TWI462701B - 用於生產具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品之方法 - Google Patents

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Description

用於生產具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品之方法
本發明是有關於一種用於生產一具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品之方法,其包括:將一具有分解嘌呤化合物能力的微生物培養於一可食性材料中,其中該微生物是米麴菌(Aspergillus oryzae )BCRC 30118(對應於ATCC 11493)、BCRC 30133(對應於ATCC 26850)、BCRC 30222(對應於ATCC 44193)、BCRC 30235(對應於ATCC 26831)或米根黴(Rhizopus oryzae )BCRC 31108(對應於ATCC 52362)。
痛風(gout)是一種由尿酸的過度產生(overproduction)或排泄不足(underexcretion)所引起的單鈉尿酸鹽結晶(monosodium urate crystals)的沉積而造成的疾病。一般而言,在一為7的pH值下,有超過90%的尿酸是以單鈉尿酸鹽的形式存在,而單鈉尿酸鹽結晶會沉積在關節的軟骨(articular cartilage)、滑液(synovial fluid)、肌腱(tendon)以及其他軟組織(soft tissue)中,或者會在腎臟中形成尿酸結石(uric acid stone)。痛風通常與被升高的血清尿酸位準(serum uric acid levels)有關聯,它的臨床症狀包括急性與慢性關節炎(acute and chronic arthritis)、痛風石(tophi)、間質腎病(interstitial renal disease)以及尿酸腎結石(uric acid nephrolithiasis)(J.R. Pittman and M.H. Bross (1999),American Family Physician ,59:1799-1806)。
高尿酸血症(hyperuricemia)被定義為在一男性個體中具有一大於7mg/dL(420μmol/L)的血液單鈉尿酸鹽位準,或者在一女性個體中具有一大於6mg/dL(360μmol/L)的血液單鈉尿酸鹽位準。高尿酸血症是痛風發展的一個危險因子,但是它與急性痛風之間的確切關聯性仍是未知。此外,高尿酸血症亦被發現與高三酸甘油酯症(hypertriglyceridemia)、糖尿病(diabetes mellitus)以及冠狀動脈疾病(coronary artery disease)的發展有關聯。
尿酸是嘌呤代謝(purine metabolism)的最終氧化產物(final oxidation product),它不具有生理角色(physiologic role)並且會被排泄至尿液中。有許多病理學的研究指出,富含嘌呤的食品(purine-rich food)的攝取是痛風以及高尿酸血症的起因。由於富含嘌呤的食品的過度攝取以及肥胖(obesity)等因素,痛風以及高尿酸血症的發生率(incidence)和盛行率(prevalence)已逐年增加,並且病患有年輕化的趨勢。因此,降低嘌呤含量的攝取被認為是可以有效預防痛風或高尿酸血症的方法。
在日常飲食當中有許多富含嘌呤的食品,包括:菇類(mushrooms)、豆類(legumes)、肉類、海鮮(seafood)、魚精(soft roe)、蛋以及酒精飲料(alcoholic beverages)等。大多數富含嘌呤的食品皆具有很高的營養價值以及含有許多生物活性成分,但是這些富含嘌呤的食品因為會造成痛風而使得可攝食此類食品的人口受到限制。因此,如何有效地降低富含嘌呤的食品中的嘌呤化合物含量即成一個極為重要的研發課題。
目前已知有許多物理性或化學性方法可供用於降低富含嘌呤的食品中的嘌呤化合物含量,例如:(1)利用不同的加工處理(processing treatment)[諸如,水洗(washing)、水煮(boiling)、蒸煮(steam cooking)、烘烤(roasting)以及乾燥(drying)]來降低海鮮食品(seafood)(例如魚、蝦等)的嘌呤化合物含量;(2)以吸附劑(adsorbent)[諸如,活性炭(activated charcoal)與沸石(zeolite)]來移除經發酵的麥芽飲料(fermented malt beverages)中的嘌呤化合物(參見US 2004/0241282 A1以及CN 1743444 A);以及(3)減少大麥芽(barley malt)的使用量以及利用稀釋處理(dilution treatment)來降低啤酒中的嘌呤化合物含量(參見CN 1743444 A以及CN 1563321 A)。
近年來,利用生物學法(biological method)[例如生物分解(biodecomposition)]來降低食品中的嘌呤化合物含量已開始受到重視。
米麴菌(Aspergillus oryzae )是一種絲狀真菌(filamentous fungus),它是屬於真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、髮菌科(Trichocomaceae)、麴菌屬(Aspergillus )。米麴菌的菌落(colony)呈平坦(plane)或放射狀皺紋(radially furrowed);菌絲(hyphae)是白色;分生孢子頭(conidial heads)是灰黃色或橄欖色;分生孢子柄(conidiophores)頂端膨大為囊泡(vesicles);囊泡上具有瓶梗(phialides),著生鏈狀分生孢子(conidia);分生孢子的表面平滑(smooth)或細微突起(finely roughened),大小可達7μm以上。G.D. Vogels與C. Van Der Drift曾報導,米麴菌會生成黃嘌呤去氫酶(xanthine dehydrogenase,XDH)、尿酸酶(uricase,Uri)、尿囊素酶(allantoinase,An)以及尿囊酸酶(allantoicase,Ac)(G.D. Vogels and C. Van Der Drift(1976),Bacteriol. Rev .,40:403-468)。米麴菌常被應用於製造醬油(soybean sauce)、味噌(miso)、醋(vinegar)以及甜麵醬(sweet bean sauce)等,並且亦可被應用於生產多種酵素[諸如,澱粉酶(amylase)以及蛋白酶(protease)]。
