JP3251977B2 - ホスファチジルイノシトールホスフォリパーゼｃ−ａｋ、その製造方法およびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホスファチジルイノシ
トールに極めて高い特異性を有するホスファチジルイノ
シトールホスフォリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ
ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｈｏｓｐｈ
ｏｌｉｐａｓｅ Ｃ）−ＡＫ、その製造方法およびその
用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ホスファチジルイノシトールホスフォリ
パーゼＣは少なくとも、ホスファチジルイノシトール
（以下，ＰＩと省略する。）を１、２ージグリセリドと
ホスフォイノシトールに加水分解する酵素であり、酵素
番号Ｅ．Ｃ．３．１．４．３として知られ（酵素ハンド
ブック４５０−４５１頁，１９８２年、朝倉書店発
行）、リン脂質研究用試薬として使用されている。また
ホスファチジルイノシトールの測定は羊水中の胎児の肺
の成熟度のマーカーとして有効であり、このホスファチ
ジルイノシトールの測定にあたってホスファチジルイノ
シトールホスフォリパーゼＣが有効な測定用酵素として
使用でき、さらに食品における添加物として使用されて
いる大豆レシチンとしてのリン脂質中に含有されている
ホスファチジルイノシトールの測定に有用である。

【０００３】

【発明の解決しようとする課題】従来よりホスフォリパ
ーゼＣはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属やスタフィロ
コカッス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する
細菌にその存在が知られている（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．，７１，７３１−７４１（１９８１））。
このホスフォリパーゼＣはホスファチジルイノシトール
ホスフォリパーゼＣを含む酵素粗製物として報告され
（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７１，７３１−
７４１（１９８１））、ホスフォリパーゼＣとホスファ
チジルイノシトールホスフォリパーゼＣとの明確な区別
がなされていなかった。これら両者を厳密に分離しなけ
ればホスファチジルイノシトールの特異的な測定に用い
たとき誤差を生じやすかった。

【０００４】また、バチルス属由来のホスファチジルイ
ノシトールホスフォリパーゼＣはカルシムやマグネシウ
ム等の２価のイオンにより阻害されることが報告され
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３，４１７５−４１７
９（１９７８））、スタフィロコカッス属由来の酵素は
トリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテル系界面活性剤：シグマ社製）やナトリウム
・デオキシコレトなどの界面活性剤によって活性阻害を
受けるものであった（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，７１，７３１−７４１（１９８１））。

【０００５】従って、このホスファチジルイノシトール
ホスフォリパーゼＣを用いてホスファチジルイノシトー
ルを定量する場合、まずホスファチジルイノシトールか
らの生成物である１、２−ジグリセリドを測定する際の
指示酵素のうち例えばグリセロキナーゼはマグネシウム
等の２価の陽イオンを要求するために反応液にマグネシ
ウム等の２価の陽イオンを添加する必要があるが、この
ような２価の陽イオンがホスファチジルイノシトールホ
スフォリパーゼＣ反応を阻害することから、これらの一
連の反応を同時に行えない欠点を有していた。また同様
に、定量分析においては、トリトンＸ−１００などの界
面活性を通常併用することからも、上記の公知の酵素は
使用し難いものであった。

【０００６】このような状況下、ホスファチジルイノシ
トールの測定において良好な酵素を提供するとともに、
該酵素の製造方法ならびに該酵素を用いてなるホスファ
チジルイノシトールの簡便かつ正確な測定方法を提供す
るものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意研究を
行った結果、意外にも大阪府池田市の畑土壌から採取し
た微生物が上記欠点を克服する新規な酵素ホスファチジ
ルイノシトールホスフォリパーゼＣ−ＡＫ（以下、ＰＩ
−ＰＬＣ−ＡＫと省略する）を生産することを見出し、
本発明を完成した。

【０００８】本発明に使用する菌株はストレプトマイセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ＰＩ−ＰＬ
Ｃ−ＡＫ産生能を有する微生物であればいずれの微生物
でもよく、ストレプトマイセス属に属する微生物、具体
的には大阪府池田市の畑土壌から採取したストレプトマ
イセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．
Ａ９４４２株）（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１１０）が例示さ
れる。

