DE68920659T2 - Nukleosidoxidase und analytisches verfahren. - Google Patents

Nukleosidoxidase und analytisches verfahren.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Enzym zur Katalyse der Oxidationsreaktion von Nucleosiden; und insbesondere auf eine neue Nucleosidoxidase YT-1, die bewirkt, daß ein Nucleosid unter Bildung von Nucleosid-5'-carbonsäure über Nucleosid-5'-aldehyd ohne Bildung von Wasserstoffperoxid als Nebenprodukt mit molekularem Sauerstoff reagiert; auf ein Verfahren zur Produktion des Enzyms, auf einen neuen Mikroorganismus, der fähig ist, das Enzym zu produzieren; und auf ein neues Untersuchungsverfahren unter Verwendung des Enzyms.
    • STAND DER TECHNIK
  • Bekannte, auf Nucleoside wirkende Enzyme umfassen solche, die deren Hydrolyse oder Desaminierung bewirken, und Enzyme (Nucleosidoxidasen) zur Katalyse der Oxidationsreaktion der Nucleoside, die durch die folgenden Gleichungen dargestellt wird:
  • Nucleosidoxidase wird normalerweise aus Mikroorganismen isoliert, typischerweise z.B. aus Pseudomonas putida; die gereinigte Oxidase wird zur Herstellung von Nucleosid-5'- carbonsäuren, zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von Nucleosiden und in Systemen zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen oder dergleichen, bei denen ein Nucleosid produziert wird oder seine Menge durch eine Reaktion abnimmt, eingesetzt.
  • In dem Oxidationsreaktions-System, in dem die Oxidase verwendet wird, wird unvermeidlich H&sub2;O&sub2; produziert, so daß das resultierende H&sub2;O&sub2; bei der Herstellung von Nucleosid-5'- carbonsäure durch Zusatz von Katalase zu dem Reaktionssystem zersetzt werden muß. Wenn aber die im Reaktionssystem produzierte H&sub2;O&sub2;-Menge zur quantitativen Bestimmung des Nucleosids gemessen wird, hat das Verfahren den Nachteil, daß Peroxidase eingesetzt werden muß. Das Verfahren weist ferner den Nachteil auf, daß z.B. ein kompliziertes Bestimmungssystem erforderlich ist (siehe z.B. die ungeprüften japanischen Patentveröffentlichungen Sho 57-58883, Sho 57-68794 und Sho 57- 94300).
  • Wir haben ausgedehnte Untersuchungen mit Nucleosidoxidasen, die z.B. von Mikroorganismen stammen, durchgeführt und herausgefunden, daß ein Stamm der Gattung Pseudomonas, der neu aus Erde isoliert worden ist, die Fähigkeit zur Produktion eines Enzyms hat, welches eine Oxidationsreaktion katalysiert, die sich von der, die die Aktivität herkömmlicher Nucleosidoxidasen involviert, unterscheidet. Wir hatten auch Erfolg bei der Isolierung und Reinigung des Enzyms, bei der Klärung seiner Charakteristika und bei der Entwicklung neuer Untersuchungs- oder Bestimmungsverfahren, die das Enzym verwenden. So ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Enzym zur Katalyse einer Oxidationsreaktion eines Nucleosids bereit, d.h. eine neue Nucleosidoxidase YT-1, die dadurch charakterisiert wird, daß die Oxidase bewirkt, daß das Nucleosid mit molekularem Sauerstoff unter Bildung von Nucleosid-5'-carbonsäure via Nucleosid-5'-aldehyd ohne Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert; ein Verfahren zur Produktion des Enzyms; einen neuen Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Produktion des Enzyms besitzt; sowie ein Verfahren zur Untersuchung eines Systems zur Herstellungs eines Neucleosids oder eines Systems, das ein Nucleosid enthält, indem die Nucleosidoxidase YT-1 auf eine Mischung aus dem System und aus einem chromogenen Reagenz, das bei Oxidation einen Farbstoff bildet, wirken gelassen wird und indem der Grad der Farbbildung durch das chromogene Reagenz, der zu der Nucleosidmenge im System proportional ist, gemessen wird; bereit.
  • Die Oxidationsreaktion des Nucleosids, die durch das erfindungsgemäße Enzym katalysiert wird, ist durch die unten angegebenen Gleichungen (1) und (2) dargestellt und unterscheidet sich stark von den bekannten Oxidationsreaktionen, die durch die Nucleosidoxidasen verursacht werden. Natürlich ist keine Nucleosidoxidase bekannt, die die durch Gleichungen (1) und (2) dargestellte Reaktion katalysiert.
  • Die Nucleosidoxidase YT-1 der vorliegenden Erfindung verursacht die Oxidationsreaktion des Nucleosids nach den obigen Gleichungen und zeigt zur gleichen Zeit entsprechend der Menge des Nucleosids Lakkase-artige Aktivität; dies sind die einzigen Charakteristika des Enzyms. Das vorliegende Enzym unterscheidet sich auch in diesem Merkmal völlig von den herkömmlichen Nucleosidoxidasen. Mit dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren wird der Grad der Farbbildung beispielsweise als Extinktion unter Ausnutzung der Lakkase- artigen Aktivität, die dem Enzym eigen ist, gemessen. Eine derartige Untersuchung kann nicht unter Verwendung der herkömmlichen Nucleosidoxidase durchgeführt werden.
  • Im folgenden wird nun das erfindungsgemäße Verfahren zur Produktion des Enzyms, seine Charakteristika sowie das vorliegende Untersuchungsverfahren unter Verwendung desselben beschrieben.
  • Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von Stämmen, die zu der Gattung Pseudomonas gehören und zur Produktion des Enzyms fähig sind, produziert werden. Der das Enzym produzierende Stamm ist beispielsweise ein Stamm, der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung neu isoliert wurde und der die folgenden Charakteristika aufweist.
    • I. Mykologische Charakteristika (A) Morphologische Charakteristika
  • (1) Die Zellen sind stabförmig, 0,5 x 1,5 - 1,7 um groß.
  • (2) Freibeweglich mit polarer Geißel.
  • (3) Keine Sporenbildung.
  • (4) Negativ bei der Gram-Färbung.
    • (B) Feststellungen bei der Inkubation (1) Nähragar-Platte
  • Durchschnittliches Wachstum mit kreisförmigen Kolonien, die eine glatte gelbe Oberfläche haben.
    • (2) Nähragar-Schrägkultur
  • Durchschnittliches Wachstum mit einer glatten gelben Oberfläche.
    • (3) Nährbouillon-Kultur
  • Wachstum an der Oberfläche des Mediums.
    • (4) Gelatine-Stichkultur
  • Wachstum an der Oberfläche; verflüssigt Gelatine (Stratiform).
    • (C) Physiologische Charakteristika
  • (1) Reduktion von Nitrat negativ
  • (2) Denitrifikation negativ
  • (3) Produktion von Indol negativ
  • (4) Produktion von Hydrogensulfat negativ
  • (5) Hydrolyse von Stärke negativ
  • (6) Verwertung von Nitrat negativ
  • (7) Verwertung von Ammoniumsalz positiv
  • (8) Pigmentationen
  • Produziert kein fluoreszierendes Pigment, kein Pyocyanin und keine Xanthomonadine. Wahrscheinlich produziert es ein diffundierbares braunes Pigment auf Nähragar-Medium.
  • (9) Harnstoff negativ
  • (10) Oxidase negativ bis schwach positiv
  • (11) Katalase positiv
  • (12) Wachstumsbereich
  • Kein Wachstum bei pH 4,5. Kein Wachstum bei 4ºC oder 41ºC. Der Wachstums-pH liegt geeigneterweise im Bereich von 5 bis 8. Die optimale Temperatur ist 35ºC.
  • (13) Verhalten gegen Sauerstoff aerob
  • (14) O-F-Test (Hugh Leifson-Methode) oxidativ
  • (15) Säurebildung aus Zuckern
  • D-Glucose positiv
  • D-Fructose positiv
  • D-Maltose positiv
  • D-Galactose positiv
  • D-Xylose positiv
  • D-Mannit negativ
  • Saccharose negativ
  • Lactose positiv
  • (16) Zersetzung von Äsculin positiv
  • (17) Arginindihydrase negativ
  • (18) Lysindecarboxylase positiv
  • (19) Ornithindecarboxylase negativ
  • (20) Phenylalanindesaminase negativ
  • (21) Eigelb-Reaktion negativ
  • (22) Zersetzung von Tween 20 positiv
  • (23) Zersetzung von Tween 80 positiv
  • (24) Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat negativ
  • (25) Erforderliche Wachstumsfaktoren Erfordert Methionin oder Cystin.