米根黴(Rhizopus oryzae )是一種絲狀真菌,它是屬於真菌界(Fungi)、接合菌門(Zygomycota)、接合菌綱(Zygomycetes)、毛黴目(Mucorales)、毛黴科(Mucoraceae)、根黴菌屬(Rhizopus )。米根黴的菌落是灰褐色,具有假根(rhizoids);孢子囊柄(sporangiophores)頂端會產生球狀孢子囊(sporangia);孢子囊大小約為160-240μm,具有囊托(apophyses)、中軸(columellae)以及大量的孢囊孢子(sporangiospores)。米根黴常被應用於製造酒精飲料以及生產多種有機酸(organic acid)[諸如,延胡索酸(fumaric acid)、琥珀酸(succinic acid)、草酸(oxalic acid)、檸檬酸(citric acid)以及乳酸(lactic acid)等]。
US 6,013,288揭示一種用以製造具有一被降低的嘌呤化合物含量的啤酒之方法,該方法是藉由使用一經分離的嘌呤核苷磷酸酶(isolated purine nucleoside phosphorylase)和/或一經分離的嘌呤核苷酶(isolated purine nucleosidase)來將麥芽汁(wort)中的嘌呤核苷(purine nucleosides)分解成嘌呤鹼基(purine bases),並且將所得到的具有被降低的嘌呤核苷含量的麥芽汁應用在一啤酒製造過程中。該嘌呤核苷酶可得自於麴菌屬(Aspergillus )[例如:米麴菌(IAM 2630)]、芽孢桿菌屬(Bacillus )以及酵母菌屬(Saccharomyces )等的微生物。
就申請人所知,迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示微生物可以被直接地應用於降低食品中的嘌呤化合物含量。
經研究,申請人從202株已知的食品安全菌株(其中有11株是米麴菌,而有11株是米根黴)中初步篩選出24株具有分解嘌呤鹼基能力的菌株,並且藉由進一步的研究發現到:在該24株菌株當中有4株米麴菌以及1株米根黴具有分解嘌呤化合物的能力。因此,這5株菌株被預期可供用於生產具有一被降低的嘌呤化合物含量之食品產品。
發明概要
於是,在第一個方面,本發明提供一種用於生產一具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品之方法,其包括:將一具有分解嘌呤化合物能力的微生物培養於一可食性材料中,其中該微生物是選自於由下列所構成的群組:米麴菌(Aspergillus oryzae )BCRC 30118(對應於ATCC 11493)、BCRC 30133(對應於ATCC 26850)、BCRC 30222(對應於ATCC 44193)、BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以及米根黴(Rhizopus oryzae )BCRC 31108(對應於ATCC 52362)。
在第二個方面,本發明提供一種具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品,它是藉由一如上所述的方法而被製得。
發明的詳細說明
為了這本說明書之目的,將被清楚地瞭解的是:文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”,以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是:若有任何一件前案刊物在此被引述,該前案刊物不構成一個下述承認:在台灣或任何其他國家之中,該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義,在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。
有許多的研究指出,富含嘌呤的食品的攝取是痛風以及高尿酸血症的起因。在日常飲食當中,大多數富含嘌呤的食品皆具有很高的營養價值以及含有許多生物活性成分,但是這些富含嘌呤的食品因為會造成痛風而使得可攝食此類食品的人口受到限制。因此,如何有效地降低富含嘌呤的食品中的嘌呤化合物含量即成為本領域中的研究人員致力研究的目標。
為達到這個目的,申請人嘗試從202株已知的食品安全菌株[其中有11株是米麴菌(Aspergillus oryzae ),而有11株是米根黴(Rhizopus oryzae )]中初步篩選出24株具有分解嘌呤鹼基能力的菌株,並藉由進一步的研究發現到:在這24株菌株當中,米麴菌BCRC 30118(對應於ATCC 11493)、BCRC 30133(對應於ATCC 26850)、BCRC 30222(對應於ATCC 44193)、BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以及米根黴BCRC 31108(對應於ATCC 52362)具有分解嘌呤化合物的能力,因而能降低菇類發酵液產物(fermented liquid product of mushroom)或豆漿發酵液產物(fermented liquid product of soybean milk)中的總嘌呤含量。
