JPH07124000A

JPH07124000A - 生体成分の測定方法

Info

Publication number: JPH07124000A
Application number: JP27715793A
Authority: JP
Inventors: Shigeki Kimura; 茂樹木村; Kuniyoshi Matsunaga; 國義松永; Motoo Arai; 基夫荒井; Koji Kishi; 浩司岸; Yasushi Shirahase; 泰史白波瀬; Yoshifumi Totsu; 吉史渡津
Original assignee: International Reagents Corp; Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc; Sysmex International Reagents Co Ltd
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1993-11-05
Publication date: 1995-05-16
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: JP3566976B2

Abstract

(57)【要約】【構成】（１）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用い
て主反応で生成されたＮＡＤ（Ｐ）を消費し、主反応を
促進させること；（２）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いてＮＡＤ
（Ｐ）を消費することによって、生体成分中に含まれる
内因性物質の影響を消去すること；（３）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ、およびその抗体
またはその阻害剤の一種または二種以上を用いて、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）サイクリングを行うこと；をそれぞれの特徴と
するＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関
与する酸化還元反応を含み、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダ
ーゼを作用させることによる生体成分の各測定方法。【効果】本発明の各測定方法によれば、ＮＡＤ（Ｐ）
を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反
応を含む生体成分の各種の測定方法を改良でき、高精度
で迅速な測定が実施できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査の分野で利用
される生体成分の新規な測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、臨床検査分野において、血
清、血漿、尿などの生体中の成分（酵素、基質など）を
測定するための反応系に、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする
デヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応が多く利用さ
れている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは３４０ｎｍに吸収極大をも
つので、ＮＡＤ（Ｐ）（酸化型補酵素）を生成する反応
においてはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）の減少が、
反対に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）を生成する反
応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）の増加
が３４０ｎｍの吸収度変化により測定される。しかし、
デヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応は、ほとんど
が可逆反応であるため、例えばＮＡＤ（Ｐ）を生成する
反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）が増加するに従って逆反
応が大きくなり反応性が低下する、つまり、測定範囲が
狭くなり、反応直線性が伸びなくなるという問題があ
る。同様に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを増加させる方法も、ＮＡ
ＤＰ（Ｈ）が増加するに従って逆反応が大きくなり反応
性が低下する。また、生体成分中には、本来目的とする
物質の測定に影響を及ぼす干渉物質、いわゆる内因性物
質が存在する場合がある。このような場合、この内因性
物質も測定すべき物質と同時に測定されることから、測
定精度に悪い影響を与えるという問題がある。一方、微
量の基質や酵素活性を増幅定量する方法として、「酵素
的サイクリング」が知られている。一般には、基質また
は酵素活性から生成した基質の「基質サイクリング」と
して測定される。ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロ
ゲナーゼが関与する酸化還元反応を繰り返す「ＮＡＤ
（Ｐ）サイクリング」もこの酵素的サイクリングの一例
である。「酵素的サイクリング」は、目的の基質や酵素
が微量であっても、これらが増幅されることにより高感
度に測定できるので微量定量法としては有用であるが、
「ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング」の場合は、酸化型〔ＮＡ
Ｄ（Ｐ）〕または、還元型〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ〕のいずれ
か一方だけを測定する必要がある。従って、ＮＡＤ
（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存するため測定不能とな
る。これを解決するためにＨＰＬＣを用いて両者を分別
したり、熱処理してどちらか一方を分解する方法がある
が、操作が複雑になる。また、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ法は酸
化性基質と還元性基質の両方を測定するが、胆汁酸にお
いては基質によりサイクリング率が異なるため、物質の
定量として問題がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関
与する酸化還元反応を含む測定方法における上記の問題
点を改良し、高精度で迅速な生体成分の測定方法を提供
することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らが鋭意研究し
た結果、下記の本発明により上記目的が達成されること
を見出した。即ち、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素と
するデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含み、
ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させることによる
生体成分の新規な各測定方法であり、その態様としては
次の通りである。（１）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて主反応で
生成されたＮＡＤ（Ｐ）を消費し、主反応を促進させる
ことを特徴とする生体成分の測定方法（測定方法１）、
（２）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いてＮＡＤ
（Ｐ）を消費することによって、生体成分中に含まれる
内因性物質の影響を消去することを特徴とする生体成分
の測定方法（測定方法２）、（３）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレ
オシダーゼ、およびその抗体またはその阻害剤の一種ま
たは二種以上を用いて、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行
うことを特徴とする生体成分の測定方法（測定方法
３）。

