JPH04335898A

JPH04335898A - Ｄ−グルコース−６−リン酸の高感度定量法および定量用組成物

Info

Publication number: JPH04335898A
Application number: JP13832491A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Ueda; 成植田; Mamoru Takahashi; 守高橋; Hideo Misaki; 美崎　英生; Shigeyuki Imamura; 茂行今村
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1991-05-14
Publication date: 1992-11-24
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: EP0639646A4; EP0639646B1; DE69129375D1; DE69129375T2; JP3036708B2; WO1992020817A1; EP0639646A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、臨床生化学検査、食品
検査等におけるグルコース−６−リン酸の酵素サイクリ
ング反応を用いた新規な高感度定量法および定量用組成
物に関する。【０００２】【従来の技術】近年、臨床検査分野において、成分分析
には化学法に代わり、より特異性の高い酵素法が普及し
つつある。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ　　１．１．１．４９）は、酵素的分析に広く用い
られている酵素のひとつであり、下記の反応を触媒する
。Ｄ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）＋　＝Ｄ−
グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
＋Ｈ＋　【０００３】本酵素は、ＡＴＰ、グルコースなどの定量
や、クレアチンキナーゼなどの酵素活性測定時の共役酵
素として他の酵素と組み合わせて用いられている。例え
ば、グルコースを定量する際には、ヘキソキナーゼ（Ｅ
Ｃ　　２．７．１．１）の作用でＡＴＰの存在下にＤ−
グルコース−６−リン酸に変換し、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ反応に導いて測定を行っている。この場合、反応によって生成した還元型ＮＡＤ（Ｐ）の
量を、一般的には３４０ｎｍにおける吸収を分光学的に
測定するのであるが、他に、ジアホラーゼ、ニトロブル
ーテトラゾリウムを用いてホルマザン色素として測定す
る方法もある。しかし、この色素は不溶性であり、自動
分析器には適さない。更に、ＮＡＤＰの代わりにチオＮ
ＡＤＰを用いる方法も報告されており（臨床検査（臨時
増刊）、Ｖｏｌ．２２、ｐ１２３２、１９７８）、これ
により感度が役２杯になっている。【０００４】上記以外にも、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼは、α−アミラーゼ（ＥＣ　　３．２．
１．１）、ホスホグルコムターゼ、ホスホヘキソースイ
ソメラーゼ（ＥＣ　　５．３．１．９）の活性測定や、
Ｄ−ソルビトール、Ｄ−フルクトースの定量等に用いら
れており、臨床検査分野においては、応用範囲の広い酵
素である。【０００５】このうち、無機リンは、シユークロースホ
スホリラーゼとホスホグルコムターゼの酵素反応系によ
ってＤ−グルコース−６−リン酸に転換され測定されて
いる（臨床検査　　機器　　試薬、Ｖｏｌ．１３、ｐ１
１３７−１１４３、１９９０）。また、Ｄ−フルクトー
スの測定は、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼを用いてＤ−グルコース−６−リン酸に変換した
のち測定されているが、ヘキソキナーゼはＤ−グルコー
スにも作用するため、Ｄ−フルクトースに特異的なフル
クトキナーゼを用いた測定法についての報告もある（Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４、２０５、１９７３）
。血清中のＤ−フルクトースは、正常値が約４０μｍｏ
ｌ／ｌ　と少量であり、糖尿病で上昇するとの報告もあ
り（日本臨床、４７、ｐ４６８、１９８９、増刊号）、
高感度可が望まれている。【０００６】一般に、酵素を用いて分析を行う場合、測
定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸化
水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行われ、
この場合、検出可能な物質の量は化学量論的に測定対象
物と等しくなる。現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては、分光分析機器を用いる方法が最も普及し
ているが、これも感度上に限界があり、測定対象物の含
量が少ない場合適さないという欠点があった。【０００７】そこで、測定対象物の含量が少ない場合や
、測定対象物を含む被検体が少量の場合等は、分光分析
よりも感度の優れた蛍光分析、発光分析等が行われてい
る。しかしながら、これらの方法も臨床検査等の汎用検
査においては、機器の普及という点からあまり適したも
のではなかった。また、微量の物質を測定するその他の
方法としては、該物質が等量の補酵素等に変換できる場
合、２種類の酵素を用いて補酵素等を増幅する、いわゆ
る酵素サイクリング法が知られている。例えば、ＮＡＤ
サイクリング、ＣｏＡサイクリング、ＡＴＰサイクリン
グなどがあるが、これらの方法は、臨床検査等のルーチ
ン分析においては、操作が煩雑なため、殆ど用いられて
いないのが現状であった。【０００８】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系に及ぼす共存物質の影響を小さくすることができる
。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を増
やすことも可能である。更に、検体が人血液である場合
などは、採血量を減らすことができるため、被採血者へ
の心理的な負担を軽減することもできるし、廃棄物の減
少により環境汚染を軽減することに貢献することにもな
る。【０００９】【発明が解決しようとする課題】前述のごとくグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて種々の物質、
酵素活性が測定されているが、これらは何れも高感度測
定法とはいいがたく、特に含量の少ない物質や酵素活性
