JPS63148998A - Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はＮ−アセチルノイラミン酸く以下Ｎ−ＡＮＡと
いう）の酵素的定量方法及びその定量用キットに関する
ものである。

〈従来の技術〉 最近、臨床検査の分野において血清中のＮ−ＡＮＡの測
定が行なわれており、急性及び慢性炎症、ショック、外
傷、心筋梗塞、糖尿病、肝疾患、各種癌等の病態を診断
するのに重要な役割を持っている。

このＮ−ＡＮＡを測定するにあたって大別して化学法と
酵素法がある。

化学法は特異性や操作性、更には危険薬品類の使用等、
望ましくない点が多いため徐々に精度の高い酵素法に移
って来ているのが実情である。

酵素法には現在大きく別けてＡ、８２つの方法が提案さ
れている。

Ｎ−ＡＮＡにノイラミン酸アルドラーゼを作用させ、Ｎ
−７セチルマンノザミン（以下Ｎ−，ＡＭ　トいう）と
ピルビン酸に分解する過程は同一であるが、Ａ法はＮ−
ＡＭをアシルグルコサミン−２−エピメラーゼとＮ−ア
セチルヘキソサミンオキ／ダーゼで過酸化水素を生成さ
せて測定するものであり、Ｂ法はピルビン酸からピルビ
ン酸オキ／ダーゼまたは乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）で、
それぞれ過酸化水素またはＮＡＤＨを生成させて測定す
るものである。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、Ａ法はアシルグルコサミン−２−エピメラーゼ
が介在する分だけ系は複雑となり、Ｂ法は内因性のピル
ビン酸の影響を受けるという欠点がある。

本発明者等は操作が簡単でしかも精度の高いＮ−ＡＮＡ
の定量法について検討したところ、土壌かう分離したフ
ラボバクテリウム属に属する１細菌カ、Ｎ−ＡＭ　に作
用してＮ−７セチルマンノサミノラクトンにすると共に
、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する新規な酵素を生産し、こ
の酵素がＮ−ＡＮＡの定量に有効に利用出来るというこ
とを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明はＮ−ＡＮＡ含有試料にＮ−アセチルノ
イラミン酸アルドラーゼ及びＮ−アセチルマンノサミン
脱水素酵素を順次又は同時に作用させ、生成するＮＡＤ
Ｈを測定することを特徴とするＮ−ＡＮＡの定量方法で
あり、またＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ
−アセチルマンノサミン脱水素酵素、ＮＡＤ及び緩衝液
を含むＮ−ＡＮＡ定量用キットである。

く問題点を解決するための手段〉 以下本発明を具体的に説明する。

本発明の測定原理は下記に示す通りである。

Ｎ−ＡＭ　＋　ＮＡＤ　＋　Ｈ２Ｏ すなわちＮ−ＡＮＡをノイラミン酸アルドラーゼによっ
てＮ−ＡＭ　とピルビン酸に分解し、生じたＮ−ＡＭに
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素（以下Ｎ−ＡＭＤ
Ｈという）を作用させ、この生成されたＮＡＤＨを公知
の測定方法、例えば紫外部３４０　ｎｍの吸光度を測定
する方法等によって測定することができる。

また各々の酵素を固体に保持させて試料と接触させるこ
とにより、生成したＮＡＤＨを同様に測定することもで
きる。また共存するＬＤＨの影響を防ぐために必要であ
ればオキサミド酸や蓚酸等の、）書割を適量添加するこ
ともできる。

本発明１こ用いるノイラミン酸アルドラーゼとしテハ、
エノンエリノア・コリ、クロマトリジウム属、肝臓等か
ら精製されるものがあり、し・ずれの起源によるもので
も良いが、特に微生物から精製されたものが好ましく、
例えば市販のノイラミン酸アルドラーゼ（牛丼化学製）
を好適ｅこ用いることがてきる。

また本発明に用いるＮ−ＡＭＤＨは、いかなる起源のも
のでも使用できるが、例えば微生物殊にフラボバクテリ
ウム属に属する細菌から選ばれた菌を培養して得られる
Ｎ−ＡＭＤＨを用いることが好ましい。

