JPS5823079B2 - 水性媒質中の過酸化水素の量および酵素酸化によって過酸化水素を発生する有機基質の量を測定する分析方法および手段 - Google Patents
水性媒質中の過酸化水素の量および酵素酸化によって過酸化水素を発生する有機基質の量を測定する分析方法および手段Info
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- JPS5823079B2 JPS5823079B2 JP54502066A JP50206679A JPS5823079B2 JP S5823079 B2 JPS5823079 B2 JP S5823079B2 JP 54502066 A JP54502066 A JP 54502066A JP 50206679 A JP50206679 A JP 50206679A JP S5823079 B2 JPS5823079 B2 JP S5823079B2
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は水性媒質中の過酸化水素、酵素的に酸化されて
過酸化水素を発生する基質、さらにこのような反応に必
要な酵素、および他の基質のＨ２Ｏ２による酸化を触媒
するペルオキシダーゼの定量に関する。
過酸化水素を発生する基質、さらにこのような反応に必
要な酵素、および他の基質のＨ２Ｏ２による酸化を触媒
するペルオキシダーゼの定量に関する。
水系中における過酸化水素濃度の測定は多（の場合、た
とえばＨ２Ｏ２を酸化剤として使用する排水処理（Ｗ、
Ｈ，Ｋｉｂｂｅｌ 、 ＰｅｒｏｘｉｄｅＴｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｗａｓｔｅ
ＷａｔｅｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｗａｔｅｒ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 Ａｕｇｕｓｔ −８ｅｐｔｅｍ
ｂｅｒ １９７６参照）および医学の診断分析において
重要である。
とえばＨ２Ｏ２を酸化剤として使用する排水処理（Ｗ、
Ｈ，Ｋｉｂｂｅｌ 、 ＰｅｒｏｘｉｄｅＴｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｗａｓｔｅ
ＷａｔｅｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｗａｔｅｒ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 Ａｕｇｕｓｔ −８ｅｐｔｅｍ
ｂｅｒ １９７６参照）および医学の診断分析において
重要である。
こうして医学的面とともに、Ｈ２０□の定量的生成を伴
なう酵素酸化反応にもとづ（多くの分析技術があり、こ
のような技術が特に価値があることは、ある酵素系の挙
動が特定の基質に対して極めて選択的であってかつ敏感
であることにもとづ（。
なう酵素酸化反応にもとづ（多くの分析技術があり、こ
のような技術が特に価値があることは、ある酵素系の挙
動が特定の基質に対して極めて選択的であってかつ敏感
であることにもとづ（。
周知のように、基質の定量的酸化を触媒して過酸化水素
の対応量を生成するために、「オキシダーゼ」を使用す
る。
の対応量を生成するために、「オキシダーゼ」を使用す
る。
その後このＨ２Ｏ２を他の酵素反応によって測定するこ
とができる、すなわちペルオキシダーゼの存在において
発生Ｈ２ｏ２によって指示染料を酸化して発色の強さで
系に存在するＨ２０□量を測定し、ついで前記Ｈ２Ｏ２
を酸化によって生成する最初に存在した基質の量を決定
する。
とができる、すなわちペルオキシダーゼの存在において
発生Ｈ２ｏ２によって指示染料を酸化して発色の強さで
系に存在するＨ２０□量を測定し、ついで前記Ｈ２Ｏ２
を酸化によって生成する最初に存在した基質の量を決定
する。
このような測定に適する酵素「オキシダーゼ」は、通常
この酵素が作用する基質の種類によって命名される。
この酵素が作用する基質の種類によって命名される。
たとえば、グルコースオキシダーゼは特にグルコースを
グルコン酸に酸化してＨ２Ｏ２を生成する触媒酵素酸化
を行ない、またコレステロールオキシダーゼは同様にコ
レステロールに作用するなどである。
グルコン酸に酸化してＨ２Ｏ２を生成する触媒酵素酸化
を行ない、またコレステロールオキシダーゼは同様にコ
レステロールに作用するなどである。
背景技術
オキシダーゼの例は当業者に周知の文献、すなわち”
Ｅｎｚｙｍｅ ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＲｅｃｏｍｍ
ｅｎｄａｔｉ ｏｎｓ”（１９７２）、Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ。
Ｅｎｚｙｍｅ ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＲｅｃｏｍｍ
ｅｎｄａｔｉ ｏｎｓ”（１９７２）、Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ。
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏ、に記載されている。
ｓｈｉｎｇ Ｃｏ、に記載されている。
このようなＨ２Ｏ２による触媒酸化に適するいくつかの
異なるペルオキシダーゼもあり、なかでも西洋大根およ
び日本太根ペルオキシダーゼがよく知られている。
異なるペルオキシダーゼもあり、なかでも西洋大根およ
び日本太根ペルオキシダーゼがよく知られている。
種々のペルオキシダーゼがＢｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ、”
Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ” ＶＯＩ、 、８（１９
６３）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されてい
る。
Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ” ＶＯＩ、 、８（１９
６３）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されてい
る。
さらにヘモグロビン、どちらかといえばその成分がある
場合にペルオキシダーゼとして作用することがある。
場合にペルオキシダーゼとして作用することがある。
前記方法の他に、いくつかの他の酵素源を生物学的液体
中の媒質、たとえば血液または尿のなかのグルコースを
測定するのに使用することができる。
中の媒質、たとえば血液または尿のなかのグルコースを
測定するのに使用することができる。
こうしてグルコースオキシダーゼによって触媒された酸
化反応によって生成したＨ２０□はペルオキシダーゼの
存在において染料を定量的に酸化することによって滴定
する他に、半透膜を有する電極を使用してこのＨ２Ｏ２
の量をポーラログラフ測定することもできる。
化反応によって生成したＨ２０□はペルオキシダーゼの
存在において染料を定量的に酸化することによって滴定
する他に、半透膜を有する電極を使用してこのＨ２Ｏ２
の量をポーラログラフ測定することもできる。
あるいは生成したＨ２０□を定量する代わりに、グルコ
ースの酸化によって消費された酸素を気体透過膜を有す
る電極、たとえば周知の「クラーク電極」で測定するこ
とができる。
ースの酸化によって消費された酸素を気体透過膜を有す
る電極、たとえば周知の「クラーク電極」で測定するこ
とができる。
しかし、上記分析法は欠点を有する。
たとえば比色分析法は試料がもともと無色であって、か
つ汚染していないことが必要であり、そうでないと有意
な測定誤差を生じる。
つ汚染していないことが必要であり、そうでないと有意
な測定誤差を生じる。
また膜を有する電気的方法は膜を注意深く取扱う必要が
あり、そうでないと細菌が汚染して電極を劣化させるこ
とになる。
あり、そうでないと細菌が汚染して電極を劣化させるこ
とになる。
さらに、一般的な系および方法によって、酵素酸化にお
いてＨ２０□を生成する有機基質、またはこの酸化中に
生成するＨ２０□、さらにこのような反応において触媒
として作用する酵素自体を定量することも望ましい。
いてＨ２０□を生成する有機基質、またはこの酸化中に
生成するＨ２０□、さらにこのような反応において触媒
として作用する酵素自体を定量することも望ましい。
本発明の目的は上記欠点を解消して、このような汎用的
な分析方法および系を提供することである。
