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Verfahren und Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose
Enzymatisch-analytische Methoden zeichnen sich allgemein durch ihre hohe Substrat-Spezifität aus und gestatten die exakte Bestimmung der Substrate in Gegenwart der meisten konstitutionsmässig ähnlichen Begleitstoffe, die bei nicht-enzymatischen Methoden stören würden, Auch für die Bestimmund der Glucose sind bereits enzymatische Methoden ausgearbeitet und in die Praxis eingeführt wor-
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oder die Umsetzung mit Hexokinase und Adenosintriphosphat zu Glucose-6-phosphat, wobei die Folgeprodukte Wasserstoffperoxyd bzw. Glucose- 6-phosphat in einer gekoppelten weiteren Reaktion in colorimetrisch oder photometrisch messbare Produkte umgewandelt werden (M. W. Slein, in : H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, S. 117, und H.
U. Bergmeyer und E. Bernt, ebda., S. 123). Am sichersten erschien bis heute die Hexokinase-Methode :
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(Es bedeuten : ATP = Adenosin-5'-triphosphorsäure, ADP = Adenosin-5'-diphosphorsäure, G-6-P = Glucose-6-phosphorsäure, TPN und TPNH = Triphosphopyridinnucleotid und dessen reduzierte Form, 6-PG = 6-Phosphogluconsäure, G-6-PDH = Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase),
Trotz ausgezeichneter Empfindlichkeit und Genauigkeit hat das genannte Verfahren den Nachteil, dass extrem reine und damit teure Enzympräparate eingesetzt werden müssen ; denn Hexokinase setzt auch Fructose zu Fructose- 6-phosphat und Mannose zu Mannose-6-phosphat um. Enthalten nun die Enzympräparate z.
B. auch nur Spuren des Enzyms Phosphohexose-Isomerase, so wird Fructose-6-phosphat in Glucose- 6-phosphat überführt und Fructose täuscht so in der Analyse Glucose vor.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass das von M. Y. Kamel und R. L. Anderson kürzlich beschriebene Enzym aus Aerobacter aerogenes (J. Biol. Chem. 239, PC 3607,1964) ausgezeichnet zur enzymatischen Bestimmung der Glucose geeignet ist. Dieses Enzym reagiert im Gegensatz zur Hexokinase praktisch nicht mit Fructose. Die relative Umsatzgeschwindigkeit des neuen Enzyms mit Fructose gegenüber Glucose ist nur zirka 0, 60/0, d. h., selbst bei grossem Fructose-Überschuss wird die Fructose praktisch nicht phosphoryliert.
Auch Mannose, Galactose, Glucosamin und N-Acetyl-glucosamin reagieren nicht gemäss Gleichung (3) und (4) ; vgl. hiezu S, 5 Da obendrein das neue Enzym bereits bei der Herstellung ziemlich frei von Phosphohexose-Isomerase anfällt und im Vergleich zur Hexokinase wesentlich einfacher von diesem und andern störenden Begleitenzymen (z.
B. Gluthathion-Reduktase, TPNH-Oxydase, Glucose-Dehydrogenase) befreit werden kann, eignet es sich viel besser zur enzymatischen Analyse der Glucose als Hexokinase.
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Aus der obigen Tabelle wird ersichtlich, dass die Acylphosphat : Glucose-Transferase vorzugsweise mit solchen Phosphatdonatoren reagiert, bei denen der Einfluss einer gegebenenfalls vorhandenen ne- gativen Ladung auf die Bindung Phosphatdonator-Enzym am geringsten ist ; siehe z. B. Glutaroyl-phos- phat, Succinyl-phosphat und 3-Phosphoglycerinsäure-l-phosphat im Vergleich zu Benzoylphosphat.
Mit i letzterem als Phosphatdonator reagiert das Enzym sogar 600/0 schneller als mit Acetylphosphat.
