JPS5898096A - エタノ−ルアミン含有液の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、エタノールアミン含有液に、エタノールアミ
ン、酸素および水を消費してグリコールアルデヒド、ア
ンモニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒するエ
タノールアミンオキンダーゼを作用せしめ、次いで反応
系において消費される酸素の量または生成されるアンモ
ニアまたは過酸化水素の量を定量することを特徴とする
定量法ｔこ関する。

臨床検査ｔこおける血清中リン脂質ｔこ関して、その約
り５％がコリン誘導体リン脂質であり、このコリン誘導
体リン脂質は、３例えばホスホリパーゼＤとコリンオキ
シダーゼとを組合せた酵素的定量法ｔこより良好に定量
し得たものであった。

ところがその残部である約ｊ％のリン脂質１こ関しては
、コリンオキシダーゼの酵素作用を受けないためｔこ定
量できないものであった。

このリン脂質成分は、エタノールアミン誘導体リン脂質
であり１本発明者らは、バチＶス（Ｂａｃ：１ｌｕｓ）
属に属する細菌Ｂ−０７ざｊ（Ｆｌｌ：ＲＭ−ＰすＮｏ
、ｊ７り♂）がエタノールアミン。

酸素および水からグリコ−μアルデヒド、アンモニアお
よび過酸化水素を生成する反応を触媒するエタノールア
ミンオキシダーゼを生産することを見い出し、このエタ
ノールアミンオキシダーゼをエタノールアミン含有液１
０作用せしめ、次いでその反応系において消費される酸
素の量または生成を見い出した。さらにエタノールアミ
ン含有液ｔこおいて、前記のエタノールアミン誘導体で
あるリン脂質１こ関してホスホリパーゼＤｉ作用せしめ
てエタノールアミンを遊離せしめ、また同時または順次
をこエタノールアミンオキシダーゼを作用せしめ１次い
でその反応系１こおいて消費される酸素の量または生成
されるアンモニアまたは過酸化水素の量を定量すること
により、エタノールアミン誘導体リン脂質の成分のみを
良好に定量し得ることを見い出した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、エタノ
ールアミン含有液に、エタノールアミン、酸素および水
を消費してグリコールアルデヒド、アンモニアおよび過
酸化水素を生成する反応を触媒する作用を有するエタノ
ールアミンオキシダーゼを作用せしめ、次いで反応系ｔ
こおいて消費される酸素の量または生成されるアンモニ
アまたは過酸化水素の量を定量することを特徴とする定
量法であり、本発明はエタノールアミン含有液ｔこおけ
るエタノールアミンの簡便かつ良好な定量法を提供する
ことを目的とするもので、さらｅこ、エタノールアミン
誘導体リン脂質やコリン誘導体リン脂質などの種々のリ
ン脂質成分含有液においてエタノールアミン誘導体のみ
を特異的１こ定量し得る方法を提供する−のである。

まず本発明１こおけるエタノールアミン含有液としては
、エタノールアミンを遊離し得るエタノールアミン誘導
体やエタノールアミン自体の含有液が挙られる。またエ
タノールアミンを遊離し得るエタノールアミン誘導体と
しては、生体リン脂質成分であるホスファチジルエタノ
ールアミンや、エタノ−〃アミンのヒドロキシル基やア
ミノ基ｔこ合 基いて化学的合成手段によって穐成される種々のエタノ
ールアミン誘導体が対象として挙られるもので、これら
の誘導体においてエタノールアミンし を遊離文得るものであれば何んら限定されるものではな
い。例えばエタノールアミン誘導体であるホヌファチジ
〃エタノールアミンは、ホスホリパーゼＤを作用せしめ
ることによりエタノールアミンを遊離させることができ
る。このホスホリパーゼＤとしては％／七ｐのしＶチン
および１モルの水からホスファチジン酸およびコリンを
生成する反応を触媒する作用を有する酵素である。また
このホスホリパーゼＤとしては、微生物由来の酵素が好
ましく、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）　Ｒに属スるストレプトマイセス−ハチジ
ヨウエンシスＡ−／／弘ｊ（ＦＥＲＭ−ＰＪＫ／３２り
）、やストレプトマイセス・クロモフスカスＡ−Ｏｆダ
ざ（ＦＥＲＭ−ＰＪＫ３！；／り）から得られるホスホ
リパーゼＤや市販のホスホリパーゼＤの試薬が挙られ、
またこれらの酵素はその酵素作用を有しているものであ
れば、組成物であっても精製物であってもよ（、ざらｔ
こ溶液であってもよく、さらに固定化酵素となしたもの
であってもよい。また上記の、エタノ−！レアミン含有
液中のエタノールアミン誘導体からエタノールアミンを
遊離せしめる酵素であるホスホリパーゼＤの使用量とし
ては、エタノールアミンを遊離するｔこ充分な量であれ
ばよく、例えば０．／ＴＪ／−以上の酵素活性を有して
いればよく、通常２〜ｊＱＵ／一程度有していればよい
。また反応条件としイｔダシー／ｌ／ｌ！衝液などの緩
衝液中１こて通常５分以上、好ましくは１０Ｐ−２０分
程度で、さらｔこ３７℃ｔこて行なうことが好ましい。