  • Der vorliegende Stamm wurde in Bezug auf die vorstehend genannten Charakteristika taxonomisch entsprechend Bergery's Manual of Systematic Bacteriology (1984) untersucht; es wurde gefunden, daß er zu der Gattung Pseudomonas gehört, da der vorliegende Stamm (1) ein Gram-negativer Stab ist und keine Sporen bildet, (2) Katalase-positiv ist, (3) mit polarer Geißel freibeweglich ist, (4) Glucose durch Oxidation zersetzt und (5) auf normalen Agar-Medien bei einem pH von 7,0 schnell wächst. Ferner wurde festgestellt, daß der Stamm mit Pseudomonas maltophilia in folgenden Charaktistika identisch ist: (1) er benötigt Cystin oder Methionin zum Wachstum, (2) ist Arginindihydrolase-negativ, (3) akkumuliert kein Poly-β- hydroxybutyrat, (4) bildet gelbe Kolonien, (5) produziert keine Xanthomonadine und (6) hat eine schwache oder negative Oxidasereaktion.
  • Die vorstehend genannten Resultate veranlaßten uns, den vorliegenden Stamm als einen Stamm von Pseudomonas maltophilia zu identifizieren. Wir nannten den Stamm Pseudomonas maltophilia LB-86. Der Stamm wurde mit dieser Bezeichnung unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2252 im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, hinterlegt.
  • Die Nucleosidoxidase YT-1 der vorliegenden Erfindung kann durch Inkubieren der Mikroorganismen, die den Stamm LB-86 und Varianten davon umfassen, zu der Gattung Pseudomonas gehören und die Fähigkeit zur Produktion der Nucleosidoxidase YT-1 aufweisen, hergestellt werden.
  • Diese Mikroorganismen können in einem geeigneten nährstoffhaltigen Medium, das irgendeins der synthetischen Medien, halbsynthetischen Medien und natürlichen Medien sein kann, die im allgemeinen zum Inkubieren von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas verwendet werden und die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen, usw., enthalten, inkubiert werden. Beispiele für nützliche Kohlenstoffquellen sind Kohlenstoffverbindungen, die von dem Mikroorganismus assemiliert werden können, wie z.B. höhere Fettsäuren, ein Stärkeabbauprodukt (Dextrin), Maltose, Lactose, Glykose, Molassen und Fructose. Diese Kohlenstoffverbindungen können einzeln eingesetzt werden, oder aber es werden mindestens zwei von ihnen kombiniert. Beispiele für verwendbare Stickstoffquellen sind Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser und dergleichen. Beispiele für verwendbare anorganische Substanzen sind normales Salz, Phosphate, Sulfate und derartige anorganische Salze von Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium, Zink, Eisen und ähnlichen anorganischen Metallen. Solche anorganischen Substanzen können, falls erforderlich, in geeigneter Weise eingesetzt werden.
  • Der Mikroorganismus kann in einer Flüssigkeit oder einem Feststoff inkubiert werden. Es ist normalerweise wünschenswert, die Inkubation aerob unter Rühren zur Belüftung durchzuführen. Die Inkubationsbedingungen, wie z.B. der pH des Mediums, die Inkubationstemperatur und Inkubationszeit werden so gewählt, daß sie für das Wachstum des Mikroorganismus, der kultiviert werden soll, geeignet sind und daß das gewünschte Enzym in höchstmöglicher Ausbeute erhalten wird. Es ist z.B. angemessen, daß der pH des Mediums im Bereich von etwa 6 bis etwa 8 liegt, und daß die Inkubationstemperatur im Bereich von etwa 20 bis 35ºC liegt. Die festzulegende Inkubationszeit ist so, daß sie zu der höchsten Akkumulation des hergestellten gewünschten Enzyms führt. Normalerweise liegt sie im Bereich von etwa 12 bis 48 Stunden. Diese Inkubationsbedingungen sowie das Inkubationsverfahren können natürlich in geeigneter Weise in Übereinstimmung mit dem zu verwendenden Mikroorganismus und den äußeren Bedingungen für die Inkubation geändert werden.
  • Die so erhaltene Kultur enthält das gewünschte Enzym normalerweise in ihrer Zellfraktion angereichert. Das Enzym kann nach verschiedenen Verfahren, die herkömmlicherweise in Verfahren zur Herstellung von Enzymen oder dergleichen unter Verwendung von Mikroorganismen angewendet werden, gesammelt und gereinigt werden. Beispiele für verwendbare Mittel umfassen Mittel, bei denen die Löslichkeit in Lösungsmitteln ausgenutzt wird; Mittel, bei denen ein Unterschied in der Ionenbindungskraft ausgenützt wird; Mittel, bei denen ein Unterschied im Molekulargewicht ausgenützt wird; Mittel, die einen Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnützen; Mittel, die einen Unterschied in der Hydrophobizität ausnützen, usw. Diese Mittel können einzeln oder in geeigneter Kombination eingesetzt werden.
  • Das gewünschte Enzym wird durch das unten näher beschriebene Verfahren aus der Zellfraktion gesammelt. Feuchte Zellen werden beispielsweise durch Zentrifugieren oder durch ein ähnliches gebräuchliches Verfahren gesammelt und dann in einem Phosphatpuffer, Trispuffer oder dergleichen suspendiert. Die Suspension wird mit einer geeigneten Kombination von Zellbehandlungsverfahren, wie z.B. Ultraschall, einer French- Press-Behandlung und einer Lysozymbehandlung behandelt, um so eine Flüssigkeit zu erhalten, die das rohe Enzym enthält.
  • Die das rohe Enzym enthaltende Flüssigkeit wird nach einem üblichen Verfahren zum Erhalt eines gereinigten Enzymproduktes gereinigt. Zunächst wird ein Präzipitat aus der Flüssigkeit gewonnen, beispielsweise durch fraktionierte Präzipitation unter Verwendung von Ethanol, Aceton oder einem ähnlichen organischen Lösungsmittel, oder durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Aluminiumsulfat oder dergleichen. Das Präzipitat wird dann chromatographisch unter Verwendung von Ionenaustauschern, wie z.B. Diethylaminoethyldextran oder eines Gelfiltrationsagenzes, wie Polyacrylamidgel, behandelt. Das gereinigte Enzymprodukt kann außerdem einer Gefriertrocknung unterzogen werden, um ein gereinigtes Pulver zu erhalten.
  • Das so erhaltene erfindungsgemäße Enzym ist dadurch charakterisiert, daß es enzymatische Aktivität zur Katalyse der Oxidationsreaktion, die durch die vorstehenden Gleichungen (1) und (2) dargestellt wird, aufweist, und es wird außerdem durch die folgenden physikochemischen Eigenschaften charakterisiert.
    • (1) Substratspezifität
  • Aktiv bei Inosin und verschiedenen anderen Nucleosiden, aber nicht aktiv bei Basen, wie Hypoxanthin, bei Nucleotiden, wie z.B. Inosinsaure, Ribose, usw.
    • (2) Temperatur und pH-Stabilität
  • Behält eine Aktivität von mindestens 95%, wenn es bei pH 6,0, 60ºC für 15 Minuten behandelt wird, und wird bei einer 15-minütigen Behandlung bei 70ºC inaktiviert. Eine mindestens 95%-ige Aktivität bleibt erhalten, wenn es bei pH 5,0 bis 6,0 60 Minuten bei 37ºC behandelt wird.
    • (3) Optimaler pH
  • pH 5,0 bis 6,0.
    • (4) Molekulargewicht
  • Etwa 130.000, bestimmt durch Gelfiltration.
    • (5) Isoelektrischer Punkt
  • pH 5,3.
    • (6) Wirkung von Inhibitoren
  • Wird durch Kaliumcyanat und Natriumazid gehemmt.
    • (7) Absorption im sichtbaren Bereich
  • Kein Absorptionsmaximum über 450 nm in einem neutralen Puffer, wie z.B. Phosphatpuffer. Oxidiertes Enzym, das nicht mit Substrat, Nitrohydrogensulfit oder dergleichen reduziert ist, hat kein Absorptionsmaximum über 450 nm.
    • (8) Metallgehalt
  • Enthält Eisen.
  • Diese physikochemischen Eigenschaften und andere Eigenschaften werden in den noch folgenden Beispielen beschrieben.
  • Das erfindungsgemäße Enzym, Nucleosidoxidase YT-1, das die vorhergenannten Eigenschaften aufweist, kann in gleicher Weise wie herkömmliche Nucleosidoxidasen zur quantitativen Bestimmung von Nucleosiden verwendet werden. Genauer gesagt, das vorliegende Enzym oxidiert Nucleoside mit molekularem Sauerstoff, der als Elektronenakzeptor dient, und ist daher für die quantitative Bestimmung des Nucleosids durch Messung der Menge an verbrauchtem Sauerstoff verwendbar. Demnach ist das vorliegende Enzym auch zur Untersuchung von Enzymen geeignet, deren Substrate oder Reaktionsprodukte Nucleoside enthalten. So ist das Enzym beispielsweise zur Messung der 5'-Nucleotidase- Aktivität verwendbar. Darüberhinaus ist das Enzym zur Messung der Fischfrische verwendbar, indem die Nucleosidmenge in einem Extrakt des Fischmuskels gemessen wird. Das vorliegende Enzym ist auch beispielsweise zur Herstellung von Nucleosid-5'- carbonsäuren nützlich.