於是,本發明提供一種用於生產一具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品之方法,其包括:將一具有分解嘌呤化合物能力的微生物培養於一可食性材料中,其中該微生物是選自於由下列所構成的群組:米麴菌BCRC 30118(對應於ATCC 11493)、BCRC 30133(對應於ATCC 26850)、BCRC 30222(對應於ATCC 44193)、BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以及米根黴BCRC 31108(對應於ATCC 52362)。
如本文中所用的,術語“嘌呤”或“嘌呤化合物”意指具有一嘌呤骨架(purine skeleton)的化合物,它包括,但不限於:嘌呤鹼基(purine bases)、嘌呤核苷(purine nucleosides)、嘌呤核苷酸(purine nucleotides)以及核酸(nucleic acid)。
如本文中所用的,術語“嘌呤鹼基”意指具有各種不同的經取代之部分的嘌呤{亦即,9H-咪唑並[4,5-d]嘧啶(9H-imidazo[4,5-d]pyrimidine)}的衍生物。嘌呤鹼基的實例包括,但不限於:腺嘌呤(adenine)、鳥糞嘌呤(guanine)、次黃嘌呤(hypoxanthine)以及黃嘌呤(xanthine)。
如本文中所用的,術語“嘌呤核苷”意指醣苷(glycoside),其中一嘌呤鹼基與一糖分子(sugar molecular)的還原基團(reducing group)藉由一N-醣苷鍵(N-glycoside bond)而被連結。嘌呤核苷的實例包括,但不限於:腺核苷(adenosine)、鳥糞核苷(guanosine)以及肌核苷(inosine)。
如本文中所用的,術語“嘌呤核苷酸”意指一種化合物,其中一嘌呤核苷的糖部分與磷酸形成一酯鍵(ester bond)。嘌呤核苷酸的實例包括,但不限於:腺嘌呤核苷酸(adenylic acid)、鳥糞嘌呤核苷酸(guanylic acid)以及肌苷酸(inosinic acid)。
如本文中所用的,術語“核酸”意指呈單-或雙-股形式的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)分子、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子以及類似之物,且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(aritificial chemical mimics)。如本文中所用的,“核酸”此術語可與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。
依據本發明,該培養是在該可食性材料的製備期間或之後被進行。在本發明的一個較佳具體例中,該培養是在該可食性材料的製備之後被進行。
依據本發明,在該培養之後可以使用一分離處理(separation treatment)來移除該微生物。該分離處理可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術(例如,離心、過濾)來進行。
依據本發明,該可食性材料包括,但不限於:菇類食品(mushroom food)、豆類食品(legume food)、酒精飲料(alcoholic beverages)、水果飲料(fruit beverages)、蔬菜飲料(vegetable beverages)、發酵乳品(fermented milk)以及醋(vinegar)。在本發明的一個較佳具體例中,該可食性材料是菇類食品或豆類食品。
適用於本發明的菇類食品包括,但不限於:菇類萃取物(mushroom extract)[諸如,菇類之經水萃取的產物(water-extracted products of mushrooms)以及菇類之經有機溶劑萃取的產物(organic solvent-extracted products of mushrooms)]、菇類調味料(mushroom seasoning)以及菇類高湯(mushroom soup stock)。
依據本發明,菇類的實例包括,但不限於:香菇(Lentinus edodes )、金針菇(Flammulina velutipes )、秀珍菇(Pleurotus ostreatus )、柳松菇(Agrocybe aegerita )、洋菇(Agaricus bisporus )、靈芝(Ganoderma lucidium )、猴頭菇(Hericium erinaceus )、雞肉絲菇(Termitomyces albuminosus )以及木耳(Auricularia auricula )。
在本發明的一個較佳具體例中,該菇類食品是選自於由下列所構成的群組:香菇之經水萃取的產物、金針菇之經水萃取的產物以及秀珍菇之經水萃取的產物。在本發明的一個更佳具體例中,該菇類食品是香菇之經水萃取的產物。
適用於本發明的豆類食品包括,但不限於:豆漿、發酵豆奶(fermented soybean milk)、豆鼓(salt black bean)、醬油(soybean sauce)、味增(miso)、豆辦醬(chilli bean sauce)、甜麵醬(sweet bean sauce)以及豆腐乳(Chinese cheese)。在本發明的一個較佳具體例中,該豆類食品是豆漿。
適用於本發明的酒精飲料包括,但不限於:啤酒(beer)、紹興酒(Shao-Hsing wine)、清酒(sake)、紅酒(red wine)、白酒(white wine)以及水果酒(fruit wine)。
適合供用於製備本發明的水果飲料的水果包括,但不限於:蘋果(apple)、桃子(peach)、香蕉(banana)、草莓(strawberry)、西瓜(watermelon)、柑橘(orange)、葡萄(grape)、甘蔗(sugar cane)、梨(pear)、荔枝(litchi)以及椰子(coconut)。
適合供用於製備本發明的蔬菜飲料的蔬菜包括,但不限於:南瓜(pumpkin)、胡蘿蔔(carrot)、番茄(tomato)、甜椒(bell pepper)、芹菜(celery)、菠菜(spinach)、玉米(corn)、芥藍(kale)、香芹(parsley)、甘藍(cabbage)以及青花菜(broccoli)。