さらにその他のエタノールアミン誘導体においては、そ
の二タノ−ルアミンのヒドロキシル基やアミノ基ｅこ基
づく結合様式ｔこ作用してその結合基を開切してエタノ
ールアミンを遊離する適宜な酵素試薬や化学試薬を用い
ればよい。

次いで遊離されたエタノールアミンやまたはあらかじめ
存在しているエタノールアミンなどのエタノールアミン
含有液は、エタノールアミン、酸素および水を消費して
グリコ−μアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素を
生成する反応を触媒する作用を有するエタノールアミン
オキシダーゼ（以下単ｔこ、エタノ−ｐアミンという）
ｔこで反応せしめる。このエタノールアミンオキシダー
ゼは、上記反応を触媒する作用を有するものであれば何
んら限定されるものでなく、例えば、バチルス属に属ス
るバチルス−ニス・ピ＝・Ｅ−０７１ｒ３（ＦＥＲＭ−
ｐＡｊ７５ｉ’ｒ　）（特願昭５６−タｌｅ り３７号参照）やアースロバフタ−（Ａｒｔ％−Ｑｒ）
属に属する菌（、Ｔ、Ｂｊ−ｏｌ、　ｃｈｅｍ、、　２
　ｊり、　　（／り６’Ｉ）２／Ｉり〕から得られたエ
タノールアミン第２０　　キシダーゼが挙られ、これら
の酵素は必要に応じて精製し、また固定化酵素として加
工してもよい。またバチルス・ニス・ピー・Ｂ−０７♂
３ｔこおいて詳しく述べれば、以下の通りである。ます
重曹Ｅ−０７１３の肉眼的および顕微鏡的観察ｔこ基く
各種の培地上１こおける培養の特徴は、次に記載する通
りである。

（Ａｌ　　肉眼的観察 （Ｊ肉汁寒天平板培地（３０℃、１１時間）円形で平ら
な集落を形成し、周囲はなめらかで灰白色〜淡黄灰色を
呈する。

可溶性色素は産生じない。

（２）肉汁寒天斜面培地（３０℃、ｉｔ待時間線状ｔこ
良好ｔこ生育し、灰白色〜淡黄灰色を呈する。可溶性色
素は産生しない。

（３）肉汁液体培地（３０℃、３２時間）生育はやや弱
い。沈澱を生ずる。

（烏　顕微鏡的観察 普通寒天培地にて３０℃、１ｇ時間培餐した後その形態
的特徴を観察した。

（１）細胞の形、大きさ 単独、二連または短連鎖する端の丸い桿状菌で、大きさ
は／、　ＯＰ−／、　ｊ　Ｘ　２．　ＯＮｊ：θｐｍで
ある。

（２）多形性の有無 なし。

（３）運動性および鞭毛 周毛で運動する。

（４）芽胞（形１位置、大きさ） 芽胞は卵形またはだ円形で、＋ｉ体の端または端の近い
位置１こ形成し、菌体は芽胞によって紡錘状になる。

（Ｃ）　　生理的性質 硝酸塩還元　　　　　　　　　　　十 脱窒反応　　　　　　　　　　　　− ＭＩ’ｌテスト　　　　　　　　　　　−ｖＰテヌト　
　　　　　　　　　　　　−インドールの産生　　　　
　　　　− 硫化水素の産生　　　　　　　　　− ゼフチンの加水分解　　　　　　＋（弱）デンプンの加
水分解　　　　　　　− クエン酸の利用 （シモンズ培地）　　　　　　　− （クリステンゼン培地）　　　　− 硝酸塩の利用　　　　　　　　　　士 アンモニウム塩の利用　　　　　　− 色素の生成　　　　　　　　　　　− オキシダーゼ　　　　　　　　　　十 カタフーゼ　　　　　　　　　　　＋ ウレアーゼ （ＳＳＢ培地）　　　　　　　− （クリステンゼン培地）　　　− 生育の範囲 （ｐＨ）至適Ｉ）４’　　　Ａ、ｊ−１０生育ｐｌ（よ
ｏ−’ｙ、’。