【０００５】本発明において測定される生体成分とは、
血液、血漿、尿、髄液、血球、唾液、涙液等中の酵素、
基質である。

【０００６】本発明に使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオ
シダーゼは、動物組織由来、微生物由来のいずれも用い
ることができる。市販品として、Streptomyces sp., St
reptococcus sp. 由来のものを用いてもよい。

【０００７】本発明にいう主反応とは、デヒドロゲナー
ゼ、またはレダクターゼ、オキシゲンナーゼ等、補酵素
としてＮＡＤ（Ｐ）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする
酸化還元反応をいう。

【０００８】以下、本発明の各測定方法を具体的に説明
する。（１）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて主反応で
生成されたＮＡＤ（Ｐ）を消費し、主反応を促進させる
ことを特徴とする生体成分の測定方法（測定方法１）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナー
ゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）を生成
する反応に用いることができる。具体的には、主反応で
生成したＮＡＤ（Ｐ）にＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ
を作用させて消費することにより、この主反応が不可逆
反応となり、反応が促進される。測定は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの消費量を３４０ｎｍの吸光度の減少として求める。
ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）に反応
しても生成されるものは３４０ｎｍに吸収がないため、
主反応の測定に影響を与えない。

【０００９】本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオ
シダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／
ｍｌ、好ましくは５〜５０単位／ｍｌあればよい。

【００１０】本方法の測定対象となる酵素としては、乳
酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グルタミン酸−オキサ
ロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸−
ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ヒドロキシ
酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
（ＭＤＨ）、コリンエステラーゼ、クレアチンホスホキ
ナーゼ（ＣＰＫ）、ロイシンアミノペプチダーゼ等が挙
げられる。

【００１１】また、本方法の測定対象となる基質として
は、尿素窒素（ＵＮ）、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離
型（非結合型）脂肪酸（ＮＥＦＡ）、クレアチン（ＣＲ
Ｎ）、シアル酸等が挙げられる。

【００１２】尚、ＵＮはＧｌＤＨを、ＧＯＴはＭＤＨ
を、ＧＰＴはＬＤＨを、ＴＧはＬＤＨをそれぞれ共役反
応させて測定する。

【００１３】（２）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用
いてＮＡＤ（Ｐ）を消費することによって、生体成分中
に含まれる内因性物質の影響を消去することを特徴とす
る生体成分の測定方法（測定方法２）：本方法は、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸
化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応に用
いることができる。本方法においては、まず、内因性物
質に起因する物質に、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに
変換するデヒドロゲナーゼを反応させる。その後、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを加えてＮＡＤ（Ｐ）に反応
させ、これを消費し、かくしてＮＡＤ（Ｐ）を補酵素と
するデヒドロゲナーゼの反応を停止させる。このあと、
本来測定すべき目的物質の測定をするが、そのときはＮ
ＡＤ（Ｐ）の関与しない反応系に導いて測定する。それ
には、例えば、オキシダーゼによりＨ₂Ｏ₂を生成する
反応や、ＮＡＤ（Ｐ）の代わりにＴｈｉｏ−ＮＡＤ
（Ｐ）を基質とする反応などがある。これらの反応では
ＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼにより消
費させられるため、デヒドロゲナーゼによりＮＡＤ
（Ｐ）Ｈが生成されることはない。

【００１４】本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオ
シダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／
ｍｌ、好ましくは１〜５０単位／ｍｌあれば良い。