Diese hohe Affinität der Acylphosphat : Glucose-Transferase zu Phosphatdonatoren der Formel I war überraschend, da die bekannten Phospho-Transferasen, wie z. B. die übliche Hexokinase und Phos- phoglycerat-Kinase, nur mit Nucleosid-triphosphaten reagieren. Weiterhin war nicht vorherzusehen, dass das neue Enzym so leicht von den bei Glucose-Bestimmungen störenden Begleitenzymen, wie Phosphohexose-Isomerase, Glutathion-Reduktase, TPNH-Oxydase, Glucose-Dehydrogenase usw. zu reinigen ist und sich deshalb besonders für das erfindungsgemässe Verfahren eignet.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, bei welchem die Glucose durch Einwirkung eines Phosphatdonators und einer Transferase in Glucose-6-phos- phat umgewandelt, das Glucose-6-phosphat mittels Triphosphopyridin-nucleotid in Gegenwart von Glucose-6-phosphorsäure-Dehydrogenase in 6-Phospho-gluconsäure übergeführt und das dabei entstan- dene Dihydro-triphosphopyridin-nucleotid spektrophotometrisch bestimmt wird, dadurch gekennzeich- net, dass man als Phosphatdonator ein Acylphosphat der allgemeinen Formel
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in welcher R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer NachbarschaftzurPhosphatgruppe besitzt, und als Transferase eine Acylphosphat :
Glucose-Transferase verwendet, wobei man gegebenenfalls das Acylphosphat erst unmittelbar vor der eigentlichen Bestimmung aus Adenosintriphosphat (ATP) und einem Acylat der allgemeinen Formel
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worin R die oben angegebene Bedeutung hat, in Gegenwart einer Acylatphosphokinase erzeugt.
Die Reaktionsfolge des erfindungsgemässen Verfahrens kann durch folgende Gleichungen charakterisiert werden :
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Das erfindungsgemässediagnostische Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose besteht
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Phosphatdonator eine Substanz der Formel I und als Transferase eine Acylphosphat : Glucose-Transferase verwendet werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird die zu untersuchende Probe mit dem Acylphosphat (I), Triphosphopyridinnucleotid (TPN), einem Puffer (beispielsweise Glycocollpuffer) und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase versetzt. Eventuell vorhandenes Glucose-6-Phosphat wird bereits jetzt umgesetzt und kann vorweg bestimmt werden. Anschliessend wird die Acylphosphat : GlucoseTransferase zugegeben und nach einigen Minuten die Glucose an Hand des entstandenen reduzierten Triphosphopyridinnucleotids (TPNH) photometrisch bestimmt.
Da die wässerigen Lösungen der Acylphosphate I nur begrenzt haltbar sind-es handelt sich ja um gemischte Säureanhydride - kann das zu verwendende Acylphosphat für den Routinegebrauch auch erst unmittelbar vor der Glucose-Bestimmung in einer vorgeschalteten enzymatischen Reaktion innerhalb der
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Messküvette synthetisiert werden ; z. B. erzeugt man Acetylphosphat aus einem stabilen Acetat und ATP mittels Acetat-Kinase bzw. Carbamylphosphat aus Carbaminsäure und ATP mittels der Carbamat-Phosphokinase.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose ist die hohe Substratspezifität der Kombination von Acylphosphat : Glucose-Tranferase mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Wie man der Tabelle 2 entnehmen kann, liegen für die Acylphosphat : Glucose-Transferase die Michaeliskonstanten (KM), die ein Mass für die Affinität zum Substrat darstellen, hinsichtlich Glucose und Fructose um 3 Zehnerpotenzen auseinander.
Tabelle 2 :
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<tb>
<tb> Michaelis-Konstanten <SEP> für <SEP> Glucose <SEP> und <SEP> Fructose <SEP> mit <SEP> verschiedenen
<tb> Phosphatdonatoren <SEP> (PH <SEP> = <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> ; <SEP> 250C) <SEP>
<tb> Acylphosphat <SEP> [KM] <SEP> Glucose <SEP> [KM] <SEP> Fructose
<tb> Acetylphospha <SEP> t <SEP> (20 <SEP> mMol) <SEP> 4. <SEP> 10-5 <SEP> Mol <SEP> 5, <SEP> 10-2 <SEP> Mol <SEP>
<tb> Carbamylphosphat <SEP> (47 <SEP> mMol) <SEP> 5. <SEP> 10-5 <SEP> Mol <SEP> 3-10-2 <SEP> Mol <SEP>
<tb> Benzoylphosphat <SEP> (12 <SEP> mMol) <SEP> 8'10-5 <SEP> Mol <SEP> 2'10-2 <SEP> Mol <SEP>
<tb> Nicotoylphosphat <SEP> (25 <SEP> mMol) <SEP> 5. <SEP> 10-5 <SEP> Mol <SEP> 2. <SEP> 10. <SEP> 2 <SEP> Mol <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> :
<SEP> Glucose-Bestimmung <SEP> mit <SEP> Carbamyl-PhosphatEndkonzentration
<tb> 2,50 <SEP> ml <SEP> Glycocoll-Puffer <SEP> 0,2 <SEP> M, <SEP> 165 <SEP> mMol
<tb> welcher <SEP> mit <SEP> KOH <SEP> auf <SEP> PH- <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> eingestellt <SEP> wurde
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> NADP <SEP> (11 <SEP> mMol, <SEP> 10 <SEP> mg/ml) <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> mMol
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> Carbamylphosphat <SEP> (140 <SEP> mMol, <SEP> 20 <SEP> mg/ml) <SEP> 4,7 <SEP> mMol
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> der <SEP> mit <SEP> HO <SEP> l <SEP> : <SEP> 10 <SEP> verdünnten <SEP> Fruchtsaftprobe.