（温度）至適温度　　　２ｊ〜３７℃ 生育温度　　　ｉｏ−ダλ℃ 酸素に対する態度　　　　　　好気性 ＯＦテヌト　（Ｈ１８ｈＬｅｉｆｓｏｎ培地）Ａ１（ア
ルカリになる）ＯＦテスト（変法培地）Ａ１（アルカリ
１こなる）エスクリンの分解　　　　　　　　− セルロースの分解　　　　　　　　− グフム染色　　　　　　　　　　　十 抗酸性染色　　　　　　　　　　　− 酸、ガスの産生 酸　　ガス アドニトール　　　　　　　　　　　−　　　−Ｌ（イ
）アラビノース　　　　　　−　　　−セロビオーヌ　
　　　　　　　　−− ヅルントール　　　　　　　−　　− メソーエリストール　　　　　　十　　　−Ｄ（→フラ
クトース　　　　　　−− ７コーヌ　　　　　　　　　　　　−−Ｄ（ト）ガフク
トース　　　　　　−−Ｄ（１）グルコース　　　　　
　　−−グリセリン　　　　　　　　−　　− イノシトール　　　　　　　　　−　　　−イヌリン　
　　　　　　　　　−− ラクトース　　　　　　　　　−− マルト一ス　　　　　　　　　　　　−−Ｄ−マンニト
ール　　　　　　　−　　　−Ｄ−マンノース　　　　
　　　−− メレジトース　　　　　　　　　−− メリビオース　　　　　　　　　−　　　−ラフィノー
ス　　　　　　　　　−　　　−Ｌ（＋ツムノース　　
　　　　　　　−−サリシン　　　　　　　　　　　−
　　　−Ｌ−ソルボーヌ　　　　　　　　　−−ソルビ
トール　　　　　　　　　−− スターチ　　　　　　　　　　　−− サッカロース　　　　　　　　　−− トレハロース　　　　　　　　　　−−Ｄ−キＶ−ロー
ス　　　　　　　　　−−ＤＮＡのｏｃ含有率（Ｔｍ法
）　　　３７３％上記の菌学的性質より、本ＢＩＢ−０
７１３はダラム陽性で、芽胞を形成する桿菌であるとの
特徴を有するもので、バーシース・マニュアル・オプ・
デタミネイティブ・・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
　Ｂ！Ｌｃｔｅｒ１ｏ１ｏｇ　）第ｇ版（ｌり７ダ）に
よれば本菌株はバチルス（Ｅａｃｉｌｌｕｓ）属に属す
るものと認められた。さらに本菌株の諸性状ヲ、バーシ
ース・マニュアル・オグφデタミネイティブ・バクテリ
オロジー第７版、第ｇ版、およびザ・ジ−ナス−バチル
ス（Ｔｈｅ−６ｅｎｕｓＢａｃｌｌｌｕｓ　ＮＡｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｌｃ、１２７）１こ対
比したが１重曹株と性状がよ（一致する菌種の記載はな
く、よって本菌株をバチルス・ニス・ピー−Ｅ−０７１
３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ、　　Ｂ　−０７１３）
と同定命名した。さらに本菌株は工業技術院微生物工業
技術研究所１こ「微工研菌寄第ｊ７りを号（ＦＫＲＭ−
Ｐ蔦ｊ７り♂）」として寄託したエタノールアミンオキ
ンダーゼを得る會こ当っては、例えば上記バチルス属ｔ
こ属するエタノールアミンオキシダーゼ生産菌を酵素を
生産する通常の方法で培養する。培養の・形態は液体培
養でも固体培養でもよく、工業的ｅこはエタノールアミ
ンオキシダーゼ生産菌の細胞をその生産用培地ｔこ接種
し深部通気攪拌培ＩＩを行なうのが有利である。

培地の栄餐源としては、微生物の培ｌＩ！に通常用いら
れるものが広（使用され得る。次素源としては同化可能
な炭素化合物であれはよ（、例えばブドウ糖、Ｖヨ糖、
乳糖、麦芽糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜
、グリセリンなどが挙られる。窒素源としては利用可能
な窒素化合物であれはよく１例えばコーン・スチーブ・
リカー、大される。その他、リン酸塩、マグネンウム、
カルンウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガ
ン、ハロゲンなどの塩類が必要に応じて使用される。さ
らに、培地１こ、エタノールアミンオキンダーゼの産生
を誘導せしめるためｔｎ、エタノールアミンやプロピル
アミンなどのアルキルアミンを誘導物質として培地中Ｃ
Ｏ，／　−／％程度添加せしめることが好ましい。