な分析方法および系を提供することである。
本発明はペルオキシダーゼの存在においてＨ２０□によ
って所定のふっ素化合物を酸化して、ふっ素原子をふっ
素イオンとして定量的に分離する公知の現象にもとづ（
。
って所定のふっ素化合物を酸化して、ふっ素原子をふっ
素イオンとして定量的に分離する公知の現象にもとづ（
。
このことは、” Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍ １ｓｔｒｙ”、Ｖｏｌ、２、Ｃｈａｐｔｅｒ ２８
、ｐａｇｅ １０００〜１００１、（１９６４） Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ ５ｅｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌ。
ｍ １ｓｔｒｙ”、Ｖｏｌ、２、Ｃｈａｐｔｅｒ ２８
、ｐａｇｅ １０００〜１００１、（１９６４） Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ ５ｅｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌ。
ｃｏ、に、安定なＣ−Ｆ、Ｃ−ＢｒおよびＣ−Ｉ結合を
有する有機ハロゲン化合物のペルオキシダーゼ酸化につ
いての研究とともに記載されている。
有する有機ハロゲン化合物のペルオキシダーゼ酸化につ
いての研究とともに記載されている。
発明の開示
特にこの反応に適する化合物はｐ−フルオロアニリンで
ある。
ある。
さて本発明者はこの反応中に生成したＦ−イオンがＦ−
選択電極、たとえば９６−０９”０ｒｉｏｎ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｉ ｎｃ、 、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 。
選択電極、たとえば９６−０９”０ｒｉｏｎ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｉ ｎｃ、 、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 。
Ｍａｓｓ、ＵＳＡ を使用して容易にかつ精密に測定
できることを見出した。
できることを見出した。
これより、Ｈ２Ｏ２およびペルオキシダーゼの二成分の
いずれカ一つを水媒質中で定量的に測定するために利用
できる本発明の一般的方法は、この媒質を有機ふっ素化
合物の過剰と反応させて、ペルオキシダーゼによって触
媒されたＨ２０□の反応によってそのＣ−Ｆ結合を開裂
して、ついでふっ素陰イオンを遊離させ、選択的にふっ
素イオンに対して敏感な電極を使用して、ふっ素イオン
生成率を電気化学的に測定することからなる。
いずれカ一つを水媒質中で定量的に測定するために利用
できる本発明の一般的方法は、この媒質を有機ふっ素化
合物の過剰と反応させて、ペルオキシダーゼによって触
媒されたＨ２０□の反応によってそのＣ−Ｆ結合を開裂
して、ついでふっ素陰イオンを遊離させ、選択的にふっ
素イオンに対して敏感な電極を使用して、ふっ素イオン
生成率を電気化学的に測定することからなる。
換言すればＦ−生成率はペルオキシダーゼ濃度を一定に
保ちながら、Ｈ２０□量に比例し、またはＨ２Ｏ２存在
量が測定反応中に消費した量を無視できる程十分に多量
であるときは、この生成率はベルロキシダーゼ存在量に
比例する。
保ちながら、Ｈ２０□量に比例し、またはＨ２Ｏ２存在
量が測定反応中に消費した量を無視できる程十分に多量
であるときは、この生成率はベルロキシダーゼ存在量に
比例する。
従って当業者に周知の手段によっていずれかの型の測定
に適する分析条件とすることが必要である。
に適する分析条件とすることが必要である。
Ｆ−イオンに極めて敏感であるが、試料中に存在する他
の物質には極めて鈍感である電極を使用≧してＦ−濃度
対時間を電気化学的に測定する。
の物質には極めて鈍感である電極を使用≧してＦ−濃度
対時間を電気化学的に測定する。
これは本発明の方法の一つの利点である。
他の利点はこのような電極がもともと丈夫で、衝撃に対
して相対的に鈍感であって、保守および校正が容易であ
るので、従来技術の電極より操作が有意に容易である。
して相対的に鈍感であって、保守および校正が容易であ
るので、従来技術の電極より操作が有意に容易である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は次の反応によって生成するＦ−イオンの
電気化学的測定にもとづ（。
電気化学的測定にもとづ（。
勿論、基質が何らかの酵素酸化によってＨ２０２がその
場で生成するときに同一の基本技術を応用することがで
きる。
場で生成するときに同一の基本技術を応用することがで
きる。
こうしてグルコースオキシダーゼの存在でグルコースを
酸化して同時にＨ２Ｏ２を生成するときに、過酸化水素
または使用したグルコースオキシダーゼを上記方法によ
って測定することができる。
酸化して同時にＨ２Ｏ２を生成するときに、過酸化水素
または使用したグルコースオキシダーゼを上記方法によ
って測定することができる。
従って本発明はグルコースあるいは、上記反応（１）と
次の反応（１ａ）とを組合せてオキシダーゼを測定する
こともできる。
次の反応（１ａ）とを組合せてオキシダーゼを測定する
こともできる。
同様に本発明の方法は触媒酸化によって過酸化水素を定
量的に生成する他の基質の定量にも応用できる。
量的に生成する他の基質の定量にも応用できる。
たとえばコレステロールオキシダーゼの存在において酸
化させるコレステロールの場合である。
化させるコレステロールの場合である。
本発明の方法の一般的原理および応用を要約すれば、発
明の基礎的な系は、緩衝液中の適当量のＨ２Ｏ２と、ペ
ルオキシダーゼと、ふっ素化合物とからなり、Ｈ２Ｏ２
は酸化剤であり、ペルオキシダーゼはｐ−フルオロアニ
リンの酸化において触媒として作用し、これはアクセプ
タとして挙動し、相対的に当量を使用してその実際の消
費が反応速度式に影響することを防止する。
明の基礎的な系は、緩衝液中の適当量のＨ２Ｏ２と、ペ
ルオキシダーゼと、ふっ素化合物とからなり、Ｈ２Ｏ２
は酸化剤であり、ペルオキシダーゼはｐ−フルオロアニ
リンの酸化において触媒として作用し、これはアクセプ
タとして挙動し、相対的に当量を使用してその実際の消
費が反応速度式に影響することを防止する。
従って反応率はＨ２Ｏ。
およびペルオキシダーゼのそれぞれの濃度に関係する。
もしペルオキシダーゼ（触媒）を所定の一連の測定にお
いて一定とすれば、反応はＨ２Ｏ２量に関係し、ｐ−フ
ルオロアニリンの酸化による対応するＦ−生成率を測定
することによって種々なＨ２Ｏ２量を測定することがで
きる。
いて一定とすれば、反応はＨ２Ｏ２量に関係し、ｐ−フ
ルオロアニリンの酸化による対応するＦ−生成率を測定
することによって種々なＨ２Ｏ２量を測定することがで
きる。
さらに反応率測定が極めて短時間に行なわれ、この間に
おけるＨ２０□濃度の変化を無視できるときには、反応
は擬−零次となって、反応率の結果の計算な容易にする
。
おけるＨ２０□濃度の変化を無視できるときには、反応
は擬−零次となって、反応率の結果の計算な容易にする
。
この系でＨ２０□の代わりにペルオキシダーゼを測定し
ようとするときは、Ｈ２０□量をペルオキシダーゼに対
して大過剰、すなわち飽和させて、過酸化水素が消費さ
れても実際上無視できるようにして測定した、Ｆ−生成
率がペルオキシダーゼ量に比例するようにする。
ようとするときは、Ｈ２０□量をペルオキシダーゼに対
して大過剰、すなわち飽和させて、過酸化水素が消費さ
れても実際上無視できるようにして測定した、Ｆ−生成
率がペルオキシダーゼ量に比例するようにする。
上記系を使用して対応するオキシダーゼの存在において
有機基質の酸化およびＨ２０□の生成をもたらすプリカ
ーサ系を測定するときは、上記と同様にして行なうこと
ができる。
有機基質の酸化およびＨ２０□の生成をもたらすプリカ
ーサ系を測定するときは、上記と同様にして行なうこと
ができる。
こうしてこの系がたとえばグルコースオキシダーゼの存
在において酸素によってグルコースを酸化して、試料に
含まれるグルコースを測定しようとするときは、ペルオ
キシダーゼの触媒反応によって消費されるＨ２Ｏ２をグ
ルコースの酸化によって生成するＨ２０□よりも反応率
が遥かに高いような適当な条件とする。
在において酸素によってグルコースを酸化して、試料に
含まれるグルコースを測定しようとするときは、ペルオ
キシダーゼの触媒反応によって消費されるＨ２Ｏ２をグ
ルコースの酸化によって生成するＨ２０□よりも反応率