適用於本發明的發酵乳品包括,但不限於:優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷凍優格(frozen yogurt)以及乳酸菌發酵飲料(lactic acid bacteria-fermented beverages)。
較佳地,該微生物是以一範圍落在3.4×105 至3.4×106 孢子/mL內的濃度被培養於該可食性材料中。更佳地,該微生物是以一範圍落在3.4×105 至1.3×106 孢子/mL內的濃度被培養於該可食性材料中。在本發明的一個較佳具體例中,該微生物是以一為1.3×106 孢子/mL的濃度被培養於該可食性材料中。
較佳地,該微生物是於一範圍落在20至37℃內的溫度下被進行培養。在本發明的一個較佳具體例中,該微生物是於一為25℃的溫度下被進行培養。
本發明亦提供一種具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品,它是藉由一如上所述的方法而被製得。該食品產品藉由總嘌呤含量降低率的分析而被證實含有低量的嘌呤化合物。因此,當該食品產品被一人類或動物攝食(ingested)之後,能夠提供有益人體的營養成分,但不會造成非所欲的效用[例如高尿酸血症、痛風或尿酸腎病變(uric acid nephropathy)等]。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明,但應瞭解的是,該等實施例僅是供例示說明用,而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 實驗材料
1.菇類之經水萃取的產物(water-extracted products of mushrooms)的製備:首先,將新鮮的金針菇(Flammulina velutipes )以及秀珍菇(Pleurotus ostreatus )(這兩者皆購自於新竹大賣場)冷凍乾燥(freeze drying)(Lyophilization systems. INC,U.S.A.),繼而使用研磨機(佑崎D3V-10,台灣)將經冷凍乾燥的金針菇與秀珍菇以及已預先經過乾燥的香菇(Lentinus edodes )(購自於台中縣新社鄉菇類生產合作社)研磨成粉末。
接著,將60g的金針菇粉末、秀珍菇粉末以及香菇粉末分別置於1L血清瓶(serum bottle)中並予以加入600mL的蒸餾水,然後於121℃下進行加熱萃取歷時20分鐘。當所形成的水性混合物冷卻到室溫時,以3,000g(himac CR21E,Hitachi)來進行離心歷時20分鐘。之後,取35mL的上清液並將之加入至250mL搖瓶(shake flask)中,然後於一為121℃的溫度以及一為0.103MPa的壓力下進行滅菌歷時15分鐘,而得到金針菇之經水萃取的產物、秀珍菇之經水萃取的產物以及香菇之經水萃取的產物備用。
2.下面實施例中所使用的胰蛋白酶大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)(DIFCO 0369)、營養瓊脂(nutrient agar)(DIFCO 0001)以及YM瓊脂(YM agar)(DIFCO 0712)是購自於Difco Laboratories Inc,USA;而馬鈴薯右旋糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)(Merck 110130)是購自於Merck,Germany。
一般實驗方法: 1.總嘌呤含量降低率(reduced rate of total purine content)的測定: (1)酸水解法(acid hydrolysis method):
有關酸水解法是參考S.N. Lou and T.Y. Chen(1997),Food Science ,24:1-11當中所述的方法來進行,並略作修改。首先,將200mg之下面實施例中所獲得的經冷凍乾燥的菇類發酵液產物或豆漿發酵液產物加入至含有螺旋蓋的玻璃試管中,接著再加入1mL去離子水(deionized water)以及10mL三氟乙酸(trifluoroacetic acid)/甲酸(formic acid)(v/v=1:1),並予以振盪混合均勻。將所形成的混合物置於90℃水浴下作用歷時15分鐘,繼而立即予以移至冰水浴中進行冷卻。接著,使用去離子水將該混合物從玻璃試管洗滌至250mL圓底燒瓶中,然後於50℃下進行減壓濃縮(decompress concentrating)(Rotary Evaporator R-200,Switzerland)。之後,將所得到的濃縮物(concentrate)溶解於10mL的0.02M KH2 PO4 緩衝液(pH 4.0)中,繼而以0.2μm濾膜(filter membrane)(Sartorius Minisart NY25,Germany)予以過濾,藉此所得到的濾液(filtrate)被拿來作為測試樣品(test sample)並進行下面的高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)。
另外,未經發酵的菇類之經水萃取的產物或豆漿(兩者皆經過冷凍乾燥)被用來作為對照組(control)並參照上述方法來進行測試樣品的製備。
(2)HPLC分析:
使用一配備有一個紫外光偵測器(ultraviolet detector)(Hitachi UV-VIS Detector L-7420,Japan)的高效能液相層析儀(Hitachi L-7100 Liquid Chromatography,Japan)來進行腺嘌呤(adenine)、鳥糞嘌呤(guanine)、次黃嘌呤(hypoxanthine)以及黃嘌呤(xanthine)的含量測定,其中所使用的管柱以及操作條件如下:分析管柱為Hypersil BDS C18(5μm)(長度:250mm×4.6mm);流動相:0.02MKH2 PO4 緩衝液(pH 4.0);流速被控制為1mL/分鐘;樣品注射體積為10μL;偵測波長被設定為254nm;腺嘌呤、鳥糞嘌呤、次黃嘌呤以及黃嘌呤的滯留時間(retention times)分別為9.59、6.79、7.24以及8.10分鐘。各個測試樣品至少被重複分析3次。總嘌呤含量(total purine content)是藉由將所測得的腺嘌呤、鳥糞嘌呤、次黃嘌呤以及黃嘌呤的含量相加而被計算出。