フラボバクテリウム属に属する上記酵素生産菌としては
、例えばフラボバクテリウムｓｐ、＆　１４１−８等が
挙げられる。フラボバクテリウム８ｐ、ＮＩＬ　１４１
−８は本発明者等が土壌中より分離した新菌株であり、
その菌学的性質は下記の通りである。

（ａ）形態 顕微鏡的観察（３０°Ｃ加糖ブイヨン培地、１６時間培
養） ■細胞の大きさ：０．４５〜０．５　Ｘ　Ｏ，５〜１１
　ミクロンの桿菌 ■細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿状の
ものまである。末端で 相互につながった短い連鎖状態も 散見する。

■運動性：認められなり・。

■胞子の有無：形成せず。

■ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：陰性 （ｂ）　　各培地におけろ生育状態 ■肉汁寒天平板培養＝３０″Ｃ１２日間の培養で直径０
．５門の円形平滑で半透明な コロニーを作る。生育は比較的よ くない。

■加糖肉汁寒天平板培養：３０’Ｃ，２日間で直径０．
８朋の円形平滑で半透明なコ ロニー、５日間で２．０〜２．５屑肩の乳白色の粘液状
のコロニーを作 る。色素の生成は認められない。

■加糖肉汁寒天斜面培地：３０’Ｃ，２日間で乳濁した
粘液状になり、３日間での 培養では下方に流下し、底部にたま る。

■加糖肉汁液体培地：３０°Ｃ１２日間の培養で少し生
育する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：３０’Ｃ，２日間でわずかに
生育するが液化はしない。

・■　リ１マスミルク；変化なし、凝固もしなし１゜ （ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元：陽性 ■脱窒反応：陰性 ■ＭＲテスト：陰性。ただし好気的培養ては陽性。

■ｖｐテスト：陰性。

■インドールの生成：陰性。

■硫化水素の生成：陰性 ■デンプンの加水分解：陰性 ■　クエン酸の利用：陰性 ■無機窒素源の利用：アンモニアは利用するが硝酸は利
用しない。

■色素の生成：陰性 ■ウレアーゼ：陽性 ■オキンダーゼ：陽性 ０カタラーゼ：陽性 ０生育の範囲：１５°Ｃ〜４１“Ｃ（至適温度３０°Ｃ
）ｐＨ４，５〜８．５（至適ｐＨ６，５付近）■酸素に
対する態度：好気性であるが嫌気的にもわずかに生育す
る。

＠　Ｏ−Ｆテスト：変化なし、又は極めて弱い発酵。

０糖類から酸及びガスの生成：※は好気的培養による。

×酸の生成　ガスの生成 ’ＩＩＩＬ−アラビノース　　　十　　　　　−ｌ　Ｄ
−キノロース　　　十　　　　　−ｒｌＤ−グルコース
　　　＋　　　　　　−１Ｄ−マンノース　　　十　　
　　　−圓　Ｄ−７ラクトース　　十　　　　　−１Ｄ
−ガラクトース　　＋　　　　　−■　麦　　芽　　糖
　　　　　　　　十　　　　　　　　−（３）庶　　糖
　　　＋　　　− ロ　乳　　　　　糖　　　　　　　　＋　　　　　　　
　−四　トレハロース　　　　＋　　　　　−囲　Ｄ−
ソルビット　　　　十　　　　　　−四　　Ｄ−マ　ン
ニ　ノ　ト　　　　　　十　　　　　　　　　　−１イ
ノンノト　　　　　十　　　　　−旧グリセリン　　　
　　＋　　　　　−四デンブン　　　　　　−　　　　
　−（ｄ）　　その他の性質 ■ペニンリン耐性；１００単位／　ｍｅでも生育する。

