SE441931B - Forfarande och medel for bestemning av pyrodruvsyra eller pyruvat - Google Patents

Description

8405647-2 mansättning av medel för pyruvatanalysering och ett analytiskt för- farande för pyrodruvsyra. _ Vidare har det visat sig att tillsats av salt av sådant slag, som frigör kalciumjoner, koboltjoner, magnesiumjoner eller manganjoner, till nämnda reaktionssystem, medför förbättring av analysen. Tillsats av någon färgalstrande eller fluorescerande indikator till reaktionssystemet medför en lämplig och ypperlig analyssammansättning resp. analysering.

Uppfinningen avser härutöver ett.medel för genomförande av det nya förfarandet. I ' «Uppfinningen förklaras närmare i samband med bifogade ritningar som visar följande. Pig. 1 ett optimalt pH-värde av pyruvatoxidas. Pig. 2 värmestabilitet av pyruvatoxidas. Pig. 3 pH-stabilitet av pyruvatoxidas. Pig. 4 resultatet av en analys av pyrodruvsyra medelst en syreelektrod och användning av pyruvat- oxidas. Pig, 5 resultatet av en analys av serum medelst en syre- elektrod och användning av pyruvatoxidas. Pig. 6 resultatet av en analys av pyrodruvsyra medelst kolometriskt sätt att använda pyruvatoxidas. Pig. 7 resultatet av en kvantitativ analys av serum-pyrodruvsyra och användning av pyruvatoxidas. Pig. 8 resultatet av en analys av ADP och användning av pyruvatoxidas.

Pig. 9 resultatet av en analys av glycerol, triglycerid och serum- triglycerid med användning av pyruvatoxidas. Pig. 10 resultatet av en analys av GPT- och GOT-aktivitet med användning av pyruvatoxidas.

Pig. ll ett korrelatdiagram av en analys av GPT-aktivitet med an- vändning av pyruvatoxidas. Pig. 12 ett korrelatdiagram av en analys av GOT-aktivitet med användning av pyruvatoxidas. 8405647r2 Pyruvatoxidas enligt uppfinningen inverkar katalyserande på en oxiderande reaktion med pyrodruvsyra, oorganiskt fosfat och syre för att bilda acetylfosfat,koldioxid och väteperoxid, och framställs företrädesvis genom att odla pyruvatoxidas alstrande mikrobiella arter tillhörande släkten Pediococcus, Streptococcus eller Aerococcus, exempelvis arterna Pediococcus sp B-0867, Streptococcus sp B-0668, Aerococcus viridans IFO 12219 eller IFO 12317.

Ovannämnda arter B-0667 och B-0668 har följande taxonomiska egen- skaper.

A. Iakttagelser vid olika medier, odlade vid 30°C under 2 dygn: Stam B-0867 Stam B-0668 Tryptosojabuljong tryptosoja- agarskiva tryptosoja- agarplatta gelatínskiva gelatinskiva) ßcP-mj 61k (ln dvznl svag växt, homogent grum- lig, senare ullig utfäll- ning svag växt, blekt gul-grå, ingen glans, ingen upp- komst av lösbart pigment kolonibildning; liten och slät växt utefter hackad linje ingen gelatinsmältning växt utefter hackad linje ingen gelatinsmältning ingen ändring svag växt, homogent grum- lig, senare ullig utfäll- ning svag växt, blekt gul-grå ingen glans, ingen upp- komst av lösbart pigment kolonibildning, liten ock slät växt utefter hackad linje växt utefter hackad linje ingen gelatinsmältning ingen ändring B. Mikroskopiska iakttagekærz Stam B-0667 Stam B-0668 Form storlek rërlizhet szorer Éramfirgniog syxifzsf ffrg fn: sfärisk, äggliknande, parvis, tetraliknande el- ler korta kedjor 0,5 - l,Û x 1,5 - 1,0 p - sfärisk, äggliknande, parvis, tetraliknande el- ler korta kedjor 0,8 - 1,0 X 1,? -1,2 u 9 8405647:2 C. Fysiologiska egenskaper: Stam B~Û667 - Stam B-0658 Växttemperaturen; us°c - - a7°c ao°c 2s°c 1o°c s°c halogentole- eller (+) eller (+) I+ + + + + rans: NaCi 10% 6,5% 5,0% 1,0% 0% OF-test fermentativ fermentativ + +++++ + beteende i syre fakultativt anaerobiskt fakultativt anaerobiskt _ nitratreduktion - indonformation - - vätesulfatbildning - - gelatinhydrolys - stärkelsehydrolys -» födoämneshydrolys + + acetoinbildning - MR-test ' - - katalas - oxidas - ureaus (SSR) - ureas (Christensen) - utnyttjande citron- syra (Christensen) - - syrabildning av §ocker: U ïadonitol - Ü i 1 L(+)-arabinos cellobios dulcitol meso-erytrítol fruktos fukøs galaktos glokos glycerol inositol insulin laktos maltos mannitol mannos melisitos melibios raffinos L(+)-ramnos salícin L-sorbos sorbitol stärkelse sackaros trehalos xylos tolerans vid 60°C under 30 min 8405647-2 .8405647r2 Såsom framgår av "Bergey's Manual of Determinative Bac- teriology, 8th Edition, l974" och "S T Cowan and K J Steel, Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge Press, l97H", är stammarna B-0667 och B-0668 - som har ovannämnda taxonomiska egenskaper, särskilt Gram-positiva kocker, med avseende på katalas och oxidas negativ, fermentativt syrabildníng av glukos och ingen gasbildning av socker (glukos) - Omnämnda i denna litteratur som tillhörande släkten Pediococcus och Streptococcus.