<tb>
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<tb>
<tb> Hamburg)0, <SEP> 01 <SEP> ml <SEP> Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> U/ml <SEP>
<tb> (1 <SEP> mg/ml, <SEP> 140 <SEP> U/mg)
<tb>
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Wenn Glucose-6-Phosphat in der Probe anwesend ist, nimmt die Extinktion zu und die Reaktion kommt nach zirka 2 min zum Stillstand.
In diesem Beispiel war kein Glucose-6-Phosphat in der Fmchtsaftprobe. Die Extinktion ist also nach wie vor 0. Die Glucose-Bestimmung wird jetzt ausgeführt durch den Start mit
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<tb>
<tb> 0,02 <SEP> ml <SEP> Acylphosphat-Glucose-Transferase <SEP> 0,26 <SEP> U/ml
<tb> (1 <SEP> mg/ml, <SEP> 40 <SEP> U/mg)
<tb>
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Die Extinktion nimmt jetzt zu, bedingt durch Bildung von NADPH in der Küvette und hat nach 5 min den Höchststand erreicht, die Reaktion kommt zum Stillstand. Es ist damit alle Glucose über Glucose-6-Phosphat und NADP-Hydrierung in 6-Phosphogluconsäure umgewandelt worden. Die Extinktionsdifferenz (AE) gilt als Mass zur Berechnung der Glucose-Konzentration.
1 1 mol Glucose bildet 1 J1Mol NADPH.
Bei 366 nm wird A E Glucose = 0,082 gemessen. Zur Berechnung wird folgende allgemein gültige Formel eingesetzt :
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darin ist E = Extinktionskoeffizient von NADPH 6,22 cm/Mol bei 340 nm
3,3 cm2/J. lMolbei366nm d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)
V = Testvolumen (3 ml) v = Volumen der eingesetzten Probe (in unserem Beispiel 0,01 ml)
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Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet, jedoch statt Carbamylphosphat Benzoylphosphat (Endmolarität = 3,3 mMol) eingesetzt.
Der Endwert nach dem Start mit Acylphosphat-Transferase ist, wie in Beispiel 1, nach 5 min erreicht. Es wird die gleiche Extinktion gefunden, Beispiel 3 : Glucose-Bestimmung mit Nicotoylphosphat :
Dass Messverfahren wird, wie Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit Nicotoylphosphat (Endmolarität = 3,3 mMol). In diesem Falle wird eine 0,01 M c-D-Glucose-Lösung hergestellt und analysiert. Eingesetzt zur Glucose-Bestimmung werden davon 0,02 ml (= 0, 2 ,Mol = 0, 036 mg Glucose), Nach dem
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.
E 0, 164Bestimmung :
Die Analyse in Fruchtsaft (schwarzer Johannisbeersaft) wird folgendermassen ausgeführt : Man pipettiert in eine Küvette, welche eine Schichtdicke von 1 cm aufweist undein Inhaltsvolumen von 3,0 ml hat, folgende Reagentienlösungen :
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<tb>
<tb> Endmolarität
<tb> 2,40 <SEP> ml <SEP> Glycocoll-Acetat-Puffer <SEP> (PH <SEP> = <SEP> 9, <SEP> 0) <SEP> 160 <SEP> mMol <SEP> Glycin
<tb> 120 <SEP> mMol <SEP> Acetat
<tb>
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<tb>
<tb> Endmolarität
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> TPN <SEP> (11 <SEP> mMol; <SEP> 10 <SEP> mg/ml) <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> mMol
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> ATP <SEP> (80 <SEP> mMol;
<SEP> 50 <SEP> mg/ml) <SEP> 2,7 <SEP> mMol
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> MgOL <SEP> (100 <SEP> mMol) <SEP> 3,3 <SEP> mMol
<tb> 0,2 <SEP> ml <SEP> einer <SEP> mit <SEP> HO <SEP> l <SEP> : <SEP> 10 <SEP> verdünnten <SEP> Fruchsaftprobe
<tb>
mit H20 wird auf 2, 96 ml aufgefüllt.
