JP5597237B2 - 血中尿酸値低減作用を有する乳酸菌 - Google Patents
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Description
(1)プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しない、Lactobacillus 属乳酸菌、
(2)Lactobacillus gasseriである、上記(1)記載の乳酸菌、
(3)Lactobacillus gasseri OLL2959 (受託番号:NITE P-224)であるLactobacillus 属乳酸菌、
(4)プリン体分解能を有する、Lactobacillus oris乳酸菌、
(5)Lactobacillus oris OLL2779 (受託番号:NITE P-223)であるLactobacillus 属乳酸菌、
(6)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、血中尿酸値上昇抑制用の飲食品、
(7)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、高尿酸血症の予防および/または治療用の医薬品、
(8)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を投与することを特徴とする、食品から摂取するプリン体量を抑制する方法、
(9)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を投与することを特徴とする、血中尿酸値上昇を抑制する方法。
(イ)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(所在地:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 郵便番号292-0818)
(ロ)寄託日:2006年3月31日
(ハ)受託番号:
Lactobacillus gasseri OLL 2959株(受託番号NITE P-224)
(イ)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(所在地:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 郵便番号292-0818)
(ロ)寄託日:2006年3月31日
(ハ)受託番号:
Lactobacillus oris OLL 2779株 (受託番号NITE P-223)
各種乳酸菌について、プリン体分解能の有無を以下の方法によって検討した。
各種の乳酸菌(菌体)をDifco Lactobacilli MRS Broth(BD製)培地を用いて、酸素吸着剤「アネロパック」(三菱ガス(株)製)と共に密閉容器に入れ、温度37℃にて一晩嫌気培養した。培養後の菌体懸濁液を回転数3000rpm、温度4℃にて10分間遠心分離して菌体を沈殿回収(集菌)した。
この菌体から1×109 CFU/mLの菌体懸濁液を0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液で調製した。
各種の菌体懸濁液を調製した後に、イノシンとグアノシンをそれぞれが1.25mMになるように各種の菌体懸濁液に加えた。これらの菌体懸濁液を37℃の恒温漕へ入れ、水平回転数140rpmにて30分間あるいは2時間振とう培養した。
振とう培養後の菌体懸濁液(反応液)について、ヌクレオシドの消費量と、ヌクレオシドの分解物である塩基(ヒポキサンチンとグアニン)の生成量を、5-ブロモウラシルを内部標準としてHPLCにて測定した。移動相Aの780μLに、反応液200μL、内部標準として5-ブロモウラシル(1.6 mg/mL) 20μLを加えて混合した。この混合液をフィルター(孔径0.45μm)で濾過した後に、透過液50μLをHPLCに注入した。HPLCの具体的な操作条件は以下の通りである。
カラム : CAPCELL PAK C18 SG120、粒子径 5μm、カラムサイズ 4.6×250 mm(資生堂)
移動相 : A : 25mM KH2PO4(0.1% メタノール)
B : 25mM KH2PO4(0.1% メタノール)/メタノール(75:25)
グラジエントA/B (min) : 100/0(0)− 100/0(10)−
20/80(20)− 20/80(25)− 100/0(26)− 100/0(40)
検出器 : フォトダイオードアレイ(Waters 996) 検出波長 254nm
流速 : 1 mL/min
カラム温度 : 常温
結果を図1〜3に示す。各化合物の定量は、HPLCチャートのピーク面積値に基づき行った。更に図1及び図2の分解率は下式に従い算出した。
分解率=100-(イノシンあるいはグアノシン量/ブランクにおけるイノシンあるいはグアノシン量)×100
