JPH04252200A - Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 - Google Patents
Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤＨに特異性の高
いＮＡＤＨキナーゼを用いて、主として疾病等の診断に
おいて、病態のマーカーとなる物質を高感度に定量する
ことにより、正確な診断を可能とし、臨床・医療等の分
野に利用できるものである。 【０００２】 【従来の技術】現在、酵素反応を用いて、病態のマーカ
ーとなる物質を定量する診断法が広く行なわれている。 しかし、現行法では測定の困難な極く微量のマーカーも
存在しまた、新生児検診のように被検液量が微量に限ら
れる場合もあって、これに対応しうる高感度な分析法が
求められている。 【０００３】それらの方法のひとつとして、サイクリン
グ反応による増感分析法があり、β−ＮＡＤ＋ ←→β
−ＮＡＤＨ 系のサイクリング反応やβ− ＮＡＤＰ＋
←→β−ＮＡＤＰＨ系のサイクリング反応等が知られ
ている。（東京化学同人社刊 生化学実験講座 第
５巻、１２１ 〜１３１ ページ） 。そして例えば、
特開昭５９−２１３４００ 号公報に記載されている如
く、β−ＮＡＤ＋に特異的なキナーゼを用いてβ−ＮＡ
ＤＨ とβ−ＮＡＤ＋を含有する溶液中のβ−ＮＡＤ＋
のみをリン酸化してβ−ＮＡＤＰ＋ とし、サイクリン
グ反応に導くことによって高感度に定量することができ
る。 【０００４】しかしながら、ＮＡＤ＋ （ 以下、β−
ＮＡＤ＋、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋、またはα−ＮＡＤ＋等
を示す。） とＮＡＤＨ（ 以下、β−ＮＡＤＨ 、Ｔ
ｈｉｏ−ＮＡＤＨ 、またはα−ＮＡＤＨ 等を示す。 ）を含有する混合系において、ＮＡＤＨが、微量に存在
している場合は、そのＮＡＤＨを定量する方法として前
述の特開昭５９−２１３４００ 号公報に記載されてい
る方法では、定量することが不可能である。そのため従
来は、ＨＰＬＣを使ったフローインジェクションアッセ
イや煮沸する方法（特開昭５８−１２９９９４号） が
あるが、高価な装置が必要だったり、操作が煩雑で時間
がかかったりするという欠点があった。また、β−ＮＡ
ＤＨ をルシフェラーゼで発光に導く高感度な方法や、
化学発光に導く方法があるが、特殊で高価な検出器が必
要であり、また試薬の安定性が問題になっている。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】本発明者等は上記した
事情に鑑み、過剰の ＮＡＤ＋ が存在する場合に、微
量のＮＡＤＨを高感度に定量する方法について、鋭意研
究を重ねた結果、ＮＡＤＨに特異的に作用するキナーゼ
を用いることによりその目的が達成できることを見いだ
した。さらに研究を重ねた結果、ＮＡＤ＋ とＮＡＤＨ
を含有する混合系においてもＮＡＤＨのみをリン酸化し
てＮＡＤＰＨ とし、これをサイクリング反応に導くこ
とにより、微量のＮＡＤＨを高感度に定量でき、また同
様に、微量のＸＴＰ についても高感度定量が可能とな
るという知見を得て、本発明を完成させた。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は、ＮＡＤ＋ 及
びＮＡＤＨが混在する溶液に、二価の金属イオン及び
ＸＴＰ〔式中、Ｘ はＡ（アデノシン）、Ｕ（ウリジン
）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン） 、Ｉ（イノシ
ン）、ｄＴ（チミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）
、ｄＵ（デオキシウリジン）、ｄＧ（デオキシグアノシ
ン）、ｄＣ（ デオキシシチジン）、ｄＩ（デオキシイ
ノシン） を示す〕の存在下に、ＮＡＤＨに特異性の高
いＮＡＤＨキナーゼを作用させてＸＤＰ（式中、Ｘ は
前記と同じ） 及びＮＡＤＰＨ を生成させ、次いでＮ
ＡＤＰＨ を、これをＮＡＤＰ＋ に酸化する触媒反応
及びＮＡＤＰ＋ をＮＡＤＰＨ に還元する触媒反応を
用いてサイクリング反応させ、該サイクリング反応によ
り消費される基質または生成する生成物の変化量を検出
することによりＮＡＤ＋ 及びＮＡＤＨが混在する溶液
中のＮＡＤＨのみを定量することを特徴とするＮＡＤＨ
の高感度定量法である。 【０００７】また、本発明は、 ＸＴＰ〔式中のＸ は
Ａ（アデノシン）、Ｕ（ウリジン）、Ｇ（グアノシン）
、Ｃ（シチジン）、Ｉ（イノシン）、ｄＴ（チミジン）
、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＵ（デオキシウリジ
ン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、ｄＣ（デオキシシ
チジン）、ｄＩ（デオキシイノシン）を示す〕を含む溶
液に、二価の金属イオン及びＮＡＤＨの存在下に、ＮＡ
ＤＨに特異性の高いＮＡＤＨキナーゼを作用させてＸＤ
Ｐ（但し式中のＸ は前記と同じ。） 及びＮＡＤＰＨ
を生成させ、次いでＮＡＤＰＨ を、これをＮＡＤＰ
＋ に酸化する触媒反応及びＮＡＤＰ＋ をＮＡＤＰＨ
に還元する触媒反応を用いてサイクリング反応させ、
該サイクリング反応により消費される基質または生成す
る生成物の変化量を検出することによりＸＴＰ を定量
することを特徴とするＸＴＰ の高感度定量法である。 【０００８】上記のＮＡＤ＋ としては、β−ＮＡＤ＋
、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋、またはα−ＮＡＤ＋が挙げられ
、ＮＡＤＨとしては、β−ＮＡＤＨ 、Ｔｈｉｏ−ＮＡ
ＤＨ 、またはα−ＮＡＤＨ が挙げられる。上記二価
の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋
，Ｃｏ２＋等が挙げられ、また酸化する触媒としては、
デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ オ
キシダーゼ、または電子運搬体を挙げることができる。 さらに電子運搬体としては、メルドラブルー（９−Ｄｉ
ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｂｅｎｚｏ− α−ｐｈｅｎ
ａｚｏｘｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１−メトキ
シＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈ
ｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、
ＰＭＳ（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍｍｅｔｈ
ｙｌｓｕｌｆａｔｅ）， または ＰＱＱ（Ｐｙｒｒｏ
ｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ）等を挙げる
ことができる。還元する触媒としては、デヒドロゲナー
ゼがあり、特にＮＡＤＰ＋ 依存性デヒドロゲナーゼが
好適である。 【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。まず、本
発明の高感度測定における反応を略示する。 【００１０】 【化１】 【００１１】ここで各記号は以下の意味を示す。 Ｅ１： ＮＡＤＰＨ とＳ１を基質として、ＮＡＤＰ＋
とＰ１を生成する反応を触媒する酸化触媒 Ｅ２： ＮＡＤＰ＋ とＳ２を基質として、ＮＡＤＰＨ
とＰ２を生成する反応を触媒する還元触媒 Ｓ１： Ｅ１の酸化型基質 Ｓ２： Ｅ２の還元型基質 Ｐ１： Ｅ１による、Ｓ１からの還元型生成物Ｐ２：
Ｅ２による、Ｓ２からの酸化型生成物ＸＤＰ ：
上記の、それぞれの「三リン酸」を「二リン酸」に置き
換えたものに同じ。 【００１２】本発明の対象となる溶液は、ＮＡＤ＋ 及
びＮＡＤＨが混在する溶液であればどのようなものでも
よく、例えばＮＡＤ＋ とＮＡＤＨの両者を含有するも
の、種々の酵素反応によって遊離生成するＮＡＤＨを含
むもの等が挙げられる。そしてその具体例としては、デ
ヒドロゲナーゼの酵素反応によってＮＡＤ＋ を基質と
して消費し、生成したＮＡＤＨを含む反応液等、例えば
以下に示す如き、１〜２０の反応液等を挙げることがで
きる。但しこれらの例示反応系は、なんら本発明の対象
を限定するものではない。 また、本発明の対象とな
る溶液は、ＸＴＰ を含む液であればどのようなもので
もよく、例えばキナーゼによる酵素反応によって、ＸＤ
Ｐ を基質として消費し、生成したＸＴＰ を含む反応
液等、例えば以下に示す如き、２１〜２９の反応液等を
挙げることができる。但しこれらの例示反応系は、なん
ら本発明の対象を限定するものではない。 【００１３】以下、式中の“ＤＨ”は、デヒドロゲナー
ゼの省略記号として用いている。 （但し、式中のＸ は、Ｕ，Ｉ，Ｇ，Ｃ，Ａ，ｄＴ，ｄ
Ｕ，ｄＩ，ｄＧ，ｄＣ，ｄＡ を示す。）これらの溶液
、１ 〜２０等においては、デヒドロゲナーゼの酵素反
応によって生成するＮＡＤＨを定量することを目的とし
た例として供したものである。さらにこの場合、ＮＡＤ
Ｈを定量することによって、これらの酵素反応系のデヒ
ドロゲナーゼの酵素活性か、ＮＡＤ＋ か、またはＮＡ
Ｄ＋ とともに消費される、酵素の基質成分のうち、い
ずれかを定量することが可能となる。また、溶液２１〜
２９等においては、キナーゼの酵素反応によって生成す
るＡＴＰ を定量することを目的とした例として供した
ものである。さらにこの場合、ＡＴＰ を定量すること
によって、これらの酵素反応系の、キナーゼの酵素活性
か、ＡＤＰ か、またはＡＤＰ とともに消費される、
酵素の基質成分となるリン化合物のうち、いずれかを定
量することが可能となる。 【００１４】また、以上の定量目的となる物質が、さら
に別の一連の反応系によって生成したものでもよく、こ
の場合最も先に行なわれた反応系に関与する、いずれか
の要素が結果的に定量可能となる。さらに、これら種々
の酵素反応については、ＮＡＤＨキナーゼの酵素反応と
同時に起こさせることもできる。 【００１５】この場合の全体の反応を次に簡単に示す。 【００１６】 【化２】 【００１７】ここで、各記号は以下の意味を示す。 Ｅ０ ： ＮＡＤ ＋ とＡ を基質として、ＮＡＤ
ＨとＢ を生成する反応を触媒するデヒドロゲーゼ Ａ ： デヒドロゲナーゼＥ０の還元型基質Ｂ ：
デヒドロゲナーゼＥ０による、Ａ からの酸化型
生成物 Ｅ１， Ｅ２， Ｓ１， Ｓ２， Ｐ１， Ｐ２ ：
前記と同義である。 【００１８】これらの酵素反応系において、反応を起こ
させるための温度、ｐＨ、安定化剤や金属イオンの必要
性などの条件は、適宜公知の技術に基づいて判断される
。 即ち、反応温度としては通常２０℃〜４０℃の範囲でよ
く、ｐＨ条件は、対象とする酵素反応にあわせて， 適
宜ｐＨ６．０ 〜９．５の範囲に設定され、これはその
ｐＨ範囲の好適な緩衝液を選択して用いることにより行
われる。これらの緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝
液、各種のグッドバッファー等が用いられる。反応時間
は酵素反応を行うに必要な時間であり、特にその範囲が
限定されるものではない。 【００１９】本発明に用いるＮＡＤＨキナーゼとしては
、ＮＡＤＨに特異的に作用し、実用に耐える安定性を有
するキナーゼであればいずれでもよいが、その例として
は、例えば以下の理化学的性質を有するＮＡＤＨキナー
ゼ（ 以下、”本酵素”という） が挙げられる。 （１） 作 用 本酵素は下記の反応式に示す通り、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋
、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋のうちの少なくとも１種のイオン
の存在下で、ＮＡＤＨとＸＴＰ（但し式中のＸ は、前
記に同じ。） を基質としてＮＡＤＨをリン酸化し、Ｎ
ＡＤＰＨ とＸＤＰ（但し式中のＸ は、前記に同じ。 ） を生成する反応を触媒する。（ 但し反応式中のＸ
は、前記に同じ。） （２） 基質特異性 本酵素は、ＮＡＤＨに対して非常に特異性が高く、 Ｎ
ＡＤ＋ には殆ど作用しない。 【００２０】本酵素の基質特異性を以下の反応条件で調
べた。 【００２１】 【表１】 【００２２】表１のＮＡＤＨを含む基質溶液０．９ｍｌ
及びＮＡＤ＋ を含む基質溶液０．９ｍｌ に、それ
ぞれ２３Ｕ／ｍｌの本酵素を０．１ｍｌ ずつ加え、３
０℃で２０分間反応させた。その後、１００ ℃、２
分間の処理で反応を停止して変性タンパクを除去し、次
いでそれぞれの基質の反応によって生成したＮＡＤＰＨ
またはＮＡＤＰ＋ の量を以下の通り測定した。なお
対照としては、基質溶液と本酵素を混合後、直ちに反応
を停止したものを用いた。 【００２３】すなわち上記反応液各１ｍｌ に、１０ｍ
Ｍ Ｇ−６−Ｐ、５０ｍＭ ＨＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８
