 있는 외에, 요구르트나 치즈 등의 유제품·발효유의 제조용 스타터로서 이용하는 것도 가능하다. 본 발명에 사용되는 유산균 처리물로서는, 예를 들면, 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물, 파쇄물 등을 들 수 있다. 또한, 유산균으로서는 생균체, 습윤균체, 건조균체 등을 적절히 사용 가능하다. 스타터로 하는 경우는, 본 발명의 L. gasseri 유산균의 생식·증식에 지장이 없는 한, 또한, 유제품 제조에 지장이 없는 한, 다른 미생물이 혼합되어 있어도 된다. 예를 들면, 요구르트용 유산균으로서 주요한 균종인 Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus 등과 혼합해도 되고, 그 밖에, 일반적으로 요구르트용이나 치즈용으로서 사용되는 균종과 혼합하여 스타터로 할 수 있다. 상기 스타터에 의한 유제품, 발효유의 제조는, 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 가온·혼합·균질화·살균 처리 후에 냉각한 젖(乳) 또는 유제품에, 상기 스타터를 혼합하고, 발효·냉각함으로써, 플레인 요구르트를 제조할 수 있다.

본 발명의 L. gasseri 유산균, 그 유산균 함유물 및/또는 그의 처리물은, 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제 등과 혼합하여, 의약 조성물로서 경구, 또는 비경구적으로 투여할 수 있으나, 바람직한 투여방법은, 경구투여이다. 경구투여제제로서는, 주지의 각종 제형으로 할 수 있고, 예를 들면, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 액제, 시럽제, 유제, 현탁제, 트로키제 등의 제형으로 할 수 있다. 또한, 당업자에게 주지의 방법으로 장용성 제제로 함으로써, 위산의 효과를 받지 않고, 본 발명의 L. gasseri 유산균을 보다 효율적으로 장까지 운반하는 것도 가능하다.

본 발명의 L. gasseri 유산균을 사용하여 제조된 의약품 및 음식품은, 음식품 중의 동균의 작용에 의해, 혈중 요산치 상승 억제효과와 고요산치혈증의 예방 및/또는 치료효과를 발휘하는 것으로 기대할 수 있다. 또한, 상기 의약품 및 음식품은, 투여되는 대상의 체내에 있어서, 식품에 포함되는 푸린체의 섭취를 억제하는 효과를 발휘하는 것으로 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 L. gasseri 유산균의 푸린체 분해능을 이용하여, 푸린체량이 저감화된 음식품을 제조하는 것도 가능하다. 본 발명의 푸린체량이 저감화된 음식품의 제조방법은, 본 발명의 L. gasseri 유산균을, 푸린체를 함유하는 음식품의 원료 또는 중간제품에 접촉시키는 공정을 포함한다. 이 공정에 의해, 그 원료 또는 중간제품에 포함되는 푸린체의 양을 효율적으로 저감시키는 것이 가능해진다. 상기 공정은, 본 발명의 L. gasseri 유산균이 생존 가능, 또는 L. gasseri 유산균에 의해 그 원료 또는 중간제품의 발효가 가능한 조건에서 행해지는 것이 바람직하다. 본 발명의 제조방법은, 상기 공정 외에, 분쇄공정, 혼합공정, 건조공정, 살균 및 충전공정 등, 목적으로 하는 음식품의 통상의 제조공정을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 음식품은, 그 카테고리나 종류에 제한은 없고, 예를 들면 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 건강식품, 개호용 식품이어도 되고, 또한 일반 식품, 예를 들면 기호품으로 분류되는 식품이어도 되나, 푸린체 섭취량의 제한이 필요한 환자 또는 증상의 환자 또는, 상기 질환 또는 증상 예비군의 일상적 또는 보조적 음식품으로서 특히 유용하다. 본 발명의 방법은, 푸린체 접종의 제한이 필요하거나, 또는 희망하는 대상이, 종래 푸린체량이 많은 것으로 여겨지는 식품을 안전하게 접종하는 것을 가능하게 한다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명은, 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 실시예 중, 균주명에 JCM으로 기재된 균주는 독립행정법인 이화학연구소 바이오리소스센터의 미생물재료 개발실로부터 입수한 기준주, 균주명에 ATCC로 기재된 균주는, American Type Culture Collection으로부터 입수한 기준주, 균주명에 MEP로 기재된 균주는 메이지 데어리즈 코포레이션 보유 균주이다.