が遥かに高いような適当な条件とする。
これによってＦ−遊離率はグルコースの酸化におけるＨ
２０□生成の測定となる。
２０□生成の測定となる。
このような条件が得られる理由は、ペルオキシダーゼ反
応自身がオキシダーゼ反応よりも遥かに速かであり、カ
リこの系における各酵素の相対量を各場合において当業
者が通常使用する手段によってこのような条件を有効に
保つことができるためである。
応自身がオキシダーゼ反応よりも遥かに速かであり、カ
リこの系における各酵素の相対量を各場合において当業
者が通常使用する手段によってこのような条件を有効に
保つことができるためである。
こうして上記強調したように、適当な一定量のオキシダ
ーゼを存在させてグルコースを定量するか、あるいはグ
ルコースを飽和して存在させてオキシダーゼ自身を定量
することができる。
ーゼを存在させてグルコースを定量するか、あるいはグ
ルコースを飽和して存在させてオキシダーゼ自身を定量
することができる。
各場合において有機基質および対応するオキシダーゼを
含む他の系にこの一般的方法を応用することができる。
含む他の系にこの一般的方法を応用することができる。
勿論前述の型以外の電極も、溶解した他の物質の存在に
おいてＦ−イオンを定量するために特に適するものであ
れば、本発明の方法において使用することができる。
おいてＦ−イオンを定量するために特に適するものであ
れば、本発明の方法において使用することができる。
これらの条件が満たされるならば、電極を古典的な型の
照合電極と組合せ、この電極系を適当な読取装置、増幅
器、測定器、記録計に連結して、ＩＩＪｆｆｌした電気
化学的パラメータを記録することができる。
照合電極と組合せ、この電極系を適当な読取装置、増幅
器、測定器、記録計に連結して、ＩＩＪｆｆｌした電気
化学的パラメータを記録することができる。
これらについては後に詳述する。
実際的見地から、一般的な分析方法は、たとえばＨ２０
□の測定の場合に次のようである。
□の測定の場合に次のようである。
測定すべきＨ２Ｏ２溶液試料をペルオキシダーゼおよび
過剰のｐ−フルオロアニリンを含む反応剤溶液と混合し
、電極系を使用して、室温または他の適当な制御された
一定の温度において、Ｆ−遊離率を測定する。
過剰のｐ−フルオロアニリンを含む反応剤溶液と混合し
、電極系を使用して、室温または他の適当な制御された
一定の温度において、Ｆ−遊離率を測定する。
もし分析試料が、測定すべきＨ２Ｏ２をはじめに含まな
いとき、すなわち酵素酸化においてＨ２０□を発生する
物質、たとえばグルコースの測定に関する分析であると
きは、反応剤溶液は対応するオキシダーゼも含む。
いとき、すなわち酵素酸化においてＨ２０□を発生する
物質、たとえばグルコースの測定に関する分析であると
きは、反応剤溶液は対応するオキシダーゼも含む。
グルコースの代りにグルコース−オキシダーゼを測定し
ようとするときは、この系は過剰のグルコースを含むで
あろう。
ようとするときは、この系は過剰のグルコースを含むで
あろう。
既述のように、この場合はＨ２０□の発生が反応率決定
段階であり、実際に測定されたＦ−遊離率はオキシダー
ゼによって触媒されたグルコースの酸化率に対応する。
段階であり、実際に測定されたＦ−遊離率はオキシダー
ゼによって触媒されたグルコースの酸化率に対応する。
未知の試料についてＦ−遊離率を測定するために、校正
曲線について照合することが好ましい。
曲線について照合することが好ましい。
校正曲線は、上記のように既知濃度の”２０２を含む一
連ノ試料を測定することによって得うレル。
連ノ試料を測定することによって得うレル。
各試料についてＦ−遊離率を記録し、勿論各試料につい
て同一であるが遊離率曲線がほぼ直線であるときにこの
遊離率の曲線の勾配を測定する。
て同一であるが遊離率曲線がほぼ直線であるときにこの
遊離率の曲線の勾配を測定する。
次にこれらの勾配なＨ２Ｏ２濃度に対してプロットして
、標準の照合曲線を作製する。
、標準の照合曲線を作製する。
この遊離率曲線の測定において測定すべき電気的パラメ
ータは電極系の読取り電圧（ｍＶ）であるが、またはネ
ルンスト式から計算した対応する〔Ｆ−〕の値が一層良
好である。
ータは電極系の読取り電圧（ｍＶ）であるが、またはネ
ルンスト式から計算した対応する〔Ｆ−〕の値が一層良
好である。
この場合Ｅ＝Ｅ’−８−１ａｇ ＣＦ ）
の式で表わされる。
式中Ｅは記録した電位、Ｅ′は系に固有な常数であって
、実験的に決定され、活性係数と液体連結電位とを含む
。
、実験的に決定され、活性係数と液体連結電位とを含む
。
Ｓはネルンスト勾配で、これも常数であって、Ｆ−濃度
をｍｏｌ／７で表わすときに１０単位の変化に対してほ
ぼ５９ｍＶである。
をｍｏｌ／７で表わすときに１０単位の変化に対してほ
ぼ５９ｍＶである。
もし〔Ｆ−〕の値を上式から計算し、ｍＶの値の代わり
に電位変化を曲線として使用すると、この曲線は直線と
なり、その勾配は測定が容易であるので照合グラフを一
層精密に描くことができる。
に電位変化を曲線として使用すると、この曲線は直線と
なり、その勾配は測定が容易であるので照合グラフを一
層精密に描くことができる。
こうしてこの分析方法および系は、選択的にＦ−に対し
て敏感な通常得られる電極を使用し、かつＨ２Ｏ２によ
って触媒変化されてＦ−イオンを定量的に生成すること
ができる有機ふっ素化合物を使用できるが、ペルオキシ
ダーゼの存在においてＨ２Ｏ２によって触媒酸化される
ｐ−フルオロアニリンの使用が好ましい。
て敏感な通常得られる電極を使用し、かつＨ２Ｏ２によ
って触媒変化されてＦ−イオンを定量的に生成すること
ができる有機ふっ素化合物を使用できるが、ペルオキシ
ダーゼの存在においてＨ２Ｏ２によって触媒酸化される
ｐ−フルオロアニリンの使用が好ましい。
この分析方法および系は、血液、尿および唾液のような
生物学的液体中に通常存在する化学的または生物学的の
種々な成分であって、空気また０２によって酵素酸化さ
れてＨ２０□を生成する物質を定量的に測定することが
できる。
生物学的液体中に通常存在する化学的または生物学的の
種々な成分であって、空気また０２によって酵素酸化さ
れてＨ２０□を生成する物質を定量的に測定することが
できる。
添付図面を参照しながら次の実施例によって本発明の実
際的な面を一層明解に説明する。 第１ａ図は実施例１の結果にもとづいてＨ２０□濃度の
異なる試料について、電極電位（ｍＶ）対時間の関係を
示す実験的校正曲線であり、第１ｂ図は第１ａ図の曲線
の初期の電位勾配ｄＶ／ｄｔ 対Ｈ２Ｏ２濃度の関係を
示すグラフであり、第２ａ図は実施例２の結果にもとづ
いて、第１ａ図と同様であるが、種々なグルコース溶液
試料のグルコースオキシダーゼ酸化の場合に測定したＦ
−生成率（電位ｍＶ対時間）曲線であり、第２ｂ図は第
１ｂ図と同様であるが、第２ａ図の曲線の電位勾配ｄｍ
Ｖ／ｄｔ対試料のグルコース濃度の関係を示すグラフで
あり、第３ａ図は第２ａ図と同様であるが、コレステロ
ールオキシダーゼの存在においてコレステロールを酸化
してＨ２０□を生成し、このＨ２０□でｐ−フルオロア
ニリンを定量的に酸化し、これに対応してＦ−イオンを
遊離する実験的生成率（ｍＶ対時間）曲線であり、第３
ｂ図は第３ａ図の曲線のｄｍＶ／ｄｔ対試料のコレステ
ロール濃度の関係を示す標準曲線であり、第４ａ図は第
２ａ図と同様であるが、実線が上記のようにネルンスト
式から計算したＣＦ−）濃度（ふっ素陰イオンμ？／ｌ
！ ）、対時間の関係を示し、破線が２？／ｌグルコー
ス溶液の分析において、触媒酸化によってＨ２Ｏ。 を生成し、このＨ２０□が遊離するＦ−に対応する電位
ｍＶ対時間の関係を示すグラフであり、第４ｂ図は一連
の既知試料について、実線が勾配ｄ（Ｆ−、ｌ／ｄｔ対
グルゴグルコース濃度が勾配ｄ（ｍＶ）／ｄｔ対グルコ
ース濃度の関係をそれぞれ示すグラフであり、第５ａ図
は過剰のＨ２Ｏ２の存在においてペルオキシダーゼの量
を変化させて測定した系におけるＦ−生成率、〔Ｆ−〕
濃度対／時間の関係を示すグラフであり、第５ｂ図は第
５ａ図の各曲線の３０ ｓｅｃにおける勾配対試料のペ
ルオキシダーゼ含量の関係を示すグラフであり、第６ａ
図は過剰のグルコースの存在においてグルコースオキシ
ダーゼを測定した反応における〔Ｆ−〕濃度対時間の関
係を示すグラフであり、第６ｂ図は第６ａ図の各曲線の
３０ｓｅｃにおける勾配ｄＶ／ｄｔ対グルコースオキシ
ダーゼ濃度の関係を示すグラフである。 実験室および産業における利用可能性 次の溶液を調製した。 （１）酵素溶液ＳＥ：西洋大根ペルオキシダーゼ（６０
０Ｕ）１０１ｎ９をｐＨ６，４の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝
液１０ｍ１に溶解した。 （１１）有機ふっ素化合物溶液Ｓ。 Ｆ ：氷酢酸１．７ｍｌおよびＮａＣ１１，７４ＰをＨ
２Ｏ２０７７１１に溶解し、次にこれに５ＭＮａＯＨ溶
液および水を十分に加えてｐＨ５〜５．５の酢酸塩緩衝
液３０ＴＬｌとした。 次にＴＷＥＥＮ２０（ポリエチレンオキサイドソルビタ
ンモノラウレート、ＩＣＩ）０．３Ｐおよびナトリウム
ラウリルサルフェート０．２１を温度６０℃で加え、次
にｐ−フルオロアニリン０．３２をＨ２Ｏ２０ｍ１に溶
解した溶液を加え、この混合物を６０℃で攪拌して均一
な溶液とした。 次にこの溶液を冷却した後に水を加えて１００ｍ１とし
た。 （ｍ） 反応剤溶液ＳＲ二二相用直前溶液ＳＣＦ ５
ｒｎｌと溶液ＳＥＯ，１ｍｌとを混合して調製した。 こうして溶液ＳＲ５，１７をプラスチックビー力に入れ
、このなかに選択的にＦ−に対して敏感な電極（９５−
０９型、０ｒｉｏｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）を入れた。 この電極はこれと組合せた照合電極を有したが、−選択
的にＦ−に対して敏感な他の電極を別の補足的電極とと
もに回路内で使用することもできる。 電極を適当な電位計、この場合はＣｏｒｎｉｎｇＥＥＬ
１１２型研究用デジタルｐＨ計、ＣｏｒｎｉｎｇＳｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎ５ｔ０、Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、 Ｍ
ａｓｓ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、の記録電圧計に接続した。 相対的ｍ■で読取った。 読みが安定なときに、校正用Ｈ２０□溶液Ｑ、１ｍｌを
磁気攪拌しながら加えた。 校正用Ｈ２Ｏ２溶液は０．４．０．８および１．６２／
１Ｈ２０２水溶液を使用した。 次に電圧の読みは変化し始め、時間の経過とともに電圧
計の記録用紙に読みを記録した。 第１ａ図は上記Ｈ２０□の３試料に対応して記録した３
本の曲線を示す。 これらの曲線の初期の部分は適当に直鎖状である。 次にこれらの曲線の勾配を対応するＨ２０□濃度に対し
てプロットして第１ｂ図を得た。 留意すべきことは、反応時間の経過につれてＦ−陰イオ
ンによって触媒酸化がある程度阻害されて反応率がいく
らか低下するにも拘らず、第１ａ図の曲線の曲率は正常
な曲線である。 第１ｂ図の標準曲線ｄＶ／ｄｔは、未知Ｈ２０□試料の
測定において照合として使用できる程度に十分な直線性
を有する。 このような測定において未知試料は上記のように正確に
処理でき、反応速度曲線を記録する。 適当な点における勾配を測定し、第１ｂ図の標準曲線を
使用して試料の対応する濃度を決定する。 勿論所望の濃度の他の校正試料を使用して、標準曲線を
、Ｈ２Ｏ２濃度０．４Ｐ／Ａ以下または１．６Ｐ／１以
上に延長することができる。 実施例 ２ この例は水溶液中のグルコースの分析に関する（反応（
１ａ）および（１）を参照）。 （ｉ） 酵素溶液ＳＥ：この溶液の調製は、グルコー
スオキシダーゼ３０００Ｕおよび西洋大根ペルオキシダ
ーゼ６００ＵをｐＨ６，４の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液７
ｍｌ中に溶解し、これにさらに緩衝液を加えて正確に１
０ＴＬｌとした。 この溶液は使用前に３℃で貯蔵した。 （！り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＣＦ ：これ
は実施例１の対応する溶液に、さらにＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）０．１２Ｐを加えて、試料中に存在
する可能性があって、Ｆ−イオンをいくらか結合して測
定を妨害する金属イオンを錯化スるようにしたことのみ
が相違する。 次に照合り゛ラフの作製は実施例１に記載するように、
溶液ＳＣＦ １．５７７Ｌｌおよび溶液５ＥＯ１１１
ｒＬｌをポリエチレンビーカに入れ、これを攪拌しなが
らグルコース標準溶液０．１ ｍｌを加えた。 この標準溶液は安息香酸１？／ｌ溶液にグルコース０．
５．１．２．３．４および５？／ｌを溶解させた水溶液
である。 次に電位一時間曲線を走らせ、第２ａ図の記録値をプロ
ットした。 その後曲線の直線部分で測定した勾配を使用して第２ｂ
図の標準グラフ射作製した。 次に第２ｂ図の標準曲線を使用して、未知試料のグルコ
ース濃度を決定した。 このとき未知試料０、１ ｍｌに溶液ＳＣＦ ５ｍｌ
および溶液ＳＥ０．１７７１１を混合して、上記のよう
に曲線を正確に描いた。 試料は市販の比較用血清試料（Ｐ型、Ｘ−２７３９０ツ
ト）、Ｈｏｆｆｍａｎｎ −Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＆ Ｃ
ｏ、、Ｂａ５ｅｌ 、 ５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄを使用
した。 この試料は凍結乾燥状態で市販され、指示シーＩ・に従
って希釈した。 試験の結果は第２ａ図の曲線Ｃ８として示す。 この曲線の勾配は０．３４８ ｍｖ／ ｓｅｃであり、
第２ｂ図によるとグルコース２．１８ ！／ｌ：に対応
する。 この試料の製造者によれば従来技術の他のグルコース測
定方法は次の分析値を与えた。 こうして、本発明の手段によって決定した値は上記範囲
に含まれる。 しかし留意すべきことは、標準曲線、従って、測定の精
密性を改良するためには、電圧計から直接読取るｍＶの
値の代わりに、上記ネルンスト式から計算した対応する
ＣＦ−、ｌの値を使用することが有利である。 計算した濃度〔Ｆ−〕を反応時間に対してプロットする
と、一つの曲線を得る（第４ａ図参照）。 この曲線の勾配は約６〜１００ ｓｅｃのかなり長時間
にわたって実際上一定である。 これはこの曲線に対数相関があるので曲率がなくなるた
めである。 このため、Ｆ−生成速度を支配するパラメータの精密な
決定は第１ａまたは１ｂ図の電圧変化曲線を使用するよ
りも第４ａ図の曲線を使用する方が容易にできる。 一般にこの勾配はｔ＝３０ｓｅｅ、電極系が平衡に達し
た瞬間の零時間で測定することが有利である。 これに関して、少量のふつ化物（ＣＦ ）＝１ｏ”Ｍ
）を反応混合物に加えることも有利である、これは平衡
時間を、ふつ化物を付加的に加えないときの約６ｍｍと
比べて約６０ ｓｅｃに短縮する力・らである。 これらの改良は後にさらに実施例４および第４ｂ図に関
して述べるが：第４ａ図について測定した勾配を対応す
る校正試料濃度に対してプロットしである。 実施例 ３ この実施例は前記反心１）および次の反応（１ｂ）によ
ってコレステロールを分析する。 （１）酵素溶液Ｓ。 ：この溶液はｐＨ６，０の０．１Ｍりん酸塩緩衝液５ｒ
ＩＬｌにコレステロールオキシダーゼ１００Ｕ１西洋大
根ペルオキシダーゼ６００ＵおよびＴＲＩＴＯＮＸ−１
００（インオクチルーフエノキシ−ポリエチレングリコ
ールＲｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ、ＵＳＡ）５７７１ｐを溶
解して調製した。 次にさらにりん酸塩緩衝液を加えて１０ｍ１とし、この
溶液を使用前に１〜５℃で貯蔵した。 （！り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＣＦ ：この
溶液は前の実施例と同様に、６０℃において０．１Ｍり
ん酸塩緩衝液約５０Ｉ７ＩｌＫＴＲＩＴＯＮＸ−１ｏｏ
ｏ、３Ｐ、コレイン酸ナトリウム０．１？、ＮａＣ
１０，５８？、次にｐ −７／ｌｚ 、ｔ ０７ ＝
リン０．３２を攪拌しながら加えた。 溶液がよ（均質になったときに冷却してりん酸塩緩衝液
を加えて１００ ｍｌとした。 （ｉｉＤ コレステロール標準試料ｓ。 Ｈ：こレバコレステロール（”ＰＲＥＣＩＳＥＴ”数、 Ｂｏｅｈｒｉｒｇｅｒ 、 ＭａｎｎｈｅｉｍｌＧｅｒ
ｍａｎｙ ）を水に溶解して１．２．３および４？／７
３の試料を調製した。 分析はアリコー）０．０１ｍ１上で行なった。 分析自身のために、前の実施例で記載した操作。 と同一操作を行なった二溶液Ｓ。 Ｆ５ＴＬｌおよび溶１ｓＥｏ、 ｉ ｒｎｌをプラスチ
ックビーカ内で攪拌し、この間上記Ｆ−に敏感な電極系
によって電位を測定した。 平衡に達したときに、一つの試料５ｃＨＯ，０１７７１
１を加え、時間の経過に伴なう電位変化を記録した。 得た曲線を第３ａ図に示す。次にこれらの曲線の勾配を
前の実施例と同様に測定し、これらの勾配値を対応する
試料のコレステロール濃度に対してプロットした結果を
第３ｂ図に示す。 これは後に未知試料中のコレステロールを決定するため