Ferner werden zugegeben :
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<tb>
<tb> 0,01 <SEP> ml <SEP> Acetatkinase <SEP> (5 <SEP> mg/ml <SEP> ; <SEP> 700 <SEP> U/ml) <SEP> 2,3 <SEP> U/ml
<tb>
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oder 340 nm, der erzeugt wird von einem Photometer oder Spektral-Photometer. Die Extinktionsanzeige des Gerätes wird auf 0 eingestellt. Es wird nunmehr
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<tb>
<tb> 0,01 <SEP> ml <SEP> Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase <SEP> 0,47 <SEP> U/ml
<tb> (1 <SEP> mg/ml, <SEP> 140 <SEP> U/mg)
<tb>
zugegeben und vermischt.
Wenn Glucose-6-Phosphat in der Probe anwesend ist, nimmt die Extinktion zu und die Reaktion kommt nach zirka 2 min zum Stillstand, In diesem Beispiel ist kein Glucose-6-Phosphat vorhanden,
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<tb>
<tb> 0,02 <SEP> ml <SEP> Acyl-Phosphat-Glucose-Transferase <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP> U/ml <SEP>
<tb> (lmg/ml, <SEP> 40 <SEP> U/mg)
<tb>
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zum Stillstand. Alle Glucose ist nun über die Glucose-6-Phosphat-Bildung und TPN-Hydrierung in 6-Phospho-Gluconsaure umgewandelt worden. Als Mass zur Berechnung der Glucose-Konzentration gilt die Extinktionsdifferenz AE Glucose.
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Zur Enteiweissung werden 10 verschiedene Blutproben zu je 0, 1 ml mit je 1 ml Perchlorsäure 0, 33 Mol versetzt. Nach Zentrifugation werden zum Testansatz 0, 2 ml Probe eingesetzt.
Dann wird wie inBeispiel l gearbeitet, jedoch kommt statt Carbamylphosphat Acetylphosphat (Endmolarität 4 Mol)' als P-Donator zur Anwendung. Berechnet nach Beispiel 1 werden folgende Werte gefunden (in Klammern sind zum Vergleich die Glucose-Werte der gleichen Probe nach der Hexokinase-ZwischenfermentMethode angegeben) :
Tabelle 3 :
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<tb>
<tb> Glucose <SEP> im <SEP> Blut
<tb> mg o <SEP> mit <SEP> AcylphosphatTransferase <SEP> mg% <SEP> mit <SEP> HK/G-6-PDH <SEP> Abweichung
<tb> 1 <SEP> 105,5 <SEP> (105, <SEP> 5) <SEP> lo <SEP>
<tb> 2 <SEP> 92 <SEP> (91) <SEP> +1 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 88, <SEP> 5 <SEP> (86) <SEP> +2, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 95 <SEP> (94) <SEP> + <SEP> 1 <SEP> %
<tb> 5 <SEP> 125 <SEP> (127)-1, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
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Tabelle 3 (Fortsetzung) :
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<tb>
<tb> mg% <SEP> mit <SEP> AcylphosphatTransferase <SEP> mg% <SEP> mit <SEP> HK/G-6-PDH <SEP> Abweichung
<tb> 6 <SEP> 82 <SEP> (82) <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> %
<tb> 7 <SEP> 99 <SEP> (97,5) <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP>
<tb> 8 <SEP> 102 <SEP> (102) <SEP> tO <SEP> % <SEP>
<tb> 9 <SEP> 75, <SEP> 5 <SEP> (76) <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 7% <SEP>
<tb> 10 <SEP> 105 <SEP> (106) <SEP> - <SEP> 1 <SEP> % <SEP>
<tb>
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gesetzt werden :
Vor Enteiweissung werden 2 verschiedene Blutproben mit verschiedenen Fructose-Mengen versetzt (vgl. Tabelle 4). Die weitere Arbeitsweise erfolgt wie in Beispiel 5 beschrieben. Zusätzlich wurde Fruc-
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Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, S. 156).