En jämförelse av dessa släkt med ídentifíkationshandboken 'enligt ovanstående visar följande.

I tabellen betyder + = mer än 85% positiv, och - = mer än 85% negativ samt d = varierar bland släkt och arter.

Art art _ släkt Pedio- släkt Strsp- B-0667 B-0668 _ kockar tokocker tillväxt vid 4500 “ - - + d tolerans vid ' ä 60°C under 30 min - + _ d glycerol (sy- § rabildning) _ - _ _ d arabinos (syrabiia- fliflš) -- - + d salttolerans 7 (Nasa 110%) + _ _ 4. _ I det nedanstående kommer arten B-0667 sålunda att refereras till som släktet Pediococcus eller Streptococcus. Såsom framgår av ovannämnda "Manual for the Identification of Medical Bacteria" och "J Gen Microbiol, 26, 185 - 197, 1961" är de taxo- nomiska egenskaperna av arten B-0667 nästan identiska med dem av Pediococcus urina-equí, men de i "Bergey's Manual of Detaminatíve Bacteríology, âth Ed, l97H" beskrivna egenskaperna är något :lika , s4oss47f2 med dem. Pâ grund härav kommer arten B-0667 att refereras till som släktet Pediococcer och att betecknas som Pedíococcus sp B-0667.

Släktet B-0668 liknar släktet Streptococcer mer än släktet Pedíococcus. Vidare framgår av "Manual for the Identification of Medical Bacteria" att arten B-0668 liknar Streptococcus faecium var durans, men inga taxonomiska egenskaper har beskrivits i "Bergey's Manual", så att detaljerad jämförelse är omöjlig. Arten B-0668 refereras emellertid till som Streptococcus sp B-0668.

Arterna B-0667 och B-0668 har deponerats för permanent samling i "Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, M I T I, Japan" under deposi- tions-nr FERM-P No 4H38 och FERM-P No 4439.

Vid en utföringsform av uppfinningen odlas ovannämnda Pedíococcus sp B-0567, Streptococcus sp B-0668, de i och för sig kända Aerococcus viridans IFO-12210 eller Aerococcus viridans IFO~l23l7 i ett brukligt medium för enzymframställning. Odlingen kan genomföras medelst vanlig vätskeodling, varvid undervatten- luftning är lämplig vid industriell framställning.

Ett brukligt medium för mikroorganismer kan lämpligen användas. Såsom kolkällor kan tjäna assimilerbara kolkällor såsom glukos, sackaros, laktos, maltos, fruktos,_ melass, pyrodruvsyra eller liknande. Assimilerbara kvävekällor såsom pepton, kött- etrakt, jästextrakt, kaseinhydrolysat eller liknande kan komma till användning. Olika oorganiska salter såsom fosfat, karbonat, sulfat, salter av magnesium, kalcium, natrium, järn, mangan eller zink kan nyttjas.

Odlingstemperaturen kan väljas inom omrâdet för uppväxt av mikrobceller och framställning av pyruvatoxidas och är lämpligen 25-3700. Odlingstiden kan varieras beroende på villkoren och av- slutas när framställningen av pyruvatoxidas i det väsentliga är slutförd och ligger vanligen mellan 18 och H8 h.

Pyruvatoxidas förekommer i celler hos mikroorganismer.

För att skilja pyruvatoxidas från de odlade cellerna, filtreras den odlade massan eller centrifugeras för att samla cellerna, och sprängs genom mekanisk behandling eller enzymatiskt som exempelvis med lysozym. Om nödvändigt, behandlas pyruvatoxidas genom att tillsätta etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och ytbe- handlingsmedel såsom TRITGN K-lGG°'eller ASEC TSL 30-LQT” för att s4oss47-2 avskilja enzymet. Den sålunda erhållna lösningen av pyruvatoxidas kan koncentreras om så behövs, varefter enzymet utfälls genom utsaltning medelst tillsats av lösbart salt såsom ammoniumsulfat eller natriumklorid. Föroreningar med låg molekylarvikt avlägsnas genom dialys. Ytterligare föroreningar undanröjs från pyruvat- oxidaslösningen lämpligen genom kromatografisk absorption, jon- bytarkromatorgrafi eller gelfiltrering. Den sålunda erhållna enzymlösningen behandlas med vakuumkoncentration och lyofilisering för att framställa pyruvatoxidaspulver. Ytterligare rening kan åstadkommas genom brukliga reningsförfaranden för protein och enzym såsom absorptionskromatografi, jonbytarkromatografí eller gelfiltrering.