に使用した。 分析すべきこれらの溶液のアリコートについて上記校正
試料と同一操作を行なった。 実施例 ４ この実施例の目的は、特にｄ（Ｆ−、ｌ／ｄｔの値対分
析試料の濃度をプロットして得る標準グラスの作製を説
明するためである。 （１）酵素溶液ＳＥ ： ０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液を通
常の操作で調製した。 また西洋大根ペルオキシダーゼ６００Ｕおよびグルコー
スオキシダーゼ３００ＵをｐＨ６，４の緩衝液１ｏｒｕ
ｌに溶解した。 溶液ＳＥは使用前３°Ｃで貯蔵した。 （！り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＦ ：この溶液
はｐＨ５，５のＱ、５ｙｙｙｌ酢酸塩緩衝液１９９ｍ１
にＥＤＴＡｏ、１８グ、ｐ−フルオロアニリン０．１２
および１．０ ”ＭＮａＦ’溶液１ｍ溶液１解ｌて調
製した。 次に前の実施例と同様にして分析した、すなわち溶液Ｓ
Ｆ ４． ｓ ｍｌ、溶液ＳＥ０．１＋７１１およびグ
ルコース溶液（下表参照）ｏ、ｉｍｌをポリエチレンビ
ーカ内で磁気攪拌した。 電位対時間の曲線を記録し、平衡後ｔ＝３０ｓｅｃにお
けるｍ■の読みを上記ネルンスト式によって対応するＣ
Ｆ ）の値（μ？／ｌ単位）に変換した。 これらの結果は次表に集めである。 これらの数字を第４ｂ図のグラフにプロットした。 このグラフの破線はｄＶ／ｄｔ対グルコース濃度、実線
はｄＣＦ−〕／ｄｔ対グルコース濃度を表わす。 図示のように実線は測定誤差の範囲で直線である。 これを本発明の方法による未知グルコース濃度の評価用
標準として使用した。 実施例 ５ この実施例は過剰の過酸化水素の存在におけるペルオキ
シダーゼの測定を報告する。 （り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＣＦ ：この溶
液は前の実施例と同様にして調製し、ｐ−フルオロアニ
リンｏ、５ＰおよびＮａＦ１μｍｏｌを含む０．３Ｍ酢
酸塩緩衝液１００７７１１（１０”ＭＦ−溶液）であっ
た。 （１１）過酸化水素在庫品：これは１０ ’Ｍ、すな
わち溶液１１に純Ｈ２Ｏ２０，３４１を含む溶液であっ
た。 （＊ｉ） ペルオキシダーゼ標準溶液ＳＥ：この溶液
は１ ｍｌにライて酵素１．２．２，４．３．６．４．
８および６．ＯＵをそれぞれ含むように調製した。 次に前の実施例と同様にして分析した。 すなわちＳＣＦ溶液４．８ｍ１１Ｈ２０２溶液０．１
ｒｕｌに攪拌しながら２０℃（±０．１℃）で一つの溶
液ＳＥ０．１ｍｌを加えた。 測定の零時間はペルオキシダーゼ添加瞬間であった。 Ｆ−の反応速度的変化を記録し、パラメータとして前と
同様にｔ＝３０ｓｅｃの値を使用した。 第５ａ図は前述のようにｍＶＯ値から計算したＣＦ−、
ｌ（μｍｏｌ／７３）の値対時間をプロットして示す。 第５ｂ図は勾配ｄＶ／ｄ（Ｆ ）（プロットした）対
ペルオキシダーゼ濃度の関係を示す。 第５ｂ図のグラフは後に免疫学試験において未知量のペ
ルオキシダーゼ測定用に使用した。 この試験において溶液ＳＣＦ はフルオロアニリン含量
が０．０５ ’ｆｌ’／ｌと低い場合も５？／ｌの場合
と同様に挙動したことに留意することが有用である。 また在庫■■２０□溶液０．１ ｒｒｔｌ（試験量）が
実際にＨ２０□５μｍｏｌを含んでいることに注意する
ことも有用である。 これは合格標準によれば、ペルオキシダーゼＩＵがＨ２
０□１μｍｏｌ／ｍｖＬを消費し、上記試験においてペ
ルオキシダーゼの最高含有濃度（０，６Ｕ）の場合に、
３０ｓｅｃ後に消費されるＨ２０□量が利用可能量の約
２０分の１であるためである。 従って濃度の変化は無視できると考えられる。 実施例 に の例は過剰のグルコースを含む媒質中のグルコースオキ
シダーゼの測定に関する。 （り ｐ−フルオロアニリンおよびグルコースの溶液
ｓｃＦ ：この溶液は通常のようにｐＨ５，３の０．
３Ｍ１ｉ液に、ｐ−フルオロアニリン５ｍｇ、グルコー
ス３グおよび１０−３ＭＮａＦ溶液１ｒｎｌを溶解し、
これを１００ｍ１にして調製した。 （１１）ペルオキシダーゼ溶液：この溶液は６０Ｕ／ｍ
ｌを含んだ。 （１ｉ） グルコースオキシダーゼ標準溶液ＳＥ：そ
れぞれ０．１．０．２５．０．５、■および２７ｍｌ！
含む５つの溶液を調製した。 分析は前と同様に行なった。 溶液５ｃＦ４．８ＴＬｌおよびペルオキシダーゼ溶液（
６Ｕ）０．１＋７１１をポリエチレンビーカ内で磁気的
に攪拌し、ｔｏにおいて溶液ＳＥＯ，１ｍｌを加えた。 予じめ既知のＮａＦ溶液で校正したＦ−に敏感な電極の
応答を１ ｍｌｙｒ間記録し、〔Ｆ−〕対時間の曲線の
グラフを作製した。 これは第６ａ図に示す。その後裔曲線の３０ ｓｅｃに
おける勾配をグルコースオキシダーゼ濃度に対してプロ
ットして、第６ｂ図のグラフを描いた。 次にこのグラフを使用して未知量のグルコースオキシダ
ーゼを含む試料について同様な測定を行なった結果を計
算して成功した。 上の実施例はまだ最適なものではな（、上記使用法はお
そらくは本発明を実施する最良の方法ではないであろう
ことに留意すべきである。 既述のように本発明は酸素または空気によって酵素的に
、換言すれば触媒的に酸化されて過酸化水素を定量的に
生成する多（の基質を分析的に測定する多くの場合に役
立つ。 次表はこの分野における可能性をいくつか要約したもの
であって、酵素、酵素が酸化触媒として作用する基質お
よびこの酸化によって生成する生成物を示す。 本発明においてペルオキシダーゼの存在においてＨ２０
□でＣ−Ｆ結合を開裂し、この分離率がＨ２Ｏ２量に比
例する他の有機ふっ素化合物を使用できることに留意す
べきである。 本発明の分析に使用する他の反応剤、すなわち緩衝剤、
表面活性剤、保存剤などの選択およびこれらの成分の相
対量は必要に応じて変化させることができる。 こうして本発明の方法は当業者が変更または変化するこ
とができる。 本発明の反応パラメータ読取技術の変更の一つとして、
各試料について所定の反応時間の後に到達した平衡電位
をキーバラメータとすることがある。 この時間はもつとも再現性のよい結果を得るように実験
的に決定する必要がある。 従ってこの技術は酵素反応が一定の平衡に到達すること
に関して、周知の方法によって「終点測定」と呼ばれる
静止型測定にもとづくものであろう。 このような変更を行なうために、各試料を使用して平衡
電位■。 を測定し、Ｖ８と対応する試料の濃度との関係を確立す
る。 この変更は自動測定系によ（適している。 このような系は上記関係データを記憶するメモリー、試
料を取上げて反応剤と接続させる自動的循環および混合
装置、電位抑流用の電極系および測定値を記憶メモリー
と比較する計算機を含み、こうして直接かつ自動的に所
望の結果を得ることができるであろう。 さらにこれらの実施例に記載した一般的方法、特に第４
ａおよび４ｂ図に関する方法も自動化することができる
。 すなわち校正パラメータのデータを電気的に処理して、
たとえばｄＶ／ｄｔ またはｄ（Ｆ−）／ｄｔのパラ
メータをメモリーに記憶させた後に、未知試料について
の実際のパラメータ測定を記憶データに対して計算機化
して所望の分析結果を自動的に得ることができる。 さらに実施例７〜１７はｐ−フルオロアニリン以外のふ
っ素化合物の使用を説明する。 これらの化合物（７〜１０）のうちのあるもののグルコ
ースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの存在におけ
るグルコース分析の挙動を対応する第７ａ〜１０ａ図お
よび第７ｂ〜１０ｂ図に説明する。 数字Ｋａを付した図面に示すパラメータ曲線はすべてグ
ルコースを１１／ｌ、３グ／ｌおよび５１／ｌそれぞれ
含む試料０．１ ｍｌを、ペルオキシダーゼ６Ｕ、グル
コースオキシダーゼ３０Ｕおよびふっ素化合物４．８ｍ
９の存在において測定し、１０ ’ＭＮａＦの存在に
おいてｐＨ５，３の酢酸塩緩衝液中で分析して得たもの
である。 一方数字にｋを付した図面においては３０ ｓｅｃにお
けるｄＶ／ｄｔの値をグルコース濃度に対してプロット
して得たものである。 またこのようなふっ素化合物は次表に示し、分析条件は
すべて同一とし、このような化合物の相対的な挙動をｐ
−フルオロアニリンの挙動に比較した。 従って下表に記載した結果は、このような化合物のなか
で、本発明の測定に適合するものに＋、適合しないもの
に一１疑問なものに川−一を付した。
際的な面を一層明解に説明する。 第１ａ図は実施例１の結果にもとづいてＨ２０□濃度の
異なる試料について、電極電位（ｍＶ）対時間の関係を
示す実験的校正曲線であり、第１ｂ図は第１ａ図の曲線
の初期の電位勾配ｄＶ／ｄｔ 対Ｈ２Ｏ２濃度の関係を
示すグラフであり、第２ａ図は実施例２の結果にもとづ