【００１５】本方法の測定対象となる酵素としては、代
表的にはアミラーゼ（ＡＭＹ）が挙げられる。

【００１６】また、本方法の測定対象となる基質として
は、代表的にはトリグリセリド（ＴＧ）が挙げられる。

【００１７】本方法を使用する例として、アミラーゼ
（ＡＭＹ）の測定を挙げる。まず試料中の内因性物質で
あるグルコースにヘキソキナーゼ（ＨＫ）を作用させて
グルコース−６−リン酸とし、さらにグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）を作用させ
て６−ホスホグルコン酸とする。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌ
クレオシダーゼを反応させると、ＮＡＤが消費され、Ｇ
−６−ＰＤＨの反応は進行しないようになる。この状態
で、ＡＭＹを測定するべく、ＡＭＹの酵素活性により生
成したグルコースにグルコースオキシダーゼを加えてＨ
₂Ｏ₂を生成するか、またはＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）を
加えてＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成を測定する（下
式参照）。

【００１８】

【化１】

【００１９】また他の例として、トリグリセリド（Ｔ
Ｇ）の測定においては、まず試料中の内因性物質である
グリセロールにグリセロールキナーゼ（ＧＫ）を作用さ
せてグリセロール３−リン酸とし、それと同時にＡＴＰ
からＡＤＰを生成する。ホスホエールピルビン酸を基質
としてピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を作用させ、そのＡ
ＤＰを消費し、ピルビン酸を生成し、ピルビン酸脱水素
酵素（ＰＤＨ）を用いてグリセロールを消去する。次
に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させると、Ｎ
ＡＤが消費され、ＰＤＨの反応は進行しないようにな
る。この状態で、ＴＧを測定するべく、Ｔｈｉｏ−ＮＡ
Ｄを加えてＴｈｉｏ−ＮＡＤＨの生成を測定する（下式
参照）。

【００２０】

【化２】

【００２１】（３）ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ、お
よびその抗体とその阻害剤の一種または二種以上を用い
て、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行うことを特徴とする
生体成分の測定方法（測定方法３）：本方法は、ＮＡＤ
（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化
還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応に用い
ることができる。本方法においては、まず、測定対象物
質に、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するデヒド
ロゲナーゼを反応させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオ
シダーゼを作用させて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費
する。このあと生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、サイクリン
グ反応をさせるが、ここでＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダー
ゼに対する抗体またはその阻害物質を加えることによ
り、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを不活性化し、サイ
クリング反応におけるＮＡＤ（Ｐ）には反応しないよう
にする。一方、サイクリング反応においては、上記で生
成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、第一のデヒドロゲナーゼの作
用を受けてＮＡＤ（Ｐ）となり、続いて第二のデヒドロ
ゲナーゼの作用を受けてもとのＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換さ
れる反応が数回繰り返される（ＮＡＤ（Ｐ）サイクリン
グ）。このサイクリング反応をｎ回繰り返すと、もとの
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをｎ倍に増幅し測定可能となる。

【００２２】本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオ
シダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／
ｍｌ、好ましくは１〜５０単位／ｍｌあれば良い。

【００２３】本方法の測定対象となる酵素としては、具
体的には、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＡＭＹ、ＣＰＫ等
が挙げられる。

【００２４】また、本方法の測定対象となる基質として
は、３α−ヒドロキシステロイド、ｍｙｏ−イノシトー
ル、Ｌ−リンゴ酸、α−アミノ酸、グルコース、Ｄ−ガ
ラクトース−６−リン酸、Ｄ−グリセロアルデヒド−３
−リン酸、乳酸、ピルビン酸、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−
マンニトール、グリセロール、カルニチン、コレステロ
ール等が挙げられる。

【００２５】ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤に
は、ニコチンアミド、アデノシンジホスフェートリボー
ス、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフ
ェートリボース等が挙げられる。抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレ
オシダーゼ抗体は、ＡＳＯ陽性血漿、血清から、または
マウス、ウサギ、ヤギなどにＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダ
ーゼを感作させて得ることができる。