また、図3の算出方法は以下の通りである。
(ヒポキサンチン量+グアニン量)/5-ブロモウラシル量
図1〜3の結果から、ヌクレオシド分解能の顕著であると判断される乳酸菌を選抜した。
先行文献(非特許文献1)に記載された方法に従い、食事性高尿酸血症モデル動物を作製し、該動物の血清尿酸値に及ぼす微生物(乳酸菌)の影響を検討した。上記方法は具体的には、オキソニン酸カリウムを2.5重量%とRNAを1.0重量%で含む混餌を調製して、ラットに摂取させ、摂取後からの血中尿酸値を陰性群や対照群と比較する方法である。本方法のモデル動物は、尿酸生成の阻害薬であるアロプリノールを経口投与した際に、該モデル動物の血中尿酸値が有意に抑制されることが明らかとなっている(食品機能研究ニューズ(第14号)、2005年3月9日発行、(株) メルシャン クリンテック環境検査センター、http://www.m-cleantec.com/gizyutu/news_0503.html)。このことは、高尿酸血症に対する食品の有効性を評価する系として上記方法が有用であることを示している。
〔微生物〕
上記in vitro試験でヌクレオシド分解能が高いと判断された、Lactobacillus fermentum MEP181504株(以下において、場合により「Lactobacillus」を「L.」と略す)、L. brevis MEP181507株、L. gaserri JCM8787株、L. gaserri OLL2959株、L. oris OLL2779株の5株を使用した。各種の乳酸菌からin vitro試験と同様にして菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を1×109 CFU/10mL/kgでラットへ経口投与した。
ラット(Wister SPF、雄、7週齢)を使用した。飼育(馴化と試験)には、ラット用プラスチックケージを使用し、1ケージ当たり1匹のラットを収容した。明暗サイクルは明期を午前7時〜午後7時(12時間)とした。
〔予備飼育(馴化)と群分け〕
実験動物は搬入した後に1週間の予備飼育(馴化)を行った。馴化中には、餌(飼料)としてAIN-93G(オリエンタル酵母工業(株))、飲水として水道水を自由摂取させた。予備飼育したラット(入荷7日後、8週齢、Day0)を午前中に非絶食下で尾静脈より採血した。この血液を室温で30分以上放置した後に、回転数10000 rpmにて10分間遠心分離して血清を分取し、血清中の尿酸値をリンタングステン酸法にて測定した。
・陰性群(第1、5群):「AIN-93G」給餌、「生理食塩水」投与(10mL/kg)、5匹
・対照群(第2、6群):「オキソニン酸カリウムを2.5重量%、RNAを1.0重量%で混合したAIN-93G」給餌、「生理食塩水」投与(10mL/kg)、5匹
・菌体投与群(第3、4、7〜9群):いずれの群も、「オキソニン酸カリウムを2.5重量%、RNAを1.0重量%で混合したAIN-93G」給餌、5匹。各群の投与菌体および投与量は、
第3群は、「L. fermentum MEP181504株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、
第4群は、「L. brevis MEP181507株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、
第7群は、「L. orisOLL2779株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、
第9群は、「L. gaserri OLL2959株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)。
群分けした後の翌日より試験期間とし、「AIN-93G」飼料(陰性群)と「AIN-93G+オキソニン酸カリウム+RNA」飼料(対照群、菌体投与群)をそれぞれ給餌器によりラットに8日間自由摂取させた。本飼料の給餌開始日をDay1とし、以後では日付と共にDayを起算した。「AIN-93G+オキソニン酸カリウム+RNA」飼料は、オキソニン酸カリウム(100g、ALDRICH)を2.5重量%とRNA(500g、MP Biomedicals. Inc.)を1.0重量%で含んでいる。菌体投与群の実験動物には、前記の菌体懸濁液を1×109 CFU/10mL/kgで強制経口投与した。陰性群と対照群には、菌体懸濁液ではなく、生理食塩水を10mL/kgで強制経口投与した。
〔測定と検査等〕
・ 一般状態の観察と体重の測定
全例(全群)においてDay1からDay8の連日、投与時に一般状態を観察し、Day0、Day1、Day5、Day8の午前9〜10時に定時で体重を測定した。
・ 摂餌量と摂水量の測定
全例(全群)においてDay1(セット値)、Day5(残値、セット値)、Day8(残値)の午前9〜10時に定時で摂餌量と摂水量を測定した。