いて、第１ａ図と同様であるが、種々なグルコース溶液
試料のグルコースオキシダーゼ酸化の場合に測定したＦ
−生成率（電位ｍＶ対時間）曲線であり、第２ｂ図は第
１ｂ図と同様であるが、第２ａ図の曲線の電位勾配ｄｍ
Ｖ／ｄｔ対試料のグルコース濃度の関係を示すグラフで
あり、第３ａ図は第２ａ図と同様であるが、コレステロ
ールオキシダーゼの存在においてコレステロールを酸化
してＨ２０□を生成し、このＨ２０□でｐ−フルオロア
ニリンを定量的に酸化し、これに対応してＦ−イオンを
遊離する実験的生成率（ｍＶ対時間）曲線であり、第３
ｂ図は第３ａ図の曲線のｄｍＶ／ｄｔ対試料のコレステ
ロール濃度の関係を示す標準曲線であり、第４ａ図は第
２ａ図と同様であるが、実線が上記のようにネルンスト
式から計算したＣＦ−）濃度（ふっ素陰イオンμ？／ｌ
！ ）、対時間の関係を示し、破線が２？／ｌグルコー
ス溶液の分析において、触媒酸化によってＨ２Ｏ。 を生成し、このＨ２０□が遊離するＦ−に対応する電位
ｍＶ対時間の関係を示すグラフであり、第４ｂ図は一連
の既知試料について、実線が勾配ｄ（Ｆ−、ｌ／ｄｔ対
グルゴグルコース濃度が勾配ｄ（ｍＶ）／ｄｔ対グルコ
ース濃度の関係をそれぞれ示すグラフであり、第５ａ図
は過剰のＨ２Ｏ２の存在においてペルオキシダーゼの量
を変化させて測定した系におけるＦ−生成率、〔Ｆ−〕
濃度対／時間の関係を示すグラフであり、第５ｂ図は第
５ａ図の各曲線の３０ ｓｅｃにおける勾配対試料のペ
ルオキシダーゼ含量の関係を示すグラフであり、第６ａ
図は過剰のグルコースの存在においてグルコースオキシ
ダーゼを測定した反応における〔Ｆ−〕濃度対時間の関
係を示すグラフであり、第６ｂ図は第６ａ図の各曲線の
３０ｓｅｃにおける勾配ｄＶ／ｄｔ対グルコースオキシ
ダーゼ濃度の関係を示すグラフである。 実験室および産業における利用可能性 次の溶液を調製した。 （１）酵素溶液ＳＥ：西洋大根ペルオキシダーゼ（６０
０Ｕ）１０１ｎ９をｐＨ６，４の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝
液１０ｍ１に溶解した。 （１１）有機ふっ素化合物溶液Ｓ。 Ｆ ：氷酢酸１．７ｍｌおよびＮａＣ１１，７４ＰをＨ
２Ｏ２０７７１１に溶解し、次にこれに５ＭＮａＯＨ溶
液および水を十分に加えてｐＨ５〜５．５の酢酸塩緩衝
液３０ＴＬｌとした。 次にＴＷＥＥＮ２０（ポリエチレンオキサイドソルビタ
ンモノラウレート、ＩＣＩ）０．３Ｐおよびナトリウム
ラウリルサルフェート０．２１を温度６０℃で加え、次
にｐ−フルオロアニリン０．３２をＨ２Ｏ２０ｍ１に溶
解した溶液を加え、この混合物を６０℃で攪拌して均一
な溶液とした。 次にこの溶液を冷却した後に水を加えて１００ｍ１とし
た。 （ｍ） 反応剤溶液ＳＲ二二相用直前溶液ＳＣＦ ５
ｒｎｌと溶液ＳＥＯ，１ｍｌとを混合して調製した。 こうして溶液ＳＲ５，１７をプラスチックビー力に入れ
、このなかに選択的にＦ−に対して敏感な電極（９５−
０９型、０ｒｉｏｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）を入れた。 この電極はこれと組合せた照合電極を有したが、−選択
的にＦ−に対して敏感な他の電極を別の補足的電極とと
もに回路内で使用することもできる。 電極を適当な電位計、この場合はＣｏｒｎｉｎｇＥＥＬ
１１２型研究用デジタルｐＨ計、ＣｏｒｎｉｎｇＳｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎ５ｔ０、Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、 Ｍ
ａｓｓ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、の記録電圧計に接続した。 相対的ｍ■で読取った。 読みが安定なときに、校正用Ｈ２０□溶液Ｑ、１ｍｌを
磁気攪拌しながら加えた。 校正用Ｈ２Ｏ２溶液は０．４．０．８および１．６２／
１Ｈ２０２水溶液を使用した。 次に電圧の読みは変化し始め、時間の経過とともに電圧
計の記録用紙に読みを記録した。 第１ａ図は上記Ｈ２０□の３試料に対応して記録した３
本の曲線を示す。 これらの曲線の初期の部分は適当に直鎖状である。 次にこれらの曲線の勾配を対応するＨ２０□濃度に対し
てプロットして第１ｂ図を得た。 留意すべきことは、反応時間の経過につれてＦ−陰イオ
ンによって触媒酸化がある程度阻害されて反応率がいく
らか低下するにも拘らず、第１ａ図の曲線の曲率は正常
な曲線である。 第１ｂ図の標準曲線ｄＶ／ｄｔは、未知Ｈ２０□試料の
測定において照合として使用できる程度に十分な直線性
を有する。 このような測定において未知試料は上記のように正確に
処理でき、反応速度曲線を記録する。 適当な点における勾配を測定し、第１ｂ図の標準曲線を
使用して試料の対応する濃度を決定する。 勿論所望の濃度の他の校正試料を使用して、標準曲線を
、Ｈ２Ｏ２濃度０．４Ｐ／Ａ以下または１．６Ｐ／１以
上に延長することができる。 実施例 ２ この例は水溶液中のグルコースの分析に関する（反応（
１ａ）および（１）を参照）。 （ｉ） 酵素溶液ＳＥ：この溶液の調製は、グルコー
スオキシダーゼ３０００Ｕおよび西洋大根ペルオキシダ
ーゼ６００ＵをｐＨ６，４の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液７
ｍｌ中に溶解し、これにさらに緩衝液を加えて正確に１
０ＴＬｌとした。 この溶液は使用前に３℃で貯蔵した。 （！り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＣＦ ：これ
は実施例１の対応する溶液に、さらにＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）０．１２Ｐを加えて、試料中に存在
する可能性があって、Ｆ−イオンをいくらか結合して測
定を妨害する金属イオンを錯化スるようにしたことのみ
が相違する。 次に照合り゛ラフの作製は実施例１に記載するように、
溶液ＳＣＦ １．５７７Ｌｌおよび溶液５ＥＯ１１１
ｒＬｌをポリエチレンビーカに入れ、これを攪拌しなが
らグルコース標準溶液０．１ ｍｌを加えた。 この標準溶液は安息香酸１？／ｌ溶液にグルコース０．
５．１．２．３．４および５？／ｌを溶解させた水溶液
である。 次に電位一時間曲線を走らせ、第２ａ図の記録値をプロ
ットした。 その後曲線の直線部分で測定した勾配を使用して第２ｂ
図の標準グラフ射作製した。 次に第２ｂ図の標準曲線を使用して、未知試料のグルコ
ース濃度を決定した。 このとき未知試料０、１ ｍｌに溶液ＳＣＦ ５ｍｌ
および溶液ＳＥ０．１７７１１を混合して、上記のよう
に曲線を正確に描いた。 試料は市販の比較用血清試料（Ｐ型、Ｘ−２７３９０ツ
ト）、Ｈｏｆｆｍａｎｎ −Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＆ Ｃ
ｏ、、Ｂａ５ｅｌ 、 ５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄを使用
した。 この試料は凍結乾燥状態で市販され、指示シーＩ・に従
って希釈した。 試験の結果は第２ａ図の曲線Ｃ８として示す。 この曲線の勾配は０．３４８ ｍｖ／ ｓｅｃであり、
第２ｂ図によるとグルコース２．１８ ！／ｌ：に対応
する。 この試料の製造者によれば従来技術の他のグルコース測
定方法は次の分析値を与えた。 こうして、本発明の手段によって決定した値は上記範囲
に含まれる。 しかし留意すべきことは、標準曲線、従って、測定の精
密性を改良するためには、電圧計から直接読取るｍＶの
値の代わりに、上記ネルンスト式から計算した対応する
ＣＦ−、ｌの値を使用することが有利である。 計算した濃度〔Ｆ−〕を反応時間に対してプロットする
と、一つの曲線を得る（第４ａ図参照）。 この曲線の勾配は約６〜１００ ｓｅｃのかなり長時間
にわたって実際上一定である。 これはこの曲線に対数相関があるので曲率がなくなるた
めである。 このため、Ｆ−生成速度を支配するパラメータの精密な
決定は第１ａまたは１ｂ図の電圧変化曲線を使用するよ
りも第４ａ図の曲線を使用する方が容易にできる。 一般にこの勾配はｔ＝３０ｓｅｅ、電極系が平衡に達し
た瞬間の零時間で測定することが有利である。 これに関して、少量のふつ化物（ＣＦ ）＝１ｏ”Ｍ
）を反応混合物に加えることも有利である、これは平衡
時間を、ふつ化物を付加的に加えないときの約６ｍｍと
比べて約６０ ｓｅｃに短縮する力・らである。 これらの改良は後にさらに実施例４および第４ｂ図に関
して述べるが：第４ａ図について測定した勾配を対応す
