KR19990007908A - 1,5-안히드로글루시톨의 정량법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소와 시료를 공존시켜, 상기 효소의 활성을 측정하는 것으로 이루어지는, 시료중 1,5-안히드로글루시톨의 정량법; 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소, 상기 효소에 대한 기질, 및 효소 활성에 의해 형성된 기질의 정량용 시약을 함유하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량용 시약에 관한 것이다. 본 발명은 또한 1,5-안히드로글루시톨에 대해 0.33 mM 이하의 Ki 값을 갖는 신규한 트레할라제; 및노카르디아속에 속하고 상기 트레할라제의 생성능을 갖는 미생물을 배지중에 배양시켜, 배양액으로 부터 상기 트레할라제를 회수하는 것으로 이루어지는, 상기 언급된 물리화학적 성질을 갖는 신규한 트레할라제의 생성 방법에 관한 것이다.

Description

1,5-안히드로글루시톨의 정량법
1,5-안히드로글루시톨은 인간 뇌척수액 및 혈장에 존재하고 질병, 특히 당뇨병 환자에게서 1,5-안히드로글루시톨의 수치가 변화하는 것으로 공지되어 있으므로, 당뇨병의 진단 표식으로써 중요하다. 이전의 1,5-안히드로글루시톨의 정량법으로는 기체 크로마토그래피와 같은 특별한 분석 장치를 이용한 방법, 특이적으로 1,5-안히드로글루시톨을 산화시키는 효소를 이용하는 방법 (일본 미심사 특허 출원 제 79780/87), 및 시료중 글루코스와 같은 기질을 각종 효소를 사용하여 다른 물질로 전환시킨 다음 시료중에 남아있는 1,5-안히드로글루시톨의 양을 피라노즈 옥시다제 또는 L-소르보스 옥시다제를 이용하여 정량하는 방법 (일본 미심사 특허 출원 제 185397/88) 이 포함된다.
일반적으로, 액체 크로마토그래피 및 기체 크로마토그래피와 같은 기기 분석은 시료의 복잡한 예비처리를 포함하고, 고가의 특별한 기기를 필요로 하며, 시간-소모적이고; 그러므로, 상기 방법은 다수의 시료 분석에 적합하지 않다. 특이적으로 1,5-안히드로글루시톨에 작용하는 효소를 사용하는 방법에 있어서, 효소를 제조하여 적절한 검출 시스템을 이끌어내는 것이 용이하지 않다. 피라노즈 옥시다제를 사용하는 방법은 피라노즈 옥시다제의 기질 특이성이 불충분하다는 결점을 갖는다.
본 발명은 1,5-안히드로글루시톨의 효소 정량법, 상기 방법에 사용되는 시약, 1,5-안히드로글루시톨의 효소 정량법에서의 사용에 적합한 신규한 트레할라제, 및 신규한 트레할라제의 생성 방법에 관한 것이다. 1,5-안히드로글루시톨 농도의 정량은 당뇨병의 진단에 유용하다.
도 1 은노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제의 pH-활성 곡선을 나타낸다.
도 2 는노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제의 pH 안정성 곡선을 나타낸다.
도 3 은노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제의 열안정성 곡선을 나타낸다.
도 4 는노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제의 온도-활성 곡선을 나타낸다.
도 5 는카텔라토스포라 페루기니아FERM BP-4329 로 부터 유래된 트레할로스 포스포릴라제의 분해 활성을 지표로서 사용하여 수득된 검정 곡선을 나타낸다. 세로좌표의 수는 효소 활성 억제율 (%) 을 나타내고, 가로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨 농도 (mM) 를 나타낸다.
도 6 은카텔라토스포라 페루기니아FERM BP-4329 로 부터 유래된 트레할로스 포스포릴라제의 합성 활성을 지표로서 사용하여 수득된 검정 곡선을 나타낸다. 세로좌표의 수는 효소 활성 억제율 (%) 을 나타내고, 가로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨 농도 (mM) 를 나타낸다.
도 7 은스트렙토마이세스 아우레오파시엔스ATCC 10762 로 부터 유래된 트레할라제를 시험 효소로서 사용하여 수득된 검정 곡선을 나타낸다. 세로좌표의 수는 효소 활성 억제율 (%) 을 나타내고, 가로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨 농도 (mM) 를 나타낸다.
도 8 은로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 14898 로 부터 유래된 트레할라제를 시험 효소로서 사용하여 수득된 검정 곡선을 나타낸다. 세로좌표의 수는 효소 활성 억제율 (%) 을 나타내고, 가로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨 농도 (mM) 를 나타낸다.
도 9 는노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제를 시험 효소로서 사용하여 수득된 검정 곡선을 나타낸다. 세로좌표의 수는 효소 활성 억제율 (%) 을 나타내고, 가로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨 농도 (mM) 를 나타낸다.
도 10 은노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제에 대한 억제율을 지표로서 사용하여 수득된 글루코스의 존재하에서 1,5-안히드로글루시톨에 대한 검정 곡선을 나타낸다. 세로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨의 부재하의 흡광도 및 1,5-안히드로글루시톨의 존재하의 흡광도 사이의 차이 (흡광도 차이) 를 나타내고, 가로좌표의 수는 1,5-안히드로글루시톨 농도 (μg/ml) 를 나타낸다.
본 발명은 하기 : 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 농도-의존적 방법으로 억제되는 효소와 시료를 공존시키고, 상기 효소의 활성을 측정하는 것으로 이루어지는, 시료중 1,5-안히드로글루시톨의 정량법;
활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 농도-의존적 방법으로 억제되는 효소, 상기 효소에 대한 기질, 및 효소 반응에 의해 형성된 기질의 정량을 위한 시약을 함유하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량용 시약;
1,5-안히드로글루시톨에 대해 0.33 mM 이하의 Ki 수치를 가지며 하기 물리화학적 성질 :
(1) 작용 : 식 (I) 로 나타낸 바와 같이 물의 존재하에서 1 분자의 트레할로스를 가수분해하여 2 분자의 D-글루코스를 형성시키는 반응을 촉매한다 :
트레할로스 + H2O → 2 D-글루코스 (I)
(2) 기질 특이성 : 트레할로스에 특이적으로 작용한다,
(3) 기질 친화성 : 트레할로스의 Km 값이 6.7 mM 이다,
(4) 적정 pH 및 안정한 pH : 효소의 적정 pH 가 5 - 6 이고, 효소는 50 ℃ 에서 30 분간 처리되는 경우, 5 - 10 의 pH 범위에서 안정하다,
(5) 적정 온도 및 열안정성 : 적정 온도는 약 45 ℃ 이고, 효소는 pH 5.0 에서 30 분간 처리되는 경우 50 ℃ 이하에서 안정하다,
(6) 억제제 : 1,10-페난트롤린, 에틸렌디아민테트라아세트산 (이후, EDTA 로 언급), 및 2,2'-비피리딜과 같은 금속 킬레이트제, p-머큐리벤조산 및 요오드아세트아미드과 같은 SH 차단제, 히드록시아민, 황산니켈 등에 의해서 억제된다,
(7) 분자량 : 도데실 소듐 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해서 측정된 효소의 서브유니트의 분자량은 약 90,000 이고, 겔 여과법에 의해 측정된 효소의 분자량은 약 400,000 이다
을 갖는 신규한 트레할라제;
노카르디아(Nocardia) 속에 속하며 상기 트레할라제의 생성능을 갖는 미생물을 배지에서 배양하고, 배양액으로 부터 상기 트레할라제를 회수하는 것으로 구성된, 상기-언급된 물리화학적 성질을 갖는 신규한 트레할라제의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 1,5-안히드로글리시톨을 함유하는 임의 시료, 예를 들어, 뇌척수액, 혈청, 원형질 및 소변과 같은 생물학적 시료, 및 상기 시료의 처리된 유액의 검정에 이용될 수 있다.
활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 농도-의존적 방법으로 억제되는 효소로서, 곤충, 동물, 식물, 미생물 등으로 부터 유래된 임의 효소가 그의 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 농도-의존적 방법으로 억제되는 한 사용될 수 있다. 바람직한 예는 트레할라제 및 트레할로스 포스포릴라제와 같은, 기질로써 트레할로스를 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 시판 상품으로서 수득될 수 있거나, 또는 미생물을 배양하므로써 제조될 수 있다.
크레할라제를 생성하는 미생물로는스트렙토마이세스속,노카르디아속 또는로도코쿠스(Rhodococcus) 속에 속하는 미생물이 포함된다.
스트렙토마이세스속에 속하는 미생물의 예로는스트렙토마이세스 아우레오파시엔스ATCC 10762 및스트렙토마이세스 크로모퍼스커스ATCC 23896 이 있다.노카르디아속에 속하는 미생물의 예로는노르카디아 트랜스발렌시스ATCC 6865 가 있다.로도코쿠스속에 속하는 미생물의 예는로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 14898,로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 15076 및로도코쿠스 로도크로우스ATCC 17895 이다.
트레할로스 포스포릴라제를 생성하는 미생물로는카텔라토스포라(Catellatospora) 속 또는키네오스포리아(Kineosporia) 속에 속하는 미생물이 포함된다.