【０００９】次に本菌株の菌学的性質について記述す
る。 ＜形態的性状＞スターチ・無機塩寒天培地で３０℃、１
４日間培養し、光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察した所
見は以下の通りである。基生菌糸は曲線状ないし直線状
に分岐を伴って伸長し、その直径は０．４−０．５μｍ
である。通常、菌糸の断裂は認められない。基生菌糸よ
り生じた気菌糸は、曲線状ないし直線状の長い主軸と互
生または対生に分岐した短い側糸とで形成され、その直
径は０．５−０．６μｍである。通常、側糸の先端は密
に３ー６回転巻いた螺旋状を呈しており、約１０−２０
個の連鎖胞子を形成する。気菌糸は培養の経過に伴い、
湿潤化（ハイグロスコピック）する。

【００１０】胞子は短円筒型、大きさは０．７−０．９
ｘ０．９−１．３μｍで表面はしわ状である。胞子の
う、運動性胞子、輪生糸および菌核は認められない。オ
ートミール寒天培地およびベネット氏寒天培地などにお
いても同様の形態が観察されたが、これらは前述と比較
し湿潤化が著しい。

【００１１】＜ジアミノピメリン酸組成＞Ｓｔａｎｅｃ
ｋ等の方法〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，２
２６−２３１（１９７４）〕に従って分析したところ、
ＬＬ−型のジアミノピメリン酸が検出され、ｍｅｓｏ−
型は検出されなかった。 ＜培養性状＞各種培地上で３０℃、２０日間培養し観察
した所見は表１に示した通りである。（色の表示はＣｏ
ｌｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ、第４版、１９
５８年、Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａに従った。

【００１２】

【表１】

【００１３】＜生理的性状＞ １）生育温度範囲：１５−４０℃（最適２０−３５℃） ２）ゼラチンの液化：陽性 ３）澱粉の加水分解：陽性 ４）脱脂牛乳のペプトン化：陽性 脱脂牛乳の固化：陽性 ５）メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地上；陽性 ：ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地上；陰性 ６）炭素源の利用性：Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンニトール、ラフィノース、ラムノース、お
よびＤ−キシロースを利用する。Ｌ−アラビノース、イ
ノシトール、およびシュクロースは利用しない。

【００１４】以上のようにＡ９４４２株は、真性の基生
菌糸より、よく分岐した気菌糸を生じ、その先端が螺旋
化して連鎖胞子を形成すること、鞭毛胞子や胞子のうを
形成しないこと、ジアミノピメリン酸がＬＬ−型である
こと等の特徴を有していることから、ストレプトマイセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するものと同定
し、本菌株をストレプトマイセス・エスピー Ａ９４４
２株と命名した。本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ
−１３１１０である。

【００１５】本発明のＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫを製造するに
はストレプトマイセス属に属するＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ生
産菌、例えば上記ストレプトマイセス属Ａ９４４２株が
用いられ、またＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫを工業的に採取しう
る量で該酵素を生産し得る能力を有する変異株または変
種であってもよく、その培養は放線菌一般の培養に通常
使用される方法に従って行うことができる。

【００１６】すなわち、培地には炭素源として、例えば
グルコース、フルクトース、澱粉、糖蜜、シュクロー
ス、グリセリン等を単独で、または組み合わせて適宜用
いることができる。また窒素源として、例えば硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、尿素、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、脱脂大豆粉、
脱脂綿実粉等を用いることができる。培地には、他に必
要に応じてリン酸、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、鉄、アルミニウム等の塩類や、各種ビタミン類、消
泡剤等、菌の生育やＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫの生産に有効な
物質を適宜添加することができる。