  • Das erfindungsgemäße Enzym hat insbesondere die einzigartige Eigenschaft, daß bei Durchführung der Oxidationsreaktion eines Nucleosids das Enzym eine Lakkase-artige Reaktion entsprechend der Menge des vorliegenden Nucleosids bewerkstelligt. Die Aktivität zur Durchführung der Lakkase-artigen Reaktion steht vollständig in Proportion zu der Nucleosidmenge. Entsprechend kann diese Eigenschaft zum Oxidieren typischer Lakkase- Substrate, wie z.B. Hydrochinon und auch zur Verknüpfung von 4- Aminoantipyrin mit Phenol oder Verbindungen des Anilin-Typs oder dergleichen zur Herstellung von Chinonimin, ebenso wie mit Lakkase aus Polyporous versicolor ausgenützt werden. Die Nucleosidmenge kann quantitativ bestimmt werden, indem die Menge des so hergestellten Pigments gemessen wird. Außerdem kann die anfängliche Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion zur Freisetzung eines Nucleosids unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms spektroskopisch genau und leicht gemessen werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein neues Verfahren zur Untersuchung flüssiger Proben bereit, das die einzigartige Lakkase-artige Aktivität des vorliegenden Enzyms ausnützt.
  • Das Untersuchungsverfahren wird nun im Detail beschrieben. Dieses Verfahren wird auf ein System angewendet, das ein Nucleosid enthält oder das zur Herstellung eines Nucleosids dient; es wird durchgeführt, indem die Nucleosidoxidase YT-1 auf ein Gemisch aus dem System und einem chromogenen Reagens zur Bildung einer Farbe bei Oxidation einwirken gelassen wird, und der Grad der Farbbildung durch das chromogene Reagens gemessen wird, wobei dieser Grad proportional zu der Nucleosidmenge im System ist.
  • Die flüssige Probe, die durch dieses Verfahren untersucht werden soll, kann irgendein System sein, das ein Nucleosid enthält, oder das der Herstellung eines freien Nucleosids dient (enzymatisches Reaktionssystem, das ein Nucleosid produziert oder freisetzt). Typische Beispiele für solche Proben werden unten angegeben:
  • (1) Flüssige Probe zur Messung der enzymatischen Aktivität, wobei 5'-Nucleotidase mit 5'-Inosinmonophosphat (IMP), 5'- Adenosinmonophosphat (AMP) oder einem ähnlichen 5'- Nucleotid umgesetzt wird, um Inosin, Adenosin oder ein ähnliches Nucleosid freizusetzen.
  • (2) Flüssige Probe zur Messung der enzymatischen Aktivität, wobei 3'-Nucleotidase mit 3'-IMP, 3'-AMP oder einem gleichartigen 3'-Nucleotid unter Freisetzung des Inosins, Adenosins oder eines gleichartigen Nucleosids umgesetzt wird.
  • (3) Flüssige Probe zur Messung der Frische von Fisch, Tierfleisch oder dergleichen, wobei eine Komponente des lebenden Körpers unter Produktion von Nucleosiden abgebaut wird oder Nucleoside enthält.
  • (4) Flüssige Probe zur Messung der Aktivität von Ribonuclease oder Deoxyribonuclease, wobei die Ribonuclease oder die Deoxyribonuclease mit RNA, DNA-Oligonucleotid oder dergleichen umgesetzt wird, und ferner Alkaliphosphatase oder dergleichen mit den resultierendem Nucleotid unter Freisetzung von Nucleosid reagiert.
  • (5) Flüssigprobenreagenz für Nucleoside, wie beispielsweise Adenosin, Desoxyuridin, Xanthosin, Thymidin, Uridin, Guanosin, Cytidin, Desoxyinosin und dergleichen.
  • (6) Flüssigproben zur Messung der Aktivität von Enzymen, beispielsweise Inosinase zur Hydrolyse von Nucleosiden als Substrate.
  • Exemplarisch für die Probe zur Messung der enzymatischen Aktivität (1), d.h. für ein Enzymreaktionssystem, das ein Nucleosid freisetzt, ist ein System, das menschliches Serum und ein Nucleotid enthält. Wenn das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren auf das System angewendet wird, wird die Aktivität von 5'-Nucleotidase im menschlichen Serum gemessen. Dieses Verfahren ist zur Untersuchung der Leberfunktion sehr nützlich. Die herkömmlichen Verfahren zur Messung der Aktivität von 5'-Nucleotidase im menschlichen Serum umfassen ein Verfahren, bei dem 5'-AMP zur Bestimmung des resultierenden freien Phosphors verwendet wird; ein enzymatisches Verfahren, das Adenosindesaminase oder Glutamindehydrogenase verwendet, wobei das Verfahren, in dem anorganischer Phosphor bestimmt wird, eine verlängerte Reaktionszeit, ein kompliziertes Vorgehen und Kompensation der Aktivität von Alkaliphosphatase, die gleichzeitig vorliegt, erfordert. Das enzymatische Verfahren weist die Nachteile auf, daß ein kompliziertes Meßsystem und eine etwa 30-minütige vorbereitende Reaktion vor Beginn der Reaktion erforderlich sind. Im Gegensatz dazu, kann das vorliegende Untersuchungsverfahren mit einer sehr einfachen Arbeitsweise mit höherer Empfindlichkeit als vorher möglich, üblicherweise in einer sehr kurzen Zeit, d.h. in etwa 2 bis 5 Minuten, durchgeführt werden, um die Messung der ins Auge gefaßten Aktivität von 5'-Nucleotidase im menschlichen Serum durchzuführen.
  • Die chromogenen Reagenzien, die bei Oxidation eine Farbe bilden, umfassen Reagenzien, die in Form einer einzelnen Verbindung vorliegen und die bei Oxidation eine Absorption im sichtbaren Bereich aufweisen; sowie solche, die jeweils als Kombination von mindestens zwei Verbindungen vorliegen und bei Oxidation eine Absorption im sichtbaren Bereich zeigen. Beispiele für verwendbare Einzelverbindungen sind verschiedene Lakkase-Substrate, wie z.B. o-Tolidin, o-Toluidin, o- Dianisidin, 10-N-Methylcarbamoyl-3,7-dimethylamino-10-H- phenothiazin, Bis-[3-bis(4-chlorphenyl)-methyl-4- dimethylaminophenyl]amin und ähnliche Substanzen des Anilin- Typs, usw. Beispielhaft für die Kombination von mindestens zwei Verbindungen ist die Kombination eines so genannten Kupplers und eines Trinders-Reagenz (Wasserstoffdonator), wie z.B. 4- Aminoantipyrin und Phenol, wie sie im allgemeinen in herkömmlicher Weise als klinische diagnostische Chemikalien eingesetzt werden. Beispiele für verwendbare Kuppler sind neben 4-Aminoantipyrin (4-AA), 2,6-Dibromaminophenol, 3- Methylbenzothiazolinon-hydrazon, usw. Beispiele für verwendbare Trinders-Reagenzien (Wasserstoffdonatoren) sind neben Phenol, β-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,6-Dichlorphenol, N,N- Dimethylanilin (DMA), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m- anisidin (ADOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-anilin (ALOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS), N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidin (ADPS), N-Ethyl-N- sulfopropylanilin (ALPS), N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5- dimethoxyanilin-Natriumsalz (DAPS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3- sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin-Natriumsalz (DAOS), N- Sulfopropyl-3,5-dimethoxyanilin (HDAPS), N-(2-Hydroxy-3- sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (HDAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy- 3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin (MAOS), N-Ethyl-N- sulfopropyl-3,5-dimethylanilin (MAPS), N-Ethyl-N-sulfopropyl-m- toluidin (TOPS), N²-Ethyl-N²-(3-methylphenyl)-N'- acetylethylendiamin (EMAE) und dergleichen.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wird das Enzym der Erfindung veranlaßt, auf ein Gemisch aus Probe und chromogenem Reagenz zu wirken. Dies kann üblicherweise so erfolgen, daß das chromogene Reagenz zu der Probe gegeben wird und daß ferner das Enzym der vorliegenden Erfindung zugesetzt wird; oder indem das Enzym der vorliegenden Erfindung dem chromogenen Reagenz zugesetzt wird und die Probe dann zugegeben wird; und danach das resultierende Gemisch für einen bestimmten Zeitraum bei einer spezifizierten Temperatur stehengelassen wird. Das Reagenz bildet dann aufgrund einer enzymatischen Reaktion eine Farbe. Nach dem obigen Verfahren wird die Probe in einer in geeigneter Weise verdünnten Form eingesetzt. Beispiele für verwendbare Verdünnungsmittel sind verschiedene Puffer, wie z.B. Phosphatpuffer und Trispuffer, Wasser, usw. Die Menge an Reagenz, die in dem Enzymreaktionssystem verwendet werden soll, ist nicht speziell limitiert, wird aber in geeigneter Weise bestimmt. Sie ist normalerweise so, daß die Konzentration des chromogenen Reagenzes im Reaktionssystem etwa 0,1 bis etwa 10 mM beträgt. Das vorliegene Enzym wird geeigneterweise in einer Menge von etwa 0,05 bis 10 Einheiten pro ml des Reaktionssystems verwendet, und die Probe wird in einer solchen Menge verwendet, daß die Konzentration des Nucleosids aus der Probe im Reaktionssystem im Bereich von etwa 0 bis nicht mehr als 0,2 mM liegt. Obgleich die Reaktionsbedingungen für das Enzymreaktionssystem nicht speziell limitiert sind, ist normalerweise eine Temperatur von etwa 20 bis 40ºC geeignet. Die Reaktionszeit kann in Übereinstimmung mit der Menge des vorliegenden Enzyms, der Reaktionstemperatur, dem pH usw. in geeigneter Weise bestimmt werden, und sie ist im allgemeinen sehr kurz. Die Reaktion ist innerhalb von etwa 20 Minuten beendet. Der pH des Reaktionssystems liegt üblicherweise im Bereich von 3 bis etwa 10; in diesem Bereich läuft die Reaktion zufriedenstellend ab. Im allgemeinen liegt der pH bevorzugt im Bereich von etwa 4 bis etwa 8.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Grad der Farbbildung, die in dem Enzymreaktionsgemisch erfolgte, gemessen, um die resultierende Änderung der Nucleosidmenge in der Probe zu bestimmen. Der Grad der Farbbildung kann nach dem üblichen Verfahren der spektroskopischen Messung der Absorption im sichtbaren Bereich des Pigments oder einer ähnlischen Substanz, die durch die Enzymreaktion produziert wird und die Absorption im sichtbaren Bereich aufweist, gemessen werden. In einem System, in dem 4-Aminoantipyrin und Phenol das Pigment Chinonimin produzieren, kann beispielsweise der Grad der Farbbildung durch Messung der Extinktion bei 500 nm mit einem Spektralphotometer bestimmt werden. Typische Beispiele für andere Systeme und Extinktionsmeßverfahren in diesen Systemen werden in den folgenden Beispielen im Detail beschrieben.