카텔라토스포라속에 속하는 미생물의 예는카텔라토스포라 페루기니아FERM BP-4329 이다.키네오스포리아속에 속하는 미생물의 예는키네오스포리아 아우란티아카ATCC 29727 이다.
상기 미생물들이 속하는 종의 균류학적 성질은 하기 문헌에 기재되어 있다.
스트렙토마이세스 아우레오파시엔스:
문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, p. 2478 (1989)]
스트렙토마이세스 크로모퍼스커스:
문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, p. 2472 (1989)]
노르카디아 트랜스발렌시스:
문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, p. 1469 (1986) 및 Vol. 4, p. 2359 (1989)]
로도코쿠스 글로베룰러스:
문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, p. 1479 (1986) 및 Vol. 4, p. 2369 (1989)]
로도코쿠스 로도크로우스:
문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, p. 2365-2367 (1989)]
카텔라토스포라 페루기니아:
문헌 [Int. J. Syst. Bacteriol.,36, 512-517 (1986)]
키네오스포리아 아우란티아카:
문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, p. 2504-2506 (1989)]
상기 미생물의 배양 방법 및 그에 의해 생성된 효소의 정제 방법이 하기에 기재된다.
트레할라제를 생성하는 미생물, 예를 들어,스트렙토마이세스,노카르디아또는로도코쿠스속에 속하는 미생물, 및 트레할로스 포스포릴라제를 생성하는 미생물, 예를 들어,카텔라토스포라또는키네오스포리아속에 속하는 미생물을 배양하기 위해서, 방선균류, 박테리아 등을 배양하는 통상적인 방법이 이용된다.
배지로서, 탄소원, 질소원, 무기염 등을 함유하는 한 천연 배지 또는 합성 배지중 어느 하나가 사용될 수 있다.
탄소원으로서, 탄수화물, 당 알콜, 유기산 등이 사용될 수 있다. 탄수화물의 예는 글루코스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 전분 및 당밀이다. 당 알콜의 예는 글리세롤, 소르비톨 및 만니톨이다. 유기산의 예는 아세트산, 락트산, 피루브산, 및 시트르산이다.
질소원으로서, 무기 또는 유기 암모늄염, 질소-함유 유기 물질 등이 사용될 수 잇다. 무기 또는 유기 암모늄염의 예는 암모니아, 암모늄 클로라이드, 탄산암모늄, 인산암모늄, 및 아세트산암모늄이다. 질소-함유 유기 물질의 예는 우레아, 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 고기 추출물, 콘 스팁액 (corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 및 효모 추출물이다.
무기 염으로서, 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 황산마그네슘, 황산철 등이 사용될 수 있다.
배양 방법으로서, 액체 배양법, 특히 액내 교반 배양법이 바람직하게 이용된다. 배양은 pH 6.0 ∼ 8.0 및 25 ∼ 37 ℃ 의 온도에서 1 ∼ 7 일간 정적 배양으로 또는 통기 및 교반시키면서 수행된다.
상기 방법으로 미생물을 배양시키므로써, 트레할라제 또는 트레할로스 포스포릴라제가 형성되어 배양액, 주로 미생물 세포중에 축적된다. 배양액으로 부터 트레할라제 또는 트레할로스 포스포릴라제의 회수는, 예를 들어, 하기 방법으로 수행될 수 있다.
배양의 완료 후, 미생물 세포를 원심분리 또는 여과에 의해서 배양액으로 부터 수합한 다음, 초음파 파쇄 등에 의해 파쇄시켜 조 효소 추출물을 수득한다. 조 효소 추출물을 염석, 유기 용매로의 침전, 투석, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과법, 및 동결건조와 같은 효소 정제를 위해 통상 사용되는 방법에 따라서 처리하므로써, 정제된 트레할라제 또는 정제된 트레할로스 포스포릴라제가 수득될 수 있다.
본 발명의 신규한 트레할라제의 물리화학적 성질은 하기와 같다.
(1) 작용
본 발명의 효소는 식 (I) 에서 나타낸 바와 같이 물의 존재하에서 1 분자의 트레할로스를 가수분해하여 2 분자의 D-글루코스를 형성하는 반응을 촉매한다.
트리할로스 + H2O → 2 D-글루코스 (I)
(2) 기질 특이성 및 억제 특이성
다양한 기질에 대한 효소의 활성을 100 mM 인산 완충액 (pH 5.5) 중 1.75 mM 의 기질 농도에서 측정한다. 결과는 상대 활성으로서 표 1 에 나타내고, 트레할로스에 대한 활성을 100 으로 정의한다.
당 상대 활성 (%)
트레할로스 100
트레할로사민 0.5
코지비오스 0
니제로스 0
말토스 0
락토스 0
수크로스 0
표 1 로 부터 명백한 바와 같이, 효소는 트레할로스에 대해 특이적으로 작용한다. 효소는 또한 기질로서 트레할로스를 사용하는 1.75 mM 의 다양한 당에 대해 억제 특이성이 있는 것으로 조사되었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
당 억제율 (%)
1,5-안히드로글루시톨 80.7
코지비오스 0
니제로스 0
말토스 0
락토스 0
수크로스 0
(3) 기질 친화성
린웨버-버크 곡선 (Lineweaver-Burk plot) [J. Am. Chem. Soc.,56, 658 (1934)] 에 의해 측정되는 바와 같이 pH 5.5 에서 트레할로스에 대한 효소의 Km 값은 6.7 mM 이다.
(4) 억제 친화성
린웨버-버크 곡선에 의해 측정되는 바와 같이 pH 5.5 에서 1,5-안히드로글루시톨에 대한 효소의 Ki 값은 0.33 mM 이다.
(5) 적정 pH
효소의 활성은 pH 5.0 - 8.0 의 인산 완충액을 사용하여 측정하므로써 적정 pH 를 결정하고, 및 도 1 에서 나타낸 pH-활성 곡선이 수득된다. 효소의 적정 pH 는 5 ∼ 6 이다.
(6) pH 안정성
pH 2.6 ∼ 12.0 의 만능 완충액 (Johnson-Lindsay buffer, Basic Methods for Biochemistry, Vol. 6, Maruzen) 중 50 ℃ 에서 30 분간 처리 후, 잔류하는 효소의 활성을 측정한다. 도 2 에서 나타낸 바와 같이, 효소는 5 ∼ 10 의 pH 범위에서 안정하다.
(7) 열안정성
효소의 열안정성은 효소를 pH 5.0 의 인산 완충액중 30 분간 각종 온도에서 효소를 유지시켜 잔류 활성을 측정하므로써 밝혀졌다. 도 3 에서 나타낸 바와 같이, 효소는 50 ℃ 이하에서 안정하다.
(8) 적정 온도
효소의 적정 온도는 pH 5.5 의 인산 완충액을 사용하여 결정된다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, 적정 온도는 약 45 ℃ 이다.
(9) 억제제 및 금속 이온의 효과
효소에 대한 각종 금속 킬레이트제, 효소 억제제 및 금속 이온의 효과를 1 mM 의 농도에서 연구하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
화합물 억제율 (%)
디에틸디티오카르밤산 51.0
2,2'-비피리딜 60.0
EDTA 67.6
1,10-페난트롤린 88.5
p-머큐리벤조산 94.7
N-에틸말레이미드 21.9
요오드아세트아미드 83.6
N-브로로숙신이미드 23.4
히드록실아민 81.2
소듐 아지드 22.8
CoCl2 20.4
NiSO4 62.1
ZnSO4 53.4
BaCl2 40.7
효소는 1,10-페난트롤린, 에틸렌디아민테트라아세트산 및 2,2'-비피리딜과 같은 금속 킬레이트제, p-머큐리벤조산 및 요오드아세트아미드와 같은 SH 차단제, 히드록실아민, 황산니켈 등에 의해 억제된다.
(10) 분자량
도데실 소듐 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 측정된 효소의 서브유니트의 분자량은 약 90,000 이고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하는 겔 여과법에 의해 측정된 효소의 분자량은 약 400,000 이다.
(11) 동질성
효소는 도데실 소듐 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단일 밴드로 분리된다. 즉, 단백질의 단일 밴드를 트리스-글리신 완충액 (pH 8.3) 중 60 분간 전기영동시킨 다음, 코마씨 염색 용액으로 염색하므로써 관찰한다.
(12) 효소 활성의 측정 방법
효소 활성은 하기 방법으로 측정된다.
1) 시약
(i) 기질 용액
트레할로스를 100 mM 인산 완충액 (pH 5.5) 중에 용해시켜 12.5 mM 의 농도를 수득한다.
(ii) 발색 시약
글루코스 옥시다제 (Toyobo Co., Ltd., Grade II), 퍼옥시다제 (Toyobo Co., Ltd., Grade III), 4-아미노안티피린 및 페놀을 수중에 용해시켜 각각 최종 농도 0.04 mg/ml, 0.04 mg/ml, 1.2 mM 및 21 mM 을 수득한다.