の測定については簡便で高い感度なほうふおが望まれて
いる。また、ヘキソキナーゼと組み合わせてＤ−グルコ
ースを高感度に測定できれば、酵素免疫法にける標識用
酵素として頻用されているβ−ガラクトシダーゼの活性
測定への応用も考えられる。【００１０】【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点につき鋭意検討した結果、グルコース−６−リン酸
の定量において、チオニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下、チオＮＡＤ類という）およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以
下、チオＮＡＤＰ類という）からなる群より選ばれた一
つと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下
、ＮＡＤ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフエート類（以下、ＮＡＤＰ類という）
からなる群より選ばれた一つの補酵素に作用するグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびチオＮＡＤ（
Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）類との２種の補酵素を用いること
により、サイリング反応を形成せしめることを見出し、
かつその反応における吸光度の測定に際し、ＮＡＤ（Ｐ
）類のアナログであるチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ
）類の還元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、３４
０ｎｍ付近と異なつていることを利用し、他物質の吸収
波長の混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施で
き、高感度な測定が可能であることを確認し、本発明を
完成するに至った。【００１１】すなわち、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施するに
当り、上記二種類の補酵素の一つにチオＮＡＤ（Ｐ）類
を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを分別
定量するもので、その結果、Ｄ−グルコース−６−リン
酸を高感度に測定できるものである。【００１２】本発明は、上記のような知見に基づいて完
成されたものであって、Ｄ−グルコース−６−リン酸を
含有する被検液に、（１）チオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフエート類（以下チオＮＡＤＰ類と
いう）及びチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
類（以下チオＮＡＤ類という）からなる群より選ばれた
一つと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
エート類（以下ＮＡＤＰ類という）及びニコチンアミド
アデニンジヌクレオチオド類（以下ＮＡＤ類という）か
らなる群より選ばれる一つとを補酵素とし、少なくとも
Ｄ−グルコース−６−リン酸を基質としてＤ−グルコノ
−δ−ラクトン−６−リン酸を生成する可逆反応をなす
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１
、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作用せしめて、次の反
応式【００１３】【化１】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類
、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元
型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチ
オＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡ
Ｄ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元
型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリン
グ反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２また
はＢ１の量を測定することを特徴とするＤ−グルコース
−６−リン酸の高感度定量法、並びに上記（１）、（２
）及び（３）を含有することを特徴とするＤ−グルコー
ス−６−リン酸定量用組成物を提供するものである。【００１４】本発明において用いられる、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）
とは、少なくともＤ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ
（Ｐ）＋　＝Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸
＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋　なる反応を触媒するものであ
って、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
群より選ばれた一つを補酵素とするものなら特に限定さ
れない。【００１５】本酵素の具体例としては、動植物に広く分
布し、乳腺組織、赤球球、肝、植物、微生物などから精
製されている。また、酵母等に見られるように一般びＮ
ＡＤＰの特異的であるが、ロイコノストツク　　メセン
テロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔ
ｅｔｏｉｄｅｓ）、アゾトバクター　　ヴイネランデイ
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）
、シユドモナス　　フルオロエツセンス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）などの酵素は
、ＮＡＤにも作用する（酵素ハンドブツク、ｐ２０〜２
１、朝倉書店（１９８３）。【００１６】また、バチルス　　ステアロサーモフイラ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｉｓ）由来の