DE69623401T2

DE69623401T2 - Bierherstellung

Info

Publication number: DE69623401T2
Application number: DE69623401T
Authority: DE
Inventors: Teruo Amachi; Haruyo Hatanaka; Hirofumi Koda; Takehiro Matsumoto; Yuji Shibano; Sakayu Shimizu; Yoshihide Suwa; Hideko Yomo
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 2003-01-09
Anticipated expiration: 2016-02-17
Also published as: EP0753572A1; EP0753572A4; ATE223478T1; DE69623401D1; EP0753572B1; JP3824326B2; DK0753572T3; US6013288A; CA2188032A1; CA2188032C

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Bier, in welchem die Konzentration der Purinverbindungen reduziert wird. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Bier, dadurch gekennzeichnet, dass Enzyme auf die Purinnukleoside einwirken, die in der Stammwürze enthalten sind, um diese in Purinbasen zu zersetzen, die von Hefe assimiliert werden können.

Hintergrund der Erfindung

In den letzten Jahren sind Anstiege im Harnsäurelevel im Blut beobachtet worden, die mit der Verwestlichung der Nahrung und der Überernährung einhergehen. Deshalb gibt es Bedenken über die Anstiege im Auftreten von Gicht, verursacht durch asymptomatische Hyperuricemie. Purinbasen, Purinnukleoside, Purinnukleotide und hochmolekulargewichtige Nukleinsäuren in der Nahrung werden verdaut, im Verdauungstrakt absorbiert und durch das purinzersetzende System in der Leber in Urinsäure zersetzt. Es gibt zahlreiche epidemiologische Befunde, die anzeigen, dass die Aufnahme einer Nahrung, die einen hohen Gehalt an Purinverbindungen hat, die Ursache für Hyperuricemie und Gicht ist. Die Erniedrigung der durch die Nahrung aufgenommenen Menge von Purmnsäuren wird deshalb als das wichtigste Mittel zur Vorbeugung von Hyperuicemie oder Gicht betrachtet.
Essensbeispiele, die große Mengen von Purinverbindungen enthalten schließen ein Fleisch, Weichrogen (soft roe), Fischeier und Leber. Alkoholische Getränke und insbesondere Bier haben jedoch auch einen bedenklich hohen Anteil an Purinverbindungen. Kaneko (Kiyoko Kaneko; Nippon Rinsho, 49: 1108-1115 (1991)) führten in Wirklichkeit einen Vergleich des Gehalts von Purinverbindungen in verschieden alkoholischen Getränken durch. Es wurde berichtet, dass fermentierte alkoholische Getränke wie Bier, Sake und Wein einen höheren Purinverbindungsgehalt als destillierte alkoholische Getränke wie Whiskey und Shochu haben, und dass Bier den höchsten Purinverbindungsgehalt unter den fermentierten alkoholischen Getränken hat. Fujimori, et al. berichtete, dass in Bier ein Gesamtgehalt von 50 bis 70 mg/Liter Purinverbindungen enthalten sind (Fujimori, et al., Nyosan, Vol. 9, No.2, pp. 128-133).
Darüber hinaus wurde dieser Wert durch die Hydrolyse der Purinverbindungen in Purinbasen, die im Bier enthalten sind, mit Perchlorsäure bestimmt und dann die resultierenden Purinbasen mittel Hochleistunsflüssigkeitschromatographie gemessen.
Obwohl der Purinverbindungengehalt im Bier innerhalb des Spektrums von 1/100 bis 1/10 der von dem oben genannten Fleisch, Eiern und Leber ist, sollte bedacht werden, dass Bier, da es in großen Mengen konsumiert wird, ein größeres Morbiditätsrisiko für Hyperuricemie und Gicht darstellt als destillierte alkoholische Getränke. Tofler und Woodings (O. B. Tofler und T. L. Woodings; Med. J. Aust. 2, 479-481 (1981)) führten eine 13jährige Studie durch, indem sie Versuchspersonen entsprechend der Menge des Bierkonsums in Studiengruppen einteilten und sie zeigten die Existenz einer Korrelation zwischen der Menge des konsumierten Biers und des Auftretens von Gicht auf. Folglich wird Bier entsprechend den Befunden von epidemiologischen Studien derzeitig für die Darstellung des höchsten Morbiditätsrisikos für Hyperuricemie und Gicht unter den alkoholischen Getränken gehalten.