[실시예 1] 유산균의 요산 저감작용에 관한 인 비트로(in vitro)의 실험방법

각종 유산균에 대해서, 푸린체 분해능의 유무를 이하의 방법으로 검토하였다.

각종 유산균(균체)을 Difco Lactobacilli MRS Broth(BD제) 배지를 사용하여, 산소흡착제「아네로팩」(미쯔비시 가스(주)제)과 함께 밀폐용기에 넣고, 온도 37℃에서 하룻밤 혐기배양하였다. 배양 후의 균체 현탁액을 회전 수 3000 rpm, 온도 4℃에서 10분간 원심분리하여 균체를 침전 회수(집균)하였다.

이 균체로부터 1×10⁹ CFU/mL의 균체 현탁액을 0.1 M 인산나트륨 완충액으로 조제하였다.

각종 균체 현탁액을 조제한 후에, 이노신과 구아노신을 각각이 1.25 mM가 되도록 각종 균체 현탁액에 첨가하였다. 이들 균체 현탁액을 37℃의 항온조로 넣고, 수평 회전 수 140 rpm으로 30분간 또는 1시간 진탕배양하였다.

진탕배양 후의 균체 현탁액(반응액)에 대해서, 뉴클레오시드의 소비량과, 뉴클레오시드의 분해물인 염기(히포크산틴과 구아닌)의 생성량을, 5-브로모우라실을 내부 표준으로 하여 HPLC로 측정하였다. 이동상 A의 780 μL에, 반응액 200 μL, 내부 표준으로서 5-브로모우라실(1.6 ㎎/mL) 20 μL를 첨가해 혼합하였다. 이 혼합액을 필터(공경 0.45 ㎛)로 여과한 후에, 투과액 50 μL를 HPLC에 주입하였다. HPLC의 구체적인 조작조건은 이하와 같다.

HPLC : Waters alliance 2690

칼럼 : CAPCELL PAK C₁₈ SG120, 입자경 5 ㎛, 칼럼 사이즈 4.6×250 ㎜(시세이도)

이동상 : A : 25 mM KH₂PO₄(0.1% 메탄올)

B : 25 mM KH₂PO₄(0.1% 메탄올)/메탄올(75:25)

그라디언트 A/B(min) : 100/0(0)-100/0(10)-

20/80(20)-20/80(25)-100/0(26)-100/0(40)

검출기 : 포토다이오드 어레이(Waters 996) 검출파장 254 nm

유속 : 1 mL/min

칼럼온도 : 상온

결과를 도 1~3에 나타낸다. 각 화합물의 정량은, HPLC 차트의 피크 면적값을 토대로 행하였다. 또한 도 1 및 도 2의 분해율은 하기 식에 따라 산출하였다.

또한, 도 3의 산출방법은 이하와 같다.

도 1~3의 결과로부터, 뉴클레오시드 분해능이 현저하다고 판단되는 유산균을 선발하였다.