費 培地温度は、菌が発育し、エタノールアミンオキンダー
ゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは２
６〜３３℃、持重こ３０℃程度が好ましい。培質時間は
、条件によって多少異なるが、通常／３−．２５時間程
度行なえばよ（、さらに２００−１１０Ｏｒｐｍの条件
にて攪拌しつつ通気せしめればよく、エタノールアミン
オキシダーゼが最高力価１こ達する時期をみはからって
適当な時期に培養ヲ終了すればよい。

このようｔこして得られたエタノールアミンオキシダー
ゼ生産菌の培養物ｔこおいて、エタノールアミンオキシ
ダーゼは主１こその菌体内ｔこ含有される。本酵素を採
取するに当って例示すれば、まず得られた培養物を濾過
または遠心分離などの手段によりその菌体を採取し１次
いでこの菌体を超音波処理、フレンチプレス処理やガラ
スビーヌ処理などの機械的破壊手段やリゾチームなどの
酵素的破壊手段ｔこで破壊し、また必要に応じてトリト
ンＸ＝／　００　（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−／　Ｑ　Ｏ：商
品名）、アテカトールＳｏ−／２０（商品名）などの界
面活性剤を添加してもよい。次いでこのようにして得ら
れたエタノールアミンオキシダーゼ含有液は、濃縮する
か、または濃縮することな（、可溶性塩類、例えば硫安
などを用いて塩析せしめるか、親水性有機ｉ謀、例えば
メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパツール
などを用いて本酵素を沈澱せしめればよい。さらにこの
沈澱物は、水または緩衝液ｔこ溶解後、必要に応じて半
透膜にて透析せしめ、さらにＤＦｉＡＫ−セファデック
ヌ、ＤＥＡＥ−セファロースやＤＥＡＥ−セルロースな
どやカルボキシメチル−セルロース、カルボキンメチル
−セファロース、カルポキンメチルーセファデックヌな
どのイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィーやセフ
ァデック：ｘＧ２００．セファロース０Ｌ−６Ｂ、セフ
ァクリ１ｖＳ−２００などの分子篩剤などのゲル濾過剤
を用いるクロマトグラフィーにて精製せしめ、その後凍
結乾燥などの処理により精製されたエタノ−ｌレアミン
オキシダーゼを得る。

次１こバチルス争ニスービー・Ｂ−Ｑ７と３の培養物か
ら得られたエタノールアミンオキシダーゼの活性測定法
および性質１こついて述べる。

■　活性測定法 ０．２Ｍ　　）リスー塩酸緩衝竺（ｐａｒ、（：））　
　０．／　　ｙｄｏ、３％　ダーアミノアンチピリン　
　　０．０２　ｖ１３ｍＭ　　Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−
トルイジン　ｏ、ｏｓｔｔ（弘５Ｕ／ＴＲＩ＞　　ベル
オキンダーゼ　　０．０　！；　１１１１７０、　／　
Ｍ　　エタノールアミン　　　　　ｏ、ｏｓｄ蒸留水　
　　　　　　　　　　　　　ｏ、ｉｉｍ計Ｏ，ダｊｌｌ
ｌｊ を加えて３７℃、ＩＯ分間反応せしめる。・反応をエタ
ノ−１ｖ２．３　ａ／を加えて反応を停止せしめ、次い
でその呈色を波長ｊｊＱｎｍＴｔこて吸光度測定する。

酵素活性は、１分間１こ１μｍｏ　ｌｅの過酸化水素を
生ずる活性をｌ単位（／　ｕｎｉｔ＠　／　Ｕ　）とす
る。また力価の算出は、次式に従う。

（ただし、ΔＡ６６０は、波長ｊ！ＯｎｍＫ、おける吸
光値を示す） ■　作用 エタノールアミンｌ上／Ｉ／ｌこ対して、メチルの酸素
および水を消費して、メチルのグリコ−〃アルデヒド、
アンモニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する
作用を有する。

−ラ０ＨＣ−ＣＨ２−ＯＨ十ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２グリコー
ルアルデヒド ■　基質特異性 前記の活性側定法において、エタノールアミンの代りに
、下記の種々の基質を用いて、その活性を測定した。そ
の結果、第１表に示す通りであった。

前記の活性測定法における緩衝液において、ｐＨ６〜７
のリン酸緩衝液、ｐＨ７〜りのトリヌー塩酸緩衝液を用
いて、その酵素活性を測定した。その結果、第１図ｔこ
示す通りで、本酵素はｐＨ７〜７３の範囲に至適ｐＨを
有すると認められる５　。