Enligt uppfinningen framställd pyruvatoxidas har följande fysio kemiska egenskaper, varvid förkortningar används enligt följande.

Pediococcus sp B-0567 - B-0667 Streptococcus sp B-0668 - B-0868 Aerococcus víridans IFO-12219 - IFO-12219 Aerococcus virídans IPO-12317 - IFO-12317 (l) Enzymverkan: Enzymet katalyserar oxidatív reaktion genom nyrodruv- syra, oorganiskt fosfat och syre för att bilda acetylfosfat, koldioxid och väteperoxid.

CH3C0COOH + HOPO3 + 02 -9 CH3COOPO3 + C02 + H202 (2) Optimalt pH-värde _ pH-värdets verkan på pyruvatoxidasets aktivitet uppmätts.

Fosfatbuffertlösníngar med pH 6-8 används för prövning. Resultaten visas i fig. l där det optimala pH-värdet är följande.

B-0667 pH 6,3 - 7,5 B-0668 pH 7,5 - 8,5 IFO-12219 pH 7,0 - 8,0 IFO-12317 pH 6,8 - 7,5 En ringa ändring iakttas genom fosfatkoncentration och något slags metalljoner. 9 8405647-2 (3) Värmestabilitet: Lnzymeta värmestabilitet bestäms genom inkubering i 10 mM fos- fatbuffert (pH 6,5), innehållande 10 pH FAD vid O, H0, 50, 60 och 70c under 10 min enligt sättet av enzymprövningen. Såsom visas i fig.2 aktiveras enzymet, erhållet av B-0667, IFO-12219 oeh IFO-12317, nå- got vid UOOC och denatureras vid en temperatur högre än 6000. Det a1 B-0668 erhållna enzymet aktiveras icke vid ROOC och denatureras nära; vid över 6000. (Ä) štabilitet av pH-värdet: Till var3ç enzymlösning (0,1 m1) sätts 0,2 M fosfacbuffert rör pa 6 - 8 (Q,9 m1) eller 0,2 M :ris-Hcl-buffert för pa 7 - 9 (0,9 mi), varvid varje lösning innehåller 10 pM FAD; lösningarna får stå kvar under 10 min vid HOOC. 20 pl av enzymlösningarna uttas, och enzymak- tiviteten bestäms. Såsom visas i fig. 3 är enzymet från B-0667, IFO- 12219 och IFO-12317 huvudsakligen stabilt vid ungefär pH 7 och det a1 B~O668 är stabilt vid ett värde för sur reaktion. (5) Verkan av olika substanser: I 1) Inverkan av olika substanser på enzymaktiviteten prövas ge- nom att istället för MgCl2 tillsätts 5 mM av nedanstående substans till prövningssystemet.

Tillsatt relativ aktivitet ($) , ““b”t”“5 B-0667 B-0668 Iro-12219 I Iro-12317 Ingen tillsats 25,ü 72,0 ü2,0 50,3 EDTA o o o 0 ngclz -1oo 1oo 100 100 c c1 ~ 9 2 69,Å 75,0 83,u 78,7 MHCI2 129,1 102,7 116,2 111,0 coc12 81,3 81,1 85.0 8h,o Baclz 20,6 58,8 23,9 23,3 2nC12 16,0 38,2 1h.9 22,8 - EDIA och aktiverad genom Mg* , Ca , Hn** och Co* . 0s4ose47-2 10 Såsom frampàr av uvanstående är enzymet: inverkan upphävd genom + ++ 4 2) lnverkan av den följande ßubstansens eliminering från pröv- ningasystemet på enzymaktiviteten visas i det nedanstående. 0,1 M dimetylglutarat-NaOH-buffert används vid fosfat-eliminering.

Eliminerad relativ aktivitet ($) *“b$t°“s B-0667 B-0668 Iro-12219 :Fo-12317 Ingen eli- minering 100 ' 100 100 100 ' tiaminpyro- fosfat O 0 O O FAD 33,9 f 100 32,7 ü1,7 tíaminpyro- fosfat'och FAD 0 O 0 I O fosfat f ' 0 O O Det framgår av ovanstående att enzymet kräver tiaminpyrofosfat och FAD som kofaktor och fosfat som substrat.