(3)總嘌呤含量降低率的計算:
菇類發酵液產物與豆漿發酵液產物的總嘌呤含量降低率(%)是藉由將上面第(2)項所測得的總嘌呤含量分別代入下列公式(1)與(2)而被計算出:
公式(1):A=(B-C)/B×100
公式(2):A=(B’-C’)/B’×100
其中:A=總嘌呤含量降低率(%)
B=未經發酵的菇類之經水萃取的產物的總嘌呤含量
B’=未經發酵的豆漿的總嘌呤含量
C=菇類發酵液產物的總嘌呤含量
C’=豆漿發酵液產物的總嘌呤含量
實施例1.具有分解腺嘌呤、鳥糞嘌呤以及尿酸(uric acid)能力的微生物的初步篩選 實驗材料:
1.在本實驗中所使用的202株食品安全菌株(food safety strains)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號,台灣),其中這202株菌株是分屬於下面18個菌屬(genera):醋酸菌屬(Acetobacter )、麴菌屬(Aspergillus )、芽孢桿菌屬(Bacillus )、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium )、灰黴屬(Botrytis )、腸球菌屬(Enterococcus )、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter )、葡萄桿菌屬(Gluconobacter )、乳桿菌屬(Lactobacillus )、乳球菌屬(Lactococcus )、被孢黴屬(Mortierella )、青黴屬(Penicillium )、丙酸桿菌屬(Propionibacterium )、根黴菌屬(Rhizopus )、酵母菌屬(Saccharomyces )、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus )、鏈球菌屬(Streptococcus )以及木黴屬(Trichoderma )。
2.在本實驗中所使用的尿酸瓊脂培養基(uric acid agar medium)具有下面表1所示的配方。
3.在本實驗中所使用的腺嘌呤瓊脂培養基(adenine agar medium)以及鳥糞嘌呤瓊脂培養基(guanine agar medium)大體上是參照上面表1所示的配方來進行配製,不同之處在於:分別以腺嘌呤以及鳥糞嘌呤來代替尿酸。
實驗方法:
將202株食品安全菌株依據BCRC所建議的最適於各菌株生長的溫度與培養基來進行活化。接著,將該等菌株分別接種至尿酸瓊脂培養基、腺嘌呤瓊脂培養基以及鳥糞嘌呤瓊脂培養基上,並在最適於各菌株生長的溫度下進行培養歷時7天。之後,以肉眼觀察各個菌株在尿酸瓊脂培養基、腺嘌呤瓊脂培養基以及鳥糞嘌呤瓊脂培養基上的生長情形。
結果:
由肉眼的觀察結果發現,有24株菌株(它們的寄存編號與名稱被顯示於下面的表2中)可以在腺嘌呤瓊脂培養基、鳥糞嘌呤瓊脂培養基以及尿酸瓊脂培養基上生長,這表示它們可以利用腺嘌呤、鳥糞嘌呤以及尿酸作為生長的能量來源。申請人據此而推論:這24株菌株應具有分解嘌呤鹼基(purine bases)的能力。
特別地,申請人發現到,在本實驗所使用的202株食品安全菌株中,有11株是米麴菌(Aspergillus oryzae ),有11株是米根黴(Rhizopus oryzae ),而在這兩個物種中各自僅有6株菌株具有分解腺嘌呤、鳥糞嘌呤以及尿酸的能力,這表示並非所有屬於米麴菌或米根黴之物種的菌株皆具有分解腺嘌呤、鳥糞嘌呤以及尿酸的能力。
實施例2.具有分解嘌呤鹼基能力的菌株對於香菇發酵液產物(fermented liquid product of Lentinus edodes )中的總嘌呤含量的影響
為了進一步確認於上述實施例1中所篩選出來的24株菌株是否具有降解嘌呤化合物(purine compounds)之能力,下面的實驗被進行。
實驗方法: A、製備具有分解嘌呤鹼基能力的菌株的孢子接種物(spore inoculums):
將上面實施例1中所篩選出的24株菌株分別依照下面表3所示的培養條件來進行培養歷時10天,而使得各個菌株可以在培養基上生長並產生孢子。接著,各個培養基分別被加入20顆玻璃珠(直徑為40mm),繼而予以搖動直至培養基上的孢子已附著於該等玻璃珠上,然後加入5mL無菌水來散浮附著在玻璃珠上的孢子。所形成的懸浮液被使用作為本實施例中的孢子接種物。
B、香菇發酵液產物的總嘌呤含量降低率的分析:
將3.5mL的上面A項中所得到的24種菌株的孢子接種物分別接種至香菇之經水萃取的產物中,繼而依據上面表3中所示的培養溫度並在一為150rpm的振盪速率下進行發酵培養歷時16小時。所形成的香菇發酵培養物(fermented culture ofLentinus edodes )以3,000g來進行離心歷時20分鐘,繼而收取澄清的香菇發酵液產物(fermented liquid product ofLentinus edodes )。之後,將各個香菇發酵液產物以及未經發酵的香菇之經水萃取的產物冷凍乾燥並依照上面“一般實驗方法”的第1項「總嘌呤含量降低率的測定」中所述的方法來測量總嘌呤含量降低率。
結果:
表4顯示24株具有分解嘌呤鹼基能力的菌株分別與香菇之經水萃取的產物進行發酵培養後,所獲得的香菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率。從表4可見,除了凝結芽孢桿菌BCRC 10272之外,其餘的23株菌株皆可以降低香菇發酵液產物中的總嘌呤含量,特別地,有7株菌株(亦即,枯草芽孢桿菌BCRC 14718;米麴菌BCRC 30118、BCRC 30133、BCRC 30222與BCRC 30235;以及米根黴BCRC 31108與BCRC 31152)可以使總嘌呤含量降低率達至68%以上,而其中米麴菌BCRC 30235甚至可以使總嘌呤含量降低率達至100%。