■　ｐ、Ｈ安定性 ２．３ＴＪ／ｍｌの酵素液を、／　００　ｍ　Ｍ　ｔＤ
各ｉｍＣＤｉｍ衝液（ｐＨ５−’Ｚｊのジメチルグルタ
ル酸緩衝液、ｐＨざ〜！；！ｊのトリ７−塩酸Ｈ＃液、
ｐＨり〜１０のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）で
６０℃、７５分間加熱処理した後、その残存活性を前記
活性測定法に基いて測定した。その結果、第２図に示す
通りで１本酵素はＩ）ＨＡ〜どの範囲で安定と認められ
た。

■　熱安定性 、２．！；Ｕ／Ｍの酵素液を、１０ｍＭ　）リヌー塩酸
緩衝液（ｐＨとＱ）でｉｏ仕分間ダ。〜７ｊ℃にて加熱
処理した後、その残存活性を前記活性測定法ｔこ基いて
測定した。その結果、第３図に示す通りで、本酵素は６
０℃まで安定と認められた。

■　等電点 ｐＨ４ｔ、乙θ付近（キャリア・アンフオライトを用い
た焦点電気泳動法により測定した。）の　金属イオンお
よびＥＤＴＡの影響 ■　界面活性剤の影響 以上の本酵素の性質より、本酵素をエタノールアミンオ
キシダーゼと認めたものである。

またこのエタノールアミンオキシダーゼの使用量として
は、例えば０．／Ｕ／σ以上有していればよく、通常０
．！；Ｕ／ｍ１以上用いられ、また反応条件としては１
例えば３７℃にて１分以上、好ましくはｊ分線上反応せ
しめればよい。このエタノールアミンオキシダーゼは、
エタノールアミン誘導体を対象とするに当って、例えば
用いるホスホリパーゼＤと順次または同時に作用せしめ
てもよい次いで反応終了後、反応系において消費される
酵素の量、または生成されるアンモニアまたは過酸化水
素の量を定量するのであるが、その定量に当っては酸素
電極、アンモニア電極またはアンモニウム電極や過酸化
水素電極などの目的とする成分をこ感応する電極ｔこよ
る電気的変化にて測定する手段ｔこて行なってもよく、
またエタノールアミンまたはエタノールアミンとホスホ
リパーゼＤとを同時に固定化酵素となして電気的変化ｔ
こで測定する手段である電極面に固着せしめた酵素電極
となして測定してもよい。この測定では、目的とする成
分の量ｔこ相関して電気的変化として定量されるもので
、この電気的変化を変換器を通じてエンドポイン法、初
速度法、ざら１こ二次微分法等常法に基いて測定し、記
録計ｔこ記録すればよい。ざらをこ過酸化水素の定ｍｔ
こ当っては光学的手段ｔこで定量すれはよく、例えば過
酸化水素の存在下にて色調変化を受ける１種もしくは２
種以上の呈色試薬や螢光や発光する螢発光試薬にて定量
される。この呈色試薬としては、通常ペルオキシダーゼ
と染料前駆体とが用いられる。このペルオキシダーゼは
西洋ワサビ由来のものが簡便ｔご用いられ、また染料前
駆体としては、電子受容体とフェノール系化合物の組合
せが通常よく用いられる。さらｔこ電子受容体としては
１例えばダーアミノアンチビリン、２−ヒドラジノベン
ゾチアゾール、３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒド
ラチン、コーアミノベンゾチアゾール等が用いられ、ま
たフェノール系化合物としては例えばフェノール、３−
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）ア
ニリン、３．５−キンレノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニ
リン％Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン等が用いられる。また
螢光薬組成物や発光薬組成物における発螢光性基質とし
ては、公知の種々のものが挙られ、例えばビスＣ２゜弘
、Ａ−）リクロロフェノール）オキザレイト、フェニル
チオヒダントイン、ホモバニリン酸、ターヒドロキシフ
ェニル酢酸、パニリルアミン、３−メトキシチラミン、
フロレチン酸、ホルデニン、ｌレミノールモノアニオン
、ルシゲニン、ワフイン等が挙られ、必要１こ応じて電
子受容体・ぺＭオキシダーゼ作用を有する物質ととも１
こ用いて過酸化水素を定量してもよい。さらに用いられ
る酵素試薬や染料前駆体の使用量としては特１こ限定さ
れるものではな（、例えばｌテスト当りベルオキンダー
ゼは通常Ｏ，ＯＳ単位以上、好ましくは０．７−６００
車位用いればよ（、また電子受容体やフェノール系化合
物は通常０１７ｍＭ以上の濃度１こ蒸留水または弱酸性
ないし弱アルカリ性の緩衝液を用いて調整した溶液をな
せばよい。またこれらの試薬は、先のホスホリパーゼＣ
Ｄやエタノールアミンオキンダーゼの酵累液と別々に用
いてもよく、さらにこれらの試薬を凍結乾燥せしめた定
量用組成物やｐ紙またはフィルム等をこ塗布してなる積
層一体型の定量用組成物となしてもよい。

