DE3245267C2

DE3245267C2 -

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Publication number: DE3245267C2
Application number: DE3245267A
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Tagata Shizuoka Jp Imamura; Hideo Tagata Shizuoka Jp Misaki
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1981-12-07
Filing date: 1982-12-07
Publication date: 1993-08-26
Also published as: JPS5898096A; FR2517698B1; US5089393A; FR2517698A1; DE3245267A1; US4788147A

Description

Die Beschreibung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Phosphatidylethanolamin. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Analyse von Phosphatidylethanolamin in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Phosphatidylethanolamin enthaltende Probe mit Phospholipase D und mit Ethanolaminoxidase, einem Enzym, das die Reaktion von Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser zu Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperioxid katalysiert, behandelt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die Menge an gebildetem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid in dem Reaktionssystem mißt, wobei die Menge an Ethanolaminoxidase mehr als 0,1 U/ml beträgt.

Bei der klinischen Prüfung kann das Serum Phospholipid, bei dem 95% Phospholipide von Cholinderivat sind, nach einem enzymatischen Verfahren analysiert werden, bei dem Phospholipase D und Cholinoxidase verwendet werden. Jedoch können die verbleibenden 5% von Phospholipiden, bedingt durch die Nichtreaktivität gegenüber Cholinoxidase, nicht analysiert werden. Die nichtanalysierbaren Phospholipide sind Phospholipide von Ethanolaminderivaten.

Die WO 80/01 081 betrifft die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Medien und von Substraten, die enzymatisch unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert werden können. Dabei läuft folgende Reaktion ab:

Die gebildeten Fluoridionen werden mit einer fluoridselektiven Elektrode gemessen. Als Beispiel für eine Wasserstoffperoxid erzeugende Reaktion wird die enzymatische Umsetzung von Ethanolamin zu Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid mittels Ethanolaminoxidase aufgeführt.

Die US 41 35 980 A betrifft eine quantitative Bestimmung von Phosphatidylcholin unter Verwendung von Cholinoxidase.

Die Druckschrift S.A. Narrod u. W.B. Jakoby; The Journal of Biological Chemistry 239 (7), Seiten 2189 bis 2193 (1964) betrifft den aeroben Katabolismus von Ethanolamin durch ein Bodenbakterium. Dabei wurde gefunden, daß der erste Schritt des Stoffwechselwegs zur Verwertung von Ethanolamin durch Ethanolaminoxidase katalysiert wird.

Die Druckschrift S.A. Narrod u. W.B. Jakoby, in: Methods in Enzymology, ed. W.A. Wood (Academic Press, New York) 1966, Vol. IX, Seiten 354 bis 357, die im übrigen obiger Druckschrift entspricht, beschreibt ein Bestimmungsverfahren, bei dem Ethanolaminoxidase verwendet wird. Dem Bestimmungsverfahren liegt folgende Reaktion zugrunde:

Ethanolamin + 1/2 O₂ → Glykolaldehyd + NH₃

Die Druckschrift T. Taki u. J.N. Kanfer, in: Methods in Enzymology, ed. J.M. Lowenstein (Academic Press, New York) 1981, Vol. 71, Seiten 746 bis 750 beschreibt die enzymatischen Reaktionen von Phospholipase D:

Phosphatidylcholin (oder Phosphatidylethanolamin) + H₂O
→ Phosphatidsäure + Cholin (oder Ethanolamin)

Chemical Abstracts 65 (1966): 17341h betrifft die Bestimmung von Ethanolamin und Serin in Phospholipiden. Dabei wird das Phospholipidgemisch mit Salzsäure hydrolysiert, durch Ionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt und Ethanolamin wird colorimetrisch mittels Ninhydrin bestimmt.

Chemical Abstracts 81 (1975): 36519n betrifft die Bildung von Phospholipase D durch Streptomyces hachÿoensis sowie die Spezifität dieses Enzyms. Es wurde gefunden, daß dieses Enzym mit Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin zu Phosphatidsäure und Ethanolamin, Cholin bzw. Serin und mit Sphingomyelin zu N-Acetylsphingosylphosphat und Cholin reagiert.