【００１７】好ましい培地のｐＨは５−８．５で特に好
ましくは６−７．５である。培養法としては通常液体培
地で行うが、工業的には深部撹拌通気培養で行うのが有
利である。培養温度は、菌が生育し、ＰＩ−ＰＬＣ−Ａ
Ｋを生産する温度範囲で適宜選択できるが、特に好まし
いのは２５−３５℃である。培養時間は条件により異な
るが、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ活性が最大になるまで培養す
ればよい。液体培養では通常２−５日程度である。

【００１８】培養物中に生成したＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ
は、液体培養では主として培養液中に存在するので培養
物から菌体、固型物を遠心分離もしくは濾過により除去
したＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ溶液を採取する。培養上清もし
くは濾液からＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫを濃縮するにあたって
は、各種酵素の分離精製に通常使用される方法を適宜組
み合わせることができる。例えば塩析、有機溶媒沈澱、
透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の方法を適宜選択組み合わせればよい。

【００１９】次ぎにストレプトマイセス・エスピーＡ９
４４２株の生産する本発明のＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫの理化
学的性質について説明する。これに関し、ＰＩ−ＰＬＣ
−ＡＫの酵素活性は以下のようにして行った。 （１）酵素活性測定方法 終濃度が４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５、０．
１３２ｍＭＰＩ、０．１３％トリトンＸ−１００から成
る反応液０．５ｍｌにＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫを含む酵素液
０．０５ｍｌを加え３７℃で１０分間反応後１Ｎ塩酸
０．１ｍｌを加え反応を止め５分間放置する。この液に
０．１ｍｌの１Ｎ苛性ソーダ、次いで１Ｍトリスー塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌを加え中和した。更に
０．５ｍｌの１、２−ジグリセリド発色反応液（終濃度
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、０．０６％４
−アミノアンチピリン、０．０６％フェノール、２ｍＭ
ＡＴＰ、２ｍＭ塩化マグネシウム、１Ｕ／ｍｌグリセロ
キナーゼ、１０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、１０Ｕ／ｍ
ｌグリセロリン酸オキシダーゼ）を加え３７℃で１０分
間反応後０．５ｍｌの０．５％で反応液の澄明化を図り
５００ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性は上記条件
下、１分間に１マイクロモルの１、２−ジグリセリドを
生成する活性を１単位として定義した。 （２）作用 １モルのホスファチジルイノシトールと１モルの水から
１モルの１、２ージグリセリドと１モルのホスフォイノ
シトールを生成する反応を触媒する。 （３）基質特異性 各種リン脂質を基質にしてＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ活性を測
定した。表２に示した結果から本酵素は、コリン含有リ
ン脂質、エタノールアミン含有リン脂質、グリセリン含
有リン脂質、アミノ酸含有リン脂質には作用せず、ＰＩ
に対してのみ特異性を有することが明かである。

【００２０】

【表２】

【００２１】（４）至適ｐＨ 前記酵素活性測定方法に従って至適ｐＨを求めたもの
で、その結果を図１に示した。ｐＨ４ー５．５（○−
○）はジメチルグルタル酸緩衝液、ｐＨ６−８．５（△
−△）はリン酸緩衝液、ｐＨ７−８（●−●）はトリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ９−１０（▲−▲）はグリシン−苛
性ソーダ緩衝液を使用した場合の活性値を示すもので、
本酵素の至適ｐＨは６−７．５付近であることが認めら
れた。 （５）最適反応温度 前記酵素活性測定方法に従い、反応温度を変え、酵素活
性を測定した。その結果、図２に示すように５５−６０
℃付近が最適反応温度であった。 （６）ｐＨ安定性 ０．１Ｍ各種緩衝液に溶解した酵素液（１０Ｕ／ｍｌ）
を３７℃で１時間処理し、残存活性を測定した。その結
果を図３に示した。ｐＨ４−７（○−○）はジメチルグ
ルタル酸緩衝液、ｐＨ７−９（●−●）はトリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９−１０（▲−▲）はグリシン苛性ソーダ
緩衝液を使用した。少なくともｐＨ６−８付近の範囲で
ほぼ９０％以上の残存活性を維持した良好な安定性を示
した。 （７）熱安定性 １０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した
ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ溶液（１０Ｕ／ｍｌ）を各温度で１
０分間加温し、残存活性を求めた。その結果、図４に示
したように４５℃まで９５％以上の残存活性を示した安
定なものであった。 （８）金属イオン等の影響 種々の金属イオン等の酵素活性に及ぼす影響について調
べた結果、表３に示したように、カルシウム、マグネシ
ウムによっては阻害されなかったが、亜鉛、銅、バリウ
ムイオン、ＥＤＴＡにより強く阻害された。