[실시예 2] 유산균의 요산 저감작용에 관한 인 비보의 실험방법

선행문헌(비특허문헌 1)에 기재된 방법에 따라, 식사성 고요산혈증 모델 동물을 제작하고, 그 동물의 혈청 요산치에 미치는 미생물(유산균)의 영향을 검토하였다. 상기 방법은 구체적으로는, 옥소닌산 칼륨을 2.5 중량%와 RNA를 1.0 중량%로 포함하는 혼합사료(混餌)를 조제하여, 랫트에 섭취시키고, 섭취 후부터의 혈중 요산치를 음성군이나 대조군과 비교하는 방법이다. 본 발명의 모델 동물은, 요산 생성의 저해제인 알로푸리놀(allopurinol)을 경구투여했을 때에, 그 모델 동물의 혈중 요산치가 유의하게 억제되는 것이 명확해졌다(식품 기능 연구 뉴스(제14호), 2005년 3월 9일 발행, (주)메르시안 클린텍 환경검사센터, http://www.m-cleantec.com/gizyutu/news_0503.html). 이 사실은, 고요산혈증에 대한 식품의 유효성을 평가하는 시스템으로서 상기 방법이 유용한 것을 나타내고 있다.

[2-1 재료 및 실험 순서]

[미생물]

상기 인 비트로 시험에서 뉴클레오시드 분해능이 높은 것으로 판단된, L. gasseri OLL2922주를 사용하였다. 각종의 유산균으로부터 인 비트로 시험과 동일하게 하여 균체 현탁액을 조제하였다. 균체 현탁액을 1×10⁹ CFU/10 mL/㎏으로 랫트에 경구투여하였다.

[실험동물]

랫트(Wister SPF, 수컷, 7주령)를 사용하였다. 사육(순화와 시험)에는, 랫트용 플라스틱 케이지를 사용하고, 1케이지당 1마리의 랫트를 수용하였다. 명암 사이클은 명기(明期)를 오전 7시~오후 7시(12시간)로 하였다.

[예비 사육(순화)과 군 나누기]

실험동물은 반입한 후에 1주간의 예비 사육(순화)을 행하였다. 순화 중에는, 먹이(사료)로서 AIN-93G(오리엔탈 효모공업(주)), 마시는 물로서 수돗물을 자유 섭취시켰다. 예비 사육한 랫트(입하 7일 후, 8주령, Day 0)를 오전 중에 비절식하에서 꼬리정맥으로부터 채혈하였다. 이 혈액을 실온에서 30분 이상 방치한 후에, 회전 수 10000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분취하고, 혈청 중의 요산치를 인텅스텐산법으로 측정하였다.

군 나누기는 각군의 혈청 중의 요산치가 동등해지도록 행하였다. 시험에는, 1군당 5마리의 랫트를 사용하고, 음성군(제1), 대조군(제2군), 균체 투여군(제3군)의 합계 3군을 설정하였다. 군명, 먹이, 투여물(투여용량), 마릿수 등을 이하에 나타낸다.

·음성군(제1군) : 「AIN-93G」급이(給餌), 「생리식염수」투여(10 mL/㎏), 5마리

·대조군(제2군) : 「옥소닌산 칼륨을 2.5 중량%, RNA를 1.0 중량%로 혼합한 AIN-93G」급이, 「생리식염수」투여(10 mL/㎏), 5마리

·균체 투여균(제3군) : 「옥소닌산 칼륨을 2.5 중량%, RNA를 1.0 중량%로 혼합한 AIN-93G」급이, 5마리. 「L. gasseri OLL2922주의 현탁액(1×10⁸ CFU/mL)」투여(10 mL/㎏).

[본 사육(시험)]

군 나누기 후의 다음날부터 시험기간으로 하고, 「AIN-93G」사료(음성군)와 「AIN-93G+옥소닌산 칼륨+RNA」사료(대조군, 균체 투여군)를 각각 급이기에 의해 랫트에 8일간 자유 섭취시켰다. 본 사료의 급이 개시일을 Day 1로 하고, 이후에서는 날짜와 함께 Day를 기산(起算)하였다. 「AIN-93G+옥소닌산 칼륨+RNA」사료는, 옥소닌산 칼륨(100 g, ALDRICH)을 2.5 중량%와 RNA(500 g, MP Biomedicals. Inc.)를 1.0 중량%로 포함하고 있다. 균체 투여군의 실험동물에는, 상기의 균체 현탁액을 1×10⁹ CFU/10 mL/㎏으로 강제 경구투여하였다. 음성군과 대조군에는, 균체 현탁액이 아니라 생리식염수를 10 mL/㎏으로 강제 경구투여하였다.