■食塩耐性：２％以上で生育しない。

■　コロニー辺縁部の運動性：流動性は見られない。

■Ｔｗｅｅｎ　８０分解：陰性 ■エクスリンの分解：陰性 以上の新規なＮ−ＡＭＤＨ生産能を有する本閑の分類学
的諸性質を「パージエイズ・マニュアル・オブ・ンステ
マチノク・バクテリオロレー」（１９８４年）第１巻の
分類と対比すると、木菌はダラム染色性が陰性、好気性
の無胞子桿菌て運動性を持たず、カタラーゼ陽性、十キ
ノダーゼ陽性で多くの糖から好気的条件で酸を生成する
、ベニ／リン耐性であるなどの性質からフラボ・；クテ
リウム属に属すると思われる。

好気的条件での糖から酸を生成する性質から、フラボバ
クテリウム・スビリノ３ボラ／（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ　）に近縁と思
われるが、ニスクリ／の分解、硝酸塩の還元、Ｔｗｅｅ
ｎ　８０の分解などの点で異なっており、従来知られて
いない新規な菌株と思われる。

以、ｈの理由により本菌をフラボバクテリウムｓｐ、Ｎ
Ｌ１．１４１　８と命名した。なお、フラボバクテリウ
ムｓｐ、ＮＱ、１４１　８は通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄第１２２２号（ＦＥＲＭ
窒素源、無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地な
らば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であ
る。炭素源としてはグルコース、ガラクトース、フラク
トース、キンロース、グリセリフ等を用いることかでき
る。窒素源としてはアンモニウム塩の他にペプトン、カ
ゼイン消化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒
素性有機物が好適に使用できる。無機物としては、ナト
リウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カル／ラ
ム、鉄等の塩類が使用できる。

本発明においては、Ｎ−ＡＭＤＨ生産能を有するＷ株ヲ
Ｎ−ＡＭまたはＮ−７セチルグルフサミンを含有する培
地で培養または浸漬したときにＮ−ＡＭＤＨが収量よく
得られる。該培養培地の好適な例としては、Ｎ−ＡＭ　
０．５％、肉エキス０．１％、ポリペプトン０．５％、
酵母エキス０．２％、食塩０．１４％、燐酸水素−カリ
ウム０．１％、ｐＨ６，８の培地例が挙げられる。そし
て該培地で３０　’Ｃ１３６時間通気撹拌培養した場合
は、Ｎ−ＡＭを他の炭素源におきかえた場合の１０〜１
００倍の生産力価を得ることができる。

培養温度は通常２０〜４０“Ｃの範囲で好適には３０〜
３３°Ｃの範囲で行なわれる。培養開始のｐＨは通常６
〜８の範囲で好適には７付近である。この様な条件下で
２０〜４０時間振盪又は深部撹拌培養を行なうか、また
はＮ−ＡＭ　またはＮ−アセチルグルコサミンを含有し
ないが、生育に好適な他の培地に生育した菌体を高濃度
に分散させ１〜１０時間好気的にそれらと共に浸漬すれ
ば、該培養物または菌体懸濁液中にＮ−ＡＭＤＨが生成
蓄積する。

Ｎ−ＡＭＤＨは通常は菌体中に存在するので培養物を遠
心分離、あるし・は濾過によって菌体だけを分離するの
が好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可
溶化することによって溶液中にス、超音波等の物理的な
ものや、トリトンＸ−１００、ラウリル硫酸ソーダ、Ｅ
ＤＴＡ等の化学的方法、リノ゛チーム等の酵素的な方法
を単独または併用して用いることができる。この様にし
て得られた菌体破壊液から核酸を常法によって除去し、
濾過または遠心分離によって不溶物を除きＮ−ＡＭＤＨ
を得る。

更にＮ−ＡＭＤＨは必要により酵素の単離精製の常法に
従って、例えばｆｉｌ　ＤＥＡＥ−セルロース塔ニよる
カラムクロマトグラフィー、（２）硫安による分画沈殿
、（３）　ＤＥＡＥ−セファデックス塔によるカラムク
ロマトグラフィー、ｆ、＋ｌ　５　′−Ａ、ＭＰセファ
ロース塔ンこよるカラムクロマトグラフィー、（５）セ
ファデックスによるゲル濾過等の方法、またはその他の
方法を必要に応じ組合わせて用いることにより、精製さ
れたＮ−ＡＭＤＨを得る二とができる。