本発明は、特に血中のリン脂質成分のうち、ホスファチ
ジルエタノールアミンの特異的な定量法として有用なも
のであり、またコリン誘導体リン脂質の定量法とを用い
て臨床検査を行なうことによす、ホスファチジルエタノ
ールアミンであるエタノールアミン誘導体リン脂質とコ
リン誘導体リン脂質の各成分を分別定量し得るものであ
る。

次いで本発明の冥施例および参考例を挙げて具体的に述
べるが、本発明はこれらによって何んら限定されるもの
ではない。

実施例１ ０．２Ｍ　　トリヌー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ１０）　　０
．！；ｍ１Ｏ３３％　ターアミノアンチピリン　　　　
　０．３ＩｎＩＯ０，２％　フェノール　　　　　　　
　　　　。、３ｄペルオキシダーゼ（ＩＵ〜多シグマＩ
ｆｆ）　　θ、／ｄエタノールアミンオキシダーゼ（，
６Ｕ／ｍＪ　Ｈ参考例１で得られた酵素）　　　　　　
　　　　　　０．／ｍｌ０ｊ％　ＮａＮ３　　　　　　
　　　　　　　　０．３ｍ１ｊ％　　　ト　リ　ト　ン
　Ｘ　−／　　０　０　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．２ｍｌ／　Ｏｍ　Ｍ　　ＭｇＣ１２Ｑ、３ｒｎ
ｌ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　。、タブ
計３．０ｍｌ 上記の組成を有する反応液Ｃ３，０ｒｄｌ＞を調整した
。この反応液＜３．０ｍｌ＞を用い、これに１０ｒｒＭ
エタノールアミンｊ′″Ｐ−２！；μｔを加え、３７℃
で２０分間反応せしめ、反応後その呈色を波長ｊ。

Ｏｎｍｋこて吸光度測定した。

その結果、第９図、をこ示す通りで、極めて良好にエタ
ノールアミンの検Ｊｉ線が得られた。

チジルエタノールアミンをホスホリパーゼＤＣ）リドン
Ｘ−１００および■Ｃ１２含有）ｔこて３７℃、１０分
間前処理したものを用いて、ホスファチジルエタノール
アミンの定量をすることができる実施例２ ０．２Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　ＨｉＯ）　　０
ｊｒｒｔＯ，３％　弘−アミノアンチピリン　　　　　
０．３ｍｌ００．２％　フェノール　　　　　　　　　
　０．３ｍｌへｗオキＶタ−セ（’Ｉ　３　Ｕ　／ＩＩ
Ｉ／　）　　　　　　０．７ｍｌエタノールアミンオキ
シダーゼ（乙Ｕ／ｍｌ　）　　０．ＩｗｒｌＯ，ｊ　＊
　　ＮａＮ　３　　　　　　　　　　　　　　　Ｑ、３
ｍｌ！；９６　　　　）　　ＩＪ　　）　　ン　Ｘ−／
　　００　　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｍｌ
／　Ｏｍ　Ｍ　　Ｍ６Ｃ１２Ｑ、３ｍｌホスホリパーゼ
Ｄ　Ｃ２０ＴＪ／ｍｌ、東洋醸造−＞　　　ｏ、１ｒｔ
ｔｔ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　。、♂
ｄ計３．０― 以上の組成を有する反応液＜３．０ｍｌ”）を調整した
。この反応液（３，θｍｌ　）に、／θｍＭｊ７ン脂質
分間反応せしめた後、波長３００　ｎ　ｍ＋こて吸光度
測定した。

その結果、第５図１こ示す通りで１図中〇−〇はホスフ
ァチジルエタノ−！レアミンをりン月旨質とした場合の
定量曲線を示し、・−・はレシチンをリン脂質とした場
合の定量曲線を示すものであり、この第５図より明らか
な通り、レシチンをこ対しては全く作用せス、かつホス
ファチジルエタノールアミンは良好ｔこ定量されたもの
であった。

実施例３ ０．２Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ＩＩ　Ｈ７，５）　
　０．．１ｍｌエタノールアミンオキシダーゼ（６Ｕ／
ｌｄ　）　　０．／１１蒸留水　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．７プ計ｉ、ｏｗｌ 上記の組成を有する反応液Ｃ１，０ｍ１）を調整した。