2) 방법
1 ml 의 기질 용액에 0.02 ml 의 효소 용액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분간 반응을 수행한다. 100 ℃ 에서 3 분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 반응 혼합물에 1 ml 의 발색 시약을 첨가하고, 반응을 37 ℃ 에서 20 분간 수행한 다음, 500 nm 에서 흡광도를 측정한다. 상기 방법에서 효소 용액 대신에 물을 사용하여 대조 용액을 제조한다.
3) 활성의 계산
트레할라제 활성을 유니트로 표현하는데, 1 유니트는 1 μmol 의 트레할로스를 37 ℃ 에서 1 분간 가수분해시키는 효소의 양으로 정의한다. 효소 용액 밀리리터당 활성 (U/ml) 은 하기 방정식에 따라 흡광도에 있어서 총 차이 (효소용액 - 대조용액) 로 부터 계산될 수 있다.
활성 (U/ml) = 2.02 ml × 흡광도차/5.33 × 0.02 ml × 30 분 × 2
본 발명의 신규 트레할라제의 생성방법을 하기에 기재한다. 방법에 있어서,노카르디아속에 속하며 상기 기재된 신규 트레할라제의 생성능을 갖는 미생물이 사용된다. 적합한 균주의 대표적인 예는노카르디아sp. NK-2067 로, 이는 본 발명자들에 의해 토양으로 부터 단리된 균주이다. 균주의 균류학적 성질을 하기에 나타낸다. 균류학적 성질을 조사하기 위한 실험은 주로 문헌 [Takeji Hasegawa: Classification and Identification of Microorganisms, University of Tokyo Press (1975)] 에 기재된 바에 따라서 수행된다. 균주의 분류 및 동정은 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1-4 (1986-1989)] 등을 참고로 하여 되어진다.
본 발명자들은, 토양으로 부터 새로이 단리된노카르디아속에 속하는 알티노마이세트 NK-2067 이 1,5-안히드로글루시톨에 고감수성인 트레할라제를 생성할 수 있다는 것을 발견하였다.
상기 악티노마이세트 NK-2067 의 균류학적, 배양 및 생리학적 특징을 하기에 기재한다.
1. 균류학적 특징
1) 균사
기생균사의 형성 : 단순 분지
기생균사의 무사분열 : 관찰
기질균사의 무사분열 : 관찰
2) 포자
포자의 형성 및 위치 : 기생균사에서 형성
포자낭의 형성 및 위치 : 관찰무
포자체의 말단에서 형성된 사슬에서의 포자수 : 10 개 이상
포자의 특성 :
표면 구조; 유연
형태 및 크기; 간상, 약 0.7 ∼ 1.0 μm × 0.7 ∼ 2.0 μm
포자의 고유운동성 및 편모의 존재; 관찰무
3) 기타
클라미도포자; 관찰무
속상체; 관찰무
유사포자낭; 관찰무
균사의 분지 형태; 단순 분지
2. 배양적 특징
NK-2067 균주는 일반적으로 사용되는 합성 배지 및 천연 배지상에서 중간 또는 양호한 성장을 나타낸다. 기질 균사의 색채는 백색 내지 탁한 핑크색이다. 가용성 갈색 안료의 형성이 배양 배지의 일부에서 관찰될 수 있다.
28 ℃ 에서 14 일간 배양한 후 관찰되는 각종 배지에서의 NK-2067 균주의 성장 및 색채와 같은 배양적 특징을 하기에 나타낸다. 색채명은 컬러 하모니 매뉴얼 [Container Corporation of America, 4th edition (1958)] 에 따라서 나타낸다.
1) 수크로스 - 질산염 아가 배지
성장; 불량
기질 균사의 색채; 백색 (a)
기생 균사의 형성 및 색채; 형성무
가용성 안료; 무
2) 글루코스 - 아스파라긴 아가 배지
성장; 양호
기질 균사의 색채; 살색 핑크 (4ca) - 더스티 피치 (5ec)
기생 균사의 형성 및 색채; 중간, 백색 (a)
가용성 안료; 무
3) 글리세롤 - 아스파라긴 아가 배지
성장; 양호
기질 균사의 색채; 살색 핑크 (5ca) - 밝은 장미 베이지 (4ec)
기생 균사의 형성 및 색채; 불량, 백색 (a)
가용성 안료; 무
4) 전분 - 무기염 아가 배지
성장; 불량
기질 균사의 색채; 오트밀 (2ec)
기생 균사의 형성 및 색채; 형성무
가용성 안료; 무
5) 티로신 아가 배지
성장; 양호
기질 균사의 색채; 누드 탠 (4gc) - 코르크 탠 (4ie)
기생 균사의 형성 및 색채; 불량, 백색 (a)
가용성 안료; 형성 (붉은 갈색)
6) 영양 아가 배지
성장; 양호
기질 균사의 색채; 밝은 머스타드 탠 (2ie)
기생 균사의 형성 및 색채; 형성무
가용성 안료; 무
7) 효모 - 말트 아가 배지
성장; 양호
기질 균사의 색채; 시나몬 (3le)
기생 균사의 형성 및 색채; 형성무
가용성 안료; 단지 소량 형성 (황토)
8) 오트밀 아가 배지
성장; 불량
기질 균사의 색채; 오트밀 (2ec)
기생 균사의 형성 및 색채; 형성무
가용성 안료; 무
3. 생리학적 특성
NK-2067 균주의 생리학적 특성을 하기에 나타낸다. 성장 온도 범위를 배양 14 일 후 측정하고, 다른 결과들은 28 ℃ 에서 배양 2 내지 3 주후에 수득한다.
1) 성장 온도 범위; 6 ∼ 36 ℃
2) 젤라틴의 액화; +
3) 전분의 가수분해; -
4) 탈지분유의 응집 및 펩톤화; -
5) 멜라닌-유사 안료의 생성
(i) 펩톤 - 효소 - 철 아가 배지; +
(ii) 티로신 아가 배지; +
6) 탄소원의 동화
기본 배지로서, 프리드함 고트리브 (Pridham Gottlieb) 아가 배지가 사용된다. 하기에서, + 는 균주가 탄소원을 이용한다는 것을 나타내고, - 는 균주가 탄소원을 이용하지 않는다는 것을 나타내다.
L-아라비노스; -
D-크실로스; _
D-글루코스; +
수크로스; +
라피노스; -
D-프룩토스; +
람노스; -
이노시톨; +
D-만니톨; -
7) 변성
기본 배지로서, 영양 아가 배지가 사용된다. 하기에서 + 는 균주가 기질을 변성시킨다는 것을 나타내고, - 는 균주가 기질을 변성시키지 않는다는 것을 나타낸다.
티로신; -
아데닌; -
크샨틴; +
하이포크샨틴; +
우레아; +
8) 산 생성
기본 배지로서, 팹톤 액체 배지가 사용된다 (브로모티몰 블루가 지시제로서 사용된다). 하기에서, + 는 균주가 산을 생성한다는 것을 나타내고, - 는 균주가 산을 생성하지 않는다는 것을 나타낸다.
글루코스; +
갈락토스; -
이노시톨; -
말토스; -
만노스; -
람노스; -
소르비톨; -
아라비노스; -
아도니톨; -
9) NaCl 내성
기본 배지로서, 영양 아가 배지가 사용된다. 하기에서, + 는 균주가 성장한다는 것을 나타내고, - 는 균주가 성장하지 않는다는 것을 나타낸다.
0 % NaCl; +
1 % NaCl; +
2 % NaCl; +
4 % NaCl; -
6 % NaCl; -
10 % NaCl; -
4. 화학분류적 특성
1) 균주에 있어서 디아미노피멜산의 광학 이성질체; 메조-형태
2) 세포성 액체의 주요 퀴논 성분; MK (메나퀴논)-8 (II, III-H4, ω-사이클)
3) 세포성 액체에서의 미콜산; 함유
4) 전체 세포의 주요 당 성분; 아라비노스 및 갈락토스
균주는 기질 균사의 무사분열이 관찰되고, 포자 사슬이 기생 균사상에서 형성되는 그의 균류학적 특성에 의해서 및; 메조-디아미노피멜산, 아라비노스 및 갈락토스가 세포벽에서 검출되고, 글리신이 검출되지 않으며, 주요 퀴논 성분이 사수소화 메나퀴논-8, 오메가 사이클 [MK-8 (II, III-H4, ω-사이클)], 및 미콜산이라는 그의 화학분류적 특성에 의해서 악티노마이세트중노카르디아속에 속하는 것으로 확인되었다.
상기 균주는노카르디아sp. NK-2067 로 명명되고, 1996 년 1 월 11 일에 국제기탁기관 [the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305 Japan)] 에 기탁번호 FERM BP-5359 로 기탁되었다.
노카르디아속의 미생물을 사용하는 상기-기재된 신규한 트레할라제의 생성을 위해서, 이전에 기재된 미생물을 배양하여 형성된 효소를 정제하는 방법과 유사한 방법이 이용된다.
활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 억제되는 효소와 함께 시료를 공존시켜, 상기 효소의 활성을측정하는 것으로 구성된 시료중 1,5-안히드로글루시톨의 정량법을 하기에 기재한다.