Vidare har uppmätts syreförbrukning och enzymreaktion medelst en syreelektrod, varvid syre förbrukas alltefter enzymaktivíteten (bildande av väteperoxid). Resultaten visas i det följande Syreförbruk- reaktionsprodukt (p mol/min) ning (p mol/ min) H202 acetylfosfat B-0667 0,0h2 0,0h2 I 0,038 B-0668 0,022 0,0213' 0,020 :Fo-12219 o,oho . 0,038 0,037 :Fo-12317 _- o,c35 0,036 ' o,o3h Undersöknïnåarflfl Eehnmföra medelst följande hjälpmedel: 8405647-2 ll Syreförbrukning: Mätinstrument för upplöst syre (YSI-dissolved oxygen- Meter, Model 531) acetylfosfat: "F Lipmann et al, J Biol Chem, 134, 463-u64,l9u0. väteperoxid: metod som tillämpar N,N~dimetylanilin, 4-amino- antipyrin och hästrädis-peroxid Såsom förklaras i det ovanstående betecknas det'av ovannämnda fyra arter bakterier utvunna enzymet som pyruvatoxidas och flavin- protein.

Undersökningsmetoden för pyruvatoxidas enligt föreliggande uppfinning är följande. 0,5 M kaliumpyruvat 0,1 ml 0,5 M fosfatbuffert (pH 7,0) 0,2 ml 0,2 % 4-aminoantipyrin 0,1 ml 0,2 % N,N-dimetylanilin 0,2 ml 0,2 M Mgclz so pl 10 mM tiaminpyrofosfat 20 pl peroxidas (45 U/ml) 0,1 ml l mM PAD 10 pl destillerat vatten 0,22 ml Ovanstående reaktionsblandning förinkuberas vid 37°C under 3 min.

Till denna lösning sätts enzymlösningen (20 pl) och förinkuberas vid 37°Cunder 10 min. 0,1 M citratbuffert (ph 6,0, Zml), inne- hållande 0,1 M EDTA tillsätts för att avbryta reaktionen. Den bildade violetta färgen uppmäts genom kolorimetri vid 565 nm.

En enhet (1 U) av enzymaktivitet definieras som den aktivitet som alstrar l pmol väteperoxid/min.

För att aktivera pyruvatoxidas-reaktionssystemet, tillsätts FAD, tiaminpyrofosfat och fosfat. Vidare tillsätts för aktivering av enzymet lämpligen jonfrigörande salt som frigör kalciumjoner, kobOltjoner, magnesiumjoner eller manganjoner i form av klorid. En indikator som färgindikator eller flurescensindikator för väteperoxid kan väljas alltefter lämplighet.

Mängden och förhållandet av beståndsdelarna i enzymreaktíonen kan väljas för väsentlig enzymreaktion och kan varieras alltefter mängden pyruvat, temperaturen och tidslängden för enzymreaktionen.

Exempelvis mellan 1 och 20 U pyruvatoxidas,0,l - 20 n mol FAD, 0,05 - 0,5 p mol tiaminpyrofosfat, 1 - 10 p mol oorganisk fosfat och 0,05 - l0,u mol jonfrigörande salt per test kan användas med fördel.

Fyruvatoxidas kan mikrokapslas eller vara I form av orärlíga 8405647-2 12 Iikvärda länkar med organiska eller oorganiska bärare eller aïsorïe- rade av Lärare. Mo]-förhållandet av indikatorer för vätepergxij är åtminstone ekvimolar eller en överskottsmängd av alstrad väte- peroxid. I fall av peroxidas användas lämpligen 045 - 20 U per test.

Dessa beståndsdelar av den enzymatiska reaktionsblandningen används företrädesvis i lösning med passande justerat pH-värde av bufferten.

Det sålunda förberedda enzymatiska reaktionssystemet tillämpas för analys av pyrodruvsyra. Alla sådana prov som innehåller pyruvat, kan analyseras. Exempelvis pyrodruvsyra själv, pyrodruvsyra i serum eller urin och pyrodruvsyra som bildar enzymreaktionssystem såsom mjölksyra och laktatdehydrogenas (LDG), ADP ch pyruvatkinas, glycerol glycerolkinas och pyruvatkinas kan omnämnas. Ytterligare detaljerade exempel på enzymatiska reaktioner som bildar pyrodruvsyra och under- sökningsobjektär följande. 7 _ (1) Undersökning av mjölksyra- eller LGD-aktivitet: LDH 7 laktat -ñÃñ--7 pyruvat + NADH2 _ (2) Undersökning av ADP- eller pyruvatkinas (PK)-aktivitet: PK ADP + fosfoenolpyruvat -----> ATP + pyruvat (3) Undersökning av glutamat-pyruvat-transaminas(GTP)~aktivítet eller -ketoglutarat: alanin + vt-ketoglutarat gg:-1) pyruvat + glutamat (H) Undersökning av glutamat-oxaloacetat-transaminas(GOT)-aktivitet: GOT aspartat + GQ-ketoglutarat -----åoxaloacetat + glutamat Oxaloacetat oxaloacetatdekarbooxilas>pyruvat + C02 (5) Undersökning av glycerol eller glycerolfosfokinas(GK)-aktivitet: glycerol + ATP --Eg--àglycerol-3-fosfat + ADP ADP + fosfoenolpyruvat --Eg-få pyruvat + ATP (6) Undersökning av triglycerid: triglycerid lipas eller linonrote1nl1nas;glycerol_3_fosfat + ADP ADP + fosfoenolpyruvat --Eg--e> pyruvat + ATP (7) Undersökning av kreatinin eller kreatininfosfokinas (CPK): kreatin -Ešâëïšgàâ->-kreatin kreatin + ATP --Egg--9 kreatinfosfat + ADP ADP + fosfoenolpyruvat --få-~+> pyruvat + ATP (8) Undersökning av myokinas: ATP + AMF 2 ADP ADP + fosfoenolpyruvat --25-<> pyruvat + ATP (9) Undersökning av fettsyra eller tiokinas-aktivitet: fattyacid + CoA + ATP -ÉÉ9EiEÉâ:> aoyl-CoA + AMF + PPi AMP + ATP 2 ADP ADP + fosfoenolpyruvat --EE--¿> pyruvat + ATP la 84Û5647"2 Dessa enzymreaktioner är endast nämnda som exempel; de pyruvat- bildande reaktionerna kan genomföras med hjälp av olika kombinationer av enzymer och dessas substrat, exempelvis biologiska prov. Såsom exemplifierat i det ovanstående kan undersökningen tillämpas icke endast på undersökningar av pyruvat, utan även på undersökning av enzym, enzymaktivitet eller substrat.