．０） 、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ ％ 牛
血清アルブミン、２．５ＩＵ／ｍｌ Ｇ−６−Ｐデヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤＰ ＋ 依存性） 、５ＩＵ／ｍｌ
ジアホラーゼ、２５０ μＭ ２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール、なる組成の発色液１ｍｌ をそ
れぞれ加えて混合し、直ちにギルフォード社ステーサー
ＩＩＩ 型分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０
℃で反応させた。この際、反応と同時に６００ｎｍ に
おける吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１
分後の吸光度値と２ 分後の吸光度値との差（△ＯＤ６
００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値とした。相対活性（％）
は、ＮＡＤＨを基質として得られた測定値（△ＯＤ６
００ｎｍ ／ｍｉｎ）を１００ ％として、ＮＡＤ＋
を基質として得られた測定値（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍ
ｉｎ）を比較値（％） で示した。 【００２４】結果は次の通りである。 基 質 相対活性（％）ＮＡＤＨ
１００ＮＡＤ＋
０．９（３） 力価の測定法 【００２５】 【表２】 【００２６】表２の組成のＮＡＤＨを含む基質溶液０．
９ｍｌ を３０℃に予備加温し、これに適当な濃度の本
酵素液０．１ｍｌ を加えて、３０℃で２０分間反応さ
せた。その後、１００ ℃、２ 分間の処理で反応を停
止して変性タンパクを除去し、次いでそれぞれの基質の
反応によって生成したＮＡＤＰＨ またはＮＡＤＰ＋
の量を以下の通り測定した。なお対照としては、基質溶
液と本酵素を混合後、直ちに反応を停止したものを用い
た。 【００２７】すなわち上記反応液各１ｍｌ に、前記”
基質特異性”の項に記載したものと同じ組成の発色液１
ｍｌ を加えて混合し、直ちにギルフォード社ステーサ
ーＩＩＩ 型分光光度計の恒温キュベット内に導き、３
０℃で反応させた。この際、反応と同時に６００ｎｍ
における吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１
分後の吸光度値と２分後の吸光度値との差（△ＯＤ６
００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値として得た。予め、濃度
既知のＮＡＤＰＨ 溶液を用いて、△ＯＤ６００ｎｍ
／ｍｉｎ とＮＡＤＰＨ 濃度との検量線を作成してお
き、これによって測定値から、生成したＮＡＤＰＨ の
量を算出した。 【００２８】なお，３０ ℃において１ 分間当り、１
ナノモル量のＮＡＤＰＨ を生成する酵素量を１単位
とする。本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値〔ミカエリス
定数〕は、３０℃、ｐＨ７．８（トリス緩衝液） にお
いて、２７マイクロモルである。 （４） 至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは、ＮＡＤＨを基質とした場合、図１
に示すようにｐＨ８．０ 〜９．０ である。 （５） 安定ｐＨ範囲 本酵素を、各種ｐＨの緩衝液に溶解し、４ ℃１６時間
放置した後、残存活性を調べたところ、図２に示すよう
にｐＨ７．０ 〜９．０ で安定であった。 （６） 作用適温の範囲 本酵素の作用適温の範囲は、図３に示すように３０℃〜
４５℃にある。 （７） 熱安定性 本酵素を、緩衝液中に溶解し、各温度で１０分間放置し
て、残存する酵素活性を測定し、熱安定性を調べた。そ
の結果、図４に示すように、本酵素は３５℃で８３％、
４０℃で６０％、４５℃で３０％の残存活性を示した。 （８） 阻害、活性化及び安定化 本酵素はＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌ
ｆａｔｅ）、ｐ−ＣＭＢ（ｐ−Ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕ
ｒｉｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋
、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋等により強く阻害され
、また酢酸ナトリウム等により活性化される。さらに、
サッカロース、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、ジチオスレイトー
ル、Ｎ−アセチル−Ｌ− システイン、硫酸アンモニウ
ム等により安定化される。 （９） 精製方法 本酵素は、常法の酵素精製方法、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、
ゲル濾過等の方法を、単独または組合わせて用いること
により精製できる。 （１０）分子量 本酵素の分子量を、アンドリウスの方法〔Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．９６，５９５（１９６５）〕に基づき、セファ
クリルＳ−３００ＨＲ 〔ファルマシア社（スウェーデ
ン） 製〕を用いたゲル濾過法で測定すると約２７０，
０００ である。 （１１） 等電点 本酵素の等電点を、アンフォライトを含むアガロースゲ
ルを用いて電気泳動法によって測定した結果ｐＩ＝６．
４０ である。 【００２９】本酵素を公知文献に記載のＮＡＤＨキナー
ゼＡ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，５８８−５９３，
１９８９）及びＢ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７，１４
７３−１４７８，１９７２） と比較すると表３の通り
である。 【００３０】 【表３】 【００３１】表３から明らかなように、本酵素は公知の
ＮＡＤＨキナーゼとは酵素化学的、物理化学的性質が異
なり、特に熱安定性の点において優れているため、他の
各種酵素と組み合わせて使用して高感度分析を行なった
りする上で、実用に耐え得るため大変有利である。本酵
素は、ピヒア・メンブラニファシエンスＹＳ２７（微工
研条寄第３２０８号） を栄養培地中で培養することに
より製造される。本酵素は、通常ｐＨ６．５ 〜９．５
程度の範囲で、また通常２０℃〜４０℃程度で反応を
おこさせれば良く、使用量も特に限定されないが、通常
１ 〜５００ 単位程度用いれば良い。 【００３２】また、ＮＡＤＨキナーゼの反応で要求され
るマグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイ
オン、またはコバルトイオン等の２ 価金属イオンは、
これらを放出できる水溶性塩、例えば塩化マグネシウム
、塩化マンガン、塩化カルシウム等を使用すれば良く、
反応系において通常０．１ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度
で用いることができ、好ましくは、１ｍＭ 〜２０ｍＭ
の濃度で用いることができる。 【００３３】さらに、ＮＡＤＨを定量する場合に用いら
れるＡＴＰ の量としては、溶液中のＮＡＤＨの量に比
べて過剰に用いれば良いが、通常反応系において、０．
１ｍＭ 〜１０ｍＭ程度の濃度で用いることが好ましい
。また、ＡＴＰ を定量する場合に用いられるＮＡＤＨ
の量としては、溶液中のＡＴＰ の量に比べて過剰に用
いれば良いが、通常反応系において、０．０５ｍＭ〜５
ｍＭ 程度の濃度で用いることが好ましい。 【００３４】さらに、Ｅ０にあたる種々の酵素による反
応とＮＡＤＨキナーゼの酵素反応を同時に起こさせる場
合、またさらに、多くの一連の酵素反応を同時に起こさ
せる場合は全体の反応が円滑に行なわれる温度、ｐＨを
適宜選択し種々の添加物等の条件を満たして行なえばよ
い。また、本発明に用いる前述の、ＮＡＤＰＨ を酸化
する触媒Ｅ１は、ＡＴＰとＮＡＤＨから先のＮＡＤＨキ
ナーゼの酵素反応によってＡＤＰ とともに生成するＮ
ＡＤＰＨ に作用し、これと酸化型基質Ｓ１より還元型
生成物Ｐ１とＮＡＤＰ＋ を生成する反応を触媒するも
のであれば如何なるものでもよい。 【００３５】さらに、これと組み合わせてサイクリング
反応を形成する、ＮＡＤＰ＋ を還元する触媒Ｅ２は、
前述のようにＥ１により生成されたＮＡＤＰ＋ に作用
して、これと還元型基質Ｓ２より酸化型生成物Ｐ２とＮ
ＡＤＰＨ を生成する反応を触媒するものであれば、い
かなるものでもよい。このＥ１とＥ２による酵素反応を
組み合わせて起こさせれば、ＮＡＤＨキナーゼにより生
成されるＮＡＤＰＨ がＥ１によりＮＡＤＰ＋ に変換
され、このＮＡＤＰ＋ がＥ２によりＮＡＤＰＨ に変
換され、このＮＡＤＰＨ が再びＥ１の反応に戻される
というしくみによって、サイクリング反応が形成される
。 【００３６】ここで、Ｅ１とＥ２の少なくとも一方がＮ
ＡＤＰ＋ 依存性であれば、ＮＡＤ（Ｈ）についてはサ
イクリング反応が形成されないので、ＮＡＤＰＨ のみ
の高感度定量が可能となる。このサイクリング反応にお
いては、１ サイクルの反応が起こるごとに、Ｅ１の反
応によりＮＡＤＰＨ と等モルのＳ１が消費され、等モ
ルのＰ１とＮＡＤＰ＋ が生成しさらに、Ｅ２の反応に
よりＮＡＤＰ＋ と等モルのＳ２が消費され、等モルの
Ｐ２とＮＡＤＰＨ が生成するが、Ｅ１単独の反応に比
べて、溶液中のＮＡＤＨの一定量に対してのサイクリン
グ反応の速度は増加するため、定量目的となる成分の量
に比べて、そのサイクリング度数をかけたモル比に相当
する量以上の基質が必要となる。通常、大過剰量の各基
質を用いればよく、例えば溶液中のＮＡＤＨ量に比べて
、１０倍〜１万倍量の基質を用いればよい。また、サイ
クリング反応に用いられるＥ１やＥ２は、サイクリング
反応を行なわせるのに充分な任意量を用いればよく、測
定目的となる成分の量に合せて、望ましい増感を得るサ
イクリング度数を、達成しうるだけの量を適宜選択する
ことができる。例えば、１ 分間に１０サイクル以上の
反応を行なうのが好ましく、そのためには例えば酵素を
用いるのであればそれぞれ１ 〜１００ 単位を用いる
のが好ましく、電子運搬体であれば、０．０１ｍＭ〜１
０ｍＭを用いるのが好ましい。ここで、このサイクリン
グ反応のｐＨ条件としては、用いる触媒が安定で、良好
に働き、サイクリング反応が円滑に行なわれるｐＨ範囲
であればよく、通常６．０ 〜９．５ 程度の範囲で適
宜、緩衝液を選択して用いればよい。例えば、リン酸緩
衝液や各種グッドバッファー等が用いられる。また、反
応は通常２５℃〜４０℃付近で１ 分以上行なえばよく
、なんら限定されるものではない。 【００３７】次に、このサイクリング反応において検出
できる変化量を定量するには、Ｓ１かＳ２の減少量、Ｐ
１かＰ２の生成量のいずれかの変化量を定量すればよい
。これらの成分を測定するには、公知の方法を用いて適
宜行なえばよいが、これらの成分を基質として作用する
、オキシダーゼやペルオキシダーゼ等を単独で、または
組み合わせて用いればよい。また、特に好適な例として
、Ｅ１にＮＡＤＰＨ ジアホラーゼを、Ｓ１にテトラゾ
リウム塩や２，６−ジクロロフェノールインドフェノー
ル等を用いれば、サイクリング反応における変化量が、
色素の発色や退色となって現れるため、反応と同時に経
時的な吸光度測定を行なってサイクリング反応における
変化量を容易に比色定量することもでき、またサイクリ
ング反応を停止したのち変化量を定量することもできる
。また同様に、Ｅ１にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ オキシダーゼを
用い、同時にペルオキシダーゼを作用させて、ＮＡＤ（
Ｐ）Ｈ オキシダーゼにより生成したＨ２Ｏ２を、発色
系に導けば、反応と同時にサイクリング反応における変
化量を定量することもでき、またサイクリング反応を停
止したのち変化量を定量することもできる。 【００３８】このようにして、サイクリング反応におい
て消費される成分の量または生成される成分の量を定量
することにより、その検量曲線から溶液中のＮＡＤＨま
たはＡＴＰの高感度定量ができる。さらには、そのＮＡ
ＤＨの値から用いた溶液中のデヒドロゲナーゼＥ０の酵
素反応系のうち、Ｅ０の酵素活性、ＮＡＤ＋ 、または
その基質成分Ａ のいずれかの定量もでき、ＡＴＰ の
値からは用いた溶液中のキナーゼの酵素反応系のうち、
キナーゼの酵素活性、ＡＤＰ 、またはその基質となる
リン化合物の、いずれかの定量もできる。また、これら
のＮＡＤ＋ 、基質Ａ、ＡＤＰ、またはキナーゼの基質
となるリン化合物等が、さらに別の一連の反応系によっ
て生成したものである場合は、最も先に行なわれた反応
系に関与する、いずれかの要素が結果的に定量できる。 【００３９】本発明の定量をなすための、酵素及び必要