[측정과 검사 등]

·일반상태의 관찰과 체중의 측정

전 예(전 군)에 있어서 Day 1부터 Day 8의 연일, 투여시에 일반상태를 관찰하고, Day 0, Day 1, Day 5, Day 8의 오전 9~10시에 정시에서 체중을 측정하였다.

·섭이량(攝餌量)과 섭수량(攝水量)의 측정

전 예(전 군)에 있어서 Day 1(세팅값), Day 5(나머지값, 세팅값), Day 8(나머지값)의 오전 9~10시에 정시에서 섭이량과 섭수량을 측정하였다.

·채혈과 생화학적 검사

전 예(전 군)에 있어서 Day 0(오전 중), Day 2(투여 1시간 후), Day 5(투여 1시간 후), Day 8(투여 전)에 꼬리정맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액은, 회전 수 10000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분취하고, 혈청 중의 요산치를 인텅스텐산법으로 측정하였다. 상기한 바와 같이, Day 0에서는 당일에 혈청 중 요산치를 측정하고, 군 나누기에 사용하였다.

·부검과 생화학적 검사

전 예(전 군)에 있어서 Day 8에 꼬리정맥으로부터 채혈한 후에, 균체 현탁액을 경구투여하였다. 투여 1시간 후에 넴뷰탈 마취(펜토바르비탈 40 ㎎/㎏)상태에서, 복부 대동맥으로부터 전채혈하여 치사시켰다. 채취한 혈액은, 회전 수 3000 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청을 분취하고, 혈청 중의 크레아티닌, 요산, 요소질소를 측정하였다.

·장기 중량의 측정

랫트의 신장을 적출하여, 습중량을 측정하였다.

[통계처리]

결과는 평균값±표준편차로 나타내고, 대조군과 균체 투여 각군을 비교하였다. 수치화한 검사치의 분산비는 F 검정을 행하고, 등분산의 경우에는 Student's t-검정을, 부등분산의 경우에는 Aspin-Welch t-검정을 행하였다. 통계처리에는, 엑셀 통계 2004의 통계해석을 사용하고, 최저 유의수준을 양측 5%로 하였다.

일반상태의 결과를 표 1에, 혈청 요산치의 추이를 도 4에 나타낸다.

각종 유산균 투여에 따른 혈청 중의 요산치의 저하에 대해서, 도 4에 나타내는 바와 같이, L. gasseri OLL2922 투여군에 있어서, 유의차가 확인되었다. 일반상태는, 어느 군에 있어서도, 신기능(크레아티닌값, 혈청 중 요소질소, 신장 중량)에 문제가 없고, 체중·섭이량·섭수량도 어느 군도 문제는 없었다.

[실시예 3] 발효유의 제조예

플레인 요구르트를 L. gasseri OLL2922, L. bulgaricus JCM1002^T, S. thermophilus ATCC19258에 의해 조제하였다. 먼저, 탈지분유 10% 배지를 사용하여, L. gasseri OLL2922, L. bulgaricus JCM1002^T, S. thermophilus ATCC19258의 벌크 스타터를 조제하였다. 다음으로, 요구르트 믹스(무지유 고형분(SNF):9.5%, 지방분(FAT):3.0%)를 95℃, 5분간에 걸쳐 가열처리하였다. 이 가열처리 후의 요구르트 믹스에, L. bulgaricus JCM1002^T와, S. thermophilus ATCC19258의 스타터를 각 1%, L. gasseri OLL2922의 스타터를 5%로 접종하고, 43℃, 4시간에 걸쳐 발효하여, 플레인 요구르트를 얻었다. 이 플레인 요구르트를 냉장고(5℃)에서 냉각한 후, 풍미와 물성을 확인하였다. 이때, 풍미와 물성은 모두 양호하였다.