Chemical Abstracts 88 (1978): 132931f betrifft Reagenzien zur Bestimmung von Lezithinen. Die Lezithine in biologischen Proben werden dabei unter Verwendung eines Inkubationssystem bestimmt, das Phospholipase D, Cholindehydrogenase, Betainaldehyddehydrogenase und NAD enthält. Die quantitative Bestimmung erfolgt durch spektrometrische Messung des während der Inkubation gebildeten NADH.

Es wurde jetzt gefunden, daß Bacillus sp. B-0783 FERM-P Nr. 5798 Ethanolamiinoxidase erzeugt, welche eine Reaktion zwischen Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser unter Bildung von Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid katalysiert. Es wurde weiterhin gefunden, daß Ethanolamin analysiert werden kann, indem man eine Ethanolamin enthaltende Probe mit Ethanolaminoxidase behandelt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder freigesetztem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid mißt. Es wurde weiterhin gefunden, daß durch Anwendung dieses Verfahrens die Phospholipide von Ethanolaminderivaten allein ebenfalls analysiert werden können, indem man diese Derivate mit Phospholipase D unter Freisetzung von Ethanolamin behandelt und gleichzeitig oder danach mit Ethanolaminoxidase behandelt und dann den verbrauchten Sauerstoff oder das freigesetzte Ammoniak oder Wasserstoffperoxid mißt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Analyseverfahren für Phosphatidylethanolamin in einer Probe zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß soll ein Analyseverfahren zur Verfügung gestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Phosphatidylethanolamin enthaltende Probe mit Phospholipase D und mit Ethanolaminoxidase, einem Enzym, das die Reaktion von Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser zu Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid katalysiert, behandelt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die Menge an gebildetem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid in dem Reaktionssystem mißt, wobei die Menge an Ethanolaminoxidase mehr als 0,1 U/ml beträgt.

Erfindungsgemäß soll ein einfaches und genaues Analyseverfahren für Phosphatidylethanolamin in einer Probe zur Verfügung gestellt werden.

Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, mit dem quantitativ ein spezifisches Phosphatidylethanolaminderivat in einer Probe, welche verschiedene Phospholipide, wie Phospholipide von Ethanolaminderivaten und Cholinderivaten, enthält, bestimmt werden kann.

Die Phospholipase D ist ein Enzym, welches eine Reaktion katalysiert, bei der Phosphatidinsäure und Cholin aus einem Molekül Lecithin und Wasser gebildet werden.

Phospholidase D wird bevorzugt aus Mikroorganismen gewonnen. Beispielsweise kann sie aus der Kulturbrühe von Streptomyces hachÿoensis A-1143 FERM-P Nr. 1329, Streptomyces chromofuscus A-0848 FERM-P Nr. 3519 erhalten werden, oder man kann im Handel erhältliche Phospholipase D verwenden.

Die Menge an Phospholipase D sollte eine ausreichende Menge sein, um Ethanolamin freizusetzen, beispielsweise mehr als 0,1 U/ml enzymatische Aktivität, vorzugsweise 2 bis 50 U/ml. Die Reaktion verläuft in schwach sauerer oder alkalischer Pufferlösung, wie Tris-HCl-Puffer, Citratpuffer, Boratpuffer, Pipes-NaOH-Puffer oder Imidazolpuffer, über 5 Minuten, bevorzugt 10 bis 20 Minuten, bei 37°C.

Das so freigesetzte Ethanolamin oder das ursprünglich vorhandene Ethanolamin wird mit Ethanolaminoxidase behandelt, welche Ethanolamin, Sauerstoff und Wasse unter Bildung von Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid verbraucht. Ethanolaminoxidase kann beispielsweise aus der Kulturbrühe von Bacillus sp. B-0783 FERM-P Nr. 5798 (japanische Patentanmeldung Nr. 56-91 937) oder einem Mikrobenstamm des Genus Arthrobacter. (J. Biol. Chem., 239, 2189 (1964)) erhalten werden. Das Enzym kann bevorzugt gereinigt oder zu einem immobilisierten Enzym modifiziert werden.

Die taxonomischen Eigenschaften von Bacillus sp. B-0783 sind wie folgt:

(A) Wachstum auf verschiedenen Medien

(1) Bouillon-Agarplatte (30°C, 18 Stunden Kultur):
rund, ebene Kolonie, glatte Kante, gräulich-weiß bis schwach gelblich-grau
keine Bildung von löslichem Pigment
(2) Bouillon-Agarschrägplatte (30°C, 18 Stunden Kultur):
filamentartiges gutes Wachstum, gräulich-weiß bis schwach gelblich-grau
keine Bildung von löslichem Pigment
(3) Bouillon-Brühe (30°C, 32 Stunden Kultur):
schwaches Wachstum, Präzipitation

(B) Mikroskopische Prüfung

Züchtung auf Nähragarmedium bei 30°C über 18 Stunden.