な試薬はひとつの系、または複数の系として、水溶液で
保存してもよく、乾燥粉末状で保存してもよい。これら
各酵素及び、必要な試薬の量を決定し、これを水溶液状
として定量に供するものであるが、１ テスト当り用い
る液量は特に限定されるものではないが、通常５０μｌ
〜５ｍｌ 程度を用いればよい。また測定の対象となる
溶液の量も、特に限定されるものではないが、通常５μ
ｌ 〜５ｍｌ 程度を用いればよい。 【００４０】また、溶液中のＮＡＤＨを遊離生成する酵
素反応は、予め別に行なってもよく、またＮＡＤＨキナ
ーゼの酵素反応と同一系で、同時に行なってもよい。つ
いで、サイクリング反応を行ない、反応において検出で
きる変化量を定量すればよい。 【００４１】 【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲をなんら制限するもの
ではない。 【００４２】 【実施例１】 ＮＡＤＨキナーゼの調製ピヒア・メン
ブラニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎ
ａｅｆａｃｉｅｎｓ）ＹＳ２７（微工研条寄第３２０８
号） を、５００ｍｌ 坂口フラスコ中のグルコース２
％、酵母エキス１％、ポリペプトン１％、リン酸水素一
カリウム０．９ ％、硫酸アンモニウム０．６ ％、塩
化カルシウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％
なる組成の、培地Ａ（ｐＨ５．５）５０ｍｌ に植菌し
、３０℃で２４時間振盪培養した。この種培養物を、培
地Ａ２０リットルに接種し、３０リットルのジャーファ
ーメンターで、通気量２０Ｌ ／ｍｉｎ 、攪拌速度３
００ｒｐｍの条件下で、３０℃で１８時間培養し、培養
物を遠心分離により集菌し菌体１４０６ｇを得た。この
全量を、グルコース０．５ ％、酵母エキス１ ％、ポ
リペプトン１％、リン酸水素一カリウム０．９ ％、硫
酸アンモニウム０．６ ％、塩化カルシウム０．０５％
、硫酸マグネシウム０．０５％、コハク酸ナトリウム２
％なる組成の、 培地Ｂ（ＰＨ５．５）２０リットル
に接種し、３０リットルのジャーファーメンターで、通
気量２０Ｌ ／ｍｉｎ、攪拌速度３００ｒｐｍの条件下
で、３０℃で６ 時間培養し、培養物を遠心分離により
集菌し、菌体１４２８ｇを得た。この全量を０．１Ｍサ
ッカロース、０．５ ％トリトンＸ−１００、５０ｍＭ
リン酸バッファー（ｐＨ６．０） に分散させて、総量
を５ リットルとし、これをダイノミル（ スイス国
ＷＡＢ社） を用いてグラスビーズ破砕した。 【００４３】回収した破砕液５２８０ｍｌは、遠心分離
によって沈殿物を除去した後、限外濾過膜（分画分子量
６，０００）を用いてバッファー交換を行ない、０．０
５Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐ
Ｈ６．０） の状態とした。次にこの酵素液５２６０ｍ
ｌを、予め０．０５Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン
酸バッファー（ｐＨ６．０） で緩衝化したＣＭ− セ
ファデックスＣ−５０カラム（ファルマシア社） に通
液して吸着させ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリ
ン酸バッファー（ｐＨ６．０）で洗浄した後、塩化ナト
リウム濃度０．１ 〜０．４Ｍの濃度勾配で溶出を行な
い、活性画分を集めた。 【００４４】溶出液４５５ｍｌ を限外濾過膜（分画分
子量６，０００）を用いてバッファー交換を行ない、１
０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ
ＨＥＰＰＳバッファー（ｐＨ７．５） として、予め
同じバッファーで緩衝化した、フェニル− トヨパール
６５０ カラム（東ソー社）に通液して吸着させ、１０
％硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ
ＨＥＰＰＳバッファー（ｐＨ７．５） で洗浄した後、
硫酸アンモニウム濃度１０％〜０％の濃度勾配で溶出を
行ない、活性画分を集めた。 【００４５】続いて、この溶出液３７２ｍｌ を、アミ
コン社製限外濾過装置（分画分子量１０，０００）を用
いて濃縮して２５ｍｌとし、予め０．２Ｍ硫酸アンモニ
ウム，５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １０ｍＭ ＨＥＰＰＳバ
ッファー（ｐＨ７．５） で緩衝化した、セファクリル
Ｓ−３００ ＨＲカラム（ファルマシア社製） にかけ
て、ゲル濾過を行なった。得られた活性画分を濃縮後、
凍結乾燥して本酵素標品１１７．３ ｍｇ（回収率３４
％） を得た。本標品の比活性は１０２Ｕ／ｍｇ であ
った。 【００４６】 【実施例２】 ＮＡＤＨの定量 多量の ＮＡＤ＋ を含む系に混在する微量のＮＡＤＨ
を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成を持つ反応液０
．８ ｍｌに２ｍＭ ＮＡＤ＋ と各濃度（０〜１０
μＭ）のＮＡＤＨを含有する試料液０．４ｍｌ を添加
し、３５℃で２０分間反応させた。反応停止後、これに
下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添加し
て混合し、直ちにギルフォード社ステーサーＩＩＩ 型
分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０℃で反応さ
せて、同時に６００ｎｍ における吸光度の変化を経時
的に測定し、発色反応後１分後の吸光度値と２分後の吸
光度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値
として得た。その結果、図５に示すように、ＮＡＤＨ濃
度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との間に、良好な直
線性が感度良く得られた。 【００４７】 反応液Ｉ組成 １００ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５） │
７．５ｍＭ ＡＴＰ
１５ｍＭ 塩化マグネシウム
０．３Ｍ
酢酸ナトリウム
１０Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨキナーゼ（実施
例１で調製したもの） 反応液ＩＩ組成
１０ｍＭ Ｇ−６−Ｐ
（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ
ＨＥＰＰＳ
１０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．１％
牛血清アルブミン
２．５ＩＵ／ｍｌ Ｇ−６−Ｐ
デヒドロゲナーゼ （ＮＡＤＰ＋ 依存性）
５ＩＵ／ｍｌ
ジアホラーゼ
３００ μＭ ２，６−ジク
ロロフェノールインドフェノール 【００４８】 【実施例３】 コール酸ナトリウムの定量微量の胆汁
酸を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成を持つ反応液
０．８ｍｌ に、各濃度（０〜１００ μＭ）のコール
酸ナトリウムを含有する試料液８０μｌ を添加し、３
５℃で２０分間反応させた。反応停止後、これに下記反
応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添加して混合
し、直ちにギルフォード社ステーサーＩＩＩ 型分光光
度計の恒温キュベット内に導き、３０℃で反応させて、
同時に６００ｎｍ における吸光度の変化を経時的に測
定し、発色反応後１ 分後の吸光度値と２ 分後の吸光
度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値と
して得た。その結果、図６に示すように、コール酸ナト
リウム濃度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との間に、
良好な直線性が感度良く得られた。 【００４９】 反応液Ｉ組成 ６７ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５）
５ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．２Ｍ 酢酸ナトリウム
２ｍＭ
ＮＡＤ＋
０．３ＩＵ／ｍｌ ３α−ハイドロ
キシステロイドデヒドロ
ゲナ−
ゼ（オリエンタル酵母社製）
７Ｕ／ｍｌ
ＮＡＤＨ キナーゼ（実施例１で調製したもの）
反応液ＩＩ組成：実施例２ で用いた反応液ＩＩ組成
に同じ。 【００５０】 【実施例４】 コール酸ナトリウムの定量微量のコー
ル酸ナトリウムを定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成
を持つ反応液３００ μｌ に、各濃度（５０，１００
，１５０，２００，２５０ μＭ）に調製したコール酸
ナトリウム溶液を検体としてそれぞれ５０μｌ を添加
し、３０℃で５分間放置した後、下記ＮＫ液を３００μ
ｌ加え、３０℃で２０分間反応させた。 次に、下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液３．０ｍｌ を
添加して混合し、３０℃で反応させて、１ 分後から６
分後までの５５０ｎｍ における１ 分間当りの平均
吸光度変化量を求めた。 その結果、β−ＮＡＤ＋を用いた場合は図７に、Ｔｈｉ
ｏ−ＮＡＤ＋を用いた場合は図８に示すように、コール
酸ナトリウム濃度と平均吸光度変化量との間に、コール
酸ナトリウム濃度２００ μＭ まで、原点を通る良好
な直線性が感度良く得られた。 【００５１】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
リン酸二カリウム （ｐＨ８．５）
８ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．５Ｍ 酢酸ナトリウム
５ｍＭ
ＮＡＤ＋ （β− 体かＴｈｉｏ− 体）
０．０
３％ 牛血清アルブミン
１０ＩＵ／ｍｌ ３α−
ハイドロキシステロイドデヒドロゲナ
−
ゼ ＮＫ液組成 ７．７Ｕ／
ｍｌ ＮＡＤＨ キナーゼ（ 実施例１で調製し
たもの）
０．２Ｍ 硫酸アンモニウム 反応液
ＩＩ組成 ２０ｍＭ Ｇ−
６−Ｐ （ｐＨ８．０）
５０ｍＭ リン酸二カリウム
０．０３％
牛血清アルブミン
１．２ｍＭ ニトロテトラゾリ
ウムブル−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ
０．５％
トリトン Ｘ−１００
３ＩＵ／ｍｌ Ｇ
−６−Ｐデヒドロゲナーゼ：イースト由来
（Ｔｈｉｏ− 体の時６ＩＵ／ｍｌ）
３ＩＵ／
ｍｌ ジアホラ−ゼ：バチルス属由来
（Ｔｈｉｏ− 体の
時６ＩＵ／ｍｌ ジアホラ−ゼ：クロストリジウム
属由来）
【００５２】 【実施例５】 血清中の胆汁酸の定量血清中の胆汁酸
濃度を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成を持つ反応
液３００ μｌ に、検体として２４例の人血清と標準
液としての５０μＭ コール酸ナトリウム溶液を、それ
ぞれ２００μｌ添加し、３０℃で５分間放置した後、下
記ＮＫ液を３００ μｌ 加え、３０℃で２０分間反応
させた。次に、下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液３．０
ｍｌ を添加して混合し、３０℃で反応させて、２ 分
後から３ 分後までの５５０ｎｍ における１ 分間の
吸光度変化量を求めた。また、公知の方法である３ α
−ＨＳＤ− ホルマザン法についても同一検体について
測定を行なった。その結果、本法と３ α−ＨＳＤ−
ホルマザン法の感度の比較は、第４ 表のようになり、
相関係数０．９９５ から相関性が高く、また、標準液
における吸光度変化量から求めた胆汁酸濃度は、図９の
ようになった。 これより本法は、従来法である３ α−ＨＳＤ− ホル
マザン法とよく相関し、胆汁酸を正確に、そして３ α
−ＨＳＤ− ホルマザン法よりも高感度に測定できるこ
とがわかった。 【００５３】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
リン酸二カリウム （ｐＨ８．５）
１２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．７５Ｍ 酢酸ナトリウ
ム ７．
５ｍＭ β−ＮＡＤ＋
０．０３％ 牛血清
アルブミン
６０ｍＭ オキサミン酸カリウ
ム １５
ＩＵ／ｍｌ ３α−ハイドロキシステロイドデヒド
ロゲナ
−ゼ ＮＫ液組成
１３．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨ キナー
ゼ（実施例１で調製したもの）
０．２Ｍ 硫酸ア
ンモニウム 反応液ＩＩ組成 ２０ｍ
Ｍ Ｇ−６−Ｐ （ｐＨ８．０）
５０ｍＭ リン酸二カ
リウム
０．０３％ 牛血清アルブミン
１．２ｍＭ