[비교예 1] RAPD(Random Amplified Polymorhic DNA)법에 의한 균주의 식별

RAPD법에 의해 L. gasseri OLL2922주 및 L. gasseri OLL2959(NITE P-224)의 식별을 행하였다. 랜덤 프라이머 RAPD5(5'-GTCAACGAAG-3', 서열번호:1)를 사용하여, 2922주 및 2959주로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 이하의 조건에서 PCR을 행하여, 얻어진 증폭산물을 전기영동했을 때의 패턴을 비교하였다.

PCR 반응액(25 ㎕)의 조성

dH₂0 18.7 ㎕

10×Ex Taq buffer 2.5 ㎕

dNTP Mix (2.5 mM) 2.0 ㎕

Ex Taq 0.4 ㎕

DNA 1.0 ㎕

Primer (100 pmol/㎕) 0.4 ㎕

PCR 조건

4 cycles (94℃, 5 min, 36℃, 5 min, 72℃, 5 min)

30 cycles (94℃, 1 min, 36℃, 1 min, 72℃, 2 min)

그 결과, L. gasseri OLL2922주 및 L. gasseri OLL2959주의 증폭산물은 상이한 패턴을 갖는 것이 명확해졌다(도 5).

본 발명에 의해, 혈중 요산치를 저감 가능한 유산균이 제공되었다. 본 발명의 유산균을 경구 섭취함으로써, 혈중 요산치를 저감할 수 있기 때문에, 본 발명의 유산균은 통풍이나 고요산혈증의 예방 및/또는 치료용 식품 또는 의약품으로서 이용할 수 있다. 특히, 본 발명의 유산균은, 식품제조상, 가스 생산에 의한 문제가 없는 것이 확인되어 있는 점에서, 실용화에 적합하다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 이용하면, 푸린체량을 저감시킨 가공식품의 제조도 가능해질 것으로 생각된다. 이와 같이, 본 발명의 유산균은, 식품 및 의약품 산업상, 매우 유용성이 높다고 할 수 있다.

독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터

NITEBP-462

20071130

SEQUENCE LISTING <110> MEIJI DAIRIES CORPORATION <120> Lactic acid bacteria having activity of reducing level of uric acid in the blood. <130> M1-A0708P <150> JP 2007-310892 <151> 2007-11-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence. <400> 1 gtcaacgaag 10

Claims

푸린체 분해능을 갖는, 수탁번호:NITE BP-462로서 기탁되어 있는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 유산균 OLL2922주.
제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 혈중 요산치 상승 억제용 음식품.
제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 고요산혈증의 예방 또는 치료용 음식품.
제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 푸린체의 흡수를 억제하기 위한 음식품.
제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 혈중 요산치 상승 억제용 의약품.
제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 고요산혈증의 예방 또는 치료용 의약품.
삭제
음식품의 원료 또는 중간제품을 제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물로부터 선택되는 하나 이상에 접촉시키는 공정을 포함하는, 푸린체가 저감화된 음식품의 제조방법.
혈중 요산치 상승 억제용 음식품 또는 의약품을 제조하기 위한, 제1항의 유산균의 사용방법.
고요산혈증의 예방 또는 치료용 음식품 또는 의약품을 제조하기 위한, 제1항의 유산균의 사용방법.
푸린체의 흡수를 억제하기 위한 음식품 또는 의약품을 제조하기 위한, 제1항의 유산균의 사용방법.
대상에 있어서 식품에 포함되는 푸린체의 섭취를 억제하기 위한, 제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 또는 파쇄물.
대상에 있어서 혈중 요산치 상승을 억제하기 위한, 제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 또는 파쇄물.
대상에 있어서 고요산혈증을 치료하기 위한, 제1항의 유산균, 그 유산균 함유물, 그 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 또는 파쇄물.