これｔこ、　２ｍＭのエタノ−！レアミンｊＰ−２！；
μＬを加えて３７℃にて１０分間反応せしめた後、酸素
電極（石川製作所製）で酸素の量の減少を測定した。

その結果、第６図ｔこ示す通りで、極めて良好な直線性
の定量結果を示すもので、Ｏ，ＯＳμｍｏｌｅのエタノ
ールアミンの量まで直線性が得られた。

またエタノールアミンの代りにホスファチジルエタノー
ルアミンをホスホリパーゼＤ（トリトンＸ　　／　００
．　ＭｇＯ１２含有）ｅこて前処理したものを用いてホ
スファチジルエタノールアミンの定量ヲすることができ
る。

実施例ダ ０．２Ｍ　　トＩＪＸ−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７ｊ　）　
　ＯＪｍｌエタノールアミンオキシダーゼＣ＆　Ｕ／ｍ
ｌ　）　０．／ａｔ１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　　　　　
　　　　　　　０１ｍ５％　　　ト　リ　ト　ン　Ｘ−
１０００，／Ｉｄホスホリ／＜−−ｔ／　Ｄ　（２０Ｕ
／Ｉ１１　）　　　　　　０．ｌｌＩ！１蒸留水　　　
　　　　　　　　　　　　　　／、ｏ１計２．０− 上記の組成を有する反応液＜２．０１１１＞を調整した
。これに、２ｍＭホスファチジルエタノールアミンをｊ
〜２ｊμＬ加え、３７℃、１０分間反応１電嶌（−ゼメ
ーター）ｔこて生成した過酸化水素の量を定量した。そ
の結果、　０．Ｏｊ　ｐ　ｍｏｌｅのホスファチジルエ
タノールアミンの量まで直線的ｔこ定量された。

また上記の過酸化水素電極の代りｔこ酸素電極を用いる
ことにより、酸素の量の減少を定量し得るものである。

実施例ｊ ０．２Ｍ　　トリ７−−塩酸ｆｍｒｊｆｌＨＣｐＨ７，
！；）　　０．２１ｄエタノールアミンオキシダーゼ（
ＡＵ／＋１１７）　　０．１ｍ１５％　　　ト　リ　ト
　ン　ｘ−１０００，／ｍｌ蒸留水　　　　　　　　　
　　　　　　　２．６Ｍ計３．０ｄ 上記の組成を有する反応液Ｃ３，０１１Ｌｌ）ｔ−調整
した。これに、、２．５ｍＭのエタノールアミンをｌ。

〜ｊＯμｔを加えて３７℃、７５分間反応させた後ｊ　
Ｎ　−ＮａＯＨ，！；　０　／Ｊ　ｔを加え、その後ア
ンモニア電極（石川製作所製）を用いて生成したアンモ
ニアの量を定量した。

その結果、第７図に示す通りで、０．０２３μめられた
。

また上記エタノールアミンの代りｔこ、ホスファ（ チジルエタノールアミンをホスホリパーゼＤ％トＩＪ　
Ｉ−ンｘ−ｉｏｏおよびＭｇＣｌ２含有）にてあらかじ
め３７℃ｔこて７０分間前処理した溶液を用いて定量す
ることもできるものである。

参考例／ ３０を容ジャー・ファーメンタ−１こ、２０ｔの培地（
ヘプトンｔｊ％、粉末酵母エキス。、５％。

ＫＣＬｏ、２％、ＮａＣ１ｏ、１％、Ｋ２ＨＰ０．０．
１％、Ｍｇ５ｏｔ　　Ｏ，１％、Ｓ／ＩＪ　：＋ンＫＭ
−７２　０．０！ｒ％、エタノールアミンｏ、ｊ％、ｐ
ＨＡ、Ｊ’）を入し、１２０℃、２ｏ分間殺菌した後、
ｊ　Ｏ℃ｔｃ温度調節し、同培地組成で前培養したバチ
ルス・ニス・ビー参Ｂ−０７ざ３の培養液６００　ｍＡ
’　（ロータリーンエカー、３０℃、２．０時間項＊＞
１加え、３００ｒｐｍの攪拌、２０１７分の通気条件に
て１７時間培培養た。陪賓後、培養物ｔｊ０００ｒｐｍ
％２０分間の遠心分離して函体を回収した。次いザイ社
製）含有／　Ｏｍ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７：（７
）１こ懸濁した後％３７℃で２時間加温処理して粗酵素
液１７００−を得た（　０．２１Ｊ　／ｒｎｌ　）。次
イテこれ１こ、冷アセトンｒｓｏｍｉを加えて、析出す
る不溶物を遠心分離Ｃ！；０００ｒｐｍ、１０分間）を
こで除去した。さらにこの上清液に、冷アセトン／２０
０１ｄを加えて析出せしめ、これをｓｏｏ。