る校正試料濃度に対してプロットしである。 実施例 ３ この実施例は前記反心１）および次の反応（１ｂ）によ
ってコレステロールを分析する。 （１）酵素溶液Ｓ。 ：この溶液はｐＨ６，０の０．１Ｍりん酸塩緩衝液５ｒ
ＩＬｌにコレステロールオキシダーゼ１００Ｕ１西洋大
根ペルオキシダーゼ６００ＵおよびＴＲＩＴＯＮＸ−１
００（インオクチルーフエノキシ−ポリエチレングリコ
ールＲｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ、ＵＳＡ）５７７１ｐを溶
解して調製した。 次にさらにりん酸塩緩衝液を加えて１０ｍ１とし、この
溶液を使用前に１〜５℃で貯蔵した。 （！り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＣＦ ：この
溶液は前の実施例と同様に、６０℃において０．１Ｍり
ん酸塩緩衝液約５０Ｉ７ＩｌＫＴＲＩＴＯＮＸ−１ｏｏ
ｏ、３Ｐ、コレイン酸ナトリウム０．１？、ＮａＣ
１０，５８？、次にｐ −７／ｌｚ 、ｔ ０７ ＝
リン０．３２を攪拌しながら加えた。 溶液がよ（均質になったときに冷却してりん酸塩緩衝液
を加えて１００ ｍｌとした。 （ｉｉＤ コレステロール標準試料ｓ。 Ｈ：こレバコレステロール（”ＰＲＥＣＩＳＥＴ”数、 Ｂｏｅｈｒｉｒｇｅｒ 、 ＭａｎｎｈｅｉｍｌＧｅｒ
ｍａｎｙ ）を水に溶解して１．２．３および４？／７
３の試料を調製した。 分析はアリコー）０．０１ｍ１上で行なった。 分析自身のために、前の実施例で記載した操作。 と同一操作を行なった二溶液Ｓ。 Ｆ５ＴＬｌおよび溶１ｓＥｏ、 ｉ ｒｎｌをプラスチ
ックビーカ内で攪拌し、この間上記Ｆ−に敏感な電極系
によって電位を測定した。 平衡に達したときに、一つの試料５ｃＨＯ，０１７７１
１を加え、時間の経過に伴なう電位変化を記録した。 得た曲線を第３ａ図に示す。次にこれらの曲線の勾配を
前の実施例と同様に測定し、これらの勾配値を対応する
試料のコレステロール濃度に対してプロットした結果を
第３ｂ図に示す。 これは後に未知試料中のコレステロールを決定するため
に使用した。 分析すべきこれらの溶液のアリコートについて上記校正
試料と同一操作を行なった。 実施例 ４ この実施例の目的は、特にｄ（Ｆ−、ｌ／ｄｔの値対分
析試料の濃度をプロットして得る標準グラスの作製を説
明するためである。 （１）酵素溶液ＳＥ ： ０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液を通
常の操作で調製した。 また西洋大根ペルオキシダーゼ６００Ｕおよびグルコー
スオキシダーゼ３００ＵをｐＨ６，４の緩衝液１ｏｒｕ
ｌに溶解した。 溶液ＳＥは使用前３°Ｃで貯蔵した。 （！り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＦ ：この溶液
はｐＨ５，５のＱ、５ｙｙｙｌ酢酸塩緩衝液１９９ｍ１
にＥＤＴＡｏ、１８グ、ｐ−フルオロアニリン０．１２
および１．０ ”ＭＮａＦ’溶液１ｍ溶液１解ｌて調
製した。 次に前の実施例と同様にして分析した、すなわち溶液Ｓ
Ｆ ４． ｓ ｍｌ、溶液ＳＥ０．１＋７１１およびグ
ルコース溶液（下表参照）ｏ、ｉｍｌをポリエチレンビ
ーカ内で磁気攪拌した。 電位対時間の曲線を記録し、平衡後ｔ＝３０ｓｅｃにお
けるｍ■の読みを上記ネルンスト式によって対応するＣ
Ｆ ）の値（μ？／ｌ単位）に変換した。 これらの結果は次表に集めである。 これらの数字を第４ｂ図のグラフにプロットした。 このグラフの破線はｄＶ／ｄｔ対グルコース濃度、実線
はｄＣＦ−〕／ｄｔ対グルコース濃度を表わす。 図示のように実線は測定誤差の範囲で直線である。 これを本発明の方法による未知グルコース濃度の評価用
標準として使用した。 実施例 ５ この実施例は過剰の過酸化水素の存在におけるペルオキ
シダーゼの測定を報告する。 （り ｐ−フルオロアニリン溶液ＳＣＦ ：この溶
液は前の実施例と同様にして調製し、ｐ−フルオロアニ
リンｏ、５ＰおよびＮａＦ１μｍｏｌを含む０．３Ｍ酢
酸塩緩衝液１００７７１１（１０”ＭＦ−溶液）であっ
た。 （１１）過酸化水素在庫品：これは１０ ’Ｍ、すな
わち溶液１１に純Ｈ２Ｏ２０，３４１を含む溶液であっ
た。 （＊ｉ） ペルオキシダーゼ標準溶液ＳＥ：この溶液
は１ ｍｌにライて酵素１．２．２，４．３．６．４．
８および６．ＯＵをそれぞれ含むように調製した。 次に前の実施例と同様にして分析した。 すなわちＳＣＦ溶液４．８ｍ１１Ｈ２０２溶液０．１
ｒｕｌに攪拌しながら２０℃（±０．１℃）で一つの溶
液ＳＥ０．１ｍｌを加えた。 測定の零時間はペルオキシダーゼ添加瞬間であった。 Ｆ−の反応速度的変化を記録し、パラメータとして前と
同様にｔ＝３０ｓｅｃの値を使用した。 第５ａ図は前述のようにｍＶＯ値から計算したＣＦ−、
ｌ（μｍｏｌ／７３）の値対時間をプロットして示す。 第５ｂ図は勾配ｄＶ／ｄ（Ｆ ）（プロットした）対
ペルオキシダーゼ濃度の関係を示す。 第５ｂ図のグラフは後に免疫学試験において未知量のペ
ルオキシダーゼ測定用に使用した。 この試験において溶液ＳＣＦ はフルオロアニリン含量
が０．０５ ’ｆｌ’／ｌと低い場合も５？／ｌの場合
と同様に挙動したことに留意することが有用である。 また在庫■■２０□溶液０．１ ｒｒｔｌ（試験量）が
実際にＨ２０□５μｍｏｌを含んでいることに注意する
ことも有用である。 これは合格標準によれば、ペルオキシダーゼＩＵがＨ２
０□１μｍｏｌ／ｍｖＬを消費し、上記試験においてペ
ルオキシダーゼの最高含有濃度（０，６Ｕ）の場合に、
３０ｓｅｃ後に消費されるＨ２０□量が利用可能量の約
２０分の１であるためである。 従って濃度の変化は無視できると考えられる。 実施例 に の例は過剰のグルコースを含む媒質中のグルコースオキ
シダーゼの測定に関する。 （り ｐ−フルオロアニリンおよびグルコースの溶液
ｓｃＦ ：この溶液は通常のようにｐＨ５，３の０．
３Ｍ１ｉ液に、ｐ−フルオロアニリン５ｍｇ、グルコー
ス３グおよび１０−３ＭＮａＦ溶液１ｒｎｌを溶解し、
これを１００ｍ１にして調製した。 （１１）ペルオキシダーゼ溶液：この溶液は６０Ｕ／ｍ
ｌを含んだ。 （１ｉ） グルコースオキシダーゼ標準溶液ＳＥ：そ
れぞれ０．１．０．２５．０．５、■および２７ｍｌ！
含む５つの溶液を調製した。 分析は前と同様に行なった。 溶液５ｃＦ４．８ＴＬｌおよびペルオキシダーゼ溶液（
６Ｕ）０．１＋７１１をポリエチレンビーカ内で磁気的
に攪拌し、ｔｏにおいて溶液ＳＥＯ，１ｍｌを加えた。 予じめ既知のＮａＦ溶液で校正したＦ−に敏感な電極の
応答を１ ｍｌｙｒ間記録し、〔Ｆ−〕対時間の曲線の
グラフを作製した。 これは第６ａ図に示す。その後裔曲線の３０ ｓｅｃに
おける勾配をグルコースオキシダーゼ濃度に対してプロ
ットして、第６ｂ図のグラフを描いた。 次にこのグラフを使用して未知量のグルコースオキシダ
ーゼを含む試料について同様な測定を行なった結果を計
算して成功した。 上の実施例はまだ最適なものではな（、上記使用法はお
そらくは本発明を実施する最良の方法ではないであろう
ことに留意すべきである。 既述のように本発明は酸素または空気によって酵素的に
、換言すれば触媒的に酸化されて過酸化水素を定量的に
生成する多（の基質を分析的に測定する多くの場合に役
立つ。 次表はこの分野における可能性をいくつか要約したもの
であって、酵素、酵素が酸化触媒として作用する基質お
よびこの酸化によって生成する生成物を示す。 本発明においてペルオキシダーゼの存在においてＨ２０
□でＣ−Ｆ結合を開裂し、この分離率がＨ２Ｏ２量に比
例する他の有機ふっ素化合物を使用できることに留意す
べきである。 本発明の分析に使用する他の反応剤、すなわち緩衝剤、
表面活性剤、保存剤などの選択およびこれらの成分の相
対量は必要に応じて変化させることができる。 こうして本発明の方法は当業者が変更または変化するこ
とができる。 本発明の反応パラメータ読取技術の変更の一つとして、
各試料について所定の反応時間の後に到達した平衡電位
をキーバラメータとすることがある。 この時間はもつとも再現性のよい結果を得るように実験
的に決定する必要がある。 従ってこの技術は酵素反応が一定の平衡に到達すること
に関して、周知の方法によって「終点測定」と呼ばれる
静止型測定にもとづくものであろう。 このような変更を行なうために、各試料を使用して平衡
電位■。 を測定し、Ｖ８と対応する試料の濃度との関係を確立す
る。 この変更は自動測定系によ（適している。 このような系は上記関係データを記憶するメモリー、試
料を取上げて反応剤と接続させる自動的循環および混合
装置、電位抑流用の電極系および測定値を記憶メモリー
と比較する計算機を含み、こうして直接かつ自動的に所