Mitteilung der Erfindung

Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Bier bereit, das einen reduzierten Gehalt von Purinverbindungen hat.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erhalten Befunde, dass Bier durch die Zersetzung der Purinnukleoside in Purinbasen, die in der Stammwürze enthalten sind, hergestellt werden kann, um einen reduzierten Gehalt von Purinverbindungen zu haben und als ein Ergebnis weiterer Forschung konnten sie die vorliegende Erfindung vervollständigen.
Die vorliegende Erfindung stellt nämlich ein Verfahren zur Herstellung von Bier bereit, dadurch gekennzeichnet, dass die nukleosidzersetzte Stammwürze durch die Veranlassung einer Nukleosidphosphorylase oder Nukleosidase auf die Stammwürze einzuwirken hergestellt wird, um die Purinnukleoside, die in der Stammwürze enthaltenen sind, in Purinbasen zu zersetzen und das Bier unter Verwendung der besagten nukleosidzersetzten Stammwürze hergestellt wird.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Stammwürze bereit, gekennzeichnet durch die Veranlassung einer Nukleosidphosphorylase oder Nukleosidase auf die Stammwürze einzuwirken.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Graph, der den Konsum vom Purinverbindungen in einem Versuchsbiergebräu in einem 70liter Umfang zeigt. Schwarze Punkte zeigen Purinnukleoside an während weiße Punkte Purinbasen anzeigen.
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm, dass die Menge von jeder Purinverbindung zeigt, wenn eine Nukleosidphosphorylase zu der Stammwürze zugegeben wurde.
Fig. 3 zeigt die Aktivität, wenn Inosin als Substrat bei pH 5,0 verwendet wird und die Reaktion für 10 min bei jeder Temperatur durchgeführt wird.
Fig. 4 zeigt die Aktivität, wenn Inosin als Substrat verwendet wird, eine gleiche Menge von 10 mM Inosinlösung zugegeben wird, nachdem jedes Mal bei 70ºC und dem jeweiligen pH inkubiert wurde, und die Reaktion für 10 min bei 70ºC durchgeführt wird.
Fig. 5 zeigt die Aktivität, wenn eine gleiche Menge von 10 mM Inosinlösung zugegeben wird, nachdem jedes Mal bei 70ºC in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 inkubiert wurde, und die Reaktion für 10 min bei 70ºC durchgeführt wird.
Fig. 6 zeigt die Aktivität, wenn eine gleiche Menge von 10 mM Inosinlösung zugegeben wird, nachdem jedes Mal bei 70ºC in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 inkubiert wurde, und die Reaktion für 10 min bei 40ºC durchgeführt wird.
Fig. 7 zeigt die Substratspezifität in Bezug auf Inosin, Adenosin und Guanosin bei 60ºC und 70ºC und pH 5,0 durch die quantitative Bestimmung der Zuckerreduzierung.
Fig. 8 zeigt die Aktivität, wenn Inosin bei 60ºC als Substrat verwendet wird, nachdem jedes Mal bei 100ºC inkubiert wurde.
Fig. 9 zeigt die Zeit-Temperaturkurven des Vorbereitungskessels und des Vorbereitungstanks im Stammwürzeproduktionsverfahren.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Purine in Stammwürze, die unter Zugabe des Enzyms hergestellt wurde, und in Stammwürze, die ohne Enzymzugabe hergestellt wurde.
Fig. 11A und 11B zeigen unter Verwendung der in Beispiel 4 hergestellten nukleosidzersetzten Stammwürze und gewöhnlicher Stammwürze den Verbrauch von Purinen während der Fermentation an.