Undersökningen genomförs genom inkubering av provet med reagens- blandningen. Denna är lämpligen en sammansättning av nödvändiga reagenser. Att mäta den förbrukade syremängden medhjälp av en mätare för upplöst syre lämpar sig för undersökningsmetoden. I detta fall är någon indikator för väteperoxid ej nödvändig. För att undersöka den framställda komponenten är det lämpligt att mäta väteperoxid- mängden, exempelvis medelst en väteperoxid-elektrodmätare såsom "IST"-oxidasmätare eller kolorimetriskt eller fluoremetriskt med en indikator för väteperoxid. Undersökningen kan lämpligen genomföras under 10-60 min vid 20-UOOC.

En indikator för väteperoxid är en kombination av en eller flera kromo- eller flurescensgeneratorer som åstadkoms genom koppling med väteperoxidkällan. Ett exempel på sådana indikatorer är en kombination av tetravärdes titanföreningar och xylenol-orange som kopplas med väteperoxid för att bilda stabil röd färg, eller en kombination av fenol eller N,N-dimetylanilin eller homovanilin- syra, 4-aminoantipyrin och peroxidas för mätning av färg eller fluorescens. 4-aminoantipyrin kan ersättas med 4-aminofenazon.

En kombination av 2,6-diklorofenol, indofenol och peroxidas och av guaiacol och peroxidas kan likaledes komma till användning. Indika- torn kan i förväg beredas som lösning. Kolori- eller fluoremetríska undersökningar kan genomföras genom att mäta absorptionen vid en våglängd såsom 565 nm.

Mängden av pyrodruvsyran kan mätas genom uträkning från 'motsvarande standardkurvor för förbrukad syre eller alstrad väte- peroxid.

Fosfat som förbrukad komponent eller acetylfosfat som alstrad komponent kan likaledes undersökas medelst någon lämplig metod.

Såsom förklaras i det ovanstående kan en sammansättning av reagenser användas för analysering, speciellt diagnostisk analy- sering, innefattande pyruvatoxidas och dettas tillämpning på olika undersökningsmetoder. Närmare bestämtoch såsom beskrivs i det ovanstående: diagnostisk analysering Såsom analys av pyruva: i s4oss47-2 1,, i detta innehållande reagens eller i serum eller urin, undersökning av enzymaktivitet av LDH, pyruvatkinas, GPT, GOT, glycerolkinas, lipas, lipoproteinlipas, kreatininfosfokinas, myokinas eller tiokinas, och analys av biologiska komponenter såsom laktat, ADP, glycerol, triglycerid, kreatinin eller fattysyra kan med fördel utföras medelst sammansättningen och metoden enligt uppfinningen.

Följande exempel förklarar utföringsformerna av uppfinningen.