ニトロテトラゾリウムブル−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ
−２Ｎａ
０．５％ トリトン Ｘ−１００
３ＩＵ／ｍｌ
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ：イースト由来
３ＩＵ／ｍｌ ジアホラ−ゼ：バチルス属由来
４０ｍ
Ｍ オキサミン酸カリウム【００５４】 【表４】 【００５５】 【実施例６】 ３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ−ゼ
の定量微量の３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを定
量する目的で、下記反応液Ｉ組成を持つ反応液０．８ｍ
ｌに、各濃度（０〜６０ＩＵ／Ｌ） の３−ヒドロキシ
酪酸デヒドロゲナーゼを含有する試料液４００ μｌ
を添加し３５℃で１０分間反応させた。反応停止後、こ
れに下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添
加して混合し、直ちに分光光度計の恒温キュベット内に
導き、３０℃で反応させて、同時に６００ｎｍ におけ
る吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１分後の
吸光度値と２分後の吸光度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ
／ｍｉｎ）を測定値として得た。その結果、図１０に
示すように、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性
量と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との間に、良好な直
線性が感度良く得られた。 【００５６】 反応液Ｉ組成 １００ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５）
７．５ｍＭ ＡＴＰ
１５ｍＭ
塩化マグネシウム
０．３Ｍ 酢酸
ナトリウム
３ｍＭ β−ＮＡＤ＋
９０ｍＭ
３− ヒドロキシ酪酸
１０Ｕ／ｍｌ ＮＡ
ＤＨキナーゼ（実施例１で調製したもの） 反応液ＩＩ
組成：実施例２で用いた反応液ＩＩ組成に同じ。 【００５７】 【実施例７】 グリセリンの定量 微量のグリセリンを定量する目的で， 下記反応液Ｉ組
成を持つ反応液３００ μｌに、各濃度（１０，２０，
３０，４０，５０ μＭ）に調製したグリセリン溶液を
検体としてそれぞれ５０μｌを添加し、３０℃で５分間
放置した後、下記ＮＫ液を３００ μｌ 加え、３０℃
で２０分間反応させた。次に、下記反応ＩＩ組成を持つ
反応液３．０ｍｌ を添加して混合し、３０℃で反応さ
せて、１分後から６分後までの５５０ｎｍ における１
分間当りの平均吸光度変化量を求めた。その結果、図１
１に示すように、グリセリン濃度と平均吸光度変化量と
の間に、原点を通る良好な直線性が感度良く得られた。 【００５８】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（ｐＨ９．０） ８ｍＭ
ＡＴＰ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．５Ｍ
酢酸ナトリウム
５ｍＭ β−ＮＡＤ＋
０．０
３％ 牛血清アルブミン
７ＩＵ／ｍｌ グリセ
リンデヒドロゲナ−ゼ ＮＫ液組成
７．７Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨキナーゼ（実施
例１で調製したもの）
０．２Ｍ 硫酸アンモ
ニウム 反応液ＩＩ組成 ２０ｍＭ
Ｇ−６−Ｐ （ｐＨ８．０）
５０ｍＭ リン酸二カ
リウム
０．０３％ 牛血清アルブミン
１．２ｍＭ
ニトロテトラゾリウムブル−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ−
２Ｎａ
０．５％ トリトンＸ−１００
３ＩＵ／ｍｌ
Ｇ−６−Ｐ デヒドロゲナ−ゼ：イ−スト由来
３
ＩＵ／ｍｌ ジアホラ−ゼ：バチルス属由来【０
０５９】 【実施例８】 アルコールデヒドロゲナーゼの定量微
量のアルコールデヒドロゲナーゼを定量する目的で，
下記反応液Ｉ組成を持つ反応液３００ μｌ に各酵素
量（１，２，３，４，５ＩＵ／Ｌ） に調製したアルコ
ールデヒドロゲナーゼ溶液を検体としてそれぞれ５０μ
ｌ を添加し、３０℃で１０分間放置した後、下記ＮＫ
液を３００ μｌ 加え、３０℃で２０分間反応させた
。次に下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液３．０ｍｌ を
添加して混合し、３０℃で反応させて、１ 分後から６
分後までの５５０ｎｍ における１ 分間当りの平均
吸光度変化量を求めた。その結果、図１２に示すように
、アルコールデヒドロゲナーゼ活性量と平均吸光度変化
量との間に、原点を通る良好な直線性が感度良く得られ
た。 【００６０】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
グリシルグリシン （ｐＨ９．０）
８ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．５Ｍ 酢酸ナトリウ
ム
０．４ｍＭ Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋
０．０３％
牛血清アルブミン
５０ｍＭ ｎ−アミルアルコー
ル ＮＫ液組成 ７．７Ｕ／
ｍｌ ＮＡＤＨキナーゼ（実施例１で調製したもの
）
０．２Ｍ 硫酸アンモニウム 反応液Ｉ
Ｉ組成 ２０ｍＭ Ｇ−６−
Ｐ （ｐＨ８．０） ５
０ｍＭ リン酸二カリウム
０．０３％ 牛
血清アルブミン
１．２ｍＭ ニトロテトラゾリウムブ
ル− ０
．１Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ
０．５％
トリトン Ｘ−１００
６ＩＵ／ｍｌ Ｇ−６−Ｐ
デヒドロゲナ−ゼ：イ−スト由来
６ＩＵ／ｍｌ ジアホ
ラ−ゼ：クロストリジウム属由来【００６１】 【実施例９】 ＡＴＰ の定量 微量のＡＴＰ を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成
を持つ反応液０．８ｍｌ に、各濃度（０〜５０μＭ）
のＡＴＰ を含有する試料液４００ μｌ を添加し、
３５℃で２０分間反応させた。反応停止後、これに下記
反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添加して混
合し、直ちに分光光度計の恒温キュベット内に導き、３
０℃で反応させて、同時に６００ｎｍ における吸光度
の変化を経時的に測定し、発色反応後１分後の吸光度値
と２分後の吸光度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉ
ｎ）を測定値として得た。その結果、図１３に示すよう
に、ＡＴＰ 濃度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との
間に、良好な直線性が感度良く得られた。 反応液Ｉ組成 １００ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５）
３ｍＭ ＮＡＤＨ
１５ｍＭ
塩化マグネシウム
０．３Ｍ 酢酸ナトリウム
１０Ｕ／ｍｌ
ＮＡＤＨキナーゼ（実施例１で調製したもの）
反応液ＩＩ組成：実施例２で用いた反応液ＩＩ組成に
同じ。 【００６２】 【発明の効果】本発明の定量法は、ＮＡＤ＋ とＮＡＤ
Ｈが混在する系において、ＮＡＤ＋ の影響を受けるこ
となく微量のＮＡＤＨを高感度に定量し得る新規なもの
である。さらに、ＮＡＤ＋ やＡＴＰ を基質とする種
々の酵素反応系に関与する酵素活性、ＮＡＤ＋ 、ＡＤ
Ｐ 、またはこれらとともに反応する基質の、いずれか
の測定をも良好に成し得るものである。ひいては、疾病
等の診断において、病態のマーカーとなる物質を正確に
感度よく短時間に定量することを可能とし、自動分析に
も適用できるため正しい診断を与えることができ、臨床
・医療等の分野で、産業上極めて有意義である。
いＮＡＤＨキナーゼを用いて、主として疾病等の診断に
おいて、病態のマーカーとなる物質を高感度に定量する
ことにより、正確な診断を可能とし、臨床・医療等の分
野に利用できるものである。 【０００２】 【従来の技術】現在、酵素反応を用いて、病態のマーカ
ーとなる物質を定量する診断法が広く行なわれている。 しかし、現行法では測定の困難な極く微量のマーカーも
存在しまた、新生児検診のように被検液量が微量に限ら
れる場合もあって、これに対応しうる高感度な分析法が
求められている。 【０００３】それらの方法のひとつとして、サイクリン
グ反応による増感分析法があり、β−ＮＡＤ＋ ←→β
−ＮＡＤＨ 系のサイクリング反応やβ− ＮＡＤＰ＋
←→β−ＮＡＤＰＨ系のサイクリング反応等が知られ
ている。（東京化学同人社刊 生化学実験講座 第
５巻、１２１ 〜１３１ ページ） 。そして例えば、
特開昭５９−２１３４００ 号公報に記載されている如
く、β−ＮＡＤ＋に特異的なキナーゼを用いてβ−ＮＡ
ＤＨ とβ−ＮＡＤ＋を含有する溶液中のβ−ＮＡＤ＋
のみをリン酸化してβ−ＮＡＤＰ＋ とし、サイクリン
グ反応に導くことによって高感度に定量することができ
る。 【０００４】しかしながら、ＮＡＤ＋ （ 以下、β−
ＮＡＤ＋、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋、またはα−ＮＡＤ＋等
を示す。） とＮＡＤＨ（ 以下、β−ＮＡＤＨ 、Ｔ
ｈｉｏ−ＮＡＤＨ 、またはα−ＮＡＤＨ 等を示す。 ）を含有する混合系において、ＮＡＤＨが、微量に存在
している場合は、そのＮＡＤＨを定量する方法として前
述の特開昭５９−２１３４００ 号公報に記載されてい
る方法では、定量することが不可能である。そのため従
来は、ＨＰＬＣを使ったフローインジェクションアッセ
イや煮沸する方法（特開昭５８−１２９９９４号） が
あるが、高価な装置が必要だったり、操作が煩雑で時間
がかかったりするという欠点があった。また、β−ＮＡ
ＤＨ をルシフェラーゼで発光に導く高感度な方法や、
化学発光に導く方法があるが、特殊で高価な検出器が必
要であり、また試薬の安定性が問題になっている。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】本発明者等は上記した
事情に鑑み、過剰の ＮＡＤ＋ が存在する場合に、微
量のＮＡＤＨを高感度に定量する方法について、鋭意研
究を重ねた結果、ＮＡＤＨに特異的に作用するキナーゼ
を用いることによりその目的が達成できることを見いだ
した。さらに研究を重ねた結果、ＮＡＤ＋ とＮＡＤＨ
を含有する混合系においてもＮＡＤＨのみをリン酸化し
てＮＡＤＰＨ とし、これをサイクリング反応に導くこ
とにより、微量のＮＡＤＨを高感度に定量でき、また同
様に、微量のＸＴＰ についても高感度定量が可能とな
るという知見を得て、本発明を完成させた。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は、ＮＡＤ＋ 及
びＮＡＤＨが混在する溶液に、二価の金属イオン及び
ＸＴＰ〔式中、Ｘ はＡ（アデノシン）、Ｕ（ウリジン
）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン） 、Ｉ（イノシ
ン）、ｄＴ（チミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）
、ｄＵ（デオキシウリジン）、ｄＧ（デオキシグアノシ
ン）、ｄＣ（ デオキシシチジン）、ｄＩ（デオキシイ
ノシン） を示す〕の存在下に、ＮＡＤＨに特異性の高
いＮＡＤＨキナーゼを作用させてＸＤＰ（式中、Ｘ は
前記と同じ） 及びＮＡＤＰＨ を生成させ、次いでＮ
ＡＤＰＨ を、これをＮＡＤＰ＋ に酸化する触媒反応
及びＮＡＤＰ＋ をＮＡＤＰＨ に還元する触媒反応を
用いてサイクリング反応させ、該サイクリング反応によ
り消費される基質または生成する生成物の変化量を検出
することによりＮＡＤ＋ 及びＮＡＤＨが混在する溶液
中のＮＡＤＨのみを定量することを特徴とするＮＡＤＨ
の高感度定量法である。 【０００７】また、本発明は、 ＸＴＰ〔式中のＸ は
Ａ（アデノシン）、Ｕ（ウリジン）、Ｇ（グアノシン）
、Ｃ（シチジン）、Ｉ（イノシン）、ｄＴ（チミジン）
、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＵ（デオキシウリジ
ン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、ｄＣ（デオキシシ
チジン）、ｄＩ（デオキシイノシン）を示す〕を含む溶
液に、二価の金属イオン及びＮＡＤＨの存在下に、ＮＡ
ＤＨに特異性の高いＮＡＤＨキナーゼを作用させてＸＤ
Ｐ（但し式中のＸ は前記と同じ。） 及びＮＡＤＰＨ
を生成させ、次いでＮＡＤＰＨ を、これをＮＡＤＰ
＋ に酸化する触媒反応及びＮＡＤＰ＋ をＮＡＤＰＨ