ｒｐｍ、／（７分間、０℃にて遠心分離して沈澱物を回
収した。この沈澱物ｆＯ，，ｆＭＫＣ１ｔ−含む０．１
ｍＭトリヌー塩酸緩衝液（ｐＨとｏ＞ｉｏｏｍｔに溶解
した後これを半透性セルロースチューブによる透析を行
なって脱塩し、次いで凍結乾燥してエタノールアミンオ
キシダーゼ粉末粉末ＣＯ，／Ｕ／■、３．２ｔ’）を得
た。

次いで得られた粉末／、Ｏｖをｂ　／　Ｏｍ　Ｍ　）　
リヌー塩酸緩衝液（Ｉｆ　ＨＩ！ｉ′Ｏ）　／　！；ｍ
ｌ＆こ溶解した後、同上緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−
セファローヌＣＬ−ＡＢ（ファルマシア社製）のカフム
（，２，ｊＸ、２／ｃｒｎ））こチャージして吸着せし
め、同上緩衝液５ｏｏｒｒｔｌで洗浄した。この後、２
００ＷＬｌの同上緩衝液と２００１１１のＯ，ｊＭＫＣ
：１を含む同上緩衝液濃 と全屈いる塊醜度変化１こよる蛋白の溶出を行なった。

ｌフラクションｌ０ＩＩＩｌとして分画し、そのフラク
ション５５６〜６６の活性画分を回収し、これを併合し
た後、１０ｍＭ　）　Ｕスー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ（Ｓ’
、　０　）に対して透析し、次いで凍結乾燥してエタノ
ールアミンオキシダーゼ粉末（０，７ｕ／＋＋９、／１
０■）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はエタノールアミンオキシダーゼの至適ｐＨ曲６
１．第、２図はエタノールアミンオキ７ダーゼのｐＨ安
定性曲線、第３図はエタノールアミンオキ７ダーゼの熱
安定性曲線を示し、第５図は過酸化水素の量ｔこよる定
量曲線を示し、第６図は過酸化水ｆｉＯ量によるホスフ
ァチジルエタノールアミンの定量曲線を示し、第６図は
酸素の量１こよる定量曲線を示し、第７図はアンモニア
ｔこよる定量曲線を示す。 特許出願人　東洋醸造株式会社 代表者　　伊東富士馬 第　　１　　図 ６７８９ 第２図 ５　　　　ｎ　　　　　７　　　８　　　　Ｄ　　　　
１０第３図 ４０　　　　　　　コＱ　　　　　　　（０７０鶏、、
ｔ　　　　＜”ｃ＞ 第　　４　　図 ０　５　１０　１５　２０　２５（，１）１０ｍデ！　
エタノールアミン 第５図 ０　５　１０　１５　２０　２５（ｕｌ）１０ｍＭ　リ
ン脂質 第６図 ５　１０　１５　２０　２５　（ｕｌ）２ｍ＋、Ｉ　　
エタノールアミン 第　　７　　図 △ｍｖ １０　　２０　　３０　　４０　５０　（１１１）２．
５ｍ門　エタノールアミ／ 手続補正書 昭和Ｓり年を月２３日 昭和５，６年特許願第１９７３ｊｔ’１号コ）発明の名
称 エタノールアミン含有液の定量法 ３１補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５％補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の掴

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）エタノールアミン含有液１こ、エタノールアミン
   、酸素および水を消費してグリコールアルデヒド、アン
   モニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する作用
   を有するエタノールアミンオキシダーゼを作用せしめ、
   次いで反応系ｔこおいて消費される酸素の量または生成
   されるアンモニアまたは過酸化水素の量を定量すること
   を特徴とする定量法。
2. （２）エタノールアミン含有液が、エタノールアミン溶
   液またはエタノールアミン誘導体から遊離されたエタノ
   ールアミン溶液である特許請求の範囲第１項記載の定量
   法。
3. （３）エタノールアミン誘導体が、ホスファチジルエタ
   ノールアミンである特許請求の範囲第２項記載の定量法
   。
4. （４）エタノールアミン誘導体から遊離されたエタノー
   ルアミンが、ホスファチジルエタノールアミンにホスホ
   リパーゼＤを作用せしめて得られたエタノールアミンで
   ある特許請求の範囲第２項または第３項記載の定量法。