Genauere Beschreibung

Die vorliegenden Erfinder vervollständigten zum Zweck der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Bier, in welchen die Konzentration der Purinverbindungen reduziert ist, die vorliegende Erfindung als ein Ergebnis der Durchführung von Forschung durch Messen der Mengen von Purinnukleosiden, Purinnukleotiden, Purinbasen und hochmolkulargewichtigen Nukleinsäuren in Bier. Purinbase ist der Gattungsbegriff für Derivate von Purin(9H-imidazo[4,5-d]pyrimidin), die verschiedene substituierte Teile haben, und Beispiele für diese schließen Adenin, Guanin und Xanthin ein.
Purinnukleosid ist der Gattungsbegriff für Glykoside, worin eine Purinbase und die reduzierende Gruppe eines Zuckers durch eine N- glykosidische Bindung verbunden sind und Beispiele für diese schließen Adenosin, Guanosin und Inosin ein.
Purinnukleotid ist der Gattungsbegriff für Verbindungen, worin der Zucker Teil eines Purinnukleosids und Phosphorsäure eine Esterbindung bilden und Beispiele für diese schließen Adenylinsäure (AMP), Guanylinsäure (GMP) und Inosininsäure (IMP) ein.
Purinverbindung ist der Gattungsbegriff für Verbindungen, die in Purinskelett enthalten, wie die oben erwähnten Purinbasen, Purinnukleoside und Purinnukleotide.
Die vorliegenden Erfinder klärten die folgen Punkte als ein Ergebnis der Messung von jeder Purinverbindungsmenge im Bier und seines Herstellungsverfahrens.
1) Obwohl die Menge der Purinverbindungen in verschieden Marken von kommerziell erhältlichen Bieren innerhalb des Spektrums von 40 bis 100 mg/Liter fluktuiert, ist die Menge an Purinnukleoside 2 bis 25 mal die Menge der Purinbasen. Die Mehrheit der Purinverbindungen, die im Bier enthalten sind, sind nämlich Purinnukleoside.
2) Im Fermentationsprozess werden Purinbasen, die in der Stammwürze enthalten sind, von der Hefe aufgenommen und metabolisiert bis sie im wesentlichen fehlen.
Als ein Ergebnis der Durchführung von ernsthafter Forschung zu Lösung dieses Problems auf der Basis der oben erwähnten analytischen Ergebnisse, haben die vorliegenden Erfinder ein Verfahren zur Herstellung von Bier, das eine reduzierte Menge von Purinverbindungen hat, erfunden.
Mit anderen Worten, obwohl normale Hefe unfähig ist Purinnukleoside aufzunehmen, ist sie in der Lage Purinbasen aufzunehmen und zu metabolisieren. In der vorliegenden Erfindung kann deshalb die Menge von Purinverbindungen, die im Bier enthalten sind, durch die Veranlassung eines Enzyms auf die Stammwürze einzuwirken, reduziert werden, wobei die Purinnukleoside, die in der Stammwürze enthalten sind, in Purinbasen zersetzt werden, um eine nukleosidzersetzte Stammwürze herzustellen. Ferner werden in der nukleosidzersetzten Stammwürze ein Teil oder alle Purinnukleoside in der Stammwürze durch das Enzym in Purinbasen zersetzt. Obwohl der Purinnukleosidanteil in dieser nukleosidzersetzten Stammwürze entsprechend der Menge des zugegebenen Enzyms, der Reaktionsdauer und der Reaktionstemperatur und so weiter eingestellt werden kann, werden vorzugsweise alle Purinnukleoside zu Purinsalzen zersetzt, um eine Stammwürze herzustellen, die frei von Purinnukleosiden ist.
Dieses Enzym kann (1) im Stammwürzeproduktionsverfahren, (2) nach dem Stammwürzeproduktionsverfahren und vor dem Fermentationsprozess wirken oder (3) im Fermentationsprozess wirken. Das Enzym kann bei Beginn der Stammwürzeherstellung (Saccharifikation) oder zu geeigneten Zeit während der Stammwürzeproduktion zugegeben werden. Um das Enzym vor dem Fermentationsprozess wirken zu lassen, sollte das Enzym einen vorgeschriebenen Zeitabstand vor dem Beginn der Fermentation, während des Stammwürzeproduktionsverfahrens, zugegeben werden. Es ist jedoch vorzuziehen, dass das Enzym vor dem Sieden während Stammwürzeproduktionsverfahrens zugegeben wird. Dieses Aus dem Grund, da das Enzym durch Kochen inaktiviert werden kann, weil aktives Enzym nicht in das vollendete Bier eingeführt werden darf und es für das Enzym so keine Möglichkeit gibt einen Effekt auf die Qualität zu haben.
Um das Enzym in dem Fermentationsprozess wirken zu lassen, wird außerdem das Enzym entweder vor dem Beginn der Fermentation oder der Fermentation zugegeben. Da es jedoch notwendig ist, dass die Purinbasen, die durch die Wirkung des Enzyms gebildet werden, durch die Hefe metabolisiert und abgebaut werden, ist es vorzuziehen, dass das Enzym zu Beginn der Fermentation oder in der ersten Hälfte der Fermentationperiode zugegeben wird.
Durch ihr Produktionsverfahren ist die Stammwürze sauer (pH 5,0- 5,5) und da die Temperatur der Produktionsverfahrens 50-80ºC ist, ist ein Enzym vorzuziehen, dass in der Lage im sauren Bereich und bei hohen Temperaturen zu reagieren.
Die Enzyme für diesen Zweck können aus Malz oder anderen Quellen gewonnen werden und sind zu Beispiel eine Nukleosidphosphorylase oder Nukleosidase. Beispiele für Enzyme aus anderen Quellen als Malz, die verwendet werden können, schließen eine Nukleosidphosphorylase (EC 2.4.2.1), die aus Kalbsmilz und Bakterien gewonnen wird, ein. Die Nukleosidase, die in der vorliegender Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf jene, die Purinnukleoside in Purinbasen und Ribose zersetzt, und hat vorzugsweise einen optimalen pH-Bereich von 4, 5 bis 6,5 und optimalen Temperaturbereich von 50ºC bis 80ºC. Es gibt keine bestimmten Beschränkungen zu einem Inhibitortyp, dem Km-Wert oder dem Molekulargewicht und so weiter, die andere allgemeine Eigenschaften des Enzyms zu Ausdruck bringen.
Eine Nukleosidase wird normalerweise durch Kultivierung eines Mikroorganismusstamms hergestellt, der die Eigenschaft hat, eine Nukleosidase zu produzieren. Beispiele für solche Stämme von Mikroorganismen, die verwendet werden, schließen die Gattungen ein Ochrobactrum, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Escherichia, Citrobacter, Serratia, Alcaligenes, Flavobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Arthrobacter, Comamonas, Pseudomonas, Kluyveromyces, Saccharomyces, Debaryomyces, Pichia, Hansenula, Sporobolomyces, Sporidiobolus, Aspergillus und Pencillium. Es gibt für den Stamm keine bestimmten Beschränkungen und sogar frisch aus Erde, Milchsäurebakterien, ranziges Essen oder tierische Organe oder Exkremente isolierte Stämme sind in ihrem Gebrauch problemlos, vorausgesetzt, dass sie die Eigenschaft haben eine Nukleosidase zu produzieren. Außerdem können sogar noch diese Stämme im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die künstlich durch aussetzen ultravioletter Strahlung oder einer Behandlung mit mutagenen Agenzien mutiert wurden, oder worin das Genfragment, das zur Expression der besagten Nukleosidaseaktivität benötigt wird, künstlich entfernt und in einen anderen Transformanten inkorporiert wurde.
Bestimmte Beispiele für Stämme von Mikroorganismen, die in der Lage sind eine Nukleosidase herzustellen schließen ein Ochrobactrum anthropi (FERM BP-5377), Streptococcus citrovorum, Pediococcus pentosaceus (IFO 3182), Leuconostoc dextranicum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus arabinosus (FIO 3070), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus cucumeris (IFO 3074), Escherichia coli B biotinfrei, Citrobacter freundii (IFO 13546), Serratia marcescens (IFO 3736), Alcaligenes faecalis, Flavobacterium meningosepticum (DSM 2800), Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus aureus (IFO 3060), Arthrobacter ureafaciens, Arthrobacter globiformis (IFO 12140), Comamonas testosteroni, Pseudomonas dacunhae (IFO 12048), Pseudomonas up tida, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus thuringiensis (TFO 3951), Kluyveromyces marxianus, Saccheromyces marxianus (IFO 0277), Debaryomyces pseudopolymorphus, Pichia pseudopolymorpha (IFO 1026), Pichia capsulata, Hansenula capsulata (IFO 0721), Sporobolomyces salmonicolor (IFO 1038), Sporidiobolus salmonicolor, Sporobolomyces odorus (IFO 1035), Aspergillus niger (IFO 4416), Pencillium spinulosum (IFO 4033), Aspergillus oryzae (IAM 2630), Aspergillus flavus (IFO 5839), Aspergillus terreus (IFO 5445), Aspergillus sojae (IFO 4386), Aspergillus parasiticus (IFO 4082) und Penecilliumarten. Jedoch besonders bevorzugte Beispiele sind Ochrobactrum anthropi (FERM BP-5377), Aspergillus niger (IFO 4416), Aspergillus oryzae (IAM 2630), Aspergillus flavus (IFO 5839) und Aspergillus terreus (IFO 5445).
Ferner können diese der oben genannten Stämme, die mit ATTC- Nummer aufgeführt sind, von der ATTC erworben werden, während diese Stämme, die mit einer IFO-Nummer aufgeführt sind, vom Fermentation Research Institute (2-17-85, Jusohonmachi-cho, Yodogawa-ku, Osaka) erworden werden können.
Überdies hat ein Bakterienstamm, der in der vorliegenden Erfindung neu isoliert wurde, Ochrobactrum anthropi, die folgenden taxonomischen Eigenschaften.