Tabelle 4 :
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<tb>
<tb> Glucose- <SEP> und <SEP> Fructose-Bestimmungen <SEP> im <SEP> Blut,
<tb> wobei <SEP> dem <SEP> Blut <SEP> steigende <SEP> Mengen <SEP> Fructose <SEP> zugesetzt <SEP> wurden.
<tb>
Glucose <SEP> (mg%)
<tb> mit <SEP> Acylphosphat-Differenz
<tb> Nr. <SEP> Fructose <SEP> Transferase <SEP> mit <SEP> HK <SEP> (0/0)
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 73 <SEP> 71,5 <SEP> + <SEP> 2,1
<tb> 16, <SEP> 0 <SEP> 72, <SEP> 2 <SEP> 71, <SEP> 5 <SEP> + <SEP> 1 <SEP>
<tb> 31,3 <SEP> 72,2 <SEP> 70,5 <SEP> + <SEP> 2,4
<tb> 62,4 <SEP> 71,6 <SEP> 70,0 <SEP> + <SEP> 2,3
<tb> 153, <SEP> 0 <SEP> 72, <SEP> 2 <SEP> 70, <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0 <SEP> 67, <SEP> 0 <SEP> 67, <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 27,8 <SEP> 67,0 <SEP> 66,1 <SEP> + <SEP> 1,3
<tb> 71, <SEP> 8 <SEP> 66, <SEP> 1 <SEP> 66, <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> 144, <SEP> 0 <SEP> 67, <SEP> 8 <SEP> 64, <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 283, <SEP> 0 <SEP> 66, <SEP> 1 <SEP> 64, <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
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ispiel 7 :
Glucose-Bestimmungen in Untersuchungsmaterial mit hohem Fructosegehalt :nator 4 mMol Acetylphosphat verwendet. Besonders zu beachten ist die glatte Durchführbarkeit der Messung. Auch Spuren von Glucose in reinster Fructose sind mit der erfindungsgemässen Methode sicher nachweisbar (vgl. Tabelle 5).
Tabelle 5 :
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<tb>
<tb> Glucose-Bestimmung <SEP> in <SEP> Untersuchungsmaterial <SEP> mit <SEP> hohem <SEP> Fructose-Gehalt
<tb> Glucose
<tb> mit <SEP> Acyl- <SEP>
<tb> phosphatTransferase <SEP> mit <SEP> HK <SEP>
<tb> Probe <SEP> Fructose
<tb> Aprikosensaft <SEP> 2,62 <SEP> 2,99 <SEP> 2,95
<tb> Johannisbeersaft <SEP> 4, <SEP> 26 <SEP> 4, <SEP> 18 <SEP> 4,10
<tb> Kirschensaft <SEP> 4,30 <SEP> 4,61 <SEP> 4,61
<tb>
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Tabelle 5 (Fortsetzung) :
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<tb>
<tb> Glucose
<tb> mit <SEP> AcylphosphatTransferase <SEP> mit <SEP> HK <SEP>
<tb> Probe <SEP> Fructose <SEP> (5.) <SEP> (5.)
<tb> Apfelsaft <SEP> 6, <SEP> 49 <SEP> 2, <SEP> 87 <SEP> 2, <SEP> 68
<tb> Apfelsaft <SEP> - <SEP> 26, <SEP> 28 <SEP> 2,59 <SEP> 2,49
<tb> Fructose, <SEP> reinst <SEP> zirka <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> * <SEP> * <SEP>
<tb>
* Dem Saft wurden zirka 200 mg Fructose/ml zugesetzt, dabei geringfügig verdünnt.
* * Methode versagt in diesem Falle.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, bei welchem die Glucose durch Einwirkung eines Phosphatdonators undeinerTransferase in Glucose-6-phosphat umgewandelt, das Glucose-6- - phosphat mittels Triphosphopyridin-nucleotid in Gegenwart von Glucose-6-phosphorsäure-Dehydro-
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ein Acylphosphat der allgemeinen Formel
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in welcher R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbar- schaft zur Phosphatgruppe besitzt, und als Transferase eine Acylphosphat :
Glucose-Transferase verwendet, wobei man gegebenenfalls das Acylphosphat erst unmittelbar vor der eigentlichen Bestimmung aus Adenosintriphosphat (ATP) und einem Acylat der allgemeinen Formel
EMI10.4
worin R die oben angegebene Bedeutung hat, in Gegenwart einer Acylatphosphokinase erzeugt.