(1) Form und Größe der Zellen:
einzelne, doppelte oder kurze Verbindung, Bacilli mit runden Kanten, 1,0-1,5 × 2,0-5,0 µm
(2) Polymorphismus: keiner
(3) Mobilität und Flagella:
peritrichös, mobil
(4) Sporen (Form, Stellung, Größe):
Sporen, sphärisch oder elliptisch, Formen an den Kanten oder fast Kanten der Zellen, spindelartige Sporen

(C) Physiologische Eigenschaften
Nitratreduktion\|+
Dinitratreaktion	-
MR-Test	-
VP-Test	-
Indolbildung	-
H₂S	-
Gelatinehydrolyse	+ (schwach)
Stärkehydrolyse	-
Citratausnutzung @	Simons-Medium	-
Chrystensen-Medium	-
Nitratausnutzung	+
Ammoniumsalzausnutzung	-
Pigmentbildung	-
Oxidase	+
Catalase	+
Urease @	SSR-Medium	-
Chrystensen-Medium	-
Wachstumsbedingungen: @	pH: optimaler pH-Wert	6,5-8,0
Wachstums-pH-Wert	5,0-9,0
Temperatur: @	optimale Temperatur	25-37°C
Wachstumstemperatur	10-42°C
Natur: aerob @	OF-Test (Hugh-Leifson-Medium)	Al (alkalisch)
OF-Test (modifiziertes Medium)	Al (alkalisch)
Aesculinzersetzung	-
Cellulosezersetzung	-
Gram-Verfahren	+
schnelles Säure-Verfahren	-
Säure- und Gasbildung

Unter Beachtung der obigen taxonomischen Eigenschaften kann der Stamm B-0783, der gram-positiv und ein sporenbildender Bazillus ist, als genus Bacillus betätigt werden, wenn man Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974) zur Prüfung heranzieht. Es werden weiterhin verschiedene taxometrische Eigenschaften entsprechend der Beschreibung des obigen Manuals und The Genus Bacillus, Agricultural Handbook, Seite 427 geprüft, und nachdem keine identischen Eigenschaften festgestellt wurden, wurde dieser Stamm als Bacillus sp. B-0783 bezeichnet. Der Stamm wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Technological Science and Industry, M.I.T.I., Japan unter FERM-P Nr. 5798 hinterlegt.

Ethanolaminoxidase kann erhalten werden, indem man den obigen Ethanolamin erzeugenden Bacillus sp. in einem an sich bekannten Medium züchtet. Man kann ein festes oder flüssiges Medium verwenden, jedoch ist eine flüssige submerse Lüftungskultur für die industrielle Erzeugung bevorzugt.

Für die Enzymbildung können die an sich bekannten Nährmedien ausgewählt werden. Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melassen oder Glycerin, verwendet werden. Assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenpulver, Weizengluten, Pepton, Fleichextrakt, Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat können verwendet werden. Verschiedene Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchloid, Kaliumphosphat oder Magnesiumsulfat, können ebenfalls gegebenenfalls verwendet werden. Die Zugabe von Alkylamin, wie Ethanolamin oder Propionylamin, zu dem Medium bei einer Konzentration von 0,1 bis 1% induziert die Bildung von Ethanolaminoxidase.

Die Züchtungstemperatur kann innerhalb eines Bereichs, der für das Wachstum der Mikroorganismen und Bildung von Enzym geeignet ist, ausgewählt werden und beträgt bevorzugt 26 bis 33°C, besonders bevorzugt 30°C. Die Züchtungszeit kann in Abhängigkeit von den Bedingungen ausgewählt werden und beträgt im allgemeinen 15 bis 25 Stunden. Die Züchtung erfolgt bei 200 bis 400 rpm unter Belüftung und sollte natürlich beendet werden, wenn die Ethanolaminoxidasebildung im wesentlichen beendet ist.

Beispiele für die Extraktion der Ethanolaminoxidase aus der Kulturmasse werden im folgenden erläutert.