Exempel l Ett medium (varje medium 100 ml, pH 7) innefattar glukos (lå), jästextrakt (0,5%) NaC1 (0,2%), KHZPOH (0,l%) KZHPOR (0,l%), MgS0u (0,05%) och CaC03 (0,3 %) och steriliseras i en Erlenmeyer- flaska vid l20°C under 20 min. I varje medium okuleras bakterier av släkten Pediococcus sp B-0667 FERM-P nr HMBB, Streptococcus sp B-0668 FERM-P nr 4H39, Aerococcus viridans IPO-12219 eller Aero- coccus viridans IFO-123 17 och odlas under skåning vid 30°C under ZH h vid 300 vpm. Därefter samlas de odlade cellerna genom centri- fugering och tvättas med 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5) och centri- fugeras på nytt för att samla bakteriecellerna. De sålunda erhållna cellerna suspenderas i den 10 mM omfattande bufferten (10 ml, pH 7,0), innehållande 0,02% lysozym och 0,l% TRITON X-100 och in- kuberas vid 37°C under 60 min. Den genom centrifugering erhållna produkten samlas. Den innehåller pyruvatoxidas. Den förefintliga enzymaktiviteten av produkten visas i den följande tabellen. släkt enzymaktiviteten B-0667 0,60 B-0668 0,38 IFO-12219 0,52 IFO-12317 0,u6 Exempel 2 Ett medium (20 l) bestående av samma komponenter som beskrivs i exempel 1 steríliseras medelst ånga i ett 30 1 fermenteringskärl.

Odlad buljong (200 ml) Pediococcus sp B-0667 FERM-P nr 4038, som odlades på samma sätt som i exempel l, tillsätts och det hela odlas nu vid 30°C under 24 h. Genom centrifugering samlade bakterie- celler (ungefär 100 g) suspenderas i lysoz mlösningen (0,2 mg/ ml, U 1), dessutom tillsätts TRITON X-100 (Hg), EDTA (Eg) och 15 8405647-2 l M fosfatbuffert (pH 6,5, #0 ml). Det hela omrörs vid 37° under 60 min. Till den därefter genom centrifugering erhållna produkten sätts ammoniumsulfat, och utfällningen samlas genom centrifugering vid 0,54 - 0,73 mättnadsgrad. Vidare tillsätts aceton (0,3 vol, kalt), och utfällningen, som samlas genom centrifugering, upplöses i 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5, 70 ml) (4750 U, utvinning 79,2%).

Till lösningen sätts ammoniumsulfat, och utfällningen samlas vid 0,5U - ÛJO mättnadsgrad genom centrifugering.

Efter upplösning av utfällningen i l0 mM fosfatbuffert (pH 6,5 fylls lösningen i en kolonn av SEPHADEf® (6 x 70 cm), och den fraktion som visar absorbering vid 280 nm, samlas upp. De aktiva fraktionerna sammanslås och frystorkas för att erhålla pyru- vatoxidas i pulverform (39H0 U, 758 mg, utvinning 65,7%).

Exempel 3 Efter upplösning av utfällningen i 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5) fylls lösningen i en kolonn av SEPHADE (6 x 70 cm), och den fraktion som visar absorbering vid 280 nm samlas upp.

De aktiva fraktionerna sammanslâs och frystorkas för att erhålla pyruvatoxidas i pulverform (3940 U, 758 mg, utvinning 65,7%).

Exempel 3 En sammansättning för pyruvatanalys (vid användning av syre- elektrod): pyruvatoxidas framställt enligt exempel 2 (samma som i de följande exemplen) 300 U FAD - 0,5 pmol tiaminpyrofosfat 10 pmol MnCl2 25 pmol 0,2M fosfatbuffaw(pH 7,5) 1,0 ml ” sukros 0,5 g 0,2M dimetylgbxanfirNaOH-buffert (pH 7,5) 5 ml Ovanstående blandning lyofiliseras för att förbereda samman- sättningen för undersökning av pyrodruvsyra (för syreelektrodmätníng, 50 tester).

Exempel 4 En sammansättning för pyruvatanalys (för kolorímetrisk under- sökning): musen-z 15 Reagens (I) pyruvatoxidas g 200 U FAD ' 0,5 pmol tiaminpyrofosfat 10 pmol 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 1,0 ml sukros ' 0,5 g 0,2 M dimetylglutarat-Na0H-buffert (pH 7,5) 0,5 ml peroxidas (100 U9mg, pepparrotperoxidas) 2,5 mg 0,3% H-aminoantipyrin 5 ml Ovanstående blandning lyofiliseras för att förbereda reagen- sen (I) för sammansättningen för pyruvatanalys (för kolorimetri, 50 tester).

Ett ytterligare reagens (II) består av 0,2% vattnigt N,N-dimetylanilin, innehållande 25 pmol MnCl2 (50 ml)och brytreagens (III) bestående av 0,1 M citratbuffert (pH 6,0, 100 ml), innehållande 0,1 M EDTA tillfogas.

Exempel 5 En sammansättning enligt exempel 3 upplöses i destillerat vatten (50 ml) och en provmängd lösning (1,0 ml) därav införs i ett reaktionskärl. Härtill sätts 5,0 mM pyruvatlösning (var och en 0-100 pl), eller mänskligt serum 50 pl och 5,0 mM pyruvatlösning (varoch en ytterligare 0-100 pl), och lösningen inkuberas vid 37°C, varefter syreförbrukningen uppmäts medelst en galvanisk-syreelek- trod. Resultaten redovisas i fig. 4.