【００２６】本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオ
シダーゼ阻害剤、抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体
の使用量は、使用するＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに
対し、瞬時、あるいは１〜１０分以内に、ＮＡＤ（Ｐ）
ヌクレオシダーゼが完全に反応を停止する量を使用すれ
ばよい。ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤、抗ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体は単独で、または２種以
上を組み合わせて用いてもよい。

【００２７】本方法を使用する例として、３α−ヒドロ
キシステロイドの測定を挙げることができる。まず試料
にＮＡＤを補酵素として３α−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）を作用させる。次
に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させ、残存し
ているＮＡＤを消費し、続いてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシ
ダーゼに対する抗体または阻害物質を加えてＮＡＤ
（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用を停止させる。引き続い
て、生成したＮＡＤＨを、ニトロテトラブルーを基質と
し、第一のデヒドロゲナーゼとしてダイアフォラーゼを
作用させてＮＡＤとし、またグルコース−６−リン酸を
基質とし、第二のデヒドロゲナーゼとしてグルコース−
６─リン酸デヒドロゲナーゼを作用させてＮＡＤＨにも
どすサイクリング反応を数回行う（下式参照）。

【００２８】

【化３】

【００２９】また他の例として、グルコースの測定にお
いては、まず試料にＮＡＤＰを補酵素としてグルコース
デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を作用させる。次に、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させ、残存しているＮ
ＡＤＰを消費し、続いてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ
に対する抗体または阻害物質を加えてＮＡＤ（Ｐ）ヌク
レオシダーゼの作用を停止させる。引き続いて、生成し
たＮＡＤＰＨを、α−ケトグルタル酸を基質とし、第一
のデヒドロゲナーゼとしてグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＧｌＤＨ）を作用させてＮＡＤＰとし、またグルコ
ース−６−リン酸を基質とし、第二のデヒドロゲナーゼ
としてグルコース−６─リン酸デヒドロゲナーゼを作用
させてＮＡＤＰＨにもどすサイクリング反応を数回行う
（下式参照）。

【００３０】

【化４】

【００３１】

【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実施例を
挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定され
るものではない。

【００３２】実施例１以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。・試薬１（ｐＨ７．８）トリスヒドロキシメチルアミノメタン 80 mmol/l β−ＮＡＤＨ 0.23 mmol/l

【００３３】・試薬２（ｐＨ７．８）リン酸一カリウム 50 mmol/l ピルビン酸ナトリウム 7.4 mmol/l ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ (Streptomyces属由来) 24 U/l

【００３４】・試薬３（ｐＨ７．８）リン酸一カリウム 50 mmol/l ピルビン酸ナトリウム 7.4 mmol/l

【００３５】これらの試薬を、乳酸デヒドロゲナーゼ
（ＬＤＨ）酵素測定用試薬として、以下の測定に供し
た。まず、試料７μｌと試薬１を３２０μｌ混和し、５
分間３７℃に恒温後、試薬２または試薬３を８０μｌ加
え、攪拌後、３７℃で３４０ｎｍにおける１分間当たり
の吸光度変化量（１〜３分後）を求めた。盲検として、
試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行っ
た。試料にはブタ心筋由来の高値の乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）を１０段階希釈したものを使用した。その
結果を図１、２に示す。本方法（試薬１＋試薬２によ
る）は従来法（試薬１＋試薬３による）に比べ、測定範
囲が広がり、反応直線性が向上した。

【００３６】実施例２以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。・試薬４（ｐＨ８．５）トリエタノールアミン 100 mmol/l β−ＮＡＤＰＨ 0.33 mmol/l グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（酵母由来） 23 U/ml α−ケトグルタル酸 15 mmol/l 界面活性剤 0.2 % ウシ血清アルブミン 0.75 %

【００３７】・試薬５（ｐＨ７．５）リン酸一カリウム 50 mmol/l ウレアーゼ（細菌由来） 1.0 U/ml ウシ血清アルブミン 0.75 % ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ (Streptomyces属由来) 4.0 U/ml