Da die Ethanolaminoxidase ein Endo-Enzym ist, wird die Kulturmasse filtriert oder zentrifugiert, und die Bakterienzellen werden mittels mechanischer Einrichtungen, wie einer Französischen Presse oder einer Behandlung mit Glasperlen, oder mittels enzymatischer Verfahren, wie mit Lysozym, zerstört bzw. abgebaut. Oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen) oder Adekatol SO-120 (Warenzeichen) werden gegebenenfalls weiter zugegeben. Die so erhaltene rohe Ethanolaminoxidase wird nach an sich für Enzyme bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren gereinigt. Beispielsweise kann man eine fraktionelle Präzipitation mit Aceton, Ethanol oder Isopropanol und Aussalzen mit Ammoniumsulfat bevorzugt anwenden. Die weitere Reinigung kann beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Sephadex, DEAE-Sephalose, DEAE-Cellulose, CM-Cellulose, CM-Sephadex oder CM-Sephadex, oder durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-200, Sepharose CL-6B oder Sephacryl S-200, und Lyophilisierung erfolgen.

Das Analyseverfahren und die biochemischen Eigenschaften von Ethanolaminoxidase, erhalten aus Bacillus sp. B-0783, sind wie folgt:

(1) Analyse- bzw. Assayverfahren (Wenn in der vorliegenden Anmeldung von "Analyse" gesprochen wird, kann hierfür selbstverständlich auch der Ausdruck "Assay" verwendet werden.)

0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)\|0,1 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin	0,02 ml
2 mM N,N-Diethyl-m-toluidin	0,05 ml
(45 U/ml) Peroxidase	0,05 ml
0,1 M Ethanolamin	0,05 ml
destilliertes Wasser	0,18 ml
insges.	0,45 ml

Das obige Gemisch (0,45 ml) wird bei 37°C während 2 Minuten vorinkubiert, dann wird Enzymlösung (50 µl) zugegeben, und bei 37°C wird während 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man Ethanol (2,5 ml) zugibt und colorimetrisch bei 550 nm mißt.

Eine Einheit (1 Einheit, 1 U) von Enzymaktivität wird als die Aktivität des Enzyms definiert, welche 1 µmol Wasserstoffperoxid pro Minute freisetzt.

Die Potenz des Enzyms wird gemäß folgender Gleichung berechnet.

worin ΔA₅₅₀ der Absorptionswert bei 550 nm ist.

(2) Enzymwirkung

Bei der Oxidation von einem Mol Ethanolamin werden ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasserstoff verbraucht, und es werden ein Mol Glykolaldehyd, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid freigesetzt.

(3) Substratspezifität

Substrat
Aktivität (%)
Ethanolamin
100
1-Amino-2-propanol	26,5
3-Amino-2-propanol	357
3-Amino-1,2-propandiol	0
Diethanolamin	0
Triethanolamin	0
Cholin	0

(4) Optimaler pH-Wert

pH 7 bis 7,5
vgl. Fig. 1
pH 6-7: Phosphatpuffer
pH 7-9: Tris-HCl-Puffer

(5) pH-Stabilität

Die Enzymlösung wird zu Puffern (100 mM) verschiedener pH-Werte (pH 5-7,5: Dimethylglutarat-Puffer, pH 8- 9,5: Tris-HCl-Puffer, pH 9-10: Glycin-NaOH-Puffer) zugegeben, und dann wird bei 60°C während 15 Minuten erwärmt, und die restliche Aktivität wird analysiert. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt, wobei ein stabiler pH 6 bis 8 beträgt.

(6) Wärmestabilität

Die Enzymlösung (2,5 U/ml) in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wird während 10 Minuten bei 40 bis 75°C behandelt, und die verbleibende Aktivität wird analysiert. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Das Enzym ist bis 60°C stabil.