Vidare upplöses en sammansättning enligt exempel 3 i destillerat vatten (25 ml)och en alikvot lösning (0,5 ml) därav införs i ett reaktionskärl, varefter inkuberas med tillsättning av vattnig lösning (0,5 ml) innehållande mänskligt serum (0-0,5 ml) vid 37°C. I fig. 5 visas resultatet av undersökningen av syreförbruk- ningen, uppmätt medelst galvanisk-syreelektrod.

Såsom visas i fig. 4 och 5 förefinns goda linjära förhållanden.

Exempel 6 Det lyofiliserade reagenset (I) enligt exempel U upplöses genom tillsättning av reagens (II) (50 ml), och varje alikvot lösning (1 m1) i små resa-ör inkuberas vid s1°c. Harrili sans s m1 kalium- pyruvatlösning (var och en 0-50 pl), och mänskligt serum (50 pl) tillsätts med 5 mM kaliumpyruvatlösning (var och en C-SC pl) 17 _ 84Û5647r2 >ch inkuberas vid 37°C under 10 min. Brytlösning (2 ml) tillsätts, varefter absorberingen mäts vid 555 nm. Såsom visas i fig. 6 före- finnsgodalinjära förhållanden, kvantitativa resultat vid de ovan visade undersökningarna och även när detta resultat samman- faller med kalibreringskurvan för väteperoxid (2,5 mM HQO2, o-sn P1). ' Ytterligare provmängder av mänskligt serum (0-0,5 ml) införs i små teströr och justeras till 0,5 ml genom att tillsätta destillerat vatten. Varje lösning (1,0 ml) av reagens (I) med tillsats av reagens (II) enligt exempel 4 sätts till och inkuberas vid 37°C under 10 min. Reaktionen avbryts genom att tillsätta brytreagens (III) (1,5 ml) och undersöks kolorimetriskt vid 565 nm. Såsom visas i fig. 7 erhålls ett gott kvantitativt resultat.

Exemgel 7' Reaktionsblandning: 0,2 M dimetylglutarat-Na0H-buffert (pH 7,5) 0,2 ml 10 mM MnCl2 50 pl 0,2% N,N-dimetylanilin 0,2 ml 0,3% 4-aminoantipyrin 0,1 ml peroxidas (45 U/ml) 0,1 ml l0 mM tiaminpyrofosfat 20 pl 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 25 ul 20 mM fosfoenolpyruvat 0,1 ml pyruvatkinas (4000 U/ml) 5 ml s mm Anp o-so pi Ovanstående reaktionsblanningjusteras till 1,0 ml genom tillsats av destillerat vatten, förinkuberas vid 37°C, varefter lösningen av pyruvatoxidas (200 U/ml, 20 pl) tillsätts, och inkube- _ ras vid 37°C under 10 min. Efter avbrytning av reaktionen genom tillsats av 0,1 m citratbuffert (pH 6,0, 2,0 ml) mäts absorberingen vid 565 nm. Såsom visas i fig. 8, erhålls goda kvantitativa resul- tat vid ADP-undersökningen genom att bestämma väteperoxid som uppstår i reaktionsblandningen av ADP, pyruvatkinas, fosfoenol- pyruvat och annat.

Enligt fig. 8 föreligger god linearitet om 2,5 mN väteperoxid används istället för 5 mM ADP.

B-406647r2 18 Exempel 8 Triglyceríd-undersökningssammansättning: Reagens (I): 0,2 M dimetylglutarat-NaOH-buffert (pH 7,5) 10 ml 0,3% H-amínoantipyrín S ml peroxídas (100 U/mg) 2,5 mg tiamínpyrofosfat l0,umo1 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 1,25 ml fosfoenolpyruvat ' 100 pmol pyruvatkinas (4000 U/ml) 0,1 ml pyruvatoxidas (200 U/ml) 2 ml lipoproteinlipas (3000 U/ml) 0,5 ml glycerolfosfokinas (300 U/ml) 1,0 ml ATP 100 pmol Ovanstående reagens lyofiliseras.

Reagens (II): 25 pmol MnCl2 i 0,2% dimetylanilin 50 ml Reagens (III) (bryt1ösning): 0,1 M Elflëi 0,1 M citratbuffert (pH 6,0) 100 ml Exempel 9 Reagens (I) enligt exempel 8 upplöses i reagens (II) och varje provmängd lösning (1,0 ml) därav fylls i teströren.

Varje provmängd (0-50 pl) av mänskligt serum, innehållande 1,02 pmol/nl triglycerid, 5 mM glycerollösning, 4,2 mM triolein i 0,1%'TRITON X-10 -lösning eller 2,5 mM väteperoxid-lösning tillsätts och inkuberas vid 37°C under 10 min. Såsom framgår av fig. 9 förefinns god linearitet.