(a) Morphologische Merkmale

(1) Zellform: Stäbchen
(2) Zellpolymorphismus: Nein
(3) Beweglichkeit: Ja
(4) Sporen: Nein

(b) Kultivierungsmerkmale

(1) Kultivierung auf Rindfleischbrüheagarplatten (30ºC, 2 Tage):
Die Kolonien erscheinen rund mit Protrusionen.
Die Kolonieoberfläche ist glatt und glänzend.

(c) Physiologische Merkmale

(1) Gramfärbung: Negativ
(2) Nitratreduktion: Negativ
(3) Denitrifikationsreaktion: Negativ
(4) Indolbildung: Negativ
(5) Säurebildung aus Glukose: Negativ
(6) Urease: Positiv
(7) Cytochromoxidase: Positiv
(8) Catalase: Positiv
(9) Säurebildung aus Xylose: Positiv
(10) optimale Wachstumstemperatur: 28-37ºC
(11) Pigmentbildung auf Kings B Medium: Negativ
(12) O-F Test: (Zucker: Glukose): Oxidation
(13) Zuckerassimilation
(1) Glukose: +
(2) Arabinose: +
(3) Mannose: +
(4) Mannitol: -
(5) N-acetylglucosamin: +
(6) Maltose: +
(7) Glukonat: -
(8) Caprat: +
(9) Adipat: -
(10) Malat: +
(11) Citrat: +
(12) Phenylacetat: -

(d) Weitere Merkmale

(1) Esculinhydrolyse: Negativ
(2) β-Galaktosidase: Negativ
(3) Gelatinhydrolyse: Negativ
(4) Arginindihydrolase: Positiv
(5) Wachstum auf MacConkey's Medium: Positiv
(6) Polymyxinsensitivität: Negativ
(7) Analinnutzung: Positiv
(8) Glycinnutzung: Positiv
Die physiologischen und biochemischen Eigenschaften wurden unter Verwendung von Apizon (Bio Merieux S. A.) untersucht. Außerdem, wen der Artname unter Verwendung der Apizone analytischen Profilindexes, basierend auf diesen Resultaten, bestimmt wurde, obwohl die Nitratreduktion und Glycinnutzung sich von der Beschreibung von Holmes et al. (International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 38, No.4, 1988, p.406-416) unterschieden, wurde das Bakterium entsprechend dem Index als Ochrobactrum anthropi identifiziert.
Dieser Stamm wurde als Ochrobactrum anthropi indentifiziert. Dieser bakterielle Stamm wurde als eine Internationale Deposition nach dem budapester Abkommen am 26. Januar 1996 an dem Institute of Biosience and der Human-Techhnology Agency of Industrial Science and Technology als FERM BP-5377 hinterlegt.
Eine routinemäßige stehende Kultur, eine Schüttelkultur, eine durchlüftete oder gerührte Kultur oder feste Kultivierung, entweder durchgehend oder in Abständen, kann durchgeführt werden um, um diesen Mikroorganismusstamm zu kultivieren und Nukleosidase herzustellen. Außerdem ist die Nukleosidase normalerweise nach der Kultivierung in dem Mikroorganismus enthalten und ein rohes oder gereinigtes Enzym, dass eine verbesserte spezifische Aktivität über der natürlichen Form hat, kann durch routinemäßige Enzymaufreinigungsmittel erhalten werden und in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Außerdem kann in dem Fall, dass die Nukleosidase in die Kulturflüssigkeit sekretiert wird, auch die besagte Kulturflüssigkeit wie sie ist verwendet werden.

Beispiele

Obwohl das folgende eine genauere Erklärung der vorliegenden Erfindung mittels Beispielen bereitstellt, wird die vorliegenden Erfindung durch diese Beispiele nicht eingschränkt.

Experiment 1. Messung der Purinverbindungen in Bier

Die Purinverbindungen in Bier wurden unter Verwendung des Hochleitsungsflüssigkeitschromatographmodels EP-10 (Eicom) analysiert. Die GS320-H (7,6 mm D · 250 mm L, Asahipack) wurde als Säule verwendet, 10 mM Natriumphosphat (pH 5,0) wurde als die mobile Schicht verwendet, die Fließrate war 1,0 ml/min und die Analyse wurde bei 30ºC durchgeführt. Nach dem entfernen aller Feststoffe mittels passieren durch einen Membranfilter wurden 10 ul der Probe injeziert und die Menge von Purinverbindungen wurde durch die Absorbtion bei 260 nm bestimmt.
Bekannte Konzentrationen von 3 Purinbasentypen (Adenin, Guanin und Xanthin) und 3 Purinnukleosidtypen (Adenosin, Guanosin und Inosin) wurden im Voraus als Bezugsproben analysiert, gefolgt von der Bestimmung Retensionszeit und des Peakoberflächenbereichs für jede Purinverbindung. Die Indentifikation jeder Purinverbindung in den eigentlichen Proben wurde basierend auf der Retensionszeit jedes Peaks bestimmt, während die Konzentration über eine Eichkurve bestimmt wurde, die aus den Peakoberflächenbereichen der bekannten Konzentrationen der Bezugsproben ermittelt wurde. Da überdies 3 Purinnukleotidtypen (Adenylinsäure, Guanylinsäure und Inosininsäure), viel schneller unter diesen analytischen Bedingungen eluieren, wechselwirken sie nicht mit der Analyse der oben genannten 6 Typen von Purinverbindungen.
Die analytischen Ergebnisse für 7 Biertypen und 2 Weintypen, alle kommerziell erhältlich, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Gesamtmenge von Purinen, wie die Summe aus Purinbasen und Purinnukleosiden anzeigt, die in eine Purinbasenmenge konvertiert wurden, war 40 bis 100 mg/Liter, auch wenn sie entsprechend dem Biertyp variiert. Die Mehrheit der Purinverbindungen war außerdem in der Nukleosidform.
Weine, die auch fermentierte alkoholische Getränke in der selben Weise wie Bier sind, zeigten einen hohen Puringehalt von 60 mg/Liter für Rotwein und einen niedrigeren Wert von 20 mg/Liter für Weißwein. Tabelle 1
Wenn ferner die Purinnukleotide im Bier und der Stammwürze mit einer Ionenaustauschersäule analysiert wurden, waren keine Purinnukleotide im Bier oder der Stammwürze vorhanden. Außerdem, wenn das Bier und die Stammwürze sogar durch Säurehydrolyse analysiert wurden, da es keine Änderung in der Gesamtmenge der Purinverbindungen vor und nach der Säurehydrolyse gab, wurde angenommen, dass hochmolekulargewichtige Nukleinsäuren wie RNA und DNA nicht im Bier oder Stammwürze vorhanden waren.

Experiment 2. Verbrauch von Purinverbindungen im Bierherstellungsverfahren

Die Purinverbindungenverbrauch im Bierproduktionsverfahren wurde in einem Versuchsgebräu in einem 70liter Umfang untersucht. Die Konzentration des ursprünglichen Extrakts war 12,5%, die zugegebene Hefemenge war 5 g Nassgewicht/Liter und die Fermentationstemperatur 11,5ºC. Die Hefe, die sich zu dem Punk, an dem der Extakt 2,5% (260 Stunden nach dem Start der Fermentation) erreichte, auf dem Boden des Fermenters abgesetzt hat, wurde entfernt, die Temperatur wurde auf 0ºC erniedrigt und es wurde eine Lagerung für weitere 300 Stunden vorgenommen.
Diese Ergebnisse sind in Fig. 1 aufgeführt. Die Gesamtmenge von Adenosin, Guanosin und Inosin wurde als die Purinnukleosidmenge und die Gesamtmenge von Adenin, Guanin und Xanthin wurde als die Purinbasenmenge aufgeführt. Obwohl die Purinbasen in der Stammwürze mit etwa 70 mg/Liter vorhanden waren, nahm die Menge in der anfänglichen Phase der Fermentation auf 10 mg/Liter ab und stieg nicht nach dieser Zeit, während der Fermentation und der Lagerung, an. Auf der anderen Seite war eine große Menge von Purinnukleosiden in der Stammwürze mit etwa 90 mg/Liter vorhanden und diese Menge veränderte sich nicht während der Fermentation und der Lagerung.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Purinbasen, die in normaler Stammwürze enthalten sind, durch Hefe aufgenommen und metabolisiert werden und im wesentlichen in der Hefewachstumsphase in der anfänglichen Phase der Fermentation verschwinden.

Beispiel 1. Zersetzung der Purinbasen durch eine Nukleosidphosphorylase

Eine Nukleosidphosphorylase, gewonnen aus Kalbsmilz (Boehringer), wurde zur Stammwürze, die eine Extraktkonzentration von 12,5% hat, auf eine Konzentration von 7 Einheiten/ml zugegeben und für 3 Stunden bei 30ºC erlaubt zu reagieren. Die Menge der Purinverbindungen in Stammwürze, zu welcher das Enzym zugegeben wurde, und einer Stammwürze als Kontrolle, die für 3 Stunden bei 30ºC ohne Enzymzugabe gehalten wurde, wurde unter Verwendung der in Experiment 1 beschriebenen Methode, gemessen.
Wie in Fig. 2 dargestellt nehmen die Mengen aller Purinnukleoside Adenosin, Guanosin und Inosin in der Stammwürze, die Enzym enthält, in Vergleich zu der Stammwürze, zu welcher kein Enzym zugegeben wurde, ab und die Mengen der Purinbasen Adenin Guanin und Xanthin nehmen dementsprechend zu. Ferner war das Zersetzungsverhältnis jedes Purinnukleosids grob 60%.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Nukleosidphosphorylase gewonnen aus Kalbsmilz wirksam im Zersetzen von Purinnukleosiden in der Stammwürze ist. Entsprechend den Ergebnissen von Experiment 2, da die Purinbasen während der Hefewachstumsphase in der anfänglichen Fermentation von der Hefe aufgenommen und metabolisiert werden, werden die Purinbasen, die durch die Zersetzung der Purinnukleoside mit der Nukleosidphosphorylase erhalten wurden, auch von der Hefe während der Fermentation aufgenommen und metabolisiert. Folglich zeigen diese Ergebnisse, dass, wenn Bier unter Verwendung der mit diesem Enzym behandelten Stammwürze hergestellt wird, der Purinnukleosidgehalt des Biers um grob 60% reduziert werden kann.
Überdies kann, da das Bier aufgeführt in Experiment 2 90 mg/Liter Purinnukleoside und 10 mg/Liter Purinbasen enthält, der Purinnukleosidgehalt von dem Bier durch die Behandlung der Stammwürze mit diesem Enzym auf die Hälfte reduziert werden.

Beispiel 2. Überprüfung der Eignung von Nukleosidase in dem Stammwürzeproduktionsverfahren verwendet werden zu können

Die Nukleosidase von Schimmelpilzen, Bakterien und Hefe wurde unter Verwendung der unten beschriebenen Prozedur überprüft.
Jeder Stamm wurde unter Verwendung der unten aufgelisteten Medien und Kultivierungsbedingunngen kultiviert und kollektiert. Nach der Suspendierung der Zellen in 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,4 wurden die Zellen durch Ultraschallhomogenisation (Schimmelpilze wurden mit Meersand in einem Mörser zerrieben) homogenisiert und die Verunreinigungen wurden durch Zentrifugation entfernt, um die rohe Enzymflüssigkeit zu erhalten. Das Enzym wurde bei 60ºC und 70ºC in 100 mM Natriumacetatpuffer mit pH 4,5 in der Anwesenheit von Substrat, das aus 5 mM Inosin, Adenosin oder Guanosin bestand, zur Reaktion gebracht. Die resultierende Lösung wurde auf ein Silicageldünnschichtplatte aufgebracht, nach welcher eine Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Entwicklungslösung, die aus normalen Buthanol, Essigsäure und Wasser in dem Verhältnis von 3 : 1 : 1 bestand, durchgeführt. Der Zersetzungsgrad der Nukleoside wurde basierend auf der Größe des Nukleosidsspots und dem entsprechendem Purinbasenspot untersucht. Die Ergebnisse für Mikroorganismen, die eine hohe Aktivität aufzeigen, sind in Tabelle 2 gezeigt.

Medienzusammensetzung und Kultivierungbedingungen

1) Schimmelpilze

Malzexrakt 5% 28ºC, 3-5 Tage
Hefeextrakt 0,3% Schüttelkultur
pH 5,5

2) Bakterien (ausgenommen Milchsäurebakterien)

Tryptone 0,5% 28ºC, 2-4 Tage
Hefeextrakt 0,5% Schüttelkultur
Glukose 0,1%
Dikaliumphosphat 0,1%
pH 7,0

3) Milchsäurebakterien

Peptone 1% 28ºC, 4-7 Tage
Rindsextrakt 1% stille Kultur
Hefeextrakt 0,5%
Glukose 2%
Span 80 0,1%
Ammoniumcitrat 0,2%
Natriumacetat 0,5%
Magnesiumsulfat-7 hydrat 0,01%
Mananchlorid-4 hydrat 0,005%
Dikaliumphosphat 0,2%
pH 6,5

4) Hefe

Hefeextrakt 0,2% 28ºC, 2-4 Tage
Peptone 0,5% Schüttelkultur
Glukose 5%
Dikaliumphosphat 0,4%
Monokaliumphosphat 0,2%
Magnesiumsulfat-7 hydrat 0,02%
pH 6,0 Tabelle 2

Beispiel 3. Eigenschaften der Nukleosidase

Unter oben gewonnen Mikroorganismen produziert das Bakterium Ochrobaktrum anthropi eine Nukleosidase, die eine hohe Aktivität hat und in der Lage ist Inosin, Adenosin und Guanosin bei 60ºC und Inosin und Guanosin bei 70ºC zu zersetzen. Die rohe Enzymflüssigkeit von Ochrobaktrum anthropi wurde gegen 50 mM MES-Puffer mit pH 6,0 dialysiert und nach dem Entfernen der niedermolekularen Substanzen aus der rohen Enzymflüssigkeit, wurden die Eigenschaften der Nukleosidase im Detail untersucht.

Methode zum Aktivitätsnachweis unter Verwendung von Insosin

Es wurden 195 ul eines 25 mM geeigneten Puffers (Natriumacetatpuffer pH 4,5-5,0, Tris-HCl-Puffer pH 7,0-9,5, MES-Puffer pH 5,5-6,5) und 5 mM Inosinlösung im Voraus bei Zimmertemperatur inkubiert. Um die Reaktion zu starten wurden 5 ul der Enzymlösung zugegeben. Zehn Minuten später wurden 200 ul 0,2 N Salzsäurelösung zugegeben um die Reaktion zu stoppen und das denaturierte Protein wurde durch Zentrifugation entfernt. Es wurden 100 ul des Überstands, 100 ul 0,1 N Natriumhydroxidlösung, 50 ul 1 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 und 345 ul Wasser gemischt und die Absorbtion bei 293 nm gemessen. Dieses wurden als Kontrolle verwendet. Außerdem wurden 5 ul (5 mU) Xanthinoxidase zugegeben und gemischt und die Absorbtion wurde, als der Anstieg in der Absorbtion bei 293 nm stoppte, gemessen. Die Einheit U, die für die Nukleosidaseaktivität verwendet wurde, repräsentiert die Menge an Enzym, die 1 umol Nukleoside in einem in 1 Minute hydrolysiert. Die Aktivität (U/ml) der Nukleosidase der Enzymflüssigkeit wurde nach 3,33 · ΔA293 bestimmt. Ferner bezieht sich ΔA293 auf den Wert, der sich aus der Subtraktion der Absorbtionskontrolle von der Absorbtion von der, wo Xanthinoxidase zugegeben worden ist, ergibt.

Methode zum Aktivitätsnachweis durch Quantifikation der Zuckerreduzierung

Es wurden 195 ul 25 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 und 5 mM Nukleosidlösung im Voraus bei jeder Temperatur inkubiert. Um die Reaktion zu starten, wurden 5 ul der Enzymlösung zugegeben. Zehn Minuten später wurden 200 ul 0,1 N Zinksulfatlösung zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Außerdem wurden 200 ul 0,1 N Natriumhydroxidlösung zugegeben, gefolgt von Zentrifugation, um das Protein zu entfernen. 200 ul des Überstands, 300 ul 4% Natriumcarbonat, 1,6% Glycin und 0,045% Kupfersulfat-5 hydratlösung, 0,9 ml 0,04% 2,9- Dimethyl-1,10-phenanthrolin und 200 ul Wasser wurden gemischt gefolgt von 8 Minuten Inkubation bei 95ºC. Die Absorbtion wurde bei 450 nm gemessen. Eine Eichkurve wurde unter Verwendung einer Riboselösung bekannter Konzentration aus der Absorbtion bei 450 nm vorbereitet, nachdem eine ähnliche Behandlung durchgeführt wurde, und es wurde die Ribosekonzentration der Enzymreaktionsflüssigkeit kalkuliert. Die Aktivtät der Nukleosidase der Enzymflüssigkeit (U/ml) wurde nach der Ribosekonzentration (uM) · 0,004 bestimmt.

(1) Temperaturoptimum

Temperaturoptimum: 50-80ºC. Die Aktivität ist in Fig. 3 gezeigt, wenn das Enzyms für 10 Minuten bei jeder Temperatur und pH 5,0 unter Verwendung von Inosin als Substrat erlaubt war zu reagieren. Obwohl die Aktivität bei 60ºC am höchsten war und auf etwa 80% des Maximums bei 70ºC abnahm, blieb die Aktivität sogar bei 80ºC unverändert.

(2) pH-Optimum

pH-Optimum: 4,5-6,5. Die Aktivität ist in Fig. 4 gezeigt, wenn das Enzyms für 10 Minuten bei 70ºC bei jedem pH unter Verwendung von Inosin als Substrat erlaubt war zu reagieren. Eine Spitzenaktivität wurden bei pH 5,0 und 6,0 beobachtet.

(3) Hitzeresistenz

Nachdem jedes mal bei 70ºC inkubiert wurde, wurden 50 mM Natriumacetatpuffer und ein gleiches Volumen einer 10 mM Inosinlösung zugegeben und für 10 Minuten bei 70ºC erlaubt zu reagieren. Die Aktivität ist in Fig. 5 gezeigt. Außerdem ist die Aktivität, wenn die Reaktion für 10 Minuten bei 40ºC erlaubt war zu reagieren, in Fig. 6 gezeigt. Im Fall der Reaktion bei 70ºC bei einer Hitzebehandlung für 10 Minuten, hat die Aktivität, obwohl sie auf etwa 70% abnahm, nach dieser Zeit kaum noch abgenommen. In dem Fall der Reaktion bei 40ºC bei einer Hitzbehandlung für 10 Minuten, hat die Aktivität, obwohl sie auf etwa 25% abnahm, nach dieser Zeit kaum noch abgenommen.
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse von (1) bis (3) wird erwartet, dass Ochrobactrum anthropi wenigstens 2 Nukleosidasetypen hat, die verschiedene Temperaturoptima, pH-Optima und Hitzeresistenzen haben.

(4) Substratspezifität

Die Substratspezifität für Inosin, Adenosin und Guanosin wurde bei 60ºC und 70ºC und bei pH 5,0 durch Quantifizierung der Zuckerreduktion, wie in Fig. 7 gezeigt, untersucht. Als ein Ergebnis der Aktivität für Adenosin, das bei 70ºC vollständig verschwindet, wurde aus der Aubstratspezifität ebenso vorhergesagt, dass es wenigsten zwei Nukleosidasetypen gibt, bestehend aus einer, die in der Lage ist Adenosin zu zersetzen und einer, die unfähig ist Adenosin zu zersetzen.

(5) Hitzeinaktivierung

Um zu untersuchen, ob das vorliegende Enzym durch Kochen der Stammwürze inaktiviert wird oder nicht, wurde die Aktivität bei 60ºC unter Verwendung von Inosin als Substrat untersucht, nachdem jedes mal bei 100ºC inkubiert worden war. Diese Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Die Aktivität verschwand vollständig, wenn für 10 Minuten bei 100ºC inkubiert wurde. Da die Aktivität, die sich aus einer Nukleosidase, die in der Lage ist Inosin zu zersetzen, und einer Nukleosidase, die unfähig ist Inosin bei 60ºC zu zersetzen, zusammensetzt, können beide Enzyme leicht durch Kochen inaktiviert werden.
Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse wurde gefunden, dass das vorliegende Enzym eine ausreichende Aktivität in der Umgebung vom pH 5,0, dem pH der Stammwürze, hat und die Fähigkeit Adenosin bei 60ºC und Inosin und Guanosin bei der hohen Temperatur von 80ºC zu zersetzen. Außerdem, da das Enzym vollständig durch kochen inaktiviert wird, ändert das aktive Enzym nicht direkt, nach dem Siedeschritt in dem normalen Bierherstellungsverfahren, die Qualität des vollendeten Biers.

Beispiel 4. Herstellung von nukleosidzersetzem Gerstenmalz

Die Zeit-Temperaturkurve des Vorbereitungskessels und des Vorbereitungstanks in dem Stammwürzeherstellungsverfahren sind in Fig. 9 gezeigt. Außerdem sind die Mischverhältnisse der Rohmaterialien von dem Vorbereitungskessel und dem Vorbereitungstank in Tabelle 3 aufgeführt. In diesem Herstellungsverfahren werden etwa 20000 U der Nukleosidase von Ochobactrum anthropi teilweise durch Hitzebehandlung, Aussalzung, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und so fort teilweise gereinigt und mit dem pulverisiertem Malz zugegeben, um die Stammwürze zu produzieren. Die Ergebnisse der Analyse der Purine, die in der Stammwürze enthalten sind, hergestellt durch die Zugabe des Enzyms, und die Analyse einer Stammwürze, die ohne Zugabe des Enzyms hergestellt wurde, sind in Fig. 10 gezeigt. Es wurden keine Purinnukleoside in der Stammwürze, die Enzym enthält, nachgewiesen und die Menge der Purinbasen nahm zu. Für die nukleosidzersetze Stammwürze wird auf diese Stammwürze verwiesen. Tabelle 3

Beispiel 5. Bierbrauen unter Verwendung nukleosidzersetzter Stammwürze

Es wurde Bier unter Verwendung nukleosidzersetzter Stammwürze in Darstellung 4 und normaler Stammwürze gebraut. Es wurden 10,5 g Bierhefe in Nassgewicht in 2 Litern Stammwürze suspendiert und für 8 Tage bei 12ºC fermentiert. Die Suspension wurde dann für 5 Tage bei 4ºC gelagert. Der Purinverbrauch während dieser Fermentation ist in Fig. 11 gezeigt. Am Ende der Fermentationsperiode war Adenosin vollständig assimiliert und die Menge von Guanin in dem Ferment nahm mit der Zeit ab und es wurde bei Abschluss der Fermentation nicht nachgewiesen.
Das Gleichgewicht des Guaninequivalents von grob 90 uM wurde durch die Hefe assimiliert. Folglich wurden Purine entsprechend einer Gesamtmenge von 260 uM in der Stammwürze in dem Fermentationsprozess verbraucht. Die Gesamtenge der Purine von Bier, das unter Verwendung von Stammwürze, die ohne Enzymbehandlung hergestellt wurde, war 500 uM. Da die Gesamtmenge von Purinen in Bier, das unter Verwendung von enzymbehandelter Stammwürze gebraut wurde, 180 uM war, war es möglich ein Bier herzustellen, in welchem die Menge von Purinen durch insgesamt 320 uM reduziert wurde. Die Fermentation war praktisch nicht unterschiedlich von der, die gewöhnliche Stammwürze verwendet, sowohl im Bezug auf das Hefewachstum und den Extraktkonsum als auch, dass es ebenso keine großen Unterschiede in Bezug auf dem Geschmack gab.

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung erlaubt das Erhalten von einem Bier, in welchen der Purinverbindungsgehalt in dem Bier reduziert ist, indem die Purinbasen durch Hefe in dem Fermentationsprozess metabolisiert werden, als ein Ergebnis von der Bierherstellung aus Stammwürze, nachdem eine Stammwürze erhalten worden ist, in welcher unter diesen Purinverbindungen, die aus den Rohmaterialien stammen, die Purinnukleoside in die besagten Purinbasen zersetzt wurden, so dass die besagten Purinnukleoside im wesentlichen nicht vorhanden sind, indem dem Enzym der vorliegenden Erfindung erlaubt wird auf die besagte Stammwürze in dem Bierherstellungsverfahren einzuwirken. Bier, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, ist fähig das Risiko der Mortalität durch Hyperuricemie, Gicht und so weiter zu reduzieren.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung ist in dem Bierherstellungsverfahren in der Lage auf die Stammwürze einzuwirken, ohne dieses Herstellungsverfahren zu verändern. Insbesondere wenn dem Enzym der vorliegenden Erfindung erlaubt wird in dem Stammwürzeproduktionsverfahren zu wirken, da die Temperatur und der pH in einem normalen Stammwürzeproduktionsverfahren (Saccharifikation) innerhalb des optimalen Spektrums des Enzyms sind, ist das Enzym in der Lage effektiv zu wirken und das besagte Enzym ist fähig auf die besagte Stammwürze innerhalb der für das Stammwürzeproduktionsverfahren benötigten Zeit zu wirken. Da außerdem das Enzym in dem Siedeprozess der Stammwürze deaktiviert werden kann, der direkt im Anschluss an das Stammwürzeproduktionsverfahren ist, dem ersten Schritt des Bierherstellungsverfahrens, kann das Enzym veranlasst werden einfacher und ökonomischer zu wirken. Außerdem in dem Fall, dass dem Enzym erlaubt wird auf die Stammwürze entweder direkt vor der Fermentation oder während der Fermentation einzuwirken, kann das Enzym auch, falls das Herstellungsverfahren einen Schritt zur Hitzebehandlung umfasst, nach dem Fermentationsprozess deaktiviert werden.
Überdies zeigt das resultierende Bier keine großen Unterschiede in Bezug auf den Geschmack von gewöhnlich vollendetem Bier auf, und es ist möglich ein Bier zu erhalten, dass als ein vollendetes Bierprodukt anklang findet.
Informationen zu dem Mikroorganismus, der in Übereinkunft mit dem der Regulation 13(2) der Regulations and Depository Authority
The Institut for Bioscience and Human-Technology
Agency of Industrial Science and Technology
Adresse: 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Präfektur Japan
Hinterlegungsnummer und Hinterlegungsdatum:
FERM BP-5377 26. Januar 1996

Claims

1) Verfahren zur Herstellung von Bier dadurch gekennzeichnet, dass einer Nukleosidphosphorylase und/oder einer Nucleosidase erlaubt wird auf die Stammwürze einzuwirken.

2) Verfahren zur Herstellung von Bier dadurch gekennzeichnet, dass eine nukleosidzersetzte Stammwürze verwendet wird, dadurch erhalten, dass eine Nukleosidphosphorylase und/oder einer Nucleosidase veranlasst werden auf die Stammwürze einzuwirken und die Purinnukleoside, die in der Stammwürze enthalten sind, in Purinbasen zu zersetzen.

3) Verfahren nach Anspruch 2 worin die besagte nukleosidzersetzte Stammwürze keine Purinnukleoside enthält.

4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 worin die besagte Nucleosidase eine Nukleosidase ist, die aus einem Mikroorganismus gewonnen wird, der die Fähigkeit hat eine Nukleosidase herzustellen, ausgewählt aus der Gruppe, die sich aus den Gattungen Ochrobactrum, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Escherichia, Citrobacter, Serratia, Alcaligenes, Flavobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Arthrobacter, Comamonas, Pseudomonas, Kluyveromyces, Saccharomyces, Debaryomyces, Pichia, Hansenula, Sporobolomyces, Sporidiobolus, Aspergillus und Pencillium zusammensetzt.

5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 worin das optimale pH-Spektrum und das optimale Temperaturspektrum der besagten Nukleosidphosphorylase oder Nukleosidase 4,5-6,5 beziehungsweise 50ºC- 80ºC ist.

6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 worin eine Nukleosidphosphorylase und/oder Nukleosidase vor oder während der Fermentierung zu der Stammwürze zugegeben wird.

7) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 worin eine Nukleosidphosphorylase und/oder Nukleosidase während des Stammwürzeproduktionsvorgangs auf die Stammwürze einwirkt.

8) Verfahren zur Herstellung von Stammwürze, dadurch gekennzeichnet, dass einer Nukleosidphosphorylase und/oder einer Nucleosidase erlaubt wird auf die Stammwürze einzuwirken.

9) Verfahren nach Anspruch 8, worin die Purinnukleoside, die in der Stammwürze enthalten sind, in Purinbasen zersetzt werden um eine nukleosidzersetzte Stammwürze zu erhalten.

10) Verfahren nach Anspruch 9 worin die besagte nukleosidzersetzte Stammwürze keine Purinnukleoside enthält.

11) Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 worin die besagte Nucleosidase eine Nukleosidase ist, die aus einem Mikroorganismus gewonnen wird, der die Fähigkeit hat eine Nukleosidase herzustellen, ausgewählt aus der Gruppe, die sich aus den Gattungen Ochrobactrum, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Escherichia, Citrobacter, Serratia, Alcaligenes, Flavobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Arthrobacter, Comamonas, Pseudomonas, Kluyveromyces, Saccharomyces, Debaryomyces, Pichia, Hansenula, Sporobolomyces, Sporidiobolus, Aspergillus und Pencillium zusammensetzt.

12) Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11 worin das optimale pH-Spektrum und das optimale Temperaturspektrum der besagten Nukleosidphosphorylase oder Nukleosidase 4,5-6,5 beziehungsweise 50ºC- 80ºC ist.