(7) Isoelektrischer Punkt

Ungefähr pH 4,60 (analysiert durch isoelektrischer Fokussierung unter Verwendung eines Ampholits als Carrier)

(8) Wirkung von Metallion und EDTA
Metallion, EDTA
Aktivität (%)
Vergleich (keine Zugabe)
100
1 mM CaCl₂	35
1 mM MgCl₂	110
1 mM BaCl₂	58
1 mM MnCl₂	52
1 mM EDTA	122
100 mM KCl	97
100 mM NaCl	64
100 mM NH₄Cl	61
100 mM LiCl	36

(9) Wirkung der oberflächenaktiven Mittel
Oberflächenaktive Mittel
Aktivität (%)
Kontrolle (keine Zugabe)
100
0,1% Triton X=100	98
0,1% Adekatol SO-145	90
0,1% Natriumdeoxycholat	83
0,1% Natriumlaurylbenzolsulfat	29
0,1% Natriumlaurylsulfat	26

Die Menge an Ethanolaminoxidase, die bei dem Assay verwendet wird, beträgt mehr als 0,1 U/ml, bevorzugt mehr als 0,5 U/ml, bei 37°C während einer Minute, bevorzugt während 5 Minuten. Die Ethanolaminoxidase kann mit Phospholipase D gleichzeitig oder daran anschließend verwendet werden.

Am Ende der Reaktion wird der verbrauchte Sauerstoff oder das freigesetzte Ammoniak oder Wasserstoffperoxid gemessen. Die entsprechende Elektrode, wie eine Sauerstoffelektrode, Ammoniakelektrode, Ammoniumelektrode oder Wasserstoffperoxidelektrode, wird für den Nachweis verwendet. Man kann auch eine immobilsierte Enzymelektode von Ethanolaminoxidase oder Ethanolaminoxidase-Phospholipase D verwenden. Bei der Analyse mit der Elektrode werden die elektrischen Stromänderungen, die der Menge an der nachzuweisenden Komponente entsprechen, für die quantitative Analyse gemessen, und der elektrische Strom wird durch Grenzflächen-Endpunkt-Bestimmung oder ein Meßverfahren, bei dem die Höhe der Werte bestimmt wird, oder ein quadratisches Differentialverfahren gemessen, wobei die entsprechenden Werte in der Aufzeichnungseinrichtung aufgezeichnet werden.

Die colorimetrische Analyse kann für die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid angewendet werden. Beispielsweise kann man ein oder mehrere sich verfärbende Mittel oder fluoreszierende Mittel, die ihre Farbe in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid, ändern, verwenden. Beispiele für Farbstoffe sind Peroxidase, wie Meerrettichperoxdase, und Farbstoffvorstufen, wie ein Gemisch aus einem Elektronenakzeptor und einer Phenolverbindung.

Beispiele für Elektronenakzeptoren sind 4-Aminoantipyrin, 2-Hydrozinobenzothiazol bzw. 2-Hydrazinbenzothiazol, 3-Methyl-2-benzothiazolhydrozin oder 2-Aminobenzothiazol. Beispiele für Phenolverbindungen sind Phenol, 3-Methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)anilin, 3,5-Xylenol, N,N-Dimethylanilin oder N,N-Diethylanilin. Beispiele für fluoreszierende Mittel sind die üblichen Mittel, wie beispielsweise Bis(2,4,6-trichlorphenol)oxalat, Phenylthiohydantoin, Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, Vanillylamin, 3-Methylthiramin, Fluorlethinsäure, Hordenin, Luminolmonoanion, Lucigenin oder Wafin. Diese fluoreszierenden Mittel können gegebenenfalls zusammen mit Elektronenakzeptoren und Peroxidase verwendet werden.

Die Menge an Enzymreagenz und Farbstoffvorstufe ist nicht begrenzt und beträgt im allgemeinen mehr als 0,05 Einheiten für die Peroxidase bei einem einfachen Test, bevorzugt 0,1 bis 500 Einheiten, bei einer Konzentration von 0,1 mM in destilliertem Wasser oder einem schwach sauren oder alkalischen Puffer für den Elektronenakzeptor und die Phenolverbindung. Diese Reagenzien können getrennt und zusammen mit der obigen Phospholinpase C oder D und der Ethanolaminoxidase verwendet werden. Diese Reagenzien können weiterhin in lyophilisierter Form oder in laminierter Form auf Filterpapier oder Film für die quantitative Analyse vorliegen.

Das erfindungsgemäße Analyse- bzw. Assayverfahren ist für die spezifische quantitative Bestimmung von Phosphatidylethanolamin in Serum-Phospholipiden geeignet.

Die klinische Prüfung in Kombination mit der Analyse von Cholinderivat und Ethanolaminderivat erlaubt die getrennte Bestimmung von Phospholipid der Ethanolaminderivate und von Phospholipid der Cholinderivate.