に還元する触媒反応を用いてサイクリング反応させ、
該サイクリング反応により消費される基質または生成す
る生成物の変化量を検出することによりＸＴＰ を定量
することを特徴とするＸＴＰ の高感度定量法である。 【０００８】上記のＮＡＤ＋ としては、β−ＮＡＤ＋
、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋、またはα−ＮＡＤ＋が挙げられ
、ＮＡＤＨとしては、β−ＮＡＤＨ 、Ｔｈｉｏ−ＮＡ
ＤＨ 、またはα−ＮＡＤＨ が挙げられる。上記二価
の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋
，Ｃｏ２＋等が挙げられ、また酸化する触媒としては、
デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ オ
キシダーゼ、または電子運搬体を挙げることができる。 さらに電子運搬体としては、メルドラブルー（９−Ｄｉ
ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｂｅｎｚｏ− α−ｐｈｅｎ
ａｚｏｘｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１−メトキ
シＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈ
ｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、
ＰＭＳ（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍｍｅｔｈ
ｙｌｓｕｌｆａｔｅ）， または ＰＱＱ（Ｐｙｒｒｏ
ｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ）等を挙げる
ことができる。還元する触媒としては、デヒドロゲナー
ゼがあり、特にＮＡＤＰ＋ 依存性デヒドロゲナーゼが
好適である。 【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。まず、本
発明の高感度測定における反応を略示する。 【００１０】 【化１】 【００１１】ここで各記号は以下の意味を示す。 Ｅ１： ＮＡＤＰＨ とＳ１を基質として、ＮＡＤＰ＋
とＰ１を生成する反応を触媒する酸化触媒 Ｅ２： ＮＡＤＰ＋ とＳ２を基質として、ＮＡＤＰＨ
とＰ２を生成する反応を触媒する還元触媒 Ｓ１： Ｅ１の酸化型基質 Ｓ２： Ｅ２の還元型基質 Ｐ１： Ｅ１による、Ｓ１からの還元型生成物Ｐ２：
Ｅ２による、Ｓ２からの酸化型生成物ＸＤＰ ：
上記の、それぞれの「三リン酸」を「二リン酸」に置き
換えたものに同じ。 【００１２】本発明の対象となる溶液は、ＮＡＤ＋ 及
びＮＡＤＨが混在する溶液であればどのようなものでも
よく、例えばＮＡＤ＋ とＮＡＤＨの両者を含有するも
の、種々の酵素反応によって遊離生成するＮＡＤＨを含
むもの等が挙げられる。そしてその具体例としては、デ
ヒドロゲナーゼの酵素反応によってＮＡＤ＋ を基質と
して消費し、生成したＮＡＤＨを含む反応液等、例えば
以下に示す如き、１〜２０の反応液等を挙げることがで
きる。但しこれらの例示反応系は、なんら本発明の対象
を限定するものではない。 また、本発明の対象とな
る溶液は、ＸＴＰ を含む液であればどのようなもので
もよく、例えばキナーゼによる酵素反応によって、ＸＤ
Ｐ を基質として消費し、生成したＸＴＰ を含む反応
液等、例えば以下に示す如き、２１〜２９の反応液等を
挙げることができる。但しこれらの例示反応系は、なん
ら本発明の対象を限定するものではない。 【００１３】以下、式中の“ＤＨ”は、デヒドロゲナー
ゼの省略記号として用いている。 （但し、式中のＸ は、Ｕ，Ｉ，Ｇ，Ｃ，Ａ，ｄＴ，ｄ
Ｕ，ｄＩ，ｄＧ，ｄＣ，ｄＡ を示す。）これらの溶液
、１ 〜２０等においては、デヒドロゲナーゼの酵素反
応によって生成するＮＡＤＨを定量することを目的とし
た例として供したものである。さらにこの場合、ＮＡＤ
Ｈを定量することによって、これらの酵素反応系のデヒ
ドロゲナーゼの酵素活性か、ＮＡＤ＋ か、またはＮＡ
Ｄ＋ とともに消費される、酵素の基質成分のうち、い
ずれかを定量することが可能となる。また、溶液２１〜
２９等においては、キナーゼの酵素反応によって生成す
るＡＴＰ を定量することを目的とした例として供した
ものである。さらにこの場合、ＡＴＰ を定量すること
によって、これらの酵素反応系の、キナーゼの酵素活性
か、ＡＤＰ か、またはＡＤＰ とともに消費される、
酵素の基質成分となるリン化合物のうち、いずれかを定
量することが可能となる。 【００１４】また、以上の定量目的となる物質が、さら
に別の一連の反応系によって生成したものでもよく、こ
の場合最も先に行なわれた反応系に関与する、いずれか
の要素が結果的に定量可能となる。さらに、これら種々
の酵素反応については、ＮＡＤＨキナーゼの酵素反応と
同時に起こさせることもできる。 【００１５】この場合の全体の反応を次に簡単に示す。 【００１６】 【化２】 【００１７】ここで、各記号は以下の意味を示す。 Ｅ０ ： ＮＡＤ ＋ とＡ を基質として、ＮＡＤ
ＨとＢ を生成する反応を触媒するデヒドロゲーゼ Ａ ： デヒドロゲナーゼＥ０の還元型基質Ｂ ：
デヒドロゲナーゼＥ０による、Ａ からの酸化型
生成物 Ｅ１， Ｅ２， Ｓ１， Ｓ２， Ｐ１， Ｐ２ ：
前記と同義である。 【００１８】これらの酵素反応系において、反応を起こ
させるための温度、ｐＨ、安定化剤や金属イオンの必要
性などの条件は、適宜公知の技術に基づいて判断される
。 即ち、反応温度としては通常２０℃〜４０℃の範囲でよ
く、ｐＨ条件は、対象とする酵素反応にあわせて， 適
宜ｐＨ６．０ 〜９．５の範囲に設定され、これはその
ｐＨ範囲の好適な緩衝液を選択して用いることにより行
われる。これらの緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝
液、各種のグッドバッファー等が用いられる。反応時間
は酵素反応を行うに必要な時間であり、特にその範囲が
限定されるものではない。 【００１９】本発明に用いるＮＡＤＨキナーゼとしては
、ＮＡＤＨに特異的に作用し、実用に耐える安定性を有
するキナーゼであればいずれでもよいが、その例として
は、例えば以下の理化学的性質を有するＮＡＤＨキナー
ゼ（ 以下、”本酵素”という） が挙げられる。 （１） 作 用 本酵素は下記の反応式に示す通り、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋
、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋のうちの少なくとも１種のイオン
の存在下で、ＮＡＤＨとＸＴＰ（但し式中のＸ は、前
記に同じ。） を基質としてＮＡＤＨをリン酸化し、Ｎ
ＡＤＰＨ とＸＤＰ（但し式中のＸ は、前記に同じ。 ） を生成する反応を触媒する。（ 但し反応式中のＸ
は、前記に同じ。） （２） 基質特異性 本酵素は、ＮＡＤＨに対して非常に特異性が高く、 Ｎ
ＡＤ＋ には殆ど作用しない。 【００２０】本酵素の基質特異性を以下の反応条件で調
べた。 【００２１】 【表１】 【００２２】表１のＮＡＤＨを含む基質溶液０．９ｍｌ
及びＮＡＤ＋ を含む基質溶液０．９ｍｌ に、それ
ぞれ２３Ｕ／ｍｌの本酵素を０．１ｍｌ ずつ加え、３
０℃で２０分間反応させた。その後、１００ ℃、２
分間の処理で反応を停止して変性タンパクを除去し、次
いでそれぞれの基質の反応によって生成したＮＡＤＰＨ
またはＮＡＤＰ＋ の量を以下の通り測定した。なお
対照としては、基質溶液と本酵素を混合後、直ちに反応
を停止したものを用いた。 【００２３】すなわち上記反応液各１ｍｌ に、１０ｍ
Ｍ Ｇ−６−Ｐ、５０ｍＭ ＨＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８
．０） 、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ ％ 牛
血清アルブミン、２．５ＩＵ／ｍｌ Ｇ−６−Ｐデヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤＰ ＋ 依存性） 、５ＩＵ／ｍｌ
ジアホラーゼ、２５０ μＭ ２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール、なる組成の発色液１ｍｌ をそ
れぞれ加えて混合し、直ちにギルフォード社ステーサー
ＩＩＩ 型分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０
℃で反応させた。この際、反応と同時に６００ｎｍ に
おける吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１
分後の吸光度値と２ 分後の吸光度値との差（△ＯＤ６
００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値とした。相対活性（％）
は、ＮＡＤＨを基質として得られた測定値（△ＯＤ６
００ｎｍ ／ｍｉｎ）を１００ ％として、ＮＡＤ＋
を基質として得られた測定値（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍ
ｉｎ）を比較値（％） で示した。 【００２４】結果は次の通りである。 基 質 相対活性（％）ＮＡＤＨ
１００ＮＡＤ＋
０．９（３） 力価の測定法 【００２５】 【表２】 【００２６】表２の組成のＮＡＤＨを含む基質溶液０．
９ｍｌ を３０℃に予備加温し、これに適当な濃度の本
酵素液０．１ｍｌ を加えて、３０℃で２０分間反応さ
せた。その後、１００ ℃、２ 分間の処理で反応を停
止して変性タンパクを除去し、次いでそれぞれの基質の
反応によって生成したＮＡＤＰＨ またはＮＡＤＰ＋
の量を以下の通り測定した。なお対照としては、基質溶
液と本酵素を混合後、直ちに反応を停止したものを用い
た。 【００２７】すなわち上記反応液各１ｍｌ に、前記”
基質特異性”の項に記載したものと同じ組成の発色液１
ｍｌ を加えて混合し、直ちにギルフォード社ステーサ
ーＩＩＩ 型分光光度計の恒温キュベット内に導き、３
０℃で反応させた。この際、反応と同時に６００ｎｍ
における吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１
分後の吸光度値と２分後の吸光度値との差（△ＯＤ６
００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値として得た。予め、濃度
既知のＮＡＤＰＨ 溶液を用いて、△ＯＤ６００ｎｍ
／ｍｉｎ とＮＡＤＰＨ 濃度との検量線を作成してお
き、これによって測定値から、生成したＮＡＤＰＨ の
量を算出した。 【００２８】なお，３０ ℃において１ 分間当り、１
ナノモル量のＮＡＤＰＨ を生成する酵素量を１単位
とする。本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値〔ミカエリス
定数〕は、３０℃、ｐＨ７．８（トリス緩衝液） にお
いて、２７マイクロモルである。 （４） 至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは、ＮＡＤＨを基質とした場合、図１
に示すようにｐＨ８．０ 〜９．０ である。 （５） 安定ｐＨ範囲 本酵素を、各種ｐＨの緩衝液に溶解し、４ ℃１６時間
放置した後、残存活性を調べたところ、図２に示すよう
にｐＨ７．０ 〜９．０ で安定であった。 （６） 作用適温の範囲 本酵素の作用適温の範囲は、図３に示すように３０℃〜
４５℃にある。 （７） 熱安定性 本酵素を、緩衝液中に溶解し、各温度で１０分間放置し
て、残存する酵素活性を測定し、熱安定性を調べた。そ
の結果、図４に示すように、本酵素は３５℃で８３％、
４０℃で６０％、４５℃で３０％の残存活性を示した。 （８） 阻害、活性化及び安定化 本酵素はＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌ
ｆａｔｅ）、ｐ−ＣＭＢ（ｐ−Ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕ
ｒｉｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋
、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋等により強く阻害され
、また酢酸ナトリウム等により活性化される。さらに、
サッカロース、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、ジチオスレイトー
ル、Ｎ−アセチル−Ｌ− システイン、硫酸アンモニウ
ム等により安定化される。 （９） 精製方法 本酵素は、常法の酵素精製方法、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、
ゲル濾過等の方法を、単独または組合わせて用いること