【００３８】・試薬６（ｐＨ７．５）リン酸一カリウム 50 mmol/l ウレアーゼ（細菌由来） 1.0 U/ml ウシ血清アルブミン 0.75 %

【００３９】これらの試薬を、血清尿素窒素（ＵＮ）測
定用試薬とし、以下の測定に供した。まず、試料６μｌ
と試薬４を２５０μｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、
試薬５または試薬６を１００μｌを添加し、３７℃で３
４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（２〜４
分後）を求めた。盲検として、試料の代わりに生理的食
塩水を用いて同様の操作を行った。試料には尿素窒素と
して約５００ｍｇ／ｄｌとなるように調製したものを１
０段階希釈したものを使用した。その結果を図３に示
す。本方法（試料４＋試料５による）は従来法（試料４
＋試料６による）に比べ、測定範囲が広がり、反応直線
性が向上した。

【００４０】実施例３以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。・試薬７（ｐＨ７．０）ＨＥＰＥＳ 0.1 mol/l ＮａＣｌ 60 mmol/l ＭｇＣｌ₂ 5 mmol/l ＣａＣｌ₂ 1 mmol/l ＡＴＰ 5 mmol/l β−ＮＡＤ 3 mmol/l ウシ血清アルブミン 0.1 % α−グルコシダーゼ（酵母由来) 125 U/ml ヘキソキナーゼ（ＨＫ）（酵母由来） 5 U/ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ (G6PDH) 10 U/ml

【００４１】・試薬８（ｐＨ７．０）ＨＥＰＥＳ 0.1 mol/l ＮａＣｌ 60 mmol/l ＭｇＣｌ₂ 5 mmol/l ＣａＣｌ₂ 1 mmol/l Ｇ５ 30 mmol/l Thio−ＮＡＤ 5 mmol/l ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ (Streptomyces属由来) 0.25 U/ml

【００４２】・ＡＭＹ試薬・Ａ（国際試薬（株）製／従
来品）

【００４３】これらの試薬を、アミラーゼ測定用試薬と
して、以下の測定に供した。まず、試料７μｌと試薬７
を２８０μｌを混和し、５分間３７℃に恒温する。次
に、試薬８を７０μｌ添加し、３７℃で４０５ｎｍにお
ける１分間当たりの吸光度変化量（３〜５分後）を求め
た。ＡＭＹ試薬・Ａ（国際試薬（株）製）を用いたＧ₇
ＰＮＰ法による測定は、使用説明書に従い、検体８μｌ
と第一試薬３２０μｌを混和し、３７℃で５分間恒温
し、次に第二試薬を８０μｌ添加し、３７℃で４０５ｎ
ｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（３〜４分後）
を求めた。試料として、患者血清検１４例及びプール血
清に最大２ｇ／ｄｌのグルコースを添加し、消去効果を
確認した。従来法のＧ₇ＰＮＰ法との血清検体における
相関性は、相関係数０．９９９、回帰式１．０１６ｘ−
３．１となり、良好な結果を得た（図４）。また、本法
によれば、アミラーゼ測定値へのグルコースの干渉も２
ｇ／ｄｌまでないことが確認できた（図５）。

【００４４】実施例４以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。・試薬９（ｐＨ８．０）リン酸二カリウム 50 mmol/l β−ＮＡＤ 6 mmol/l ウシ血清アルブミン 0.03 % オキサミン酸カリウム 75 mmol/l ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ 20 U/ml

【００４５】・試薬１０（ｐＨ７．０）ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ (Streptomyces属由来) 10 U/ml リン酸一カリウム 25 mmol/l ウシ血清アルブミン 0.03 %

【００４６】・試薬１１（ｐＨ７．０）抗ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ抗体 1000 トッド単位リン酸一カリウム 25 mmol/l ウシ血清アルブミン 0.1 %