こうして得られる新規酵素Ｎ−ＡＭＤＨの理化学的性質
は下記の通りである。

（１）作用及び基質特異性 次の反応式に示されるごとく、Ｎ−ＡＭとＮＡＤの共存
下でＮ−ＡＭをＮ−アセチルマンノサミノラクトンに酸
化すると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する。

Ｎ−７セチルマンノサミノラクト／は水中では更に自動
的に加水分解されてＮ−７セチルマ／ノサミン酸になる
。故に反応は事実上不可逆的である。他の中性糖やヘキ
ソサミン、Ｎ−アセチルグルコサミ／、Ｎ−７セチルガ
ラクトサミンに対しては全く、もしくはほとんど作用し
ない。またＮＡＤＰ　や２，６−ジクロルフェノールイ
ンドフェノール等を電子受容体として、はとんど利用し
なしゝＱ ８．０〜９．０である。

またリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及びグ
リノン−苛性ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した
結果は第１図に示すとおりである。

安定ｐＨ範囲は第２図に示すごと＜８．５〜９．５であ
る。

使用緩衝液はリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、グリンンー苛性ソーダ緩衝液である。

（３）作用適温の範囲 第３図に示すごと＜３５〜５０°Ｃである。

（Ｊｌ　　ｐＨ、温度等による失活の条件第４図に示す
ごと＜１０分間の熱処理では４５°Ｃまで安定であり、
それ以上の温度では急速に失活する。４５°Ｃ１１０分
間の熱処理ではｐｕｓ、ｓ〜９．５で安定であり、ｐＨ
７以下では特に不安定である。

（５）阻害剤の影響及び安定化 上表は各種金属・ｆオ／及び阻害剤を２　ｍＭの濃度て
含有する反応液中での酵素活性を測定したものである。

活性化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られ
ていなし・。

（６）精製方法 本酵素の単離・精製は常法に従って行なうことができ、
例えばＤＥＡＥ−七ルロースを用いたカラムクロマトグ
ラフィー、硫安沈殿、ＤＥＡＥ−セフアデツクスを用い
たカラムクロマトグラフィー、５’−ＡＭＰセファロー
スを用いたカラムクロマトグラフィー、セファデックス
によるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わ
せ有）を用いてセファデックスＧ−２００のカラムンこ
よるゲル濾過法により測定した値は約１１万〜１２万で
ある。

（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動７．５％ポリア
クリルアミドゲルを用いて常法によってアクリルアミド
ディスク電気泳動を行なった結果、第５図に示すごとく
、はぼ単一のバンドが認められた。４　ｍＡで１時間２
０分後の泳動距離は２８朋である。

（９）？ｉ−電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定した値は４
．９である。

ｍ／に６０　ｍＭ　ＮＡＤ溶液０．Ｌｍｌを加える。３
７°Ｃに１０分間保った後、酵素液１０μｅを加え、０
．３ＭＮ−ＡＬｉ　溶液０．Ｌｍｌを加えて混合し、反
応を始める。直ちに３７°Ｃに保った吸光度測定用セル
（１ｃｍ光路）に移し、３４０　ｎｍの波長で１分ごと
に５分または必要であればそれ以上の時間にわたって吸
光度を」］１定する。１単位は１分間に１μモルのＮＡ
ＤＨを生成させる酵素量である。

以上のように本酵素はその作用及び基質特異性において
従来全く知られていない新規な酵素である。

Ｎ−ＡＮＡにＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを
作用させてＮ−ＡＭ　とピルビン酸に分解し、この分解
液に上記Ｎ−ＡＭＤＨを作用させる場合には、ｐＨ７〜
１０及び温度５０°Ｃ以下、好ましく　ハｐ８８〜９．
５及び温度３０〜４５°Ｃ（７）条件で、通常は２〜２
０分間程分間窓させる。ｐＨの調整には前記ｐＨ範囲を
維持することができ、かつ酵素反応を阻害しない任意の
緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム緩衝液、トリ
ス−塩酸緩衝液、グリンンー苛性ソーダ緩衝液、炭酸ナ
トリウム緩衝液等が好適に使用できる。