により精製できる。 （１０）分子量 本酵素の分子量を、アンドリウスの方法〔Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．９６，５９５（１９６５）〕に基づき、セファ
クリルＳ−３００ＨＲ 〔ファルマシア社（スウェーデ
ン） 製〕を用いたゲル濾過法で測定すると約２７０，
０００ である。 （１１） 等電点 本酵素の等電点を、アンフォライトを含むアガロースゲ
ルを用いて電気泳動法によって測定した結果ｐＩ＝６．
４０ である。 【００２９】本酵素を公知文献に記載のＮＡＤＨキナー
ゼＡ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，５８８−５９３，
１９８９）及びＢ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７，１４
７３−１４７８，１９７２） と比較すると表３の通り
である。 【００３０】 【表３】 【００３１】表３から明らかなように、本酵素は公知の
ＮＡＤＨキナーゼとは酵素化学的、物理化学的性質が異
なり、特に熱安定性の点において優れているため、他の
各種酵素と組み合わせて使用して高感度分析を行なった
りする上で、実用に耐え得るため大変有利である。本酵
素は、ピヒア・メンブラニファシエンスＹＳ２７（微工
研条寄第３２０８号） を栄養培地中で培養することに
より製造される。本酵素は、通常ｐＨ６．５ 〜９．５
程度の範囲で、また通常２０℃〜４０℃程度で反応を
おこさせれば良く、使用量も特に限定されないが、通常
１ 〜５００ 単位程度用いれば良い。 【００３２】また、ＮＡＤＨキナーゼの反応で要求され
るマグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイ
オン、またはコバルトイオン等の２ 価金属イオンは、
これらを放出できる水溶性塩、例えば塩化マグネシウム
、塩化マンガン、塩化カルシウム等を使用すれば良く、
反応系において通常０．１ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度
で用いることができ、好ましくは、１ｍＭ 〜２０ｍＭ
の濃度で用いることができる。 【００３３】さらに、ＮＡＤＨを定量する場合に用いら
れるＡＴＰ の量としては、溶液中のＮＡＤＨの量に比
べて過剰に用いれば良いが、通常反応系において、０．
１ｍＭ 〜１０ｍＭ程度の濃度で用いることが好ましい
。また、ＡＴＰ を定量する場合に用いられるＮＡＤＨ
の量としては、溶液中のＡＴＰ の量に比べて過剰に用
いれば良いが、通常反応系において、０．０５ｍＭ〜５
ｍＭ 程度の濃度で用いることが好ましい。 【００３４】さらに、Ｅ０にあたる種々の酵素による反
応とＮＡＤＨキナーゼの酵素反応を同時に起こさせる場
合、またさらに、多くの一連の酵素反応を同時に起こさ
せる場合は全体の反応が円滑に行なわれる温度、ｐＨを
適宜選択し種々の添加物等の条件を満たして行なえばよ
い。また、本発明に用いる前述の、ＮＡＤＰＨ を酸化
する触媒Ｅ１は、ＡＴＰとＮＡＤＨから先のＮＡＤＨキ
ナーゼの酵素反応によってＡＤＰ とともに生成するＮ
ＡＤＰＨ に作用し、これと酸化型基質Ｓ１より還元型
生成物Ｐ１とＮＡＤＰ＋ を生成する反応を触媒するも
のであれば如何なるものでもよい。 【００３５】さらに、これと組み合わせてサイクリング
反応を形成する、ＮＡＤＰ＋ を還元する触媒Ｅ２は、
前述のようにＥ１により生成されたＮＡＤＰ＋ に作用
して、これと還元型基質Ｓ２より酸化型生成物Ｐ２とＮ
ＡＤＰＨ を生成する反応を触媒するものであれば、い
かなるものでもよい。このＥ１とＥ２による酵素反応を
組み合わせて起こさせれば、ＮＡＤＨキナーゼにより生
成されるＮＡＤＰＨ がＥ１によりＮＡＤＰ＋ に変換
され、このＮＡＤＰ＋ がＥ２によりＮＡＤＰＨ に変
換され、このＮＡＤＰＨ が再びＥ１の反応に戻される
というしくみによって、サイクリング反応が形成される
。 【００３６】ここで、Ｅ１とＥ２の少なくとも一方がＮ
ＡＤＰ＋ 依存性であれば、ＮＡＤ（Ｈ）についてはサ
イクリング反応が形成されないので、ＮＡＤＰＨ のみ
の高感度定量が可能となる。このサイクリング反応にお
いては、１ サイクルの反応が起こるごとに、Ｅ１の反
応によりＮＡＤＰＨ と等モルのＳ１が消費され、等モ
ルのＰ１とＮＡＤＰ＋ が生成しさらに、Ｅ２の反応に
よりＮＡＤＰ＋ と等モルのＳ２が消費され、等モルの
Ｐ２とＮＡＤＰＨ が生成するが、Ｅ１単独の反応に比
べて、溶液中のＮＡＤＨの一定量に対してのサイクリン
グ反応の速度は増加するため、定量目的となる成分の量
に比べて、そのサイクリング度数をかけたモル比に相当
する量以上の基質が必要となる。通常、大過剰量の各基
質を用いればよく、例えば溶液中のＮＡＤＨ量に比べて
、１０倍〜１万倍量の基質を用いればよい。また、サイ
クリング反応に用いられるＥ１やＥ２は、サイクリング
反応を行なわせるのに充分な任意量を用いればよく、測
定目的となる成分の量に合せて、望ましい増感を得るサ
イクリング度数を、達成しうるだけの量を適宜選択する
ことができる。例えば、１ 分間に１０サイクル以上の
反応を行なうのが好ましく、そのためには例えば酵素を
用いるのであればそれぞれ１ 〜１００ 単位を用いる
のが好ましく、電子運搬体であれば、０．０１ｍＭ〜１
０ｍＭを用いるのが好ましい。ここで、このサイクリン
グ反応のｐＨ条件としては、用いる触媒が安定で、良好
に働き、サイクリング反応が円滑に行なわれるｐＨ範囲
であればよく、通常６．０ 〜９．５ 程度の範囲で適
宜、緩衝液を選択して用いればよい。例えば、リン酸緩
衝液や各種グッドバッファー等が用いられる。また、反
応は通常２５℃〜４０℃付近で１ 分以上行なえばよく
、なんら限定されるものではない。 【００３７】次に、このサイクリング反応において検出
できる変化量を定量するには、Ｓ１かＳ２の減少量、Ｐ
１かＰ２の生成量のいずれかの変化量を定量すればよい
。これらの成分を測定するには、公知の方法を用いて適
宜行なえばよいが、これらの成分を基質として作用する
、オキシダーゼやペルオキシダーゼ等を単独で、または
組み合わせて用いればよい。また、特に好適な例として
、Ｅ１にＮＡＤＰＨ ジアホラーゼを、Ｓ１にテトラゾ
リウム塩や２，６−ジクロロフェノールインドフェノー
ル等を用いれば、サイクリング反応における変化量が、
色素の発色や退色となって現れるため、反応と同時に経
時的な吸光度測定を行なってサイクリング反応における
変化量を容易に比色定量することもでき、またサイクリ
ング反応を停止したのち変化量を定量することもできる
。また同様に、Ｅ１にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ オキシダーゼを
用い、同時にペルオキシダーゼを作用させて、ＮＡＤ（
Ｐ）Ｈ オキシダーゼにより生成したＨ２Ｏ２を、発色
系に導けば、反応と同時にサイクリング反応における変
化量を定量することもでき、またサイクリング反応を停
止したのち変化量を定量することもできる。 【００３８】このようにして、サイクリング反応におい
て消費される成分の量または生成される成分の量を定量
することにより、その検量曲線から溶液中のＮＡＤＨま
たはＡＴＰの高感度定量ができる。さらには、そのＮＡ
ＤＨの値から用いた溶液中のデヒドロゲナーゼＥ０の酵
素反応系のうち、Ｅ０の酵素活性、ＮＡＤ＋ 、または
その基質成分Ａ のいずれかの定量もでき、ＡＴＰ の
値からは用いた溶液中のキナーゼの酵素反応系のうち、
キナーゼの酵素活性、ＡＤＰ 、またはその基質となる
リン化合物の、いずれかの定量もできる。また、これら
のＮＡＤ＋ 、基質Ａ、ＡＤＰ、またはキナーゼの基質
となるリン化合物等が、さらに別の一連の反応系によっ
て生成したものである場合は、最も先に行なわれた反応
系に関与する、いずれかの要素が結果的に定量できる。 【００３９】本発明の定量をなすための、酵素及び必要
な試薬はひとつの系、または複数の系として、水溶液で
保存してもよく、乾燥粉末状で保存してもよい。これら
各酵素及び、必要な試薬の量を決定し、これを水溶液状
として定量に供するものであるが、１ テスト当り用い
る液量は特に限定されるものではないが、通常５０μｌ
〜５ｍｌ 程度を用いればよい。また測定の対象となる
溶液の量も、特に限定されるものではないが、通常５μ
ｌ 〜５ｍｌ 程度を用いればよい。 【００４０】また、溶液中のＮＡＤＨを遊離生成する酵
素反応は、予め別に行なってもよく、またＮＡＤＨキナ
ーゼの酵素反応と同一系で、同時に行なってもよい。つ
いで、サイクリング反応を行ない、反応において検出で
きる変化量を定量すればよい。 【００４１】 【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲をなんら制限するもの
ではない。 【００４２】 【実施例１】 ＮＡＤＨキナーゼの調製ピヒア・メン
ブラニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎ
ａｅｆａｃｉｅｎｓ）ＹＳ２７（微工研条寄第３２０８
号） を、５００ｍｌ 坂口フラスコ中のグルコース２
％、酵母エキス１％、ポリペプトン１％、リン酸水素一
カリウム０．９ ％、硫酸アンモニウム０．６ ％、塩
化カルシウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％
なる組成の、培地Ａ（ｐＨ５．５）５０ｍｌ に植菌し
、３０℃で２４時間振盪培養した。この種培養物を、培
地Ａ２０リットルに接種し、３０リットルのジャーファ
ーメンターで、通気量２０Ｌ ／ｍｉｎ 、攪拌速度３
００ｒｐｍの条件下で、３０℃で１８時間培養し、培養
物を遠心分離により集菌し菌体１４０６ｇを得た。この
全量を、グルコース０．５ ％、酵母エキス１ ％、ポ
リペプトン１％、リン酸水素一カリウム０．９ ％、硫
酸アンモニウム０．６ ％、塩化カルシウム０．０５％
、硫酸マグネシウム０．０５％、コハク酸ナトリウム２
％なる組成の、 培地Ｂ（ＰＨ５．５）２０リットル
に接種し、３０リットルのジャーファーメンターで、通
気量２０Ｌ ／ｍｉｎ、攪拌速度３００ｒｐｍの条件下
で、３０℃で６ 時間培養し、培養物を遠心分離により
集菌し、菌体１４２８ｇを得た。この全量を０．１Ｍサ
ッカロース、０．５ ％トリトンＸ−１００、５０ｍＭ
リン酸バッファー（ｐＨ６．０） に分散させて、総量
を５ リットルとし、これをダイノミル（ スイス国
ＷＡＢ社） を用いてグラスビーズ破砕した。 【００４３】回収した破砕液５２８０ｍｌは、遠心分離
によって沈殿物を除去した後、限外濾過膜（分画分子量
６，０００）を用いてバッファー交換を行ない、０．０
５Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐ
Ｈ６．０） の状態とした。次にこの酵素液５２６０ｍ
ｌを、予め０．０５Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン
酸バッファー（ｐＨ６．０） で緩衝化したＣＭ− セ
ファデックスＣ−５０カラム（ファルマシア社） に通
液して吸着させ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリ
ン酸バッファー（ｐＨ６．０）で洗浄した後、塩化ナト
リウム濃度０．１ 〜０．４Ｍの濃度勾配で溶出を行な
い、活性画分を集めた。 【００４４】溶出液４５５ｍｌ を限外濾過膜（分画分
子量６，０００）を用いてバッファー交換を行ない、１
０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ
ＨＥＰＰＳバッファー（ｐＨ７．５） として、予め
同じバッファーで緩衝化した、フェニル− トヨパール
６５０ カラム（東ソー社）に通液して吸着させ、１０
％硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ
ＨＥＰＰＳバッファー（ｐＨ７．５） で洗浄した後、
硫酸アンモニウム濃度１０％〜０％の濃度勾配で溶出を
行ない、活性画分を集めた。 【００４５】続いて、この溶出液３７２ｍｌ を、アミ
コン社製限外濾過装置（分画分子量１０，０００）を用
いて濃縮して２５ｍｌとし、予め０．２Ｍ硫酸アンモニ
ウム，５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １０ｍＭ ＨＥＰＰＳバ
ッファー（ｐＨ７．５） で緩衝化した、セファクリル
Ｓ−３００ ＨＲカラム（ファルマシア社製） にかけ
て、ゲル濾過を行なった。得られた活性画分を濃縮後、
凍結乾燥して本酵素標品１１７．３ ｍｇ（回収率３４
％） を得た。本標品の比活性は１０２Ｕ／ｍｇ であ
った。 【００４６】 【実施例２】 ＮＡＤＨの定量 多量の ＮＡＤ＋ を含む系に混在する微量のＮＡＤＨ
を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成を持つ反応液０
．８ ｍｌに２ｍＭ ＮＡＤ＋ と各濃度（０〜１０
μＭ）のＮＡＤＨを含有する試料液０．４ｍｌ を添加
し、３５℃で２０分間反応させた。反応停止後、これに