시료중 1,5-안히드로글루시톨의 농도는, 공지된 농도의 1,5-안히드로글루시톨의 존재하에 측정되는 상기 효소의 활성 및 1,5-안히드로글루시톨 농도로 부터 미리 제조된 검정 곡선을 이용하여, 시료의 존재하에 측정되는 농도-의존적 방법으로 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소의 활성으로 부터 측정될 수 있다.
이와는 달리, 1,5-안히드로글루시톨의 부재하에 상기 효소의 활성 (A) 과 1,5-안히드로글루시톨의 존재하에서의 상기 효소의 활성 (B) 사이에 차이, 또는 하기 방정식에 따라 계산된 억제율이 1,5-안히드로글루시톨의 존재하에 측정된 상기 효소의 활성 대신에 검정 곡선에 대해서 이용될 수 있다.
억제율 (%) = [(A-B)/A × 100]
A: 1,5-안히드로글루시톨의 부재하에 효소 활성
B: 1,5-안히드로글루시톨의 존재하에 효소 활성
농도-의존적 방법으로 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소의 활성은 효소 활성을 측정하기 위한 통상적인 방법으로 측정될 수 있다. 효소 반응은 효소, 효소에 대한 기질 및 필요에 따라서, 효소 활성 조절제를 수성 배지에 첨가하므로써 제조된 반응 혼합물중, 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 60 분간, 바람직하게는 1 ∼ 20 분간, 보다 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 수행된다. 효소 활성의 측정은 형성된 생성물의 농도 또는 일정 조건하에서 효소 반응의 결과로서 잔존하는 기질을 측정하므로써; 또는 형성된 생성물 또는 잔존하는 기질을 다른 물질로 전환시킨 다음 그의 농도를 측정하므로써 수행된다.
수성 배지로서, 완충액 및 생리 식염수와 같은 물-함유 액체가 사용될 수 있다. 완충액이 바람직하게 사용된다.
완충액의 예는 락테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 프탈레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 트리에탄올아민 완충액, 디에탄올아민 완충액, 리신 완충액, 바르비탈 완충액, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액, 이미다졸 완충액, 말레이트 완충액, 옥살레이트 완충액, 글리신 완충액, 보레이트 완충액, 카르보네이트 완충액 및 굿 (Good's) 완충액이다.
효소 활성 조절제의 예는 EDTA 및 1,10-페난트롤린과 같은 금속 킬레이트제, 만니톨 및 글리세롤과 같은 당 알콜, 아연 및 구리와 같은 금속 이온, 요오드아세트산 및 요오드아세트아미드와 같은 SH 차단제이다.
트레할라제가 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소로서 사용되는 1,5-안히드로글루시톨의 정량법을 하기에 기재한다.
트레할라제는, 2 분자의 D-글루코스가 1 분자의 트레할로스 및 1 분자의 물로 부터 형성되는, 식 (I) 로 나타낸 반응을 촉매한다.
트리할로스 + H2O → 2 D-글루코스 (I)
효소 반응은 트레할로스, 트레할라제, 및 필요에 따라서, 상기 언급된 효소 활성 조절제를 상기 언급된 수성 배지에 첨가하므로써 제조된 반응 혼합물중, 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 20 분간, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 수행된다.
효소 활성은 D-글루코스의 정량을 위해서 사용된 화학적 또는 생화학적 방법에 의해서 측정될 수 있다. 증가된 D-글루코스의 양은 환원력 등에서의 증가가 화학적으로 측정되는 직접적인 방법, 또는 D-글루코스가 측정을 위해 다른 기질로 전환되는 방법에 의해서 측정될 수 있다. D-글루코스에 대해 높은 특이성을 가지며 폭넓은 용도를 위한 자동 생화학적 분석기에 이용될 수 있는 효소를 이용하는 방법이 특히 바람직하다.
상기 방법의 예는: 1) D-글루코스가 글루코스 옥시다제에 의해서 산화되고, 반응에 의해 형성된 과산화수소가 비색정량적으로 정량되는 방법; 2) D-글루코스가 피라노스 옥시다제에 의해서 산화되고, 반응에 의해 형성된 과산화수소가 비색정량적으로 정량되는 방법; 3) D-글루코스가 조효소 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (이후, NAD 로 언급) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (이후, NADP 로 언급) 의 존재하에서 글루코스 데히드로게나제를 사용하여 탈수소화되고, 반응에 의해 형성된 조효소의 환원 형태인 NADH 또는 NADPH 모두의 흡광도를 분광 광도계로 측정하는 방법; 및 4) D-글루코스를 아데노신 트리포스페이트의 존재하에서 헥소키나제 또는 글루코키나제를 이용하여 인산화시키고, 형성된 D-글루코스-6-포스페이트를 조효소 NADP 의 존재하에서 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 이용하여 탈수소시켜, 반응에 의해 형성된 NADPH 의 흡광도를 분광 광도계에 의해서 측정하는 방법이다.
상기 기재된 바와 같이, D-글루코스의 정량은 D-글루코스를 과산화수소 및 조효소 (예를 들어, 상기 언급된 NADH 및 NADPH) 와 같은, 용이하게 측정가능한 중간체로 효소학적으로 전환시켜, 중간체의 양을 측정하므로써 수행될 수 있다. 과산화수소는 비색정량, 형광분석, 화학발광 분석 및 전극 방법과 같은 방법에 의해서 정량될 수 있고, 조효소 NADH 및 NADPH 는, 예를 들어, 비색정량법에 의해서 정량될 수 있다.
비색정량법은 퍼옥시다제와 같은 효소의 존재하에서 과산화수소와 착색제를 반응시켜 발색시킨 다음, 분광 광도계로 측정하므로써 수행될 수 있다. 착색제로서, 트린더 (Trinder's) 시약 및 류코 시약이 사용될 수 있다.
트린더 시약의 예는 4-아미노안티피린과 페놀 및 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산과 같은 페놀 화합물의 조합, 4-아미노안티피린과 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술로프로필)-m-톨루이딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술로프로필)-3,5-디메톡시아닐린, 소듐 N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, 및 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (이후, EMSE 로 언급) 과 같은 아닐린 화합물의 조합이다.
류코 시약의 예는 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아딘, 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아딘, 소듐 N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민이다.
형광분석법은 퍼옥시다제와 같은 효소의 존재하에서 과산화수소를 형광 시약과 반응시켜 형광 물질을 형성시킨 다음, 형광분석계로 측정하므로써 수행될 수 있다. 형광 시약으로서, p-히드록시페닐아세트산, p-히드록시페닐프로피온산, 코우마린 등이 사용될 수 있다.
화학발광 분석법은 퍼옥시다제와 같은 효소의 존재하에서 과산화수소와 형광 시약을 반응시켜 발색시킨 다음, 발광계로 측정하므로써 수행될 수 있다. 형광 시약으로서, 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄 에스테르 등이 사용될 수 있다.
NADH 및 NADPH 와 같은 조효소는 흡광도를 측정하므로써 직접적으로 정량될 수 있다. 이와는 달리, 그들은 다른 기질로 전환된 후 측정될 수 있다. 예를 들어, NADPH 는 NADPH 를 테트라졸륨 염과 반응시키고 반응에 의해 형성된 포르마잔 안료를 분광 광도계를 사용하여 측정하므로써 정량될 수 있다.
상기 방법 1) 에 따른 효소 활성의 측정 방법을 하기에 기재한다. 트레할라제의 효소 활성은 식 (II) 로 나타낸 반응을 수행하여 퀴논이민 안료를 형성시키고 분광 광도계로 안료의 농도를 측정하므로써 측정된다.
상기 방법에 따른 검정에서 사용되는 반응 혼합물은, 트레할라제, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 트레할로스, 4-아미노안티피린, EMSE 등을 인산 완충액과 같은 완충액에 첨가하므로써 제조된다. 인산 완충액의 pH 는 바람직하게는 5.0 ∼ 8.0, 보다 바람직하게는 6.0 ∼ 7.0 이고, 그의 농도는 바람직하게는 10 ∼ 500 mM, 보다 바람직하게는 50 ∼ 250 mM 이다.
완충액에 첨가되는 기질의 농도는 하기와 같다 : 트레할라제, 바람직하게는 0.001 ∼ 10 U/ml, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 1 U/ml; 글루코스 옥시다제, 바람직하게는 1 ∼ 100 U/ml, 보다 바람직하게는 10 ∼ 50 U/ml; 퍼옥시다제, 바람직하게는 1 ∼ 50 U/ml, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 U/ml; 트레할로스, 바람직하게는 1 ∼ 100 mM, 보다 바람직하게는 10 ∼ 5 mM; 4-아미노안티피린, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mM; EMSE, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mM.
상기-기재된 반응 혼합물에 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료를 첨가하고, 반응을 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 20 분간, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 수행한다. 효소 활성은 550 nm 에서의 흡광도를 측정하므로써 정량되는, 반응에 의해 형성된 퀴논이민 안료의 농도로 부터 정량될 수 있다.
D-글루코스가 시료중에 존재하는 경우에 있어서, 하기 방법에 앞서 시료중 D-글루코스를 제거하는 것이 바람직하다. D-글루코스를 함유하는 시료의 예는 혈액, 혈청 및 원형질이다.