  • In dem Fall, wo die nach dem obigen erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchende Probe ein Enzymreaktionssystem ist, bei dem ein Nucleosid freigesetzt werden soll, z.B. eine Flüssigkeit, die Nucleotidase oder dergleichen enthält, wird die Reaktion, die durch das vorliegende Enzym zu bewerkstelligen ist, in der Zelle des Spektralphotometers durchgeführt, um das resultierende Ansteigen der Extinktion pro Zeiteinheit zu bestimmen, wodurch die enzymatische Aktivität der Nucleotidase oder dergleichen gemessen werden kann.
  • Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein neues Untersuchungsverfahren bereit, das das Enzym der Erfindung verwendet und das zur quantitativen Bestimmung von Nucleosiden und auch zur Messung der Aktivität von Enzymen in Systemen zur Herstellung oder Freisetzung von Nucleosiden sehr nützlich ist.
    • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele genauer beschrieben. Die Aktivität der Nucleosidoxidase wurde nach dem folgenden Verfahren gemessen.
    • VERFAHREN ZUR MESSUNG DER NUCLEOSIDOXIDASE-AKTIVITÄT
  • Eine 1 ml-Menge an 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 7 mM Inosin, wird in die Zelle einer Enzymelektrode gegeben, ferner werden 5 ul Enzymprobe dazugegeben, und die anfängliche Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wird bei 25ºC gemessen, indem die Verringerung der Menge an gelöstem Sauerstoff, die etwa 250 uM im gesättigten Zustand bei 25ºC ist, mit der Zeit unter Verwendung der Enzymelektrode gemessen wird. Der Verbrauch von 1 uM Sauerstoff pro Minute wird als 1 Einheit (U) festgelegt.
  • Die Zeichnungen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, zeigen folgendes:
  • Fig. 1 ist ein Diagramm, das das Ergebnis der Hochdruck- Flüssigkeits-Chromatographie zeigt, die für das Reaktionsprodukt, das durch Oxidation von Inosin als Substrat unter Verwendung des vorliegenden Enzyms erhalten worden war, durchgeführt wurde; dabei wurde das Resultat durch einen enzymatischen Aktivitätstest I gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten.
  • Fig. 2 ist ein Diagramm, das das durch den enzymatischen Aktivitätstest II gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Ergebnis zeigt, wobei Inosin als Substrat unter Verwendung des vorliegenden Enzyms in Gegenwart von Phenol und 4- Aminoantipyrin unter Bildung des Pigments Chinonimin oxidiert wurde; das Diagramm zeigt die Beziehung zwischen dem Grad der Farbbildung durch das Pigment und der Konzentration des Substrats.
  • Fig. 3 ist ein Diagramm, das das Ergebnis zeigt, das durch Untersuchung des vorliegenden Enzyms auf Temperaturstabilität erhalten wurde.
  • Fig. 4 ist ein Diagramm, das das Ergebnis zeigt, das durch Untersuchung des vorliegenden Enzyms hinsichtlich der pH- Stabilität erhalten wurde.
  • Fig. 5 ist ein Diagramm, das das Ergebnis zeigt, das durch Untersuchung des vorliegenden Enzyms hinsichtlich des optimalen pH erhalten wurde.
  • Fig. 6 ist ein Diagramm, das das Ergebnis der Spektralanalyse des vorliegenden Enzyms zeigt, die in 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) durchgeführt wurde.
  • Fig. 7 und 10 sind Diagramme, die jeweils die Beziehung zwischen der Nucleosidmenge in einer von verschiedenen Testproben und der gemessenen Extinktion zeigen, wobei die dargestellten Ergebnisse in den Beispielen 4 und 5 erhalten wurden.
  • Fig. 11 und 12 sind Diagramme, die die Relation zwischen der Nucleosidmenge in einer Probe und der gemessenen Extinktion zeigen, wie sie in den Beispielen 6 und 7 bestimmt wurde.
  • Fig. 13 ist ein Diagramm, das das Ergebnis zeigt, das durch Messung der Aktivität von 5'-Nucleotidase im menschlichen Serum gemäß Beispiel 12 erhalten wurde; und
  • Fig. 14 ist ein Diagramm, das das Meßergebnis nach Beispiel 10 darstellt (Beziehung zwischen der Menge an Inosin und der gemessenen Extinktion).
    • BEISPIEL 1
  • Eine Menge von 100 ml Bouillon-Medium (1% Fleischextrakt, 1% Pepton und 0,5% NaCl, im folgenden dieselbe Zusammensetzung), die sich in einem 500 ml-Sakaguchi-Kolben befand, wurde mit Pseudomonas maltophilia LB-86, FERM BP-2252, beimpft; anschließend wurde das Ganze unter Schütteln (110 UpM) bei 25ºC 12 Stunden lang inkubiert, wobei eine Kultur erhalten wurde.
  • Sechs Liter sterilisiertes Bouillon-Medium, das 0,07% Entschäumungsmittel "Adekanol" (Produkt von Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) enthielt, wurde in einen 10 Liter-Flaschenfermenter gegeben und mit der resultierenden Kultur in einer Menge von 2% beimpft. Die Kultur wurde für 12 Stunden bei einer Temperatur von 25ºC unter Schütteln bei 250 UpM bei einer Belüftungsrate von 6 Liter/Minute inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellen gesammelt, in 1 Liter Phosphatpuffer (pH 6,0) suspendiert und 15 Minuten lang unter Bedingungen von 20 kHz und 200 W mit Ultraschall behandelt, wodurch ein Zellextrakt erhalten wurde.
  • Der Extrakt hatte eine Nucleosidoxidase-Aktivität von 1,2 U/ml.
    • BEISPIEL 2
  • Eine Menge von 100 ml Bouillon-Medium, die sich in einem 500 ml-Sakaguchi-Kolben befand, wurde mit Pseudomonas maltophilia LB-86 beimpft, anschließend folgte eine 12-stündige Inkubation unter Schütteln (110 UpM) bei 25ºC, wobei eine Kultur erhalten wurde.
  • 100 ml sterilisiertes Hefeextrakt-Glucose-Medium (2,5% Hefeextrakt, 3% Glucose, 0,1% KCl, 0,1% KH&sub2;PO&sub4; und 0,05% MgSO&sub4;7H&sub2;O, pH 7,2), die sich in einem 500 ml-Sakaguchi-Kolben befand, wurde mit der resultierenden Kultur in einer Menge von 2% beimpft. Die Kultur wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 25ºC unter Schütteln bei 110 UpM inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellen gesammelt und in Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, in Kolben gefüllt, von denen jeder 30 ml Puffer enthielt. Die Suspension wurde danach unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 mit Ultraschall behandelt, wobei ein Zellextrakt erhalten wurde.
  • Der Extrakt hatte eine Nucleosidoxidase-Aktivität von 7,0 U/ml.