下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添加し
て混合し、直ちにギルフォード社ステーサーＩＩＩ 型
分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０℃で反応さ
せて、同時に６００ｎｍ における吸光度の変化を経時
的に測定し、発色反応後１分後の吸光度値と２分後の吸
光度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値
として得た。その結果、図５に示すように、ＮＡＤＨ濃
度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との間に、良好な直
線性が感度良く得られた。 【００４７】 反応液Ｉ組成 １００ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５） │
７．５ｍＭ ＡＴＰ
１５ｍＭ 塩化マグネシウム
０．３Ｍ
酢酸ナトリウム
１０Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨキナーゼ（実施
例１で調製したもの） 反応液ＩＩ組成
１０ｍＭ Ｇ−６−Ｐ
（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ
ＨＥＰＰＳ
１０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．１％
牛血清アルブミン
２．５ＩＵ／ｍｌ Ｇ−６−Ｐ
デヒドロゲナーゼ （ＮＡＤＰ＋ 依存性）
５ＩＵ／ｍｌ
ジアホラーゼ
３００ μＭ ２，６−ジク
ロロフェノールインドフェノール 【００４８】 【実施例３】 コール酸ナトリウムの定量微量の胆汁
酸を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成を持つ反応液
０．８ｍｌ に、各濃度（０〜１００ μＭ）のコール
酸ナトリウムを含有する試料液８０μｌ を添加し、３
５℃で２０分間反応させた。反応停止後、これに下記反
応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添加して混合
し、直ちにギルフォード社ステーサーＩＩＩ 型分光光
度計の恒温キュベット内に導き、３０℃で反応させて、
同時に６００ｎｍ における吸光度の変化を経時的に測
定し、発色反応後１ 分後の吸光度値と２ 分後の吸光
度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ）を測定値と
して得た。その結果、図６に示すように、コール酸ナト
リウム濃度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との間に、
良好な直線性が感度良く得られた。 【００４９】 反応液Ｉ組成 ６７ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５）
５ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．２Ｍ 酢酸ナトリウム
２ｍＭ
ＮＡＤ＋
０．３ＩＵ／ｍｌ ３α−ハイドロ
キシステロイドデヒドロ
ゲナ−
ゼ（オリエンタル酵母社製）
７Ｕ／ｍｌ
ＮＡＤＨ キナーゼ（実施例１で調製したもの）
反応液ＩＩ組成：実施例２ で用いた反応液ＩＩ組成
に同じ。 【００５０】 【実施例４】 コール酸ナトリウムの定量微量のコー
ル酸ナトリウムを定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成
を持つ反応液３００ μｌ に、各濃度（５０，１００
，１５０，２００，２５０ μＭ）に調製したコール酸
ナトリウム溶液を検体としてそれぞれ５０μｌ を添加
し、３０℃で５分間放置した後、下記ＮＫ液を３００μ
ｌ加え、３０℃で２０分間反応させた。 次に、下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液３．０ｍｌ を
添加して混合し、３０℃で反応させて、１ 分後から６
分後までの５５０ｎｍ における１ 分間当りの平均
吸光度変化量を求めた。 その結果、β−ＮＡＤ＋を用いた場合は図７に、Ｔｈｉ
ｏ−ＮＡＤ＋を用いた場合は図８に示すように、コール
酸ナトリウム濃度と平均吸光度変化量との間に、コール
酸ナトリウム濃度２００ μＭ まで、原点を通る良好
な直線性が感度良く得られた。 【００５１】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
リン酸二カリウム （ｐＨ８．５）
８ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．５Ｍ 酢酸ナトリウム
５ｍＭ
ＮＡＤ＋ （β− 体かＴｈｉｏ− 体）
０．０
３％ 牛血清アルブミン
１０ＩＵ／ｍｌ ３α−
ハイドロキシステロイドデヒドロゲナ
−
ゼ ＮＫ液組成 ７．７Ｕ／
ｍｌ ＮＡＤＨ キナーゼ（ 実施例１で調製し
たもの）
０．２Ｍ 硫酸アンモニウム 反応液
ＩＩ組成 ２０ｍＭ Ｇ−
６−Ｐ （ｐＨ８．０）
５０ｍＭ リン酸二カリウム
０．０３％
牛血清アルブミン
１．２ｍＭ ニトロテトラゾリ
ウムブル−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ
０．５％
トリトン Ｘ−１００
３ＩＵ／ｍｌ Ｇ
−６−Ｐデヒドロゲナーゼ：イースト由来
（Ｔｈｉｏ− 体の時６ＩＵ／ｍｌ）
３ＩＵ／
ｍｌ ジアホラ−ゼ：バチルス属由来
（Ｔｈｉｏ− 体の
時６ＩＵ／ｍｌ ジアホラ−ゼ：クロストリジウム
属由来）
【００５２】 【実施例５】 血清中の胆汁酸の定量血清中の胆汁酸
濃度を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成を持つ反応
液３００ μｌ に、検体として２４例の人血清と標準
液としての５０μＭ コール酸ナトリウム溶液を、それ
ぞれ２００μｌ添加し、３０℃で５分間放置した後、下
記ＮＫ液を３００ μｌ 加え、３０℃で２０分間反応
させた。次に、下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液３．０
ｍｌ を添加して混合し、３０℃で反応させて、２ 分
後から３ 分後までの５５０ｎｍ における１ 分間の
吸光度変化量を求めた。また、公知の方法である３ α
−ＨＳＤ− ホルマザン法についても同一検体について
測定を行なった。その結果、本法と３ α−ＨＳＤ−
ホルマザン法の感度の比較は、第４ 表のようになり、
相関係数０．９９５ から相関性が高く、また、標準液
における吸光度変化量から求めた胆汁酸濃度は、図９の
ようになった。 これより本法は、従来法である３ α−ＨＳＤ− ホル
マザン法とよく相関し、胆汁酸を正確に、そして３ α
−ＨＳＤ− ホルマザン法よりも高感度に測定できるこ
とがわかった。 【００５３】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
リン酸二カリウム （ｐＨ８．５）
１２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．７５Ｍ 酢酸ナトリウ
ム ７．
５ｍＭ β−ＮＡＤ＋
０．０３％ 牛血清
アルブミン
６０ｍＭ オキサミン酸カリウ
ム １５
ＩＵ／ｍｌ ３α−ハイドロキシステロイドデヒド
ロゲナ
−ゼ ＮＫ液組成
１３．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨ キナー
ゼ（実施例１で調製したもの）
０．２Ｍ 硫酸ア
ンモニウム 反応液ＩＩ組成 ２０ｍ
Ｍ Ｇ−６−Ｐ （ｐＨ８．０）
５０ｍＭ リン酸二カ
リウム
０．０３％ 牛血清アルブミン
１．２ｍＭ
ニトロテトラゾリウムブル−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ
−２Ｎａ
０．５％ トリトン Ｘ−１００
３ＩＵ／ｍｌ
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ：イースト由来
３ＩＵ／ｍｌ ジアホラ−ゼ：バチルス属由来
４０ｍ
Ｍ オキサミン酸カリウム【００５４】 【表４】 【００５５】 【実施例６】 ３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ−ゼ
の定量微量の３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを定
量する目的で、下記反応液Ｉ組成を持つ反応液０．８ｍ
ｌに、各濃度（０〜６０ＩＵ／Ｌ） の３−ヒドロキシ
酪酸デヒドロゲナーゼを含有する試料液４００ μｌ
を添加し３５℃で１０分間反応させた。反応停止後、こ
れに下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添
加して混合し、直ちに分光光度計の恒温キュベット内に
導き、３０℃で反応させて、同時に６００ｎｍ におけ
る吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１分後の
吸光度値と２分後の吸光度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ
／ｍｉｎ）を測定値として得た。その結果、図１０に
示すように、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性
量と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との間に、良好な直
線性が感度良く得られた。 【００５６】 反応液Ｉ組成 １００ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５）
７．５ｍＭ ＡＴＰ
１５ｍＭ
塩化マグネシウム
０．３Ｍ 酢酸
ナトリウム
３ｍＭ β−ＮＡＤ＋
９０ｍＭ
３− ヒドロキシ酪酸
１０Ｕ／ｍｌ ＮＡ
ＤＨキナーゼ（実施例１で調製したもの） 反応液ＩＩ
組成：実施例２で用いた反応液ＩＩ組成に同じ。 【００５７】 【実施例７】 グリセリンの定量 微量のグリセリンを定量する目的で， 下記反応液Ｉ組
成を持つ反応液３００ μｌに、各濃度（１０，２０，
３０，４０，５０ μＭ）に調製したグリセリン溶液を
検体としてそれぞれ５０μｌを添加し、３０℃で５分間
放置した後、下記ＮＫ液を３００ μｌ 加え、３０℃
で２０分間反応させた。次に、下記反応ＩＩ組成を持つ
反応液３．０ｍｌ を添加して混合し、３０℃で反応さ
せて、１分後から６分後までの５５０ｎｍ における１
分間当りの平均吸光度変化量を求めた。その結果、図１
１に示すように、グリセリン濃度と平均吸光度変化量と
の間に、原点を通る良好な直線性が感度良く得られた。 【００５８】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（ｐＨ９．０） ８ｍＭ
ＡＴＰ
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
０．５Ｍ
酢酸ナトリウム
５ｍＭ β−ＮＡＤ＋
０．０
３％ 牛血清アルブミン
７ＩＵ／ｍｌ グリセ
リンデヒドロゲナ−ゼ ＮＫ液組成
７．７Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨキナーゼ（実施
例１で調製したもの）
０．２Ｍ 硫酸アンモ
ニウム 反応液ＩＩ組成 ２０ｍＭ
Ｇ−６−Ｐ （ｐＨ８．０）
５０ｍＭ リン酸二カ
リウム
０．０３％ 牛血清アルブミン
１．２ｍＭ
ニトロテトラゾリウムブル−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ−
２Ｎａ
０．５％ トリトンＸ−１００
３ＩＵ／ｍｌ
Ｇ−６−Ｐ デヒドロゲナ−ゼ：イ−スト由来
３
ＩＵ／ｍｌ ジアホラ−ゼ：バチルス属由来【０
０５９】 【実施例８】 アルコールデヒドロゲナーゼの定量微
量のアルコールデヒドロゲナーゼを定量する目的で，
下記反応液Ｉ組成を持つ反応液３００ μｌ に各酵素
量（１，２，３，４，５ＩＵ／Ｌ） に調製したアルコ
ールデヒドロゲナーゼ溶液を検体としてそれぞれ５０μ
ｌ を添加し、３０℃で１０分間放置した後、下記ＮＫ
液を３００ μｌ 加え、３０℃で２０分間反応させた
。次に下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液３．０ｍｌ を
添加して混合し、３０℃で反応させて、１ 分後から６
分後までの５５０ｎｍ における１ 分間当りの平均
吸光度変化量を求めた。その結果、図１２に示すように
、アルコールデヒドロゲナーゼ活性量と平均吸光度変化
量との間に、原点を通る良好な直線性が感度良く得られ
た。 【００６０】 反応液Ｉ組成 ６５ｍＭ
グリシルグリシン （ｐＨ９．０）
８ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ
塩化マグネシウム
０．５Ｍ 酢酸ナトリウ