시료중 D-글루코스의 제거는 D-글루코스를 컬럼 등을 사용하여 흡착 제거시키는 물리적 방법 및 D-글루코스가 또 다른 기질로 전환되는 화학적 또는 생화학적 방법에 의해서 수행될 수 있다. 효소를 사용하는 생화학적 전환 방법은 바람직하게는 자동 생화학적 분석기를 사용하는 검정에 이용된다.
D-글루코스는 D-글루코스의 정량에 사용되는 상기-기재된 전환 방법에 의해서 또 다른 기질로 전환될 수 있다. 상기 방법의 예는: 1) D-글루코스가 글루코스 옥시다제를 사용하여 D-글루코노-δ-락톤으로 전환되는 방법; 2) D-글루코스가 피라노스 옥시다제를 사용하여 2-데히드로-D-글루코스로 전환되는 방법; 3) D-글루코스가 글루코스 데히드로게나제를 사용하여 D-글루코노-δ-락톤으로 전환되는 방법; 및 4) D-글루코스가 헥소키나제 또는 글루코키나제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 사용하여 D-글루코노-δ-락톤-6-포스페이트로 전환되는 방법이다.
D-글루코스를 함유하는 시료의 검정은 하기 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 시료중 D-글루코스를 상기 방법 1) 또는 2) 에 의해 또 다른 기질로 전환시키고, 형성된 과산화수소는 일본 미심사 특허출원 공보 제 83287/82 에 기재된 방법에 의해서 제거되고, 트레할라제의 작용을 이용하는 반응을 수행하고, 반응에 의해 형성된 D-글루코스의 양을 측정한다. 이와는 달리, 시료중 D-글루코스를 상기 방법 3) 또는 4) 에 의해 또 다른 기질로 전환시키고, 형성된 NADH 또는 NADPH 를 NADH 옥시다제, NADPH 옥시다제 등을 이용하여 또 다른 기질로 전환시킨다. 4) 의 방법이 이용되는 경우에 있어서, 반응 혼합물에 남아있는 아데노신 트리포스페이트를 디아포라제, 아데노신 트리포스파타제 등을 이용하여 또 다른 기질로 전환시킨다. 이어서, 트레할라제의 작용을 이용하는 반응을 수행하고, 반응에 의해 형성된 D-글루코스의 양을, 예를 들어, 상기 방법 1) 또는 2) 에 의해 정량한다.
시료중 D-글루코스의 제거를 포함하는 1,5-안히드로글루시톨의 대표적인 정량법은 하기의 단계로 이루어진다 : 글루코스 옥시다제를 이용하여 D-글루코스를 D-글루코노-δ-락톤 및 과산화수소로 전환시키고; 퍼옥시다제의 존재하에서 EMSE 와 같은 과산화수소-제거된 화합물과의 반응에 의해서 형성된 과산화수소를 제거하고; 및 식 (II) 로 나타낸 상기 방법에 따라서 트레할라제 활성을 측정한다.
상기 방법에서, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, EMSE 등을 인산 완충액과 같은 완충액에 첨가하므로써 제조된 반응 혼합물은 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 20 분간, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 시료와의 반응을 수행하여 시료중 D-글루코스를 제거한다. 반응 혼합물에 트레할로스, 트레할라제, 4-아미노안티피린 등을 함유하는 시약을 첨가하고, 트레할라제 활성을 상기 기재된 방법에 의해서 측정한다. 시약의 성분의 농도는 상기와 동일하다.
또 다른 대표적인 방법은 하기의 단계로 이루어진다 : 아데노신 트리포스페이트의 존재하에서 글루코키나제를 이용하여 D-글루코스를 D-글루코스-6-포스페이트로 전환시키고; 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 이용하여 D-글루코스-6-포스페이트 및 NADP 를 D-글루코노-δ-락톤-6-포스페이트 및 NADPH 로 전환시키고; 아데노신 트리포스페이트를 아데노신 트리포스페타제를 이용하여 분해시키고; 및 식 (II) 로 나타낸 상기 방법에 따라서 트레할라제 활성을 측정한다.
상기 방법에서, 글루코키나제, ATP, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 및 NADP 를 인산 완충액과 같은 완충액에 첨가하므로써 제조된 반응 혼합물을 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 20 분간, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 시료와의 반응을 수행하여 시료중 D-글루코스를 제거한다. 반응 혼합물에 남아있는 아데노신 트리포스페이트를 아데노신 트리포스파타제의 첨가에 의해 분해한 후, 트레할로스, 트레할라제, 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린, EMSE 등을 함유하는 시약을 반응 혼합물에 첨가하고, 트레할라제 활성을 상기 기재된 방법에 의해서 측정한다. 시약의 성분의 농도는 상기와 동일하다. 반응 혼합물에 함유된 기질의 농도는 하기와 같다 : 글루코키나제, 바람직하게는 0.1 ∼ 100 U/ml, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 U/ml; 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 바람직하게는 0.1 ∼ 100 U/ml, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 U/ml; 아데노신 트리포스파타제, 바람직하게는 0.1 ∼ 100 U/ml, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 U/ml; NADP, 바람직하게는 1 ∼ 100 mM, 보다 바람직하게는 10 ∼ 50 mM; 아데노신 트리포스페이트, 바람직하게는 1 ∼ 100 mM, 보다 바람직하게는 10 ∼ 50 mM. 다른 화합물 및 효소는 상기와 동일한 농도로 사용된다.
다음으로, 트레할로스 포스포릴라제에 대한 설명을 하기에 기재한다. 트레할로스 포스포릴라제는 식 (III) 으로 나타낸 반응을 가역적으로 촉매한다.
트레할로스 포스포릴라제의 효소 활성은, D-글루코스, β-D-글루코스-1-포스페이트, 트레할로스, 또는 인산의 농도 변화를 공지된 방법으로 측정하는 직접적인 방법이나, 또는 상기 기질들을 측정을 위한 다른 기질로 전환시키는 방법에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, 식 (III) 의 반응에서 오른쪽 방향으로의 효소 활성은 식 (IV) 의 반응을 수행하고 반응에 의해 형성된 NADPH 의 농도를 광학적으로 측정하므로써 측정될 수 있다.
상기 효소 활성의 측정을 위한 반응 혼합물은 트레할로스 포스포릴라제, β-포스포글루코뮤타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 트레할로스, NADP 등을 인산 완충액과 같은 완충액에 첨가하므로써 제조된다. 인산 완충액의 pH 는 바람직하게는 5.0 ∼ 8.0, 보다 바람직하게는 6.0 ∼ 7.0 이고, 그의 농도는 바람직하게는 10 ∼ 500 mM, 보다 바람직하게는 50 ∼ 250 mM 이다.
완충액에 첨가된 기질의 농도는 하기와 같다 : 트레할로스 포스포릴라제, 바람직하게는 0.001 ∼ 10 U/ml, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 1 U/ml; β-포스포글루코뮤타제, 바람직하게는 0.1 ∼ 50 U/ml, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 U/ml; 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 바람직하게는 0.1 ∼ 50 U/ml, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 U/ml; 트레할로스, 바람직하게는 1 ∼ 100 mM, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mM; NADP, 바람직하게는 1 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 mM.
상기-기재된 반응 혼합물에 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료를 첨가하고, 반응을 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 20 분간, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 수행한다. 효소 활성은 340 nm 에서 흡광도를 측정하므로써 정량되는 반응에 의해 형성된 NADPH 의 농도로 부터 정량될 수 있다.
식 (III) 의 반응에서 왼쪽 반응으로의 효소 활성은, 예를 들어, 식 (V) 의 반응 수행하고, 반응에 의해 형성된 퀴논이민 안료의 농도를 광학적으로 측정하므로써 측정될 수 있다.
상기 효소 활성의 측정을 위한 반응 혼합물은 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제, 크샨틴 옥시다제, 퍼옥시다제, 글루코스, β-글루코스-1-포스페이트, 이노신, 4-아미노안티피린, EMSE 등을 이미다졸 완충액과 같은 완충액에 첨가하므로써 제조된다. 이미다졸 완충액의 pH 는 바람직하게는 5.0 ∼ 8.0, 보다 바람직하게는 6.0 ∼ 7.0 이고, 그의 농도는 바람직하게는 10 ∼ 200 mM, 보다 바람직하게는 50 ∼ 100 mM 이다.
완충액에 첨가된 기질의 농도는 하기와 같다 : 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 U/ml, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 U/ml; 크샨틴 옥시다제, 바람직하게는 1 ∼ 50 U/ml, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 U/ml; 퍼옥시다제, 바람직하게는 1 ∼ 50 U/ml; 글루코스, 바람직하게는 5 ∼ 200 mM, 보다 바람직하게는 20 ∼ 100 mM; β-글루코스-1-포스페이트, 바람직하게는 5 ∼ 200 mM, 보다 바람직하게는 20 ∼ 100 mM; 이노신, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mM; 4-아미노안티피린, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mM; EMSE, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mM.