また本発明に供される試料中のＮ−ＡＮＡは遊離の状態
にあることが必要であり、血清や血しょう、組織の一部
等の様に蛋白質や糖脂質に結合しているンアル酸を測定
する場合にはノイラミニダーゼを作用させて遊離状態に
する。この場合に使用するノイラミニダーゼは、いがな
る起源のものでも良いが、クロストリジウム属、アスロ
バクター属、コリネバクテリウム属、ストレプトコツカ
ス属等に属する微生物から産生ずるものが好適である。

Ｎ−ＡＭＤＨの作用により生成されるＮＡＤＨの定量は
いかなる方法を用いても良いが、最も一般的に用いられ
ている方法は、紫外部３４０　ｎｍにおける吸光度をカ
リ定する方法である。可視部に吸収を持つ色素に転換し
て定量する方法はフェナジンメトサルフェートとニトロ
フ゛ルーテトラゾリウムと共に反応させて生成したダイ
ホルマザンの５７０ｎｍにおける吸光度を測定するもの
や、ＮＡＤＨ酸化酵素［Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ　９８
１４３３　（１９８５）　］やフェナジンメトサルフェ
ートまたそれに類する作用をする電子伝達体または金属
イオ／と反応させて生成した過酸化水素？バーオキ／ダ
ーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適な
波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に導
かれたものはルミノールと共に発光させて検出すること
もてきる。また適当シー選択した複数の酸化還元指示薬
と電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量
的に検出することも可能である。これらの検出方法はそ
の特徴によって使いわければ良い。

本発明のＮ−ＡＮＡ定量用キットはＮ−アセチルノイラ
ミン酸アルドラーゼ、Ｎ−ＡＭＤＨ、ＮＡＤと生成され
るＮＡＤＨを定量するための酵素や試薬類及びこれらの
反応を円滑に勧めるための緩衝用試薬からなっている。

この試薬類、酵素類は液剤、固形剤もしくは凍結乾燥剤
とし、必要に応じ工使用前に緩衝液に溶解混合して測定
用試薬とする。

測定方法は試料に先ずＮ−アセチルノイラミン酸アルド
ラーゼを作用させ、Ｎ　ＡＭ　を生成させ、次にＮ−Ａ
ＭＤＨを作用させることシこよってＮＡＤＨを生成させ
る。そしてこれをそのまま、あるいはＮＡＤＨ定量用試
薬を加えること？こまってＮＡＤＨを測定する。本発明
では測定方法は１試薬系でも２試薬系でも良く、さらン
こ何試薬系で測定しても良い。

〈発明の効果〉 本発明によれば操作が簡単てしかも内因性ピルビン酸の
影響を受けない正確性の高いＮ　ＡＮＡの定量が可能と
なり、／アル酸の臨床検査の診断分野において極めて有
意義である。

次に本発明を実施例？こより説明する。

〈実施例〉 実施例１ 溶液中のＮ−ＡＮＡの濃度を下記試薬を用いて下記方法
により定量した。

１、試薬 ０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０＞　　　　６１０
μＩＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（牛丼化学
製）（１０単位／　ｍｅ　）　　　３００μｅＮＡＤ　
　（６０ｍＭ）　　　　　　　　　　　５３　ｐ　ＩＮ
−ＡＭＤＨ（１２３単位／ｍｅ）６０μｍ試料溶液　　
　　　　　　　　　　　　２０μｊ２、定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、３７°Ｃで１０
分間反応させ３４０　　ｎｍで吸光度を測定し、同様に
してＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼのかわりに
水を同量加えて反応させた場合の吸光度を差しひいて試
料溶液の吸光度とした。別に既知濃度のＮ−ＡＮＡ溶液
を同様にして得た検量線から試料溶液中のＮ−ＡＮＡの
濃度を求めた。第６図に検量線を示す。