Die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)\|0,5 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin	0,3 ml
0,2% Phenol	0,3 ml
Peroxidase (45 U/ml, Sigma Chem.)	0,1
Ethanolaminoxidase (6 U/ml, erhalten aus dem Bezugsbeispiel 1) @	0,5% NaN₃	0,3 ml
5% Triton X-100	0,2 ml
10 mM MgCl₂	0,3 ml
destilliertes Wasser	0,9 ml
insgesamt	3,0 ml

Zum Vergleich wird eine Ethanolaminlösung (5 bis 25 µl) zu dem obigen Reaktionsgemisch (3,0 ml) zugegeben.

Bei 37°C wird 20 Minuten lang inkubiert und anschließend bei 500 nm colorimetrisch gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt. Man erhält eine ganz genaue Standardkurve von Ethanolamin.

Das Ethanolamin wird durch ein Reaktionsgemisch aus Phosphatidylethanolamin, behandelt mit Phospholipase D (die Triton X-100 und MgCl₂ enthält), ersetzt, und dann wird bei 37°C während 10 Minuten inkubiert, um das Phosphatidylethanolamin zu analysieren.

Beispiel 2
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)\|0,5 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin	0,3 ml
0,2% Phenol	0,3 ml
Peroxidase (45 U/ml)	0,1 ml
Ethanolaminoxidase (6 U/ml)	0,1 ml
0,5% NaN₃	0,3 ml
5% Triton X-100	0,2 ml
10 mM MgCl₂	0,3 ml
Phospholipase D (20 U/ml, Toyo Jozo Co.)	0,1 ml
destilliertes Wasser	0,8 ml
insgesamt	3,0 ml

10 mM Phospholipidemulsion (5 bis 25 µl) wird zu dem obigen Reaktionsgemisch (3 ml) zugegeben, und dann wird bei 37°C während 20 Minuten inkubiert und colorimetrisch bei 500 nm gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt, worin Phosphatidylamin und Lecithin als Phospholipid verwendet wurden. Gemäß der Figur wirkt das Enzym nicht auf Lecithin, und das Phosphatidylethanolamin konnte genau analysiert werden.

Beispiel 3
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)\|0,2 ml
Ethanolaminoxidase (6 U/ml)	0,1 ml
destilliertes Wasser	0,7 ml
insgesamt	1,0 ml

Als Vergleich wird 2 mM Ethanolamin (5 bis 25 µl) zu dem obigen Reaktionsgemisch (1 ml) zugegeben; dann wird bei 37°C während 10 Minuten inkubiert, und der verbrauchte Sauerstoff wird mittels einer Sauerstoffelektrode (Produkt von Ishikawa Seisakusho) gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 6 dargestellt. Man kann eine genaue lineare Standardkurve beobachten. Die Linearität kann bis mindestens 0,05 µmol Ethanolamin beobachtet werden.

Phosphatidylethanolamin kann quantitativ bestimmt werden, indem man Phosphatidylethanolamin, welches mit Phospholipase D (die Triton X-100 und MgCl₂ enthält) behandelt wurde, statt Ethanolamin verwendet.

Beispiel 4
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)\|0,5 ml
Ethanolaminoxidase (6 U/ml)	0,1 ml
10 mM MgCl₂	0,2 ml
5% Triton X-100	0,1 ml
Phospholipase D (20 U/ml)	0,1 ml
destilliertes Wasser	1,0 ml
insgesamt	2,0 ml

2 mM Phosphatidylethanolamin (5 bis 25 µl) wird zu dem obigen Reaktionsgemisch (2,0 ml) zugegeben, und dann wird bei 37°C während 10 Minuten inkubiert. Die Menge an freigesetztem Wasserstoffperoxid wird unter Verwendung einer Wasserstoffperoxidelektrode (YSI Co., Oxidasemeter) bestimmt, und 0,05 µmol Phosphatidylethanolamin konnte linear analysiert werden.

Die obige Wasserstoffperoxidelektrode kann durch eine Sauerstoffelektrode ersetzt werden, mit der die Menge an verbrauchtem Sauerstoff gemessen werden kann.