상기-기재된 반응 혼합물에 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료를 첨가하고, 반응을 10 ∼ 50 ℃ 에서 1 ∼ 20 분간, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 수행한다. 효소 활성은 550 nm 에서의 흡광도를 측정하므로써 정량되는 반응에 의해 형성된 퀴논이민 안료의 농도로 부터 정량될 수 있다.
농도-의존적 방법으로 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 억제되는 효소, 상기 효소에 대한 기질, 및 효소 활성에 의해 형성된 기질의 정량용 시약을 함유하는 본 발명의 1,5-안히드로글루시톨의 정량용 시약을 하기에 기재한다.
트레할라제가 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소로서 사용되는 경우, 기질은 트레할로스이고, 형성된 기질의 정량용 시약은 D-글루코스의 정량용 시약이다.
트레할로스 포스포릴라제가 농도-의존적 방법으로 활성이 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소로서 사용되는 경우, 기질은 트레할로스 및 인산, 또는 D-글루코스 및 β-글루코스-1-포스페이트이다. 각 반응에서 형성된 기질은 각기 D-글루코스 및 β-글루코스-1-포스페이트, 또는 트레할로스 및 인산이다. 즉, 형성된 기질의 정량용 시약은 트레할로스, 인산, D-글루코스 또는 β-글루코스-1-포스페이트의 정량용 시약이다.
트레할라제 활성을 측정하기 위한 시약은 트레할로스 및 D-글루코스의 정량용 시약을 함유한다. 필요에 따라서, 완충액, 기타 효소, 그에 대한 기질 및 조효소를 더 함유할 수 있다. 트레할로스 포스포릴라제 활성의 측정용 시약은 트레할로스, 인산, 및 D-글루코스의 정량용 시약 또는 β-글루코스-1-포스페이트의 정량용 시약; D-글루코스, β-글루코스-1-포스페이트, 및 트레할로스의 정량용 시약 또는 인산의 정량용 시약을 함유한다. 필요에 따라서, 완충액, 기타 효소, 그에 대한 기질 및 조효소를 더 함유할 수 있다.
D-글루코스, β-글루코스-1-포스페이트, 트레할로스, 및 인산에 대한 각각의 정량용 시약은 상기 기질들을 정량하기 위한 상기-기재된 방법에 사용되는 것과 같은 기질을 함유한다.
D-글루코스를 제거하기 위한 시약은 D-글루코스를 효소를 사용하여 다른 기질로 전환시키는 상기-기재된 방법에서 사용되는 것과 같은 기질을 함유한다.
예를 들어, 상기 방법 1) 에 따른 D-글루코스의 제거용 시약은 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, EMSE, 및 필요에 따라, 상기-언급된 완충액, 기타 효소, 그에 대한 기질, 및 조효소를 함유할 수 있다. 상기 방법 4) 에 따른 D-글루코스의 제거용 시약은 글루코키나제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 트리포스페이트, NADP, 및 필요에 따라, 상기-언급된 완충액, 기타 효소, 그에 대한 기질, 및 조효소를 함유할 수 있다. D-글루코스의 제거용 시약은 상기-기재된 1,5-안히드로글루시톨의 정량용 시약과 혼합되어 시약 키트를 제조할 수 있다.
글루코스 옥시다제, 글루코스 데히드로기나제, 피라노스 옥시다제, 글루코키나제, 헥소키나제, β-포스포글루코뮤타제, 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제, 크샨틴 옥시다제, 퍼옥시다제 및 아데노신 트리포스파타제와 같이 사용되는 효소는 상품으로서 수득될 수 있고, 또는 상기 효소를 생성할 수 있는 미생물을 배양하므로써 제조될 수 있다. 완충액, 기질, 조효소, 효소에 대한 기질, 착색제, 형광제 및 발광제로서, 시판되는 것이 사용될 수 있다.
하기 시험예는로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 14898 로 부터 유래된 트레할라제를 사용하므로써, 1,5-안히드로글루시톨에 의한 효소 활성의 억제의 예를 나타낸다.
시험예 1 (1,5-안히드로글루시톨에 의한 억제 특이성)
반응 혼합물은 참고예 3 에서 제조된 트레할라제 10 mU/ml, 0.81 mg/ml 의 4-아미노안티피린, 1 mg/ml 의 EMSE, 30 U/ml 의 글루코스 옥시다제, 10 U/ml 의 퍼옥시다제, 및 1 mM 의 표 4 에 나타낸 시험 당을 100 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 첨가하므로써 제조된다. 10 mg/ml 의 트레할라제를 반응 혼합물에 첨가하여 교반한 후, 550 nm 에서의 흡광도 변화를 분광 광도계로 측정한다.
반응 개시후 10 분동안 흡광도의 증가를 측정하고, 시험 당의 부재하에 흡광도의 증가 (A) 및 1 mM 의 시험 당의 존재하에서의 흡광도의 증가 (B) 로 부터 하기 방정식 : [(A-B)/A × 100] 에 따라 억제율 (%) 을 계산한다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
시험 당 (1 mM) 억제율 (%)
1,5-안히드로글루시톨 45.0
D-글루코사민 0
N-아세틸-D-글루코사민 0
D-만노스 0.5
D-갈락토스 0.2
D-푸룩토스 0
D-푸코스 0
L-푸코스 0
D-크실로스 0
말토스 0
수크로스 0
로도코쿠스 글로베룰러스 ATCC 14898 로 부터 유래된 트레할라제의 활성은 1,5-안히드로글루시톨에 의해서 특이적으로 억제된다.
본 발명의 구현예를 하기 실시예에서 설명한다.
발명을 실현하기 위한 최량의 양태
실시예 1
카텔라토스포라 페루기니아FERM BP-4329 로 부터 유래된 트레할로스 포스포릴라제를 사용하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량법
반응 혼합물은 참고예 1 에서 제조된카텔라토스포라 페루기니아로 부터 유래된 트레할로스 포스포릴라제 10 mU/ml, 2.5 U/ml 의 β-포스포글루코뮤타제 (Beckman Instruments, Inc.), 5 U/ml 의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (Sigma Chemical Co.), 10 mM NADP, 및 다양한 농도인 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료를 100 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 첨가하므로써 제조된다. 10 mg/ml 의 트레할로스를 반응 혼합물에 첨가하여 교반시킨 후, 340 nm 에서의 흡광도 증가를 분광 광도계로 측정한다.
반응 개시후 10 분 동안 흡광도의 증가를 측정하고, 억제율 (%) 은 1,5-안히드로글리시톨의 부재하에 흡광도의 증가 (A) 및 각 농도인 1,5-안히드로글리시톨의 존재하에서의 흡광도의 증가 (B) 로 부터 하기 방정식 : [(A-B)/A × 100] 에 따라 계산된다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, 억제율과 1,5-안히드로글루시톨 농도 사이는 양호한 직선 관계이고, 그에 의해 1,5-안히드로글루시톨에 대한 검정 곡선을 수득한다.
실시예 2
카텔라토스포라 페루기니아FERM BP-4329 로 부터 유래된 트레할로스 포스포릴라제를 사용하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량법
반응 혼합물 (3 ml) 은 참고예 1 에서 제조된 트레할로스 포스포릴라제 10 mU/ml, 50 mM 의 글루코스, 2 ml 의 무기 인의 정량 키트 (Kyowa Medex Co., Ltdl), 및 각종 농도의 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료를 50 mM 이미다졸 완충액 (pH 7.0) 에 첨가하므로써 제조된다. 50 mM β-글루코스-1-포스페이트를 반응 혼합물에 첨가하여 교반시킨 후, 550 nm 에서의 흡광도 증가를 분광 광도계로 측정한다.
흡광도의 증가를 반응 개시후 10 분 동안 측정하고, 억제율 (%) 을 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 계산한다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, 억제율과 1,5-안히드로글루시톨의 농도 사이는 양호한 직선 관계이고, 그에 의해 1,5-안히드로글루시톨에 대한 검정 곡선을 수득한다.
실시예 3
스트렙토마이세스 아우레오파시엔스ATCC 10762 로 부터 유래된 트레할라제를 사용하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량법
반응 혼합물은 참고예 2 에서 제조된 트레할라제 10 mU/ml, 0.81 U/ml 의 4-아미노안티피린, 1 mg/ml EMSE, 30 U/ml 의 글루코스 옥시다제, 10 U/ml 의 퍼옥시다제, 및 각종 농도의 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료를 100 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 첨가하므로써 제조된다. 10 mg/ml 의 트레할라제를 반응 혼합물에 첨가하여 교반한 후, 550 nm 에서의 흡광도 증가를 분광 광도계로 측정한다.
흡광도의 증가를 반응 개시후 10 분 동안 측정하고, 억제율 (%) 을 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 계산한다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, 억제율과 1,5-안히드로글루시톨의 농도 사이는 양호한 직선 관계이고, 그에 의해 1,5-안히드로글루시톨에 대한 검정 곡선을 수득한다.
실시예 4
로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 14898 로 부터 유래된 트레할라제를 사용하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량법
참고예 3 에서 제조된로도코쿠스 글로베룰러스로 부터 유래된 트레할라제를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 3 에서와 동일한 방법을 반복한다. 도 8 에 나타낸 바와 같이, 억제율과 1,5-안히드로글루시톨의 농도 사이는 양호한 직선 관계이고, 그에 의해 1,5-안히드로글루시톨에 대한 검정 곡선을 수득한다.