    • BEISPIEL 3
  • Zu 272 ml Zellextrakt, der in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 hergestellt worden war, wurden 60 ml 20%-iges Streptomycinsulfat gegeben, das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren entfernt, dann wurde Ammoniumsulfat zu dem Überstand bis zu einer Konzentration von 35% gegeben. Nach Entfernung des resultierenden Präzipitats wurde weiter Ammoniumsulfat dem Überstand zugesetzt, und zwar bis zu einer Konzentration von 60%. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei niedriger Temperatur stehengelassen, um ein Präzipitat zu bilden, welches dann gesammelt und in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) gelöst wurde. Die Lösung wurde 1 Tag lang in einem Dialysierschlauch dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine DEAE-Toyopearl 650 M-Säule (Produkt von Tosoh Co.), die mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) equilibriert war, aufgetragen, anschließend wurde mit demselben Puffer in einer Elution mit linearem Gradienten von 0 bis 0,5 M normales Salz gewaschen.
  • Die aktive Fraktion wurde mit einer Amicon-Membran (Produkt von Amicon) konzentriert, Fraktioniermolekulargewicht 20.000. Zur Gelfiltration wurde das Konzentrat auf eine Sephacryl S-200- Säule (Produkt von Pharmacia), die mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert war, aufgetragen. Die aktiven Eluatfraktionen wurden gesammelt, wieder mit einer Amicon-Membran konzentriert, Fraktioniermolekulargewicht 20.000, und dann einer Gelfiltration mit Sephacryl S-200 unterworfen.
  • Die aktiven Eluatfraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei gereinigte Nucleosidoxidase YT-1 erhalten wurde.
  • Durch Disk-Elektrophorese wurde festgestellt, daß das reine Produkt einheitlich war.
  • Tabelle 1 zeigt das Ergebnis der Reinigung. TABELLE 1 Spezifische Ausbeute Reinigungsschritte Ausbeute (ml) Aktivität Zellextrakt Ammoniumsulfatfraktion Dialysiert DEAE-Toyopearl Sephacryl S-200
  • Die gereinigte Probe der erfindungsgemäßen Nucleosidoxidase YT- 1, die in Beispiel 3 erhalten worden war, wurde hinsichtlich ihrer Eigenschaften untersucht, was im folgenden genauer beschrieben wird.
    • (1) Enzymatischer Aktivitätstest I 1) Nachweis des Oxidationsreaktionsprodukts
  • Zehn U der Enzymprobe, die in einer geeigneten Menge Wasser gelöst waren, wurden in einen Dialysierschlauch gegeben, welcher dann zur Reaktion in 100 ml 7 mM Inosin-Lösung gebracht wurde.
  • Während einer Reaktionszeit von 0 bis 800 Minuten wurde aus dem Reaktionsgemisch in geeigneten Zeitintervallen Proben entnommen und durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) mit einer Säule aus Fine SIL C&sub1;&sub8; (Produkt von Japan Sepctroscopic Co., Ltd.) unter Verwendung von 50 mM Phosphatpuffer (pH 3,0)/Methanol = 95/5 als Lösungsmittel bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/min untersucht. Die Absorption wurde bei 260 nm nachgewiesen.
  • Fig. 1 zeigt das während des spezifizierten Zeitraums erhaltene Ergebnis.
  • In dem Diagramm ist die Retentionszeit (Min.) als x-Achse, die Reaktionszeit (Inkubationszeit, Min.) als y-Achse und die Extinktion bei 260 nm als z-Achse aufgetragen.
  • Fig. 1 zeigt folgendes: die Menge an Inosin nimmt mit der Zeit ab und zwei Peaks (P-1 und P-2) erscheinen. Der Peak P-1 ist im Anfangsstadium der Reaktion vergrößert, nimmt dann ab und verschwindet danach. Der Peak P-2 bleibt eventuell allein zurück.
  • Wenn der Peak P-1 durch HPLC abgetrennt wurde und mit der Enzymprobe (Nucleosidoxidase) umgesetzt wurde, wurde festgestellt, daß der Peak unter Sauerstoffverbrauch in P-2 umgewandelt worden war. Andererseits zeigte P-2 bei Umsetzung mit der Enzymprobe keine Veränderung.
  • Das obige Ergebnis zeigt, daß die Enzymprobe der Erfindung bewirkt, daß Inosin unter Bildung von P-1 oxidiert wird und daß ferner P-1 zu P-2 oxidiert wird.
    • 2) Identifizierung des Reaktionsprodukts 2)-1 Herstellung von P-1 und P-2
  • Die Enzymprobe (100 U), die in einem Dialysierschlauch angepaßt war, wurde in 100 ml wäßrige Inosin-Lösung (2 mg/ml) gebracht, anschließend erfolgte eine Reaktion bei 37ºC über Nacht bei Rühren zur Belüftung, wobei P-2 hergestellt wurde. Nach Entfernung des Schlauchs wurde das Reaktionsgemisch mit Salzsäure auf einen pH von 3,0 eingestellt, die resultierenden Kristalle von P-2 wurden durch Zentrifugieren gesammelt, mit Salzsäure-Lösung (pH 3,0) gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei etwa 190 mg P-2-Kristalle erhalten wurden.
  • Die Enzymprobe (10 U), die sich in einem Dialysierschlauch befand, wurde in der gleichen Weise wie zur Herstellung von P-2 mit einer wäßrigen Lösung von Inosin umgesetzt. Dem Reaktionsgemisch wurde von Zeit zu Zeit Proben entnommen und durch HPLC analysiert. Wenn die Ansammlung von P-1 erhöht war (37ºC, etwa 30 Minuten), wurde der Enzym-enthaltende Schlauch zur Beendigung der Reaktion entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der HPLC unterworfen, um eine P-1-Fraktion abzutrennen, welche dann durch Gefriertrocknung gereinigt wurde, um so P-1-Pulver zu erhalten.
    • 2)-2 Identifizierung der Basenkomponente und des Zuckers von P- 1 und P-2
  • P-1, P-2 und Inosin wurden jeweils mit 1N Salzsäure bei 100ºC 1 Stunde lang hydrolysiert. Jedes erhaltene Gemisch wurde zur Identifizierung der Base und des Zuckers, die darin enthalten waren, analysiert.
  • Dünnschicht-Chromatographie und HPLC zeigten, daß die Basenkomponente jeder Testprobe dasselbe Verhalten wie das Standardprodukt Hypoxanthin aufwies. Demnach können die Basenkomponenten von P-1 und P-2 als Hypoxanthin identifiziert werden, welches auch die Base von Inosin ist.
  • Die Zuckeranalyse durch Dünnschicht-Chromatographie stellte D- Ribose aus dem Zersetzungsgemisch von Inosin fest, zeigte aber einen Fleck an einer von D-Ribose verschiedenen Position für die Abbaugemische von P-1 und P-2. Dies zeigt an, daß P-1 und P-2 den Zuckeranteil von Inosin in oxidierter Form enthalten.
    • 2)-3 Identifizierung von P-1
  • P-1 wurde mit dem 1,2-fachen Äquivalentgewicht von Natriumborhydrid reduziert. Bei Analyse durch Dünnschicht- Chromatographie und HPLC stimmte das Reduktionsprodukt mit dem Standardprodukt von Inosin im Verhalten überein. Dementsprechend wurde das durch Reduktion von P-1 mit Natriumborhydrid erhaltene Produkt als Inosin identifiziert. Die Struktur, welche zum Original-Inosin als Substrat reduziert werden kann, ist allein Inosin-5'-aldehyd. Dies wurde auch durch das NMR-Spektrum und das IR-Spektrum bewiesen. Nach diesen Resultaten wurde P-1 als Inosin-5'-aldehyd identifiziert.
    • 2)-4 Identifizierung von P-2
  • Es wurden das C¹³-NMR-Spektrum und das H¹-NMR-Spektrum einer Probe von P-2-Kristallen aufgenommen.
  • Für C¹³-NMR wurde eine Kupplung und Entkupplung durchgeführt. Für H¹-NMR wurde die Messung des Spektrums in Dimethylsulfoxid (DMSO-d&sub6;) vorgenommen, dann wurde demselben Lösungsmittel schweres Wasser (D&sub2;O) zugesetzt.
  • Tabelle 2 zeigt die bestimmten Signale hinsichtlich der chemischen Verschiebung, der Bindungskonstanten usw. Danach wurde P-2 als Inosin-5'-carbonsäure identifiziert. TABELLE 2 Chemische Verschiebung (ppm) Multiplizität Kupplungskonstante (Hz)
  • In der obigen Tabelle steht "s" für Singulett und "d" für Dublett.