【００２２】

【表３】

【００２３】（９）界面活性剤の影響 非イオン性界面活性剤のトリトンＸ−１００（シグマ社
製）の影響は表４に示すように強く活性化され、その最
適濃度は０．０７％付近であった。

【００２４】

【表４】

【００２５】（１０）等電点 ｐＨ４．４７±０．１５（キャリアアンフォライトを用
いる焦点電気泳動法による。） （１１）分子量 ３８０００±３０００（スーパーローズ１２（ファルマ
シア社製）を用いるゲル濾過法による。）以上のＰＩ−
ＰＬＣ−ＡＫにおいて、少なくとも、その作用および基
質特異性からホスファチジルイノシトールに高い基質特
異性を有し、ホスフォリパーゼＣに属する酵素と認めら
れ、さらにカルシウムイオン、マグネシウムイオンによ
り阻害されず、トリトンＸ−１００によって活性化され
るとの特有の性質を有し、至適ｐＨがｐＨ６−７．５付
近、ｐＨ安定性がｐＨ６−８付近、分子量が３８０００
±３０００である新規な酵素と認められ、ＰＩ−ＰＬＣ
−ＡＫと命名したものである。

【００２６】次にＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫを用いるＰＩの測
定法について述べる。前述の基質特異性の項で述べたよ
うに本酵素はＰＩに対して極めて高い特異性を示すの
で、ＰＩ以外のレシチン、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルグリセロール等の各種リン脂質を
含有する被検液を用いた場合でもＰＩからのみ１、２−
ジグリセリドを遊離させることができる。この１、２−
ジグリセリドは、下記の種々の方法によって簡便に定量
できる。 （１）１、２−ジグリセリドにリパーゼを作用せしめて
グリセリンと脂肪酸となす。 （２−１）生成したグリセリンに、少なくともマグネシ
ウムイオン、ＡＴＰの存在下にグリセロキナーゼを作用
せしめて、ＡＤＰおよびグリセロ−３−リン酸を形成す
る。 （２−３）このグリセロ−３−リン酸に、グリセロ−３
−リン酸オキシダーゼを作用せしめて、酸素を消費して
過酸化水素およびジヒドロキシアセトンリン酸を生成せ
しめる。

【００２７】（２−４）消費した酸素を酸素電極で定量
するか、生成した過酸化水素を過酸化水素電極にて定量
するか、または過酸化水素と反応して検出できる生成物
に変化する指示薬組成物、例えば西洋ワサビやその組織
培養物、さらに微生物由来のペルオキシダーゼなどのペ
ルオキシダーゼ作用を有する物質と染料前駆体、簡便に
は４−アミノアンチピリン、４−アミノ−３−ヒドラジ
ノ−５−メルカプト−１、２、４−トリアゾール、２−
ヒドラジノベンゾチアゾール、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾロンヒドラチン、２−アミノベンゾチアゾルなど
の電子受容体とフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナ
トリウム、ｐ−クロロフェノール、２、４−ジクロロフ
ェノール、２、４−ジブロモフェノール、３−メチル−
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン、
３−アセトアミノ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ
−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンなどの
フェノール系またはアニリン系化合物との組成を有する
通常色調の変化を可視にて生じる呈色薬組成物を組み合
わせて分光光学的手段にて定量する。また、紫外線照射
により蛍光を発する蛍光薬組成物や発色する発光薬組成
物を用いて分光光学的手段にて定量できるもので、公知
の適宜の定量手段を使用すればよい。