실시예 5
노카르디아sp. NK-2067 을 사용하는 트레할라제의 생성법
노카르디아sp. NK-2067 를 1-l 에를렌메이어 플라스크에서의 1 g/dl 의 수크로스, 0.5 g/dl 의 NZ-아민, 0.2 g/dl 의 펩톤, 0.1 g/dl 의 효모 추출물 및 0.1 g/dl 의 고기 추출물을 함유하는 125 ml 의 배지 (pH 7.2) 에 접종하고, 30 ℃ 에서 48 시간 동안 진탕 배양시킨다. 생성된 배양액 (125 ml) 을 5-l 단지 발효기중 2375 ml 의 상기와 동일한 조성을 갖는 배지에 접종하고, 30 ℃ 에서 2 일간 통기 및 교반시킨면서 배양한다.
생성된 배양액 (2.5 l) 를 원심분리 (12,000 ×g, 20 분) 하여 세포를 수합한다. 세포를 500 ml 의 10 % 글리세롤을 함유하는 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) (이후, GP 완충액으로 언급) 에 현탁시켜 다이노밀 (Dynomill; W.A. Bachofen) 을 사용하여 파쇄하고, 이어서 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 한다. 수득된 상층액에 황산암모늄을 첨가하고, 황산암모늄의 70 % 포화도에 의해 침전된 분획을 수합하여 소량 (약 100 ml) 의 GP 완충액에 용해시킨다. 생성된 용액을 5 l 의 GP 완충액에 대해 24 시간 동안 투석시킨다. 투석된 용액을 GP 완충액으로 예비-평형화된 DEAE-셀룰로파인 (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) 의 컬럼 (1 L, 직경: 5 cm) 을 통과시키고, 그에 의해 트레할라제가 컬럼상에 흡착된다. 컬럼을 동일한 완충액으로 세척하여 오염된 단백질을 제거한 후, 0 ∼ 1 M 염화나트륨을 함유하는 GP 완충액을 사용하는 염화나트륨 농도 구배로 용출을 수행한다. 약 0.4 ∼ 0.6 M 의 염화나트륨으로 용출된 활성 분획을 합하여, 거기에 황산암모늄을 첨가한다. 황산암모늄의 70 % 포화도에 의해 침전된 분획을 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 에 의해 수합하여, 50 ml 의 GP 완충액중에 용해시킨다. 생성된 용액을 2 l 의 GP 완충액에 대해 24 시간 동안 투석하여 정제된 트레할라제 제제를 수득한다.
효소 제제의 고유 활성은 21 mU/mg 이다.
실시예 6
노카르디아sp. NK-2067 로 부터 유래된 트레할라제를 사용하는 1,5-안히드로글루시톨의 정량법
실시예 5 에서 제조된노카르디아sp. 로 부터 유래된 트레할라제를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 3 과 동일한 방법을 반복한다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 억제율과 1,5-안히드로글루시톨 농도 사이는 양호한 직선 관계이고, 이에 의해 1,5-안히드로글루시톨의 검정 곡선이 수득된다.
실시예 7
하기 시약 1, 2 및 3 으로 구성된 1,5-안히드로글루시톨을 정량하기 위한 시약 키트를 제조한다 :
시약 1 :
글루코스 옥시다제 30 U/ml
(아스퍼질러스 니제르로 부터 유래, Toyobo Co., Ltd.)
퍼옥시다제 (호스래디쉬로 부터 유래, Toyobo Co., Ltd.) 10 U/ml
EMSE 1 mg/ml
인산 완충액 (pH 5.5) 100 mM
시약 2 :
트레할라제 (실시예 5 에서 제조) 1 U/ml
4-아미노안티피린 0.8 mg/ml
인산 완충액 (pH 5.5) 100 mM
시약 3 :
트레할로스 2 mM
실시예 8
0 ∼ 500 μg/ml 범위의 농도인 1,5-안히드로글루시톨 및 1 mg/ml 의 농도인 D-글루코스를 함유하는 시료를 제조한다. 10 μl 의 각 시료에 300 μl 의 실시예 7 에서 제조된 시약 1 을 첨가하고, 혼합물을 30 ℃ 에서 10 분간 항온배양시켜 D-글루코스를 D-글루코노-δ-락톤으로 전환시키고, 동시에 형성된 과산화수소를 제거한다. 이어서, 100 μl 의 실시예 7 에서 제조된 시약 2 를 첨가한 다음, 10 μl 의 실시예 7 에서 제조된 시약 3 을 첨가한다. 흡광도의 증가를 자동분석기 (Hitachi 7070) 으로 측정한다.
각 농도의 1,5-안히드로글루시톨의 존재하에서의 흡광도를 1,5-안히드로글루시톨의 분재하에서의 흡광도로 부터 뺀다. 도 10 에 나타낸 바와 같이, 수득된 절대치 (흡광도 차이) 와 1,5-안히드로글루시톨 농도 사이에 양호한 직선 관계가 있다. 그러므로, 글루코스를 함유하는 시료중 1,5-안히드로글루시톨 농도를 정량할 수 있다는 것이 증명되었다.
실시예 9
하기 시약 4, 5, 6 및 7 로 구성된 1,5-안히드로글루시톨을 정량하기 위한 시약 키트를 제조한다.
시약 4 :
글루코키나제 5 U/ml
(B.스테아로써모필러스로 부터 유래, Sigma Chemical Co.)
아데노신 트리포스페이트 10 mM
MgCl220 mM
글루코스-6-포스페이트 데히드로기나제 10 U/ml
(빵 효모로 부터 유래, Sigma Chemical Co.)
NADP 10 mM
인산 완충액 (pH 7.0) 100 mM
시약 5 :
아데노신 트리포스파타제 3 U/ml
(돼지 뇌로 부터 유래, Sigma Chemical Co.)
시약 6 :
트레할라제 1 U/ml
글루코스 옥시다제 30 U/ml
퍼옥시다제 10 U/ml
4-아미노안티피린 0.8 mg/ml
EMSE 1 mg/ml
인산 완충액 (pH 7.0) 100 mM
시약 7 :
트레할로스 2 mM
실시예 10
500 μg/ml 의 농도인 1,5-안히드로글루시톨 및 1 ∼ 10 mg/ml 범위인 농도의 D-글루코스를 함유하는 시료를 제조한다. 각 시료 10 μl 에 300 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 4 를 첨가하고, 혼합물을 30 ℃ 에서 10 분간 항온배양시킨다. 이어서, 실시예 9 에서 제조된 시약 5 10 μl 를 첨가하고, 혼합물을 5 분간 배양시켜 아데노신 트리포스페이트를 분해시키고, 그에 의해 글루코키나제 반응을 중단시킨다. 글루코스는 상기 단계를 통한 글루코스-6-포스페이트를 통해 D-글루코노-δ-락톤-6-포스페이트로 전환된다.
반응 혼합물에 100 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 6 을 첨가하고, 이어서 10 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 7 을 첨가한다. 반응을 30 ℃ 에서 10 분간 수행하고, 흡광도의 증가를 자동분석기 (Hitachi 7070) 으로 측정한다.
흡광도 차이는 실시예 8 에서와 동일한 방법으로 계산되고, 수득된 값과 시료중의 글루코스 농도 사이의 관계가 연구되었다. 표 5 에 나타낸 바와 같이, 흡광도 차이는 시료중의 글루코스 농도에 관계없이 일정하다. 그러므로, 1,5-안히드로글루시톨 농도는 글루코스의 존재하에서 정량될 수 있다는 것이 증명되었다.
첨가된 글루코스의 농도 (mg/ml) 흡광도 차이 (mAbs)
0 55
1.0 55
2.5 56
5.0 55
7.5 54
10.0 56
실시예 11
정상 인간 혈청, 및 0 ∼ 500 μg/ml 범위의 농도인 1,5-안히드로글루시톨을 상기 정상 혈청에 첨가하므로써 제조된 1,5-안히드로글루시톨-첨가 혈청이 시료로서 사용된다. 각 시료 20 μl 에 300 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 4 를 첨가하고, 혼합물을 30 ℃ 에서 10 분간 항온배양시킨다. 이어서, 10 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 5 를 첨가한 다음, 5 분간 배양시킨다. 생성된 혼합물에 100 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 6 을 첨가한 다음, 10 μl 의 실시예 9 에서 제조된 시약 7 을 첨가한다. 반응을 30 ℃ 에서 10 분간 수행하고, 흡광도 증가를 자동분석 (Hitachi 7070) 으로 측정한다. 이와는 별개로, 상기와 동일한 공정을 0 ∼ 500 μg/ml 의 1,5-안히드로글루시톨을 함유하는 시료상에서 수행하므로써 검정 곡선을 제작한다. 혈청 시료중 1,5-안히드로글루시톨 농도를 검정 곡선을 기초로 하여 계산한다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
첨가된 1,5-안히드로글루시톨(μg/ml) 측정치(μg/ml) 회수율(%)
0 25 -
100 124 96
200 224 96
300 325 100
400 426 104
500 526 104
정량된 정상 인간 혈청중 1,5-안히드로글루시톨 농도는 문헌상의 수치와 근접하다. 1,5-안히드로글루시톨-첨가 혈청에 대해 측정된 수치는 이론치와 근접한 회수율을 나타낸다. 혈청중 1,5-안히드로글루시톨 농도가 본 발명에 따른 방법에 의해서 정량될 수 있다는 것이 증명되었다.