為了確認上述實驗結果的正確性,在上面B項當中所得到的該7株菌株之經冷凍乾燥的香菇發酵液產物被拿來作進一步總嘌呤含量降低率的分析,而有關總嘌呤含量降低率的分析大體上是參照上面“一般實驗方法”的第1項「總嘌呤含量降低率的測定」當中所述的方法來進行,不同之處在於:在進行HPLC分析之前,從各個測試樣品中分別取出4個等份(每份10μL)並分別予以加入單一的腺嘌呤、鳥糞嘌呤、次黃嘌呤以及黃嘌呤標準品,繼而將之進行HPLC分析而得到各個嘌呤的實際滯留時間,各個試驗樣品隨後即以該等實際滯留時間來進行成分分析。所得到的結果被顯示在下面的表5中。
從表5可見,除了枯草芽孢桿菌BCRC 14718以及米根黴BCRC 31152之外,米麴菌BCRC 30118、BCRC 30133、BCRC 30222與BCRC 30235以及米根黴BCRC 31108確實具有分解嘌呤化合物之能力,因而能有效地降低香菇發酵液產物中的總嘌呤含量,其中以米麴菌BCRC 30235的效果最好,它可以使總嘌呤含量降低率達至53.5%。另外,米麴菌BCRC 30118、BCRC 30133、BCRC 30222、BCRC 30235以及米根黴BCRC 31108亦可被購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC),它們的寄存編號分別為ATCC 11493、ATCC 26850、ATCC 44193、ATCC 26831以及ATCC 52362。根據表5所示的結果,申請人選用米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)、BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)來進行下面的實驗。
實施例3.米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的孢子接種量以及發酵時間對於不同的菇類發酵液產物(fermented liquid product of mushroom)中的總嘌呤、蛋白質以及多醣含量之影響
為瞭解在上面實施例2中所篩選出的米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的孢子接種量以及發酵時間對於不同的菇類發酵液產物中的總嘌呤、蛋白質以及多醣含量的影響,金針菇之經水萃取的產物、秀珍菇之經水萃取的產物以及香菇之經水萃取的產物被拿來進行下面的實驗。
實驗方法: A、米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的孢子接種物的製備:
本實驗所使用的米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的孢子接種物大體上是參照上面實施例2的“A、製備具有分解嘌呤鹼基能力的菌株的孢子接種物”當中所述的方法來進行製備,不同之處在於:以血球計數器(hemocytometer)(Bright-Line,Hauser Scientific,Horsham,PA)來計算所得到的孢子接種物中的孢子數量。
B、菇類發酵液產物的製備:
首先,將香菇之經水萃取的產物、秀珍菇之經水萃取的產物以及金針菇之經水萃取的產物分別分裝至搖瓶(每一種菇類之經水萃取的產物各45個)中,接著將上面A項中所得到的米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的孢子接種物以一為3.4×105 、1.3×106 以及3.4×106 孢子/mL的接種量分別接種至各個搖瓶(每一接種量各15個)內,並於一恆溫振盪培養箱(25℃、150rpm)內進行發酵培養。在第16、24、32、40以及48小時之時,分別取出含有不同孢子接種量的搖瓶(每一接種量各3個),然後將各個搖瓶中的菇類發酵培養物以3,000g來進行離心歷時20分鐘。之後,分別收取部分的澄清的菇類發酵液產物來進行下面的蛋白質殘存率與多醣殘存率的測定。另外,將剩餘的菇類發酵液產物以及未經發酵的菇類之經水萃取的產物冷凍乾燥並依照上面“一般實驗方法”的第1項「總嘌呤含量降低率的測定」中所述的方法來測量總嘌呤含量降低率。
C、蛋白質殘存率(residual rate of protein)的測定:
有關蛋白質的含量測定是使用Bio-Rad蛋白質分析套組(Bio-Rad Protein Assay Kit)(Bio-Rad,Cat No. 500-0006)來進行。首先,將100μL之上述B項中所得到的菇類發酵液產物或未經發酵的菇類之經水萃取的產物加入至一試管中,接而加入5mL之經5倍稀釋的蛋白質分析染料試劑濃縮物(protein assay dye reagent concentrate)並予以混合作用歷時20~30分鐘。接著,取出1mL的混合物並以分光光度計(Beckman DU-800)來測量波長595nm下的吸光值。
另一方面,將各個牛血清白蛋白標準溶液(bovine serum albumin standard solution)的濃度(0μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL以及100 μg/mL)與其相對應的吸光值(OD595 )作圖,可得到一標準曲線(standard curve)。
混合物的吸光值(OD595 )藉由該標準曲線而被換算成濃度(μg/mL)來表示。菇類發酵液產物的蛋白質殘存率(%)是藉由將所測得的蛋白質濃度代入下列公式(3)而被計算出:
公式(3):D=(E/F)×100
其中:D=蛋白質殘存率(%)
E=菇類發酵液產物的蛋白質濃度
F=未經發酵的菇類之經水萃取的產物的蛋白質濃度
D、多醣殘存率(residual rate of polysaccharide)的測定:
將上述B項中所得到的發酵液產物或未經發酵的菇類之經水萃取的產物以去離子水來進行5倍稀釋(5-fold dilution),繼而取出0.2mL的稀釋溶液並將之置於一試管中,然後加入0.8mL的95%酒精並予以混合均勻。接著,將所形成的混合物置於-20℃的冰箱中歷時1小時以沉澱多醣,然後在4℃下以12,000rpm進行離心歷時25分鐘。之後,以0.8mL的75%酒精來清洗所得到的粗多醣沉澱物(crude polysaccharide precipitate),繼而在4℃下以12,000rpm進行離心歷時25分鐘以去除雜質。所得到的沉澱物以0.2mL的去離子水予以溶解,藉此而得到樣品溶液。之後,將0.2mL的樣品溶液置於一新的試管中,接而加入0.2mL 5%酚溶液(phenol solution),繼而緩慢地加入1mL濃硫酸(concentrated sulfuric acid)並予以均勻混合,然後靜置歷時30分鐘以使反應完全。當所形成的混合物的溫度降至室溫時,取出1mL的混合物並以分光光度計(Beckman DU-800)來測量波長490nm下的吸光值。
另一方面,將葡萄糖標準溶液(glucose standard solution)的濃度(0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL以及100μg/mL)與其相對應的吸光值(OD490 )作圖,可得到一標準曲線。
混合物的吸光值(OD490 )藉由該標準曲線而被換算成濃度(μg/mL)來表示。菇類發酵液產物的多醣殘存率(%)是藉由將所測得的多醣濃度代入下列公式(4)而被計算出:
公式(4):G=(H/I)×100
其中:G=多醣殘存率(%)
H=菇類發酵液產物的多醣濃度
I=未經發酵的菇類之經水萃取的產物的多醣濃度
結果:
圖1A至圖1C分別顯示將米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以不同的孢子接種量接種至香菇之經水萃取的產物並於發酵培養的第16、24、32、40以及48小時之時,所獲得的香菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率、蛋白質殘存率以及多醣殘存率。從圖1A可見,當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的接種量為1.3×106 孢子/mL時,香菇發酵液產物中的總嘌呤含量被降低最多,特別地,在發酵培養的第16小時之時,所測得的總嘌呤含量降低率為61%,而在發酵培養的第48小時之時,所測得的總嘌呤含量降低率高達84%。另外,從圖1B與圖1C可見,當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的接種量為1.3×106 孢子/mL時,香菇發酵液產物中的蛋白質殘存率會隨著發酵時間的增加而從68%降低至16%,而多醣殘存率則維持在一為75%~95%的範圍內。
圖2A至圖2C分別顯示將米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以不同的孢子接種量接種至秀珍菇之經水萃取的產物並於發酵培養的第16、24、32、40以及48小時之時,所獲得的秀珍菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率、蛋白質殘存率以及多醣殘存率。從圖2A可見,當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的接種量為1.3×106 孢子/mL時,秀珍菇發酵液產物中的總嘌呤含量被降低最多,特別地,在發酵培養的第48小時之時,所測得的總嘌呤含量降低率可達至61%。另外,從圖2B與圖2C可見,當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的接種量為1.3×106 孢子/mL時,秀珍菇發酵液產物中的蛋白質殘存率不會隨著發酵時間的增加而有顯著的降低,大約維持在一為45%~65%的範圍內,而多醣殘存率則要比其他2種接種量所具者為高,大約維持在一為90%~110%的範圍內。
圖3A至圖3C分別顯示將米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以不同的孢子接種量接種至金針菇之經水萃取的產物並於發酵培養的第16、24、32、40以及48小時之時,所獲得的金針菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率、蛋白質殘存率以及多醣殘存率。從圖3A可見,當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的接種量為1.3×106 孢子/mL時,金針菇發酵液產物中的總嘌呤含量被降低最多,特別地,在發酵培養的第40小時之時,所測得的總嘌呤含量降低率為73%,而在發酵培養的第48小時之時,所測得的總嘌呤含量降低率高達97%。另外,從圖3B與圖3C可見,當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)的接種量為1.3×106 孢子/mL時,金針菇發酵液產物中的蛋白質殘存率不會隨著發酵時間的增加而有顯著變化,大約維持在一為20%~35%的範圍內,而多醣殘存率在發酵培養的第32小時之時降低至50%,但是在發酵培養的第48小時之時上升至96%。
這個實驗結果顯示:米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)對於香菇之經水萃取的產物、秀珍菇之經水萃取的產物以及金針菇之經水萃取的產物中的嘌呤化合物具有良好的分解能力,並且當米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以一為1.3×106 孢子/mL的接種量來被接種時,可達至最好的嘌呤化合物分解效果。
實施例4.米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)對於豆漿發酵液產物(fermented liquid product of Soybean mi1k)中的總嘌呤含量的影響 實驗方法: A、米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)的孢子接種物的製備:
本實驗所使用的米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)的孢子接種物大體上是參照上面實施例2的“A、製備具有分解嘌呤鹼基能力的菌株的孢子接種物”當中所述的方法來製備,不同之處在於:發酵培養歷時7天,以及以血球計數器來計算所得到的孢子接種物中的孢子數量。
B、豆漿發酵液產物的總嘌呤含量降低率的分析:
將1kg的黃豆(soybean)以及8kg的水置於一均質機(homogenizer)(Vita-Mix VM0101B,USA)中進行均質處理歷時15分鐘,繼而將所形成的均質物(homogenate)煮沸歷時30分鐘,而得到豆漿。將35mL的豆漿分別加入至6個250mL搖瓶中,然後於一為121℃的溫度以及一為0.103MPa的壓力下進行滅菌歷時15分鐘。當搖瓶的溫度降低至室溫時,將上面A項中所得到的米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)的孢子接種物分別以一為1.3×106 孢子/mL的接種量接種至3個搖瓶中,並於一恆溫振盪培養箱(25℃、150rpm)內進行發酵培養歷時16小時。所形成的豆漿發酵培養物以3,000g來進行離心歷時20分鐘,繼而收取澄清的豆漿發酵液產物。將各個豆漿發酵液產物以及未經發酵的豆漿冷凍乾燥並依照上面“一般實驗方法”的第1項「總嘌呤含量降低率的測定」中所述的方法來測量總嘌呤含量降低率。
結果:
由實驗結果發現,將米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)分別以一為1.3×106 孢子/mL的接種量接種至豆漿中並經過發酵培養歷時16小時,所獲得的豆漿發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率分別為15.24%±6.37%以及39.93%±2.33%。根據這個實驗結果,申請人認為米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)以及BCRC 30222(對應於ATCC 44193)可以有效地降低含嘌呤化合物飲料(purine compounds-containing beverages)中的總嘌呤含量。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時,本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述,明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
圖1A至圖1C分別顯示將米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以不同的孢子接種量接種至香菇之經水萃取的產物並於發酵培養的第16、24、32、40以及48小時之時,所獲得的香菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率、蛋白質殘存率以及多醣殘存率;
圖2A至圖2C分別顯示將米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以不同的孢子接種量接種至秀珍菇之經水萃取的產物並於發酵培養的第16、24、32、40以及48小時之時,所獲得的秀珍菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率、蛋白質殘存率以及多醣殘存率;以及
圖3A至圖3C分別顯示將米麴菌BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以不同的孢子接種量接種至金針菇之經水萃取的產物並於發酵培養的第16、24、32、40以及48小時之時,所獲得的金針菇發酵液產物中被測得的總嘌呤含量降低率、蛋白質殘存率以及多醣殘存率。

Claims (8)

  1. 一種用於生產一具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品之方法,其包括:將一具有分解嘌呤化合物能力的微生物培養於一具有一第一嘌呤含量的可食性材料中,以使得所得到的經培養的可食性材料具有一低於該第一嘌呤含量的第二嘌呤含量,其中該微生物是選自於由下列所構成的群組:米麴菌(Aspergillus oryzae )BCRC 30118(對應於ATCC 11493)、BCRC 30133(對應於ATCC 26850)、BCRC 30222(對應於ATCC 44193)、BCRC 30235(對應於ATCC 26831)以及米根黴(Rhizopus oryzae )BCRC 31108(對應於ATCC 52362);以及該可食性材料是選自於由下列所構成的群組:菇類食品、酒精飲料、水果飲料、蔬菜飲料、發酵乳品以及醋。
  2. 如申請專利範圍第1項的方法,其中該微生物是選自於由下列所構成的群組:米麴菌BCRC 30133(對應於ATCC 26850)、BCRC 30222(對應於ATCC 44193)以及BCRC 30235(對應於ATCC 26831)。
  3. 如申請專利範圍第1項的方法,其中該培養是在該可食性材料的製備期間或之後被進行。
  4. 如申請專利範圍第1項的方法,其中該可食性材料是菇類食品。
  5. 如申請專利範圍第4項的方法,其中該菇類食品是菇類之經水萃取的產物。
  6. 如申請專利範圍第1項的方法,其中該微生物是以一範 圍落在3.4×105 至3.4×106 孢子/mL內的濃度被培養於該可食性材料中。
  7. 如申請專利範圍第1項的方法,其中該微生物是於一範圍落在20至37℃內的溫度下被進行培養。
  8. 一種具有一被降低的嘌呤化合物含量的食品產品,它是藉由一如申請專利範圍第1至7項中任一項的方法而被製得。
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