【００２８】（３−１）また、生成したグリセロ−３−
リン酸に、ＮＡＤの存在下にグリセロ−３−リン酸デヒ
ドロデナーゼを作用せしめて、還元型ＮＡＤおよびジヒ
ドロキシアセトンリン酸を生成せしめる。 （３−２）この生成した還元型ＮＡＤを、その特異的吸
収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて吸光度測定す
るか、ジアホラーゼとニトロテトラゾリウムブルー（Ｎ
ＴＢ）や３−（ｐ−インドフェノール）−２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ・テトラゾリウム
・クロライドなどのテトラゾリウム塩類にてホルマザン
色素を形成してこのホルマザン色素を分光光学的手段に
て定量する。 （４−１）さらに生成したグリセリンに、グリセリンオ
キシダーゼを作用せしめて、過酸化水素およびジヒドロ
キシアセトンを形成し、この過酸化水素を上記方法にて
定量するか、公知方法にてジヒドロキシアセトンを定量
してもよい。 （５−１）さらにまた、生成したグリセリンに、ＮＡＤ
の存在下にグリセリンデヒドロデナーゼを作用せしめ
て、還元型ＮＡＤおよびジヒドロキシアセトンを生成せ
しめ、この過酸化水素を上記方法にて定量するか、公知
方法にてジヒドロキシアセトンを定量してもよい。 （６−１）さらに、１、２−ジグリセリドからはリパー
ゼで遊離した脂肪酸を、ＣｏＡ−ＳＨおよびＡＴＰの存
在下、アシル−ＣｏＡ合成酵素にてアシル−ＣｏＡとな
す。

【００２９】（６−２）このアシル−ＣｏＡに、アシル
−ＣｏＡオキシダーゼを作用せしめて、過酸化水素と
２、３−デヒドロアシル−ＣｏＡとを形成せしめ、簡便
には、この過酸化水素を上記方法にて定量する。 （７−１）または、遊離した脂肪酸を、ＣｏＡ−ＳＨお
よびＡＴＰの存在下のアシル−ＣｏＡ合成酵素、アシル
−ＣｏＡオキシダーゼまたはアシル−ＣｏＡデヒドロデ
ナーゼにて形成された２、３−デヒドロアシル−ＣｏＡ
に、エノイル−ＣｏＡヒドロターゼ、ＮＡＤの存在下で
の３−ヒドロキシアシルＣｏＡ−デヒドロデナーゼ、ア
セチルＣｏＡの存在下での３−ケトアシルＣｏＡ−チオ
ラーゼを作用せしめて、反応において形成された還元型
ＮＡＤを上記した方法にて定量すればよい。 （８−１）さらに、ＰＩにＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫが作用し
て遊離したもう一方の生成物であるホスフォイノシトー
ルの定量測定については、アルカリホスファターゼ、Ｎ
ＡＤ、ジアフォラーゼ、ＮＴＢ存在下にイノシトールデ
ヒドロゲナーゼを作用させホルマザン発色で容易に比色
定量ができる。

【００３０】以上の本発明における種々のＰＩ測定用組
成について、簡便なＰＩ測定用組成を例示すれば、ＰＩ
を１、２−ジグリセリドとホスフォイノシトールとに分
解する工程用としてトリス−塩酸緩衝液０．０１ー０．
５Ｍ（ｐＨ７．２−８．５）、０．０５％−０．２％の
トリトンＸ−１００、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ０．０１−
０．２Ｕ／ｍｌから成る反応液組成が挙げられる。ま
た、１、２−ジグリセリドを発色に導く工程用組成とし
てはリパーゼ５０−４００Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰ０．１−２
ｍＭ、塩化マグネシウム０．２−２ｍＭ、グリセロキナ
ーゼ０．１−１Ｕ／ｍｌ、グリセロ−３−リン酸オキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ１−１０Ｕ／ｍｌ、４−アミ
ノアンチピリン０．０２％−０．２％、フェノールまた
はアニリン誘導体０．０２％−０．２％を含有する。ま
たはトリス−塩酸緩衝液０．０１−０．５Ｍ（ｐＨ７．
２−８．５）、ＡＴＰ０．１−２ｍＭ、塩化マグネシウ
ム０．２−２ｍＭ、０．０５％−０．２％のトリトンＸ
−１００、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ０．０１−０．２Ｕ／ｍ
ｌ、リパーゼ５０−４００Ｕ／ｍｌ、グリセロキナーゼ
０．１−１Ｕ／ｍｌ、グリセロ−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ１−１０Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ０．２−２ｍＭ、ジア
フォラーゼ１−１０Ｕ／ｍｌ、ＮＴＢ０．０１％−０．
１％、牛血清アルブミン０．０５％−０．２％を含有す
る。