    • 3) Stöchiometrie der Reaktion
  • Ein U der Enzymprobe wurde zu 1 ml 100 mM Phosphatpuffer, der 50 nM Inosin enthielt, gegeben. Die Menge des Sauerstoffverbrauchs wurde mit einer Sauerstoffelektrode, die Menge an produziertem P-2 aus der Peakfläche des HPLC und die Menge an Wasserstoffperoxid durch die Phenol-4- aminoantipyrinperoxidase-Methode und die Ferritthiocyanid- Methode bestimmt (Ronald Thurman et al., Eur. J. Biochem., 25, 420-430 (1972)).
  • Es wurden 47 Nanomol P-2 aus 50 Nanomol Inosin bei einem Sauerstoffverbrauch von 51 Nanomol produziert. Es wurde kein Wasserstoffperoxid nachgewiesen.
  • Als nächstes wurde ein U der Enzymprobe zu 1 ml 100 mM Phosphatpuffer, der 100 Nanomol P-1 enthielt, gegeben, um in gleicher Weise die Menge des Sauerstoffverbrauchs, die Menge an produziertem P-2 und die Menge an Wasserstoffperoxid zu bestimmen.
  • Es wurde festgestellt, daß 97 Nanomol P-2 aus 100 Nanomol P-1 bei einem Sauerstoffverbrauch von 48 Nanomol produziert wurden. Es wurde kein Wasserstoffperoxid nachgewiesen.
  • Die Zugabe von 1 U Katalase zu den obigen Reaktionssystemen führte zu keinem Unterschied in der Menge des Sauerstoffverbrauchs. Es wurde festgestellt, daß die Nucleosidoxidase-Probe weder Katalase-Aktivität noch Peroxidase-Aktivität aufwies. Die Ergebnisse geben auch an, daß die vorliegende Reaktion kein Wasserstoffperoxid produziert.
  • Die oben angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Enzym 1 Mol Inosin init 1/2 Mol Sauerstoff als Elektronenakzeptor unter Bildung von 1 Mol Inosin-5'-aldehyd und 1 Mol Wasser oxidiert, und ferner 1 Mol Inosin-5'-aldehyd mit 1/2 Mol Sauerstoff als Elektronenakzeptor unter Bildung von 1 Mol Inosin-5'-carbonsäure oxidiert.
    • (2) Enzymatischer Aktivitätstest II 1) Identifizierung eines Reaktionsprodukts, das aus 1,4- Hydrochinon als Substrat erhalten wird, und Stöchiometrie
  • Ein U der Enzymprobe wurde zu 1 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 uM Inosin und 0,2 uM 1,4-Hydrochinon enthielt, gegeben, um eine 10-minütige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen. Das Reaktionsprodukt wurde mittels HPLC analysiert.
  • Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Elutionsposition mit der des Standardprodukts p-Chinon übereinstimmte.
  • Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsprodukt im UV-Spektrum mit dem Standardprodukt identisch war.
  • Somit wurde das Reaktionsprodukt als p-Chinon identifiziert.
  • Ein U der Enzymprobe wurde zu 1 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,06 uM Inosin und 0,12 uM 1,4-Hydrochinon enthielt, gegeben, um eine 10-minütige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen; die Menge an verbrauchtem Sauerstoff wurde unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode gemessen.
  • Es wurde festgestellt, daß der Sauerstoffverbrauch 0,115 uM betrug. Daraus folgte, daß 0,055 uM Sauerstoff, was 0,115 uM minus 0,06 uM ist, die zur Oxidation von Inosin verwendete Sauerstoffmenge, zur Oxidation von 0,12 uM 1,4-Hydrochinon verwendet wurde.
  • Demnach oxidiert das vorliegende Enzym 1 Mol 1,4-Hydrochinon mit einem 1/2 Mol Sauerstoff unter Herstellung von 1 Mol p- Chinon und 1 Mol Wasser. Diese Reaktion ist daher mit der bereits bekannten Reaktion von Lakkase (Lakkase EC 1.10.3.2) identisch.
    • 2) Relation zwischen Nucleosidoxidation und Laccase-Aktivität
  • Wenn das vorliegende Enzym mit einem Lakkase-Substrat, wie z.B. 1,4-Hydrochinon, vermischt wird, erfolgt keine Reaktion. Wenn allerdings Inosin, Adenosin oder ähnliche Nucleoside in diesem Reaktionssystem vorliegen, tritt die Lakkase-Reaktion ein. Mit anderen Worten, die Lakkase-Aktivität des vorliegenden Enzyms erfordert die Anwesenheit des Nucleosids. Diese Tatsache ist durch den folgenden Test bewiesen worden.
  • Ein U des vorliegenden Enzyms wurde veranlaßt, auf 1 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,06 uM Inosin und 0,02; 0,06; 0,12 oder 0,6 uM 1,4-Hydrochinon enthielt, zu wirken, um die Menge des resultierenden Sauerstoffverbrauchs und die Menge an gebildetem p-Chinon zu bestimmen. Tabelle 3 zeigt das Ergebnis. TABELLE 3 1,4-Hydrochin (uM) Menge des Sauerstoffverbrauchs (uM) Menge an gebildetem Chinon (uM)
  • Tabelle 3 zeigt, daß bei Oxidation von 1 Mol Nucleosid mit 1 Mol Sauerstoff als Elektronenakzeptor das vorliegende Enzym konkurrierend mit, aber getrennt von der Nucleosidoxidation die Lakkase-Reaktion mit 1 Mol Sauerstoff als Elektronenakzeptor durchführt.
    • 3) Aktivität auf Phenol und 4-Aminoantipyrin
  • Ähnlich wie die bekannte Lakkase (die von Polyporus versicolor stammt) bewirkt das vorliegende Enzym, daß Phenol und 4- Aminoantipyrin eine Kupplungsreaktion durch Oxidation in Anwesenheit eines Nucleosids unter Bildung von rotem Chinonimin-Pigment eingehen. Durch das UV-Spektrum und das Spektrum der sichtbaren Absorption, durch die HPLC- Elutionsposition, usw. des Pigments wurde festgestellt, daß das auf diese Weise produzierte Pigment mit dem Chinonimin-Pigment identisch ist, das durch die herkömmliche Oxidationsreaktion zwischen Phenol und 4-Aminoantipyrin, die durch Peroxidase in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid erfolgt, produziert wird.
  • Das vorliegende Enzym wurde in Bezug auf die Beziehung zwischen der Produktion von Chinonimin-Pigment (Grad der Farbbildung) und der Nucleosidmenge, was später weiter unten beschrieben wird, getestet. Inosin, das als Nucleosid diente, wurde in einer spezifizierten Konzentration zu 3 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 10 mM Phenol und 4-Aminoantipyrin enthielt, gegeben, dann wurde noch ein U des vorliegenden Enzyms dem Puffer zugesetzt, um Reaktion und Farbbildung durchzuführen. Fig. 2 zeigt das Ergebnis.
  • In dem genannten Diagramm ist die Inosin-Konzentration (in Nanomol) auf der Abszisse und die Extinktion bei 500 nm auf der Ordinate aufgetragen.
  • Fig. 2 zeigt, daß es eine lineare Beziehung zwischen der Nucleosidmenge und der Farbbildung gibt, was anzeigt, daß das vorliegende Enzym zur Kolorimetrie von Nucleosiden unter Verwendung der obigen Reaktion verwendbar ist.
    • (3) Substrat-Sezifitätstest
  • Unter Verwendung der in Tabelle 4 aufgelisteten Verbindungen als Substrate wurde die Aktivität des vorliegenden Enzyms dafür bestimmt (relativ zu der Aktivität auf Inosin, die als 100 angenommen wurde). TABELLE 4 Substrat Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) Neucleosid Inosin Adenosin Guanosin Xanthosin Uridin Cytidin Deoxyinosin Deoxyadenosin Deoxyguanosin Deoxythymidin Thymidin Nucleinsäure-Base Hypoxanthin Xanthin Adenin Guanin Thymin Cytosin Uracil Zucker D-Ribose D-Ribose-1-phosphorsäure D-Ribose-5-phosphorsäure 2-Deoxy-D-ribose Nucleotid
  • Tabelle 4 zeigt, daß das vorliegende Enzym auf Nucleoside wirkt, daß es aber nicht auf Nucleinsäure-Basen oder Zucker, die einzeln vorliegen, wirkt und auch nicht auf Nucleotide wirkt.
  • Es ist zu erkennen, daß der Zuckerteil des Nucleosids, auf das das Enzym wirkt, Ribose oder Deoxyribose sein kann, und daß der Basenteil verschieden sein kann.
    • (4) Spezifitätstest auf Lakkase-Substrat
  • Das vorliegende Enzym wurde auf die Substrat-Spezifität seiner Lakkase-artigen Aktivität in Gegenwart von 7 mM Inosin in der folgenden Weise untersucht. Eine Einheit des vorliegenden Enzyms wurde zu einer Probe, die 7 mM Inosin und 1 mM Lakkase- Substrat, das in Tabelle 5 angegeben ist, enthielt, gegeben; das Gemisch wurde dann 5 Minuten lang stehengelassen. Es wurde das Absorptionsspektrum der Probe vor und nach dem Zusatz des Enzyms aufgenommen. Tabelle 5 zeigt das Ergebnis. TABELLE 5 Lakkasesubstrat Absorptionsmaximum vor der Reaktion Änderung im Absorptionsspektrum durch Reaktion Hydrochinon p-Aminophenol p-Phenylendiamin Kaffeesäure Pyrogallol Orzin p-Chinon Phenol p-Chlorphenol keine Absorption im sichtbaren Bereich Neuer Peak kleiner keine Veränderung
  • Tabelle 5 zeigt, daß das vorliegende Enzym in Gegenwart von Inosin auf verschiedene Lakkase-Substrate einwirkt.