Beispiel 5
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)\|0,2 ml
Ethanolaminoxidase (6 U/ml)	0,1 ml
5% Triton X-100	1,0 ml
destilliertes Wasser	2,6 ml
insgesamt	3,0 ml

Als Vergleich wird 2,5 mM Ethanolamin (10 bis 50 µl) zu dem obigen Reaktionsgemisch (3,0 ml) zugegeben; dann wird bei 37°C während 15 Minuten inkubiert, anschließend wird 5 N NaOH (50 µl) zugegeben, und die Menge an freigesetztem Ammoniak wird unter Verwendung einer Ammoniakelektrode (Produkt von Ishikawa Works) gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 7 dargestellt. 0,025 µmol Ethanolamin konnte linear analysiert werden.

Anstelle von Ethanolamin, kann Phosphatidylethanolamin, welches mit Phospholipase D (die Triton X-100 und MgCl₂ enthält) bei 37°C während 10 Minuten behandelt wurde, analysiert werden.

Bezugsbeispiel

Ein wäßriges Medium (20 l, pH 6,8), welches 1,5% Pepton, 0,5% gepulverten Hefeextrakt, 0,2% KCl, 0,1% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄, 0,05% Silicon KM-72 und 0,5% Ethanolamin enthält, wird in einem 20-Liter-Fermentationsbehälter bei 120°C während 20 Minuten sterilisiert. Eine Impfkultur von Bacillus sp. B-0783 FERM-P Nr. 5798, welche auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 30°C während 20 Stunden im gleichen Medium (500 ml) gezüchtet wurde, wurde zur Inokulation des obigen Mediums verwendet. Dann wurde bei 30°C während 17 Stunden bei 3000 rpm mit einer Belüftung von 20 l/min gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde bei 5000 rpm während 20 Minuten zentrifugiert, und man erhält Bakterienzellen. Die Zellen werden in Lysozym (Eizai Co., 500 mg)- Lösung (2 l) in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und bei 37°C während 2 Stunden inkubiert, und man erhält eine rohe Enzymlösung (1700 ml, 0,2 U/ml). Kaltes Aceton (850 ml) wird zugegeben, und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren (5000 rpm, 10 Minuten) entfernt. Weiter wird kaltes Aceton (1200 ml) zu der überstehenden Lösung gegeben, und der Niederschlag wird bei 0°C und 5000 rpm während 10 Minuten abzentrifugiert.

Das Präzipitat wird in 0,1 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 100 ml), welcher 0,5 M KCl enthält, gelöst und in einem Cellophanbeutel dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert, und man erhält Ethanolaminpulver (0,1 U/mg, 3,2 g).

1,0 g Pulver wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 15 ml) gelöst und auf eine Säule (2,5×21 cm) von DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Co.) gegeben, die mit dem gleichen Puffer equilibriert ist, und dann wird mit dem gleichen Puffer (500 ml) gewaschen. Die Gradienteneluierung mit 200 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und dem gleichen Puffer, der 0,5 M KCl enthält, wird durchgeführt. Es werden je 10-ml- Fraktionen fraktioniert, und die aktiven Fraktionen Nr. 56 bis 66 werden gesammelt. Die vereinigte aktive Fraktion wird gegenüber 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert und lyophilisiert, und man erhält Ethanolaminoxidasepulver (0,7 U/ml, 110 mg).

Die Zeichnungen erläutern die Erfindung. Es zeigt

Fig. 1 den optimalen pH-Wert von Ethanolaminoxidase;

Fig. 2 die pH-Stabilitätskurve von Ethanolaminoxidase;

Fig. 3 die Wärmestabilitätskurve von Ethanolaminoxidase;

Fig. 4 die Standardkurve von Ethanolamin;

Fig. 5 die Kurve für die quantitative Analyse von Phosphatidylethanolamin durch Bestimmung der Menge an Wasserstoffperoxid;

Fig. 6 die Kurve für die quantitative Analyse von Ethanolamin durch Bestimmung der Menge an verbrauchtem Sauerstoff; und

Fig. 7 die Kurve für die quantitative Analyse von Ethanolamin mittels einer Ammoniakelektrode.

Claims

Verfahren zur Analyse von Phosphatidylethanolamin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphatidylethanolamin enthaltende Probe mit Phospholipase D und mit Ethanolaminoxidase, einem Enzym, das die Reaktion von Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser zu Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid katalysiert, behandelt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die Menge an gebildetem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid in dem Reaktionssystem mißt, wobei die Menge an Ethanolaminoxidase mehr als 0,1 U/ml beträgt.