【００３１】１、２−ジグリセリドを遊離脂肪酸として
測定する反応組成としてはＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液
０．０１−０．５Ｍ（ｐＨ７．２−８．５）、塩化マグ
ネシウム０．２−２ｍＭ、リパーゼ５０−４００Ｕ／ｍ
ｌ、ＡＴＰ０．１−２ｍＭ、ＣｏＡ−ＳＨ０．１−２ｍ
Ｍ、アシル−ＣｏＡ合成酵素０．１−２Ｕ／ｍｌ、アシ
ル−ＣｏＡオキシダーゼ２−２０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシ
ダーゼ１−１０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン０．
０２％−０．２％、フェノールまたはアニリン誘導体
０．０２％−０．２％を含有する。

【００３２】他方、ＰＩの構成成分のホスフォイノシト
ールを測定する試薬の組成を例示すればトリス−塩酸緩
衝液０．０１−０．５Ｍ（ｐＨ７．２−８．５）、アル
カリホスファターゼ０．５−１０Ｕ／ｍｌ，イノシトー
ルデヒドロゲナーゼ０．２−３Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ０．２
−２ｍＭ、ジアフォラーゼ１−１０Ｕ／ｍｌ、ＮＴＢ
０．０１％−０．１％、牛血清アルブミン０．０５％−
０．２％を含有する。

【００３３】測定方法は極めて簡便で、上記組成の反応
液０．５−２ｍｌにＰＩを含有する被検液（ＰＩ濃度と
して０．５−２ｍＭ）０．０１−０．０５ｍｌを加え、
３７℃で反応が終了するまで通常、５−２０分間加温
し、適宜な分光光学的手段、例えば過酸化水素の呈色で
は５００−６００ｎｍの波長で比色分析を行うことがで
きる。

【００３４】

【実施例】以下に、実施例を挙げて、本発明を更に詳細
に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるもの
ではない。

【００３５】

【実施例１】脱脂大豆粉２％、グルコース２％、酵母エ
キス０．５％、ペプトン２％、塩化ナトリウム０．３
％、リン酸二ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム
０．０５％からなる培地１００ｍｌにストレプトマイセ
ス・エスピーＡ９４４２株を一白金耳移植し、２８℃で
３日間振盪培養を行い種菌を得た。

【００３６】ついで種菌を上記と同一培地よりなる培地
（但し、消泡剤ディスフォームＢＣ−５１Ｙを０．２％
添加）４リットルを含有する５リットル容ジャーファメ
ンターに移植し、本培養を行った。９６時間後にＰＩ−
ＰＬＣ−ＡＫ活性は最大（０．９２Ｕ／ｍｌ）に達し
た。