実施例２ 溶液中のＮ−ＡＮＡの濃度を下記試薬を用いて下記方法
により定量した。

１、試薬 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　（０，１％ト
リトンＸ−１００含有）　　　　　　　　　　１００μ
ｌフエナジンメトサルフエート（ｌａｇ／ｍ１）５μｌ ニドｐフ゛ル−テトラゾリウム（１０ｓ＋ｇ／屑／）５
　μ　ｅ ＮＡＤ　　　（４０ｍｇ／　ｍｅ　　）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２０　　μ　１Ｎ−ア
セチルノイラミン酸アルドラーゼ（牛丼化学製）（１０
単位／　ｍｅ　）　　　　４０μｌＮ−ＡＭＤＨ（１２
３単位／’＋＋＋ｒ）　　　　　　　１Ｏｐｌ試料溶液
　　　　　　　　　　　　　　１０μ１２、定量方法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、３７°Ｃで１
５分間反応させた。その後０．３規定塩酸２．０ｍｌを
添加して良く撹はんした。生成した色素を５７０　ｎｍ
で吸光度を測定した。Ｎ−７セチルノイラミ／酸アルド
ラーゼのかわりに水を同量添加して同様ンこ反応処理し
たものの吸光度をブランクとして差しひき、試料の吸光
度とした。別に既知濃度のＮ−ＡＮＡ溶液を同様にして
得た倹１線から試料溶液中のＮ−ＡＮＡの濃度を求めた
。

実施例３ 血清中のンアル酸量を下記試薬を用い、下記方法によっ
て定量した。

１、試薬 Ａ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，６）　　　　ｌ　
ｍｅノイラミニダーゼ（５Ｉｉｉ位／　ｍｅ　）　　　
’１　ｍｔＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｌ
Ｏ７１１位／ｍｅ）　　　　　　　　　　　ＬｔｍｔＢ
、　０．１　Ｍす／酸纒衝液（ｐＨ８，０）　　　５．
７ゴＮ−ＡＭＤＨ（１２３ｉｉｉ位／ｍｅ）　　　　　
０．６ｍｅＮＡＤ　　（６０ｍＭ）　　　　　　　　　
０．５　ｍｌオキサミド酸　　　　　　　　　　４．４
阿ｑ２、定量方法 血清２０μｌを試験管ンことり、試薬Ａ、３００μｅを
加え、３７°Ｃで１５分間反応させた後、試薬Ｂ２６８
０μｌを加え、更に１０分間反応を続けた。これについ
て３４０　ｎｍで吸光度を測定し、試薬Ａ、のかわりン
こ水を用いて、同様に処理して得た吸光度をブランクと
して差しひいた。別に既知ａ度のＮ−アセチルノイラミ
ニルラクトースの溶液を同様にして得た検量線から血清
中のンアル酸の濃度を求めた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフであり、第２図
は安定ｐＨを示すグラフである。第３図は本酵素の作用
適温の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安
定性を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバン
ドを示す図である。第６図は実施例１における検量線で
ある。なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそ
れぞれリン酸カリウム緩衝液（〇−〇）、トリス−塩酸
緩衝液（Δ−△）及びグリンンー苛性ソーダ緩衝液（・
−・）である。 特許出願人　財団法人　野田産業科学研究所Ｐ）−１ ｐＨ 温度（°Ｃ） 過度（０Ｃ） ＩＪ−ＡＮＡ４８（慴Ｍ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ−アセチルノイラミン酸含有試料にＮ−アセチ
   ルノイラミン酸アルドラーゼ及びＮ−アセチルマンノサ
   ミン脱水素酵素を順次又は同時に作用させ、生成するＮ
   ＡＤＨを測定することを特徴とするＮ−アセチルノイラ
   ミン酸の定量方法。
2. （２）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−ア
   セチルマンノサミン脱水素酵素、ＮＡＤ及び緩衝液を含
   むＮ−アセチルノイラミン酸定量用キット。