望の結果を得ることができるであろう。 さらにこれらの実施例に記載した一般的方法、特に第４
ａおよび４ｂ図に関する方法も自動化することができる
。 すなわち校正パラメータのデータを電気的に処理して、
たとえばｄＶ／ｄｔ またはｄ（Ｆ−）／ｄｔのパラ
メータをメモリーに記憶させた後に、未知試料について
の実際のパラメータ測定を記憶データに対して計算機化
して所望の分析結果を自動的に得ることができる。 さらに実施例７〜１７はｐ−フルオロアニリン以外のふ
っ素化合物の使用を説明する。 これらの化合物（７〜１０）のうちのあるもののグルコ
ースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの存在におけ
るグルコース分析の挙動を対応する第７ａ〜１０ａ図お
よび第７ｂ〜１０ｂ図に説明する。 数字Ｋａを付した図面に示すパラメータ曲線はすべてグ
ルコースを１１／ｌ、３グ／ｌおよび５１／ｌそれぞれ
含む試料０．１ ｍｌを、ペルオキシダーゼ６Ｕ、グル
コースオキシダーゼ３０Ｕおよびふっ素化合物４．８ｍ
９の存在において測定し、１０ ’ＭＮａＦの存在に
おいてｐＨ５，３の酢酸塩緩衝液中で分析して得たもの
である。 一方数字にｋを付した図面においては３０ ｓｅｃにお
けるｄＶ／ｄｔの値をグルコース濃度に対してプロット
して得たものである。 またこのようなふっ素化合物は次表に示し、分析条件は
すべて同一とし、このような化合物の相対的な挙動をｐ
−フルオロアニリンの挙動に比較した。 従って下表に記載した結果は、このような化合物のなか
で、本発明の測定に適合するものに＋、適合しないもの
に一１疑問なものに川−一を付した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水性媒質中において二つの成分、すなわちＨ２０□
およびペルオキシダーゼのいずれか一つを定量的に測定
する一般的方法であって、ペルオキシダーゼによって触
媒されたＨ２Ｏ２の作用によってＣ−Ｆ結合を開裂する
ことができる有機ふっ素化合物の過剰を前記水性媒質と
反応させて、ついでＦ−を遊離させ、選択的にＦ−に敏
感な電極によってＦ−の生成率を電気化学的に測定する
方法。 ２ 分析すべき成分がＨ２Ｏ２であって、所定のＦ−に
敏感な電極を使用して数秒または数分内に適当に測定す
るのに十分なＦ−生成率を得るようにペルオキシダーゼ
濃度を適当に定めて使用し、一連の比較分析測定の各測
定を通してこのような濃度を一定に保つ、請求の範囲第
１項の方法。 ３ 分析すべき成分がペルオキシダーゼであって、Ｆ−
生成率を測定する間、Ｈ２０□量がほぼ一定であるよう
に十分に多量のＨ２Ｏ２を特徴する請求の範囲第１項の
方法。 ４ 水性媒質中において二つの成分、すなわち有機基質
およびこれに作用するオキシダーゼのいずれか一つを定
量的に測定する方法であって、オキシダーゼ量および／
または基質量のいずれかに比例する率でＨ２０□を生成
しながら前記基質を酸化し、請求の範囲第２項の方法を
使用して）Ｔ２０２の生成率を測定し、ふっ素化合物の
酸化率が前記基質の酸化率よりも遥かに速かである、請
求の範囲第１項の方法の応用。 ５ 分析すべき成分が有機基質であり、Ｈ２Ｏ２生成率
を数秒または数分内に測定するのに十分なオキシダーゼ
濃度を使用し、一連の比較分析測定の各測定を通してこ
のような濃度を一定に保つ、請求の範囲第４項の応用。 ６ 分析すべき成分が前記オキシダーゼであって、Ｈ２
０□生成率を測流する間、基質の濃度をほぼ一定に保つ
ように基質の量を大過剰として使用する、請求の範囲第
４項の応用。 ７（ａ）少なくとも緩衝剤と、ペルオキシダーゼと、前
記ふっ素化合物とを含む反応剤溶液を調製し、 （ｂ） 分析すべき液体試料を前記反応剤溶液の一部
と混合し、 （ｅ） 前記選択的にＦ−イオンに敏感な電極を前記
混合物に浸漬して、ふっ素原子の酵素的分離の間、電極
の電位の変化率を測定し、 （ｄ） こうして得た前記変化率のデータを、既知の
Ｈ２０□濃度の校正溶液について予じめ同様に行なった
比較分析から得た標準化データと比較し、（ｅ） 曲
間Ｃ）で測定した前記変化率のデータと、標準化試料中
で既知のＨ２０□濃度に対応するデータとの相関関係を
確立して、分析試料中のＨ２０□濃度を規定する 工程からなる、請求の範囲第２項の方法っ８（ａ）少な
くとも緩衝剤と、前記基質に特有なオキシダーゼと、ペ
ルオキシダーゼと、Ｈ２０□によるペルオキシダーゼ触
媒酸化反応によって開裂してついでＦ−陰イオンを遊離
することができるふっ素原子を有するふっ素化合物とを
含む反応剤水溶液を調製し、 （ｂ） 前記反応剤溶液の過剰を、分析すべき試料溶
液と混合し、 （ｅ） 前記混合物中で、前記ふっ素原子の酵素的開
裂反応の間、前記電極電位の時間に対する変化率を測定
し、 （ｄ） こうして得た前記電位変化率のデータを、分
析すべき既知濃度の同一基質を含む試料について予じめ
行なった校正分析から得た標準電位変化率と比較し、 （ｅ） 前１Ｑｃ）で測定した値を、既知濃度の前記
基質に対応する標準データと相関させて、分析すべき試
料中の基質の濃度を決定する、 工程からなる請求の範囲第５項の応用。 ９ 前記分析すべき基質がグルコースまたはコレステロ
ールであり、対応するオキシダーゼがそれぞれグルコー
スオキシダーゼおよびコレステロールオキシダーゼであ
る、請求の範囲第８項の応用。 １０ （ａ） 少なくとも緩衝剤と、ペルオキシダ
ーゼと、オキシダーゼに特有な有機基質の過剰と、Ｈ２
０□によるペルオキシダーゼ触媒酸化を含む反応によっ
て開裂してついでＦ−陰イオンを遊離することができる
ふっ素原子を有するふっ素化合物とを含む反応剤水溶液
を調製し、 （ｂ） 前記溶液中に選択的にＦ−に敏感な電極を浸
漬させ、 （ｅ） 前記反応剤溶液に、分析すべき基質オキシダ
ーゼを含む試料を混合し、前記ふっ素原子の酵素的開裂
反応の間、前記電極電位の時間に対する変化を測定し、 （ｄ） こうして得た前記電位変化率またはネルンス
ト式から計算した対応する〔Ｆ−〕データを、既知濃度
の分析すべき同一オキシダーゼを含む試料について予じ
め校正分析して得た標準電位変化率または対応する標準
〔Ｆ−〕データと比較し、前駆ｃ）で測定した値を前記
標準データと相関させて所望の結果を得る 工程からなる請求の範囲第６項の応用。 １１ ふっ素化合物がｐ−フルオロアニリ７ 、ｐ
−フルオロフェノール、２・３・５・６−チトラフルオ
ロフエノール、５−フルオロ−２−メチルアニリンまた
はｐ−フルオロアニソールである、請求の範囲第１ない
し１０項のいずれかの方法または応用。 １２ 水性試料中で、酵素の存在において酸化されて
対応量のＨ２Ｏ２を遊離する有機基質の量、または条件
によって前記酵素の量を測定する分析系であって、緩衝
液中で、前記基質と、この基質の酸化に特有な前記酵素
と、ベルオキシタ２ゼと、このペルオキシダーゼによっ
て触媒された前記Ｈ２Ｏ２の作用によって開裂されてつ
いでＦ−を遊離するふっ素原子を有する有機ふっ素化合
物と、前記Ｆ−遊離反応速度を電気化学的に抑流し、か
つこの反応速度データを、前記基質または酵素の既知試
料を予じめ同様に測定することによって得た標準照合デ
ータと比較して所望の結果を計算する手段を有する分析
系。 １３ 前記手段が、選択的にＦ−に敏感な電極と、前
記緩衝剤、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび前記
ｐ−フルオロアニリン、ｐ−フルオロフェノール、２・
３・５・６−チトラフルオロフエノール、５−フルオロ
−２−メチルアニリンまたはｐ−フルオロアニソールか
らなるふっ素化合物を攪拌した水性混合物中で前記Ｆ−
イオンの活性度にもとづく電位を記録する電圧計とを有
する、請求の範囲第７項記載の系。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61175168U (ja) * | 1985-04-18 | 1986-10-31 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE2091T1 (de) | 1983-01-15 |
| DE2964377D1 (en) | 1983-01-27 |
| JPS55500889A (ja) | 1980-11-06 |
| EP0020623A1 (fr) | 1981-01-07 |
| EP0020623B1 (en) | 1982-12-22 |
| US4353983A (en) | 1982-10-12 |
| WO1980001081A1 (fr) | 1980-05-29 |
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