ム
０．４ｍＭ Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋
０．０３％
牛血清アルブミン
５０ｍＭ ｎ−アミルアルコー
ル ＮＫ液組成 ７．７Ｕ／
ｍｌ ＮＡＤＨキナーゼ（実施例１で調製したもの
）
０．２Ｍ 硫酸アンモニウム 反応液Ｉ
Ｉ組成 ２０ｍＭ Ｇ−６−
Ｐ （ｐＨ８．０） ５
０ｍＭ リン酸二カリウム
０．０３％ 牛
血清アルブミン
１．２ｍＭ ニトロテトラゾリウムブ
ル− ０
．１Ｍ ＥＤＴＡ−２Ｎａ
０．５％
トリトン Ｘ−１００
６ＩＵ／ｍｌ Ｇ−６−Ｐ
デヒドロゲナ−ゼ：イ−スト由来
６ＩＵ／ｍｌ ジアホ
ラ−ゼ：クロストリジウム属由来【００６１】 【実施例９】 ＡＴＰ の定量 微量のＡＴＰ を定量する目的で， 下記反応液Ｉ組成
を持つ反応液０．８ｍｌ に、各濃度（０〜５０μＭ）
のＡＴＰ を含有する試料液４００ μｌ を添加し、
３５℃で２０分間反応させた。反応停止後、これに下記
反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ を添加して混
合し、直ちに分光光度計の恒温キュベット内に導き、３
０℃で反応させて、同時に６００ｎｍ における吸光度
の変化を経時的に測定し、発色反応後１分後の吸光度値
と２分後の吸光度値との差（△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉ
ｎ）を測定値として得た。その結果、図１３に示すよう
に、ＡＴＰ 濃度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との
間に、良好な直線性が感度良く得られた。 反応液Ｉ組成 １００ｍＭ
ＨＥＰＰＳ （ｐＨ８．５）
３ｍＭ ＮＡＤＨ
１５ｍＭ
塩化マグネシウム
０．３Ｍ 酢酸ナトリウム
１０Ｕ／ｍｌ
ＮＡＤＨキナーゼ（実施例１で調製したもの）
反応液ＩＩ組成：実施例２で用いた反応液ＩＩ組成に
同じ。 【００６２】 【発明の効果】本発明の定量法は、ＮＡＤ＋ とＮＡＤ
Ｈが混在する系において、ＮＡＤ＋ の影響を受けるこ
となく微量のＮＡＤＨを高感度に定量し得る新規なもの
である。さらに、ＮＡＤ＋ やＡＴＰ を基質とする種
々の酵素反応系に関与する酵素活性、ＮＡＤ＋ 、ＡＤ
Ｐ 、またはこれらとともに反応する基質の、いずれか
の測定をも良好に成し得るものである。ひいては、疾病
等の診断において、病態のマーカーとなる物質を正確に
感度よく短時間に定量することを可能とし、自動分析に
も適用できるため正しい診断を与えることができ、臨床
・医療等の分野で、産業上極めて有意義である。
【図１】本酵素の至適ｐＨ（●ー●はリン酸緩衝液；○
ー○はトリス塩酸緩衝液；▲ー▲は、グリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液） を示す図
ー○はトリス塩酸緩衝液；▲ー▲は、グリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液） を示す図
【図２】本酵素の安定ｐＨ範囲（ ●ー●はリン酸緩衝
液；○ー○はトリス塩酸緩衝液；▲ー▲は、グリシン水
酸化ナトリウム緩衝液） を示す図
液；○ー○はトリス塩酸緩衝液；▲ー▲は、グリシン水
酸化ナトリウム緩衝液） を示す図
【図３】本酵素の作用適温の範囲を示す図
【図４】本酵
素の熱安定性を示す図
素の熱安定性を示す図
【図５】実施例２ における検量線を、ＮＡＤＨ濃度と
△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
【図
６】実施例３ における検量線を、コール酸ナトリウム
濃度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した
図
６】実施例３ における検量線を、コール酸ナトリウム
濃度と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した
図
【図７】実施例４における、β−ＮＡＤ＋を用いた場
合の検量線を、コール酸ナトリウム濃度と△ＯＤ５５０
ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
合の検量線を、コール酸ナトリウム濃度と△ＯＤ５５０
ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
【図８】実施例４における、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋を用い
た場合の検量線を， コール酸ナトリウム濃度と△ＯＤ
５５０ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
た場合の検量線を， コール酸ナトリウム濃度と△ＯＤ
５５０ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
【図９】実施例５における、本法と３α−ＨＳＤ−ホル
マザン法との、測定値の相関を示した図
マザン法との、測定値の相関を示した図
【図１０】実施例６における検量線を、３−ヒドロキシ
酪酸デヒドロゲナーゼ活性量と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍ
ｉｎ との関係で示した図
酪酸デヒドロゲナーゼ活性量と△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍ
ｉｎ との関係で示した図
【図１１】実施例７における検量線を、グリセリン濃度
と△ＯＤ５５０ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
と△ＯＤ５５０ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図
【
図１２】実施例８における検量線を、アルコールデヒド
ロゲナーゼ活性量と△ＯＤ５５０ｎｍ ／ｍｉｎ との
関係で示した図
図１２】実施例８における検量線を、アルコールデヒド
ロゲナーゼ活性量と△ＯＤ５５０ｎｍ ／ｍｉｎ との
関係で示した図
【図１３】実施例９における検量線をＡＴＰ 濃度と、
△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図出願
人 （財） 野田産業科学研究所同
国際試薬株式会社代理人 弁理士 平木祐
輔同 弁理士 石井 貞次同
弁理士 早川 康
△ＯＤ６００ｎｍ ／ｍｉｎ との関係で示した図出願
人 （財） 野田産業科学研究所同
国際試薬株式会社代理人 弁理士 平木祐
輔同 弁理士 石井 貞次同
弁理士 早川 康
Claims (4)
- 【請求項１】 ＮＡＤ ＋及びＮＡＤＨが混在する溶液
に、二価の金属イオン及びＸＴＰ［式中、Ｘ はＡ（ア
デノシン）、Ｕ（ウリジン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（
シチジン）、Ｉ（イノシン）、ｄＴ（チミジン）、ｄＡ
（デオキシアデノシン）、ｄＵ（デオキシウリジン）、
ｄＧ（デオキシグアノシン）、ｄＣ（デオキシシチジン
）、ｄＩ（デオキシイノシン）を示す］の存在下に、Ｎ
ＡＤＨに特異性の高いＮＡＤＨキナーゼを作用させてＸ
ＤＰ（式中、Ｘ は前記と同じ） 及びＮＡＤＰＨ を
生成させ、次いでＮＡＤＰＨ を、これをＮＡＤＰ＋
に酸化する触媒反応及びＮＡＤＰ＋ をＮＡＤＰＨ に
還元する触媒反応を用いてサイクリング反応させ、該サ
イクリング反応により消費される基質または生成する生
成物の変化量を検出することにより ＮＡＤ＋ 及びＮ
ＡＤＨが混在する溶液中のＮＡＤＨのみを定量すること
を特徴とするＮＡＤＨの高感度定量法。 - 【請求項２】 ＮＡＤ＋ が、β−ＮＡＤ＋、Ｔｈｉ
ｏ−ＮＡＤ＋、またはα−ＮＡＤ＋であり、ＮＡＤＨが
、β−ＮＡＤＨ 、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＨ 、またはα−
ＮＡＤＨ である請求項１記載のＮＡＤＨの高感度定量
法。 - 【請求項３】 ＸＴＰ〔式中、Ｘ はＡ（アデノシン）
、Ｕ（ウリジン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）
、Ｉ（イノシン）、ｄＴ（チミジン）、ｄＡ（デオキシ
アデノシン）、ｄＵ（デオキシウリジン）、ｄＧ（デオ
キシグアノシン）、ｄＣ（デオキシシチジン）、ｄＩ（
デオキシイノシン）を示す〕を含む溶液に、二価の金属
イオン及びＮＡＤＨの存在下に、ＮＡＤＨに特異性の高
いＮＡＤＨキナーゼを作用させてＸＤＰ（式中、Ｘ は
前記と同じ） 及びＮＡＤＰＨ を生成させ、次いでＮ
ＡＤＰＨ を、これをＮＡＤＰ＋ に酸化する触媒反応
及びＮＡＤＰ＋ をＮＡＤＰＨ に還元する触媒反応を
用いてサイクリング反応させ、該サイクリング反応によ
り消費される基質または生成する生成物の変化量を検出
することによりＸＴＰを定量することを特徴とするＸＴ
Ｐ の高感度定量法。 - 【請求項４】 ＮＡＤ＋ が、β−ＮＡＤ＋、Ｔｈｉ
ｏ−ＮＡＤ＋、またはα−ＮＡＤ＋であり、ＮＡＤＨが
、β−ＮＡＤＨ 、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＨ 、またはα−
ＮＡＤＨ である請求項３記載のＸＴＰ の高感度定量
法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP3007999A JP2818696B2 (ja) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 |
| US07/823,113 US5250416A (en) | 1991-01-25 | 1992-01-21 | Method for highly sensitive determination of NADH using kinase |
| DE69206001T DE69206001T2 (de) | 1991-01-25 | 1992-01-24 | Verfahren zur hochsensitiven Bestimmung von NADH mit NADH Kinase. |
| EP92101139A EP0496412B1 (en) | 1991-01-25 | 1992-01-24 | Method for highly sensitive determination of NADH using NADH kinase |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3007999A JP2818696B2 (ja) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 |
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|---|---|
| JPH04252200A true JPH04252200A (ja) | 1992-09-08 |
| JP2818696B2 JP2818696B2 (ja) | 1998-10-30 |
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| JP (1) | JP2818696B2 (ja) |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 1991-01-25 JP JP3007999A patent/JP2818696B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-01-21 US US07/823,113 patent/US5250416A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-01-24 DE DE69206001T patent/DE69206001T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-01-24 EP EP92101139A patent/EP0496412B1/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009225784A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-10-08 | Asahi Kasei Pharma Kk | ピロリン酸の測定方法 |
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|---|---|
| EP0496412A3 (en) | 1992-12-09 |
| US5250416A (en) | 1993-10-05 |
| EP0496412A2 (en) | 1992-07-29 |
| JP2818696B2 (ja) | 1998-10-30 |
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