참고예 1
카텔라토스포라 페루기니아FERM BP-4329 를 이용한 트레할로스 포르포릴라제의 생성
카텔라토스포라 페루기니아를 2-l 에를렌메이어 플라스크중 3 g/dl 의 수크로스, 0.5 g/dl 의 NZ-아민, 0.2 g/dl 의 펩톤, 0.1 g/dl 의 효모 추출물 및 0.1 g/dl 의 고기 추출물을 함유하는 300 ml 의 배지 (pH 7.0) 중에 접종하고, 30 ℃ 에서 48 시간 동안 진탕 배양시킨다. 생성된 배양액 (600 ml) 을 30-l 단지 발효기중 상기와 동일한 조성을 갖는 배지 15 l 중에 접종하고, 30 ℃ 에서 3 일간 통기 및 진탕하면서 배양시킨다.
생성된 배양액 (15 l) 를 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 하여 세포를 수합한다. 세포를 1000 ml 의 200 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에 현탁시키고, 다이모밀 (W.A. Bachofen) 을 이용하여 파쇄한 다음, 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 한다. 수득된 상층액에 50 % 포화도의 황산암모늄을 첨가하고, 형성된 침전물을 수합하여 소량 (약 200 ml) 의 200 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에 용해시킨다. 생성된 용액을 5 l 의 동일한 완충액에 대해서 24 시간 동안 투석시킨다. 투석된 용액을 65 ℃ 에서 15 분간 가열한 다음, 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 한다. 수득된 상층액을 동일한 완충액으로 예비 평형화시킨 겔 여과 배지 (Toyopearl HW65F, Tosoh Corporation) 의 컬럼 (1 L, 직경: 5 cm) 을 통과시킨다. 용출된 활성 분획을 합하여, 거기에 50 % 포화도로 황산암모늄을 첨가한다. 형성된 침전물을 원심분리 (12,000 r.p.m., 20 분) 하여 수합하고 20 ml 의 200 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에 용해시킨다. 생성된 용액을 2 l 의 동일한 완충액에 대해 24 시간 동안 투석시켜 트레할로스 포스포릴라제 제제를 수득한다.
효소 제제의 고유 활성은 100 mU/mg 이다.
참고예 2
스트렙토마이세스 아우레오파시엔스ATCC 10762 를 이용한 트레할라제의 생성
스트렙토마이세스 아우레오파시엔스ATCC 10762 를 1-l 에를렌메이어 플라스크중 1 g/dl 의 수크로스, 0.5 g/dl 의 NZ-아민, 0.2 g/dl 의 펩톤, 0.1 g/dl 의 효모 추출물 및 0.1 g/dl 의 고기 추출물을 함유하는 125 ml 의 배지 (pH 7.2) 중에 접종하고, 30 ℃ 에서 48 시간 동안 진탕 배양시킨다. 생성된 배양액 (125 ml) 을 5-l 단지 발효기중 상기와 동일한 조성을 갖는 배지 2375 ml 중에 접종하고, 30 ℃ 에서 2 일간 통기 및 진탕하면서 배양시킨다.
생성된 배양액 (2.5 l) 를 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 하여 세포를 수합한다. 세포를 10 % 글리세롤을 함유하는 500 ml 의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) (이후, GP 완충액으로 언급) 중에 현탁시키고, 다이모밀 (W.A. Bachofen) 을 이용하여 파쇄한 다음, 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 한다. 수득된 상층액에 황산암모늄을 첨가하고, 황산암모늄의 70 % 포화도에 의해 침전된 분획을 수합하여 소량 (약 100 ml) 의 GP 완충액중에 용해시킨다. 생성된 용액을 5 l 의 GP 완충액에 대해서 24 시간 동안 투석시킨다. 투석된 용액을 GP 완충액으로 예비 평형화시킨 DEAE-셀룰로핀 (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) 의 컬럼 (1 L, 직경: 5 cm) 을 통과시키므로써, 트레할라제가 컬럼상에 흡착된다. 컬럼을 동일한 완충액으로 세척하여 오염된 단백질을 제거한 후, 0 - 1 M 염화나트륨을 함유하는 GP 완충액을 사용하여 염화나트륨 농도 구배로 용출을 수행한다. 약 0.4 ∼ 0.6 M 의 염화나트륨으로 용출된 활성 분획을 합하여, 거기에 황산암모늄을 첨가한다. 황산암모늄의 70 % 포화도로 침전된 분획을 원심분리 (12,000 × g, 20 분) 하여 수합하고 50 ml 의 GP 완충액중에 용해시킨다. 생성된 용액을 2 l 의 GP 완충액에 대해 24 시간 동안 투석시켜 정제된 트레할로스 포스포릴라제 제제를 수득한다.
효소 제제의 고유 활성은 21 mU/mg 이다.
참고예 3
로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 14898 을 이용한 트레할라제의 생성
로도코쿠스 글로베룰러스ATCC 14898 를 사용하는 것을 제외하고, 참고예 2 에서와 동일한 공정을 반복하여, 정제된 트레할라제 제제를 수득한다.
효소 제제의 고유 활성은 15 mU/mg 이다.
본 발명은 1,5-안히드로글리시톨의 효소 정량법, 방법중 사용되는 시약, 1,5-안히드로글리시톨의 효소 정량법에서의 사용에 적합한 신규한 트레할라제, 및 신규한 트레할라제의 제조 방법을 제공한다. 1,5-안히드로글루시톨 농도의 정량법은 당뇨병의 진단에 유용하다. 본 발명에 따라서, 1,5-안히드로글루시톨은 정확하고 신속하게 정량될 수 있다.

Claims (12)

  1. 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소와 시료를 공존시켜, 상기 효소의 활성을 측정하는 것으로 이루어지는, 시료중 1,5-안히드로글루시톨의 정량법.
  2. 제 1 항에 있어서, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소가 트레할라제인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소가 트레할로스 포스포릴라제인 방법.
  4. 1,5-안히드로글루시톨에 대해 0.33 mM 이하의 Ki 값을 가지며 하기의 물리화학적 성질을 갖는 트레할라제 :
    (1) 작용 : 식 (I) 로 나타낸 바와 같이 물의 존재하에서 1 분자의 트레할로스를 가수분해하여 2 분자의 D-글루코스를 형성시키는 반응을 촉매한다 :
    트레할로스 + H2O → 2 D-글루코스 (I)
    (2) 기질 특이성 : 트레할로스에 특이적으로 작용한다,
    (3) 기질 친화성 : 트레할로스의 Km 값이 6.7 mM 이다,
    (4) 적정 pH 및 안정한 pH : 효소의 적정 pH 가 5 - 6 이고, 효소는 50 ℃ 에서 30 분간 처리되는 경우, 5 - 10 의 pH 범위에서 안정하다,
    (5) 적정 온도 및 열안정성 : 적정 온도는 약 45 ℃ 이고, 효소는 pH 5.0 에서 30 분간 처리되는 경우 50 ℃ 이하에서 안정하다,
    (6) 억제제 : 1,10-페난트롤린, 에틸렌디아민테트라아세트산, 및 2,2'-비피리딜과 같은 금속 킬레이트제, p-머큐리벤조산 및 요오드아세트아미드과 같은 SH 차단제, 히드록시아민, 황산니켈 등에 의해서 억제된다,
    (7) 분자량 : 도데실 소듐 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해서 측정된 효소의 서브유니트의 분자량은 약 90,000 이고, 겔 여과법에 의해 측정된 효소의 분자량은 약 400,000 이다.
  5. 노카르디아속에 속하고 상기 트레할라제의 생성능을 갖는 미생물을 배지중에 배양시켜, 배양액으로 부터 상기 트레할라제를 회수하는 것으로 이루어지는 제 4 항의 트레할라제의 생성 방법.
  6. 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소, 상기 효소에 대한 기질, 및 효소 활성에 의해 형성된 기질의 정량을 위한 시약을 함유하는, 1,5-안히드로글루시톨의 정량용 시약.
  7. 제 1 항에 있어서, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소가 제 4 항에 따른 효소인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소가 트레할라제인 시약.
  9. 제 6 항에 있어서, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소가 트레할로스 포소포릴라제인 시약.
  10. 제 6 항에 있어서, 활성이 농도-의존적 방법으로 1,5-안히드로글루시톨에 의해 억제되는 효소가 제 4 항에 따른 효소인 시약.
  11. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서, 시료를 효소와 공존시키기 전에 시료중 D-글루코스의 제거를 더 포함하는 방법.
  12. 제 8 항 또는 제 10 항에 있어서, D- 글루코스의 제거용 시약을 더 함유하는 시약.
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