【００３７】

【実施例２】実施例１で得られた培養物をで遠心分離を
行い、上清２．５リットルを得、ついで限外濾過により
３００ｍｌまで濃縮を行った後、１８０ｍｌのアセトン
を添加し、酵素を沈澱させた。１０％硫安を含む１０ｍ
Ｍトリスー塩酸緩衝液２００ｍｌに酵素を溶解後、５０
００回転、１０分間の遠心分離により不溶物を除去し、
上清１９２ｍｌを得た。これを３ｘ１５ｃｍのオクチル
ーセファロースＣＬ−４Ｂを充填したカラムにかけ、１
０％硫安から徐々に硫安濃度を下げて目的とする酵素蛋
白を溶出させた。ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫは２％硫安を含む
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液の画分に溶出された。この
画分１５０ｍｌを透析により脱塩し、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ−セファロー
スカラム（３ｘ１０ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ０．
５Ｍ塩化カリウムまでの直線濃度勾配法により酵素を溶
出させた。活性画分６０ｍｌを透析により脱塩し、凍結
乾燥により精製ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ酵素を得た（比活性
２１０Ｕ／ｍｇ蛋白）。

【００３８】

【実施例３】最終濃度でトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）０．１Ｍ、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＡＴ
Ｐ、０．１％トリトンＸ−１００、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ
０．１Ｕ／ｍｌ、リパーゼ（旭化成工業製）２５０Ｕ／
ｍｌ、グリセロキナーゼ（旭化成工業製）０．５Ｕ／ｍ
ｌ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業
製）４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ（シグマ社製）５Ｕ
／ｍｌ、４−アミノアンチピリン０．０５％、フェノー
ル０．０５％からなる反応液１ｍｌに１ｍＭＰＩ（フナ
コシ社製）溶液０．０２ｍｌを加え３７℃で１０分間反
応させた後分光光度計（５００ｎｍ）で比色した結果、
吸光度０．１１８が得られた。

【００３９】

【実施例４】最終濃度でＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．３）０．１Ｍ、１ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＣｏＡ−ＳＨ、０．１％トリトンＸ
−１００、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ０．１Ｕ／ｍｌ、リパー
ゼ（旭化成工業製）２５０Ｕ／ｍｌ、アシルーＣｏＡ合
成酵素（旭化成工業製）０．５Ｕ／ｍｌから成る反応液
０．５ｍｌに１ｍＭＰＩ０．０２ｍｌを加え３７℃で５
分間反応後、２０ｍＭＮーエチルマレイミド０．５ｍｌ
加え未反応のＣｏＡと反応させ、次いで最終濃度でアシ
ルＣｏＡオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ
（シグマ社製）１０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン
０．１％、ＡＤＯＳ（アスコルベートオキシダーゼ；ド
ータイト社製）０．１％からなる反応液０．５ｍｌを加
え３７℃で５分間反応させ、５５０ｎｍで比色定量し
た。その結果、吸光度０．１７６が得られた。

【００４０】

【実施例５】最終濃度でトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）０．１Ｍ、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＡＴ
Ｐ、０．１％トリトンＸ−１００、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ
０．１Ｕ／ｍｌ、リパーゼ（旭化成工業製）２５０Ｕ／
ｍｌ、グリセロキナーゼ（旭化成工業株式会社製）０．
５Ｕ／ｍｌ、グリセロ−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製）４Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ１ｍＭ、ジア
フォラーゼ５Ｕ／ｍｌ、ＮＴＢ０．０５％、牛血清アル
ブミン０．０５％で構成される反応液２ｍｌに１ｍＭＰ
Ｉ溶液を０−０．０５ｍｌまで変えて添加し、３７℃で
１０分間反応を行い、５５０ｎｍで比色した。その結果
を図５に示した。良好な直線性が認められた。

【００４１】

【実施例６】最終濃度でトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）０．１Ｍ、０．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭＡＴ
Ｐ、０．１％トリトンＸ−１００、ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ
０．１Ｕ／ｍｌ、アルカリホスファターゼ（旭化成工業
製）５Ｕ／ｍｌ、イノシトールデヒドロゲナーゼ（シグ
マ社製）４Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ１ｍＭ、ジアフォラーゼ５
Ｕ／ｍｌ、ＮＴＢ０．０５％、牛血清アルブミン０．０
５％で構成される反応液２ｍｌに１ｍＭＰＩ溶液を０−
０．０５ｍｌまで変えて添加し、３７℃で１０分間反応
を行い、５５０ｎｍで比色した。その結果を図６に示し
た。良好な直線性が認められた。