Exempel 10 Sammansättning för undersökning av serum transaminas för 100 tester: (1) sammansättning för GTP-undersökning (glutamat-pyruvat- transamínas) (för 100 tester): Reagens (I): lyofiliserat reagens, bestående av följande: pyruvatoxidas 000 U FAD 630 nmol tíaminpyrcfosfat Lšßlurol 19 8405647-2 L-alanin » 20 mnç; W-ketogluaraf :sal suhros 1 y H-aminoantipyrin 150 pmol peroxidas N50 U 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 2,5 ml 0,2 M aimeryiglurarar-Naon (pH 7,5) ' so m1 Reagens (II) (100 ml används för reagens (I): H2 pmol MnCl2 i 0,2% dimetylanilin-lösning 210 ml Reagens (III) (brytlösning) 200 ml för reagens (I), 2,0 ml för 1 test: ' 0,1 M EDTA i 0,2 M Citratbuffert (pH 5,0) H20 ml (2) sammansättning för GOT-undersökning (glutamat- oxaloacetat-transaminas) (för 100 tester): Reagens (I) lyofiliserat reagens, bestående av följande: pyruvatoxidas H00 U FAD 500 nmol tiaminpyrofosfat 150 pmol L-aspartsyra 20 mmol Mëketoglutarat 1 mmol oxaloacetatdekarboxylas 200 U sukros - l g H-aminoantipyrín l50,pmol peroxidas H50 U 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 2,5 ml 0,2 M dímetylglutarat-Na0H-buffert (pH 7,5) 30 ml Reagens (II) och reagens (III): samma som ovanstående (1).

Exemgel ll Reagenserna (I) enligt exempel 10, (1) (för GPT-aktivitets- undersökning)och (2)(för GOT-aktivitetsundersökning) upplöses vart och ett genom att tillsätta reagens (II) (100 ml). Varje provmängd (1,0 ml) av lösningen införs i små teströr och förinkuberas vid 37°C under 5 min (förínkuberad lösning av reagens (I): Standard- serumlösningen (20_pl) (MAXITOL , Calbichem Co, innehållande GPT 700 K U/ml och GOT 1000 K U/ml), utspädd i ett konstant förhållande, tillsättes och inkuberas vid 37°C under 10 min. Reaktionen avbryts genom tillsats av brytreagens (III) (2,0 ml) och absorptionen mäts vid 565 nM. _ , _...___...______._...-.._._.,_._ ß4o5647f2 N Såsom visas i fíg.l0 företer de båda enzymaktiviteterna linearitet ända upptill den optiska tätheten av ungefär 1,0 (enzymaktivitet: ungefär 750 K U/ml).

Exempel 12 V Till varje förinkuberad lösning av reagens (I), èrhållen i exempel ll, sätts 20 pl mänskligt serum (US prov) och inkuberas vid 37°C under 20 min. Brytreagens (III) (0,2 ml) tillsätts och absorp- tionen mäts vid 565 nm.

Samma prov av mänskligt serum undersöks medelst LKB-metoden (UV-absorberingsmetoden, GOT-undersökningssammansättning och GPT- undersökningssammansättning, framställda av LKB Corp) och korreleras med GPT- och GOT-aktiviteten.

Av fig. ll framgår korrelationskoefficienten :r = 0,966 och regressionsekvationen: y = 0,00295 x'+ 0,0032 för GPT-undersökningen.

Av fig. 12 framgår korrelationskoefficienten: r= 0,966 och regressionsekvationen: y = 0,00287 x + 0,0l80.

Claims (3)

8405647-2 21 P A T E N T K R A V

1. Förfarande vid analytisk bestämning av pyrodruvsyra eller pyruvat i ett prov innehållande pyrodruvsyra eller pyruvat frigörande system, k ä n n e t e c k n a t- av att provet får reagera i ett reaktionssystem bestående av pyru- vatoxidas med ett optimalt pH-värde på åtminstone 6,3-8,5, FAD, tiaminpyrofosfat, fosfat och jonfrigörande salt, valt ur den grupp som består av kalciumjon, koboltjon, magnesium- jon och manganjon och att därefter mängden av en förbrukad komponent som syre eller en alstrad komponent som väteneroxid uppmätes.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det pyruvat frigörande systemet innefattar frigöring av pyruvat medelst en enzymreaktion.

3. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att mängden väteperoxid mätes med en indikator för väte- peroxid, lämpligen bestående av peroxidas, 4-aminoantipyrin och fenol eller N,N-dimetylanilin eller homovaniljsyra. U. Medel för genomförande av förfarandet enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det består av pyruvatoxidas, framställt genom att de pyruvatoxidasproducerande mikroorganis- merna Aerococcus viridans IFO-12219 eller Aerococcus viridans IFO-12317 odlats i ett näringsmedium och att bildat pyruvat- oxidas isolerats ur krossade, frånskilda celler, flavinadenin- dinukleotid (FAD), tiaminpyrofosfat, fosfat och ett salt som frigör kalciumjoner, koboltjoner, magnesiumjoner eller mangan- joner och lämpligen en indikator för väteperoxid.