・ 採血と生化学的検査
全例(全群)においてDay0(午前中)、Day2(投与1時間後)、Day5(投与1時間後)、Day8(投与前)に尾静脈より採血した。採取した血液は、回転数10000 rpmにて10分間遠心分離して血清を分取し、血清中の尿酸値をリンタングステン酸法にて測定した。前記した通り、Day0では当日に血清中尿酸値を測定し、群分けに使用した。
・ 剖検と生化学的検査
全例(全群)においてDay8に尾静脈より採血した後に、菌体懸濁液を経口投与した。投与1時間後にネンブタール麻酔(ペントバルビタール40mg/kg)状態にて、腹大動脈より全採血して致死させた。採取した血液は、回転数3000 rpmにて15分間遠心分離して血清を分取し、血清中のクレアチニン、尿酸、尿素窒素を測定した。
・ 臓器重量の測定
ラットの腎臓を摘出し、湿重量を測定した。
結果は平均値±標準偏差で示し、対照群と菌体投与各群を比較した。数値化した検査値の分散比はF検定を行い、等分散の場合にはStudent's t-検定を、不等分散の場合にはAspin-Welch t-検定を行った。統計処理には、エクセル統計 2004 の統計解析を使用し、最低有意水準を両側5%とした。
〔2−2 結果〕
一般状態の結果を表1(L.fermentumとL.brevis)と表2(L orisとL.gasseri)に、血清尿酸値の推移を図4および5に示す。
各種乳酸菌投与による血清中の尿酸値の低下について、図5に示すように、L.oris OLL 2779投与群およびL.gasseri OLL2959投与群において、有意差が認められた。一般状態は、いずれの群においても、腎機能(クレアチニン値、血清中尿素窒素、腎重量)に問題がなく、体重・摂餌量・摂水量もいずれの群も問題はなかった。また、一般状態の所見については、各種乳酸菌の間で有意差は観察されなかった。L.oris OLL2779およびL.gasseri OLL2959の科学的特徴を表3に示す。
(発酵乳の製造例1)
プレーンヨーグルトをL. gasseri OLL2959 (NITE P-224)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258により調製した。まず、脱脂粉乳10%培地を用いて、L. gasseri OLL2959 (NITE P-224)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258のバルクスターターを調製した。次に、ヨーグルトミックス(無脂乳固形分(SNF): 9.5%、脂肪分(FAT): 3.0%)を95℃、5分間で加熱処理した。この加熱処理後のヨーグルトミックスに、L. bulgaricus JCM1002Tと、S. thermophilus ATCC19258のスターターを各1%、L. gasseri OLL2959 (NITE P-224)のスターターを5%で接種し、43℃、4時間で発酵して、プレーンヨーグルトを得た。このプレーンヨーグルトを冷蔵庫(5℃)で冷却してから、風味と物性を確認した。このとき、風味と物性はいずれも良好であった。
(発酵乳の製造例2)
プレーンヨーグルトをL. oris OLL2779 (NITE P-223)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258により調製した。まず、脱脂粉乳10%培地を用いて、L. oris OLL2779 (NITE P-223)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258のバルクスターターを調製した。次に、ヨーグルトミックス(無脂乳固形分(SNF): 9.5%、脂肪分(FAT): 3.0%)を95℃、5分間で加熱処理した。この加熱処理後のヨーグルトミックスに、L. bulgaricus JCM1002Tと、S. thermophilus ATCC19258のスターターを各1%、L. oris OLL2779 (NITE P-223のスターターを5%で接種し、43℃、4時間で発酵して、プレーンヨーグルトを得た。このプレーンヨーグルトを冷蔵庫(5℃)で冷却してから、風味と物性を確認した。このとき、風味と物性はいずれも良好であり、L. oris OLL2779は食品の製造に好適に使用できることが確認された。
Claims (3)
- 受託番号:NITE P-223で寄託されている、ラクトバチルス・オリスOLL2779(Lactobacillus oris OLL2779)。
- 請求項1記載の乳酸菌および/または該乳酸菌含有物を含む、血中尿酸値上昇抑制用の飲食品。
- 請求項1記載の乳酸菌および/または該乳酸菌含有物を含む、高尿酸血症の予防および/または治療用の医薬品。
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