【００４７】・試薬１２（ｐＨ８．０）グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ） 20 mmol/l リン酸二カリウム 50 mmol/l ウシ血清アルブミン 0.03 % ニトロテトラゾリウムブルー 1.2 mmol/l トリトンＸ−１００ 0.5 % グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 6 U/l ダイアフォラーゼ 6 U/l オキサミン酸カリウム 40 mmol/l

【００４８】・胆汁酸・Ｅ「コクサイ」（国際試薬
（株）製／従来品）

【００４９】これらの試薬を、血清中総胆汁酸濃度測定
用試薬として、以下の測定に供した。尚、試薬１１中の
抗ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ抗体は、ＡＳＬＯ陽性血漿の高力
価のものをゲル濾過して精製したものを用いた。まず、
試料１００μｌと試薬９を１．０ｍｌ混和し、５分間３
７℃に恒温後、試薬１０を５００μｌ加え、５分間３７
℃で反応させ、さらに試薬１１を５００μｌ加え、５分
間３７℃で反応させる。最後に試薬１２を１．０ｍｌ加
え、３７℃で５５０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度
変化量（１〜３分後）を求めた。胆汁酸・Ｅ「コクサ
イ」（国際試薬（株）製）は、使用説明書に従い、検体
２０μｌに第一試薬３２０μｌを添加し、３７℃で５分
間恒温し、次に第二試薬を８０μｌ添加後、５分後の吸
光度を５４６ｎｍで測定した。また、検体ブランクとし
て第一試薬から３α−ＨＳＤを抜いたブランク試薬を同
様に操作し、この測定値を差し引いて、胆汁酸濃度を求
めた。試料には血清２０例、標準液（コール酸ナトリウ
ム５０μｍｏｌ／ｌ）を１００μｍｏｌ／ｌを最高に
１０段階希釈したものを使用した。盲検として、試料の
代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。そ
の結果を図６に示す。本方法（試料９〜１２による）に
よれば、約８０μｌｍｏｌ／ｌまで直線性が確認され
た。一方、従来法（3 α−ＨＳＤ−ホルマザン法）との
相関係数は、ｒ＝０．９５３、回帰式ｙ＝０．９７４ｘ
−０．２８７となり、良好な相関性を示した。

【００５０】

【発明の効果】本発明の各測定方法によれば、ＮＡＤ
（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化
還元反応を含む生体成分の各種の測定方法を改良でき、
高精度で迅速な測定が実施できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定方法１と従来法による乳酸脱水素
酵素測定の検量線を示す。

【図２】本発明の測定方法１と従来法による乳酸脱水素
酵素測定時の経時変化を示す。

【図３】本発明の測定方法１と従来法による尿素窒素測
定の検量線を示す。

【図４】本発明の測定方法２と従来法によるアミラーゼ
測定における相関性を示す。

【図５】本発明の測定方法２での、アミラーゼ測定値へ
のグルコースの干渉を示す。

【図６】本発明の測定方法３による血清中総胆汁酸濃度
測定の検量線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者荒井基夫大阪府堺市鴨谷台３−２−20−204 (72)発明者岸浩司兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２国際試薬株式会社研究開発センター内 (72)発明者白波瀬泰史兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２国際試薬株式会社研究開発センター内 (72)発明者渡津吉史兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２国際試薬株式会社研究開発センター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲ
ナーゼが関与する酸化還元反応を含み、ＮＡＤ（Ｐ）ヌ
クレオシダーゼを作用させることを特徴とする生体成分
の測定方法。
【請求項２】ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて
主反応で生成されたＮＡＤ（Ｐ）を消費し、主反応を促
進させることを特徴とする請求項１記載の生体成分の測
定方法。
【請求項３】ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて
ＮＡＤ（Ｐ）を消費することによって、生体成分中に含
まれる内因性物質の影響を消去することを特徴とする請
求項１記載の生体成分の測定方法。
【請求項４】ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ、および
その抗体またはその阻害剤の一種または二種以上を用い
て、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行うことを特徴とする
請求項１の生体成分の測定方法。