  • Wir haben festgestellt, daß neben Inosin, Nucleoside, wie z.B. die in Tabelle 4 aufgelisteten, die für verschiedene Nucleosidoxidasen als Substrate dienen, nützlich sind, um zu bewirken, daß das vorliegende Enzym Lakkase-artige Aktivität zeigt.
    • (5) Temperatur- und pH-Untersuchungen 1) Temperaturstabilität
  • Das vorliegende Enzym wurde 15 Minuten lang in 100 ml Phosphatpuffer (pH 6,0) behandelt und danach hinsichtlich der verbleibenden Aktivität geprüft.
  • Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt (Abszisse = Temperatur, Ordinate = verbleibende Aktivität); es zeigt, daß das Enzym stabil bleibt, selbst wenn es 15 Minuten lang bei 60ºC behandelt wird.
    • 2) pH-Stabilität
  • Das vorliegende Enzym wurde bei verschiedenen pH-Werten bei 37ºC 60 Minuten behandelt und anschließend hinsichtlich seiner verbliebenen Aktivität bei pH 6,0 untersucht.
  • Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt (Abszisse = pH, Ordinate = verbleibende Aktivität); es zeigt, daß das Enzym bei einem pH von 5 bis 6 stabil ist.
    • 3) Optimaler pH
  • Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist (Abszisse = pH, Ordinate = relative Aktivität), stellte sich heraus, daß der optimale pH des vorliegenden Enzyms 5 bis 6 ist. In Fig. 5 stellt (1) Acetatpuffer (u = 0,05) und (2) Phosphatpuffer (u = 0,05) dar.
    • 4) Optimale Temperatur
  • Die Sauerstoffelektrode zur Messung der Aktivität des vorliegenden Enzyms ist unfähig, bei Temperaturen über 40ºC genaue Messungen abzugeben. Im Bereich bis zu 40ºC zeigt das Enzym die höchste Aktivität bei 40ºC.
    • (6) Test zur Messung des Molekulargewichts
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde durch das Gelfiltrationsverfahren mit einer Säule (2,5 cm im Durchmesser und 90 cm in der Länge) aus Sephacryl S-200 (Produkt von Pharmacia) gemessen.
  • Das so bestimmte Molekulargewicht betrug 130.000.
    • (7) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
  • Das Enzym wurde unter Kühlung (4ºC) 48 Stunden lang einer Elektrophorese unterworfen, wobei Carrier-Ampholite pH 3,5-10,5 (LKB-Produkte AB, Schweden) sowie eine elektrofokkusierende Apparatur, hergestellt von LKB, verwendet wurden, um den isoelektrischen Punkt des Enzyms zu bestimmen.
  • Der so bestimmte isoelektrische Punkt des vorliegenden Enzyms war pH 5,3.
    • (8) Wirkung von Inhibitoren
  • Eine Lösung des vorliegenden Enzyms (0,02 U) wurde veranlaßt, 10 Minuten lang bei einem pH von 6,0 und bei 25ºC in Gegenwart verschiedener Inhibitoren auf Inosin zu wirken, danach wurde die enzymatische Aktivität gemessen.
  • Tabelle 6 zeigt das Ergebnis TABELLE 6 Inhibitor Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) kein Inhibitor Kaliumcyanat Hydroxylamin Natriumazid o-Phenanthrolin α,α'-Dipyridyl Natrium-N,N'-Diethylditiocarbamat Chinacrin Hydrazinsulfat Jodessigsäure Quecksilber-p-chlorbenzoat Phenylmethylsulfonylfluorid N-Bromosuccinimid
  • Tabelle 6 zeigt, daß das vorliegende Enzym durch Kaliumcyanat, Natriumazid, N-Bromsuccinimid, usw. gehemmt wird.
    • (9) Spektralanalyse der Absorption in UV und sichtbarem Bereich
  • Das vorliegende Enzym wurde in 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) einer Spektralanalyse unterworfen.
  • Fig. 6 zeigt das Ergebnis.
    • (10) Metallgehalt
  • Die Atomabsorptions-Spektralphotometrie zeigte, daß das Enzym Eisen enthielt, während kein Molybdän, Kupfer, Mangan und Zink nachgewiesen wurde.
    • (11) Einfluß von Metallionen auf die Aktivität
  • Eine Lösung des Enzyms (0,02 U) wurde bei pH 6,0 und 25ºC 10 Minuten lang auf Inosin in Gegenwart verschiedener Metallionen wirkengelassen, danach wurde die Aktivität des Enzyms gemessen, um den Einfluß der Metallionen auf die Aktivität zu untersuchen.
  • Tabelle 7 zeigt das Ergebnis. TABELLE 7 Verwendete Metallsalze Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) keine
    • (12) Km-Wert
  • Der feststellbare Km-Wert wurde für Inosin mit 4,4 x 10&supmin;&sup5; M bestimmt.
    • (13) Aminosäure-Zusammensetzung
  • Das vorliegende Enzym wurde im Vakuum unter Verwendung von 6N Salzsäure 24, 48 oder 72 Stunden lang hydrolysiert. Nach gründlichem Entfernen der Säure wurde das Zersetzungsgemisch in 0,09 M Citratpuffer (pH 2,2) gelöst, die Lösung wurde dann für eine Aminosäureanalyse unter Verwendung eines automatischen Aminosäure-Analysators, Modell JLC200A, ein Produkt von Nippon Denshi Co., Ltd., verwendet.
  • Für die quantitative Bestimmung von Tryptophan (Trp) wurde das Enzym mit 4,2N NaOH bei 110ºC 24 Stunden lang hydrolysiert und anschließend in gleicher Weise analysiert. Für Cystin (Cys) wurde das Enzym mit Perameisensäure oxidiert, dann mit Salzsäure abgebaut und anschließend analysiert (S. Moore, J. Biol. Chem., 238, 235 (1963)).
  • Die untenstehende Tabelle 8 zeigt das Ergebnis. TABELLE 8 Aminosäure Anzahl der Reste
    • (14) Diskelektrophorese
  • Das vorliegende Enzym wurde der Diskelektrophorese in zwei Spuren entsprechend dem Verfahren von Davis (J.B. Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404 (1964)) unterworfen, wobei 7% Polyacrylamidgel (pH 9,5) verwendet wurden. Eine Spur wurde zur Proteinfärbung verwendet, die andere wurde in 1 mm-Einheiten geschnitten und zur Aktivitätsbestimmung verwendet, um so die elektrophoretische Mobilität zu untersuchen.
  • Das Enzym war als einzelnes Band gewandert und es wurde festgestellt, daß sich die elektrophoretische Mobilität in Übereinstimmung mit der Aktivität befand.
  • Unten werden Beispiele angegeben, in denen das vorliegende Enzym für das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren eingesetzt wird. Das in diesen Beispielen verwendete Enzym ist eine gereinigte Probe der Nucleosidoxidase YT-1, die in Beispiel 3 erhalten wurde.
    • BEISPIEL 4
  • 4-Aminoantipyrin 23,4 mg
  • 5% Phenol 2 ml
  • 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) 98 ml
  • Gesamt 100 ml
  • Eine Menge von 10 ul Nucleosidoxidase (0,35 U) wurde zu 2 ml chromogener Lösung der obigen Zusammensetzung gegeben. Anschließend wurde 0,3 ml Testprobe, die eine spezifische Konzentration an Adenosin enthielt, der Lösung zugesetzt, das Gemisch wurde bei 30ºC 20 Minuten lang umgesetzt und dann die Extinktion bei 500 nm gemessen.
  • Das Ergebnis ist in Fig. 7 dargestellt, wobei die Extinktion auf der Ordinate gegen die Adenosinkonzentration (mM) der Testprobe auf der Abszisse aufgetragen ist.
  • Fig. 7 zeigt, daß das Adenosin in der Testprobe durch Messung der Extinktion leicht quantitativ und genau bestimmt werden kann.
    • BEISPIEL 5
  • 4-Aminoantipyrin 23,4 mg
  • N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin 178,7 mg
  • 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) 100 ml
  • Gesamt 100 ml
  • Eine Menge von 10 ul Nucleosidoxidase (0,35 U) wurde zu 2,0 ml einer chromogenen Lösung mit der obigen Zusammensetzung gegeben. Anschließend wurden 0,3 ml Testprobe, die Inosin, Guanosin oder Deoxyadenosin in einer spezifizierten Konzentration enthielt, der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 30ºC umgesetzt und dann bei 630 nm hinsichtlich der Extinktion untersucht.