【００４２】

【発明の効果】本発明におけるＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫは、
少なくともその作用および基質特異性からホスファチジ
ルイノシトールに高い基質特異性を有し、ホスフォリパ
ーゼＣに属する酵素と認められ、さらにカルシウムイオ
ン、マグネシウムイオンにより阻害されず、トリトンＸ
−１００によって活性化されるとの特有の性質を有し、
至適ｐＨがｐＨ６−７．５付近、ｐＨ安定性がｐＨ６−
８付近、分子量が３８０００±３０００である新規な酵
素を得たもので、ストレプトマイセス属に属する生産菌
による製造方法を提供するとともに、カルシウムイオ
ン、マグネシウムイオンにより阻害されない特有の理化
学的性質によるＰＩの簡便かつ正確な測定方法を提供す
るものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫの作用の最適ｐＨを示す曲
線である。

【図２】ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫの作用の最適温度を示す曲
線である。

【図３】ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫのｐＨ安定性を示す曲線で
ある。

【図４】ＰＩ−ＰＬＣ−ＡＫ熱安定性を示す曲線であ
る。

【図５】実施例５における試薬組成を用いたときのＰＩ
（ホスファチジルイノシトール）の測定結果である。

【図６】実施例６における試薬を用いたときのＰＩの測
定結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも下記の理学的性質を有するホ
   スファチジルイノシトールホスフォリパーゼＣ： （ａ）作用：１モルのホスファチジルイノシトールと１
   モルの水から１モルの１，２−ジグリセリドと１モルの
   ホスフォイノシトールを生成する反応を触媒する。 （ｂ）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに作用
   する。 （ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ６−７．５付近。 （ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ６−８付近で安定。 （ｅ）種々の物質の影響：カルシウムイオン、マグネシ
   ウムイオンにより阻害されない。 （ｆ）界面活性剤の影響：トリトンＸ−１００（ポリオ
   キシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤）
   によって活性化される。 （ｇ）分子量：３８０００±３０００（スーパーローズ
   １２を用いるゲル濾過法による。）（ｈ）最適反応温度：５５−６０℃付近。 （ｉ）等電点：ｐＨ４．４７±０．１５。
2. 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属するホスファ
   チジルイノシトールホスファリパーゼＣ−ＡＫ生産菌を
   培養し、その培養物から請求項１記載の酵素を採取する
   ことを特徴とする該酵素の製造方法。
3. 【請求項３】 ストレプトマイセス属に属するホスファ
   チジルイノシトールホスファリパーゼＣ−ＡＫ生産菌が
   ストレプトマイセス・エスピーＡ９４４２株（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１３１１０）である請求項２記載の該酵素の製造
   方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の酵素を含む反応液に少な
   くともホスファチジルイノシトールを含有する被検液を
   添加し、１、２−ジグリセリドとホスフォイノシトール
   とを生成せしめ、これらのいずれか一方または両方を定
   量することを特徴とするホスファチジルイノシトールの
   測定方法。
5. 【請求項５】 少なくとも下記の理学的性質を有するホ
   スファチジルイノシトールホスフォリパーゼＣを使用す
   ることを特徴とするホスファチジルイノシトー ルの測定
   法。 （ａ）作用：１モルのホスファチジルイノシトールと１
   モルの水から１モルの１，２−ジグリセリドと１モルの
   ホスフォイノシトールを生成する反応を触媒する。 （ｂ）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに作用
   する。 （ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ６−７．５付近。 （ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ６−８付近で安定。 （ｅ）種々の物質の影響：カルシウムイオン、マグネシ
   ウムイオンにより阻害されない。 （ｆ）界面活性剤の影響：トリトンＸ−１００（ポリオ
   キシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤）
   によって活性化される。 （ｇ）分子量：３８０００±３０００（スーパーローズ
   １２を用いるゲル濾過法による。） （ｈ）最適反応温度：５５−６０℃付近。 （ｉ）等電点：ｐＨ４．４７±０．１５。