  • In der gleichen Weise wie in Fig. 7 ist das Ergebnis in Fig. 8 (Messungen für Inosin), Fig. 9 (für Guanosin) und Fig. 10 (für Deoxyadenosin) dargestellt.
  • Die Diagramme zeigen, daß die Nucleoside in den Testproben leicht und genau quantitativ bestimmt werden können, indem die Extinktion gemessen wird.
    • BEISPIEL 6
  • 4-Aminoantipyrin 23,4 mg
  • N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin 171,3 mg
  • Glycerin-2-phosphorsäure 2Na 1,76 g
  • MnSO&sub4; 4-6H&sub2;O 19,4 mg
  • 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) 100 ml
  • Gesamt 100 ml
  • Eine Menge von 10 ul Nucleosidoxidase (0,35 U) wurde zu 2,0 ml chromogener Lösung der obigen Zusammensetzung gegeben. Anschließend wurden 0,1 ml Testprobe, die 5'-Nucleotidase (Produkt von Sigma, 5'-ND Control E) in einer spezifizierten Konzentration enthielt, der Lösung zugesetzt; ferner wurden 0,2 ml 11,5 mM 5'-Adenylsäure (5'-AMP)-Lösung als Substrat zugesetzt, dann wurde das Gemisch hinsichtlich des Anstiegs der Extinktion bei 555 nm pro Zeiteinheit für etwa 5 Minuten unter Verwendung eines Spektralphotometers untersucht.
  • Das Ergebnis ist in Fig. 11 angegeben, wobei der Anstieg der Extinktion pro Minute auf der Ordinate und die Konzentration der 5'-Nucleotidase (U/Liter) auf der Abszisse aufgetragen ist.
  • Fig. 11 zeigt, daß die Nucleotidase in der Testprobe durch Messung der Extinktion leicht und genau quantitativ bestimmt werden kann.
    • BEISPIEL 7
  • 4-Aminoantipyrin 23,4 mg
  • 5% Phenol 2 ml
  • MnSO&sub4; 4-6H&sub2;O 19,4 mg
  • 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) 98 ml
  • Gesamt 100 ml
  • Eine Menge von 10 ul Nucleosidoxidase (0,35 U) wurde zu 2,0 ml chromogener Lösung der obigen Zusammensetzung gegeben. Anschließend wurden 0,1 ml Testprobe, die 3'-Nucleotidase (Produkt von Sigma) in einer spezifischen Konzentration enthielt, zu der Lösung gegeben, anschließend folgte der Zusatz der Lösung von 0,2 ml 11,5 mM 3'-Adenylsäure (3'-AMP) als Substrat. Das Gemisch wurde in Bezug auf den Anstieg der Extinktion bei 505 nm pro Zeiteinheit für etwa 5 Minuten unter Verwendung eines Spektralphotometers untersucht.
  • In der gleichen Weise wie in Fig. 11 ist dieses Ergebnis in Fig. 12 dargestellt.
  • Das Diagramm zeigt, daß die Nucleotidase in der Testprobe leicht, schnell und genau quantitativ bestimmt werden kann.
    • BEISPIEL 8
  • Zu derselben chromogenen Lösung, wie sie in Beispiel 6 verwendet wurde, wurden 10 ul (0,35 U) Nucleosidoxidase und 0,1 ml menschliches Serum gegeben. Anschließend wurden 0,2 ml 5'- AMP (11,5 mM) dem Gemisch zugesetzt und der Anstieg der Extinktion bei 555 nm mit einem Spektralphotometer gemessen, um die Aktivität von 5'-Nucleotidase im menschlichen Serum zu bestimmen.
  • Die unten stehende Tabelle 9 zeigt das Ergebnis, das erhalten wurde, indem das obige Verfahren 15 Mal unter Verwendung derselben Serumprobe wiederholt wurde. TABELLE 9 Anzahl der Wiederholungen Mittlere Messung U/Liter Standardabweichung U/Liter Variationskoeffizient %
  • Die obige Tabelle zeigt, daß die 5'-Nucleotidase-Aktivität im menschlichen Serum nach dem vorliegenden Untersuchungsverfahren mit hoher Reproduzierbarkeit gemessen werden kann.
    • BEISPIEL 9
  • In der gleichen Weise wie in Beispiel 8 wurde die Aktivität von 5'-Nucleotidase bei 18 menschlichen Serumproben untersucht.
  • Zum Vergleich wurde das bekannte enzymatische Verfahren (C.L.M. Ardesteijn, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Band 14, Seiten 155- 158 (1976)) für dieselben Proben menschlichen Serums angewendet, um dieselbe enzymatische Aktivität zu bestimmen.
  • Fig. 13 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
  • In Fig. 13 ist das nach dem herkömmlichen Verfahren erzielte Ergebnis (U/ml) auf der Abszisse vs. gegen das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Ergebnis (U/ml) auf der Ordinate aufgetragen; das Diagramm zeigt somit alle Ergebnisse, die nach den beiden Verfahren für die Proben erzielt wurden. Der aus dem Diagramm errechnete Korrelationskoeffizient war 0,994, was eine sehr hohe Korrelation zwischen den beiden Untersuchungsverfahren angibt.
  • Die vorstehenden Resultate demonstrieren, daß das vorliegende Untersuchungsverfahren auf die Bestimmung der Aktivität von 5'- Nucleotidase im menschlichen Serum mit hoher Empfindlichkeit, schnell bei einer stark vereinfachten Arbeitsweise anstelle des herkömmlichen Verfahrens, das die Nachteile aufweist, daß ein kompliziertes Untersuchungssystem sowie eine vorbereitende Reaktion für etwa 30 Minuten vor dem Beginn der Hauptreaktion notwendig ist, anwendbar ist.
    • BEISPIEL 10
  • Eine 1 ml-Menge einer 1 mM o-Toluidin-Lösung wurde zu 2 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), der Inosin in einer spezifizierten Konzentration enthielt, gegeben, ferner wurden 10 ul Nucleosidoxidase (0,35 U) zugesetzt; dann wurde das Gemisch 15 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt und anschließend hinsichtlich der Extinktion bei 480 nm untersucht.
  • Das Resultat ist in Fig. 14 dargestellt, wobei die Extinktion bei 480 nm auf der Ordinate, die Inosinmenge (uM) im Reaktionsgemisch auf der Abszisse aufgetragen ist.
  • Das Diagramm zeigt, daß die Inosinmenge in den Proben genau gemessen werden kann, indem die proportionale Beziehung zwischen dem Inosingehalt der Proben und ihrer Extinktion ausgenützt wird.
  • Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wurde Pseudomonas maltophilia LB-86 mit der genannten Bezeichnung und unter der Hinterlegungsnr. FERM P-9813 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, am 14. Januar 1988 hinterlegt, wobei die Hinterlegungsnr. am 20. Januar 1989 in FERM BP-2252 geändert wurde.

Claims (7)

1. Nucleosidoxidase YT-1, die als Enzym zur Katalyse einer Oxidationsreaktion eines Nucleosids dient, wobei die Oxidase dadurch gekennzeichnet ist, daß die Oxidase bewirkt, daß das Nucleotid mit molekularem Sauerstoff unter Bildung von Nucleosid-5'-carbonsäure via Nucleosid-5'-aldehyd ohne Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert.
2. Verfahren zur Produktion von Nucleosidoxidase YT-1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und der die Fähigkeit aufweist, die in Anspruch 1 definierte Nucleosidoxidase zu produzieren, inkubiert wird und die Oxidase YT-1 aus der resultierenden Kultur gesammelt wird.
3. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Gattung Pseudomonas gehört und die Fähigkeit aufweist, die in Anspruch 1 definierte Nucleosidoxidase YT-1 zu produzieren.
4. Mikroorganismus nach Anspruch 3, der FERM BP-2252 ist.
5. Verfahren zur Untersuchung einer Probe, die ein System zur Produktion eines Nucleosids oder ein System, das ein Nucleosid enthält, darstellt, wobei das Verfahren dadurch charakterisiert wird, daß es bewirkt, daß die in Anspruch 1 definierte Nucleosidoxidase YT-1 auf eine Mischung der Probe und einem chromogenen Reagens wirkt, und der Grad der Farbbildung durch das chromogene Reagens, der zu der Änderung der Nucleosidmenge in der Probe proportional ist, gemessen wird.
6. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 5, in dem die Probe aus einer Probe, die das Nucleosid enthält, einem enzymatischen Reaktionssystem zur Freisetzung des Nucleosids und einem enzymatischen Reaktionssystem zur Zersetzung des Nucleosids ausgewählt wird.
7. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 5, in dem die Probe ein Nucleosid freisetzendes enzymatisches Reaktionssystem ist, das menschliches Serum und ein Nucleotid zur Bestimmung der Aktivität von 5'-Nucleotidase in dem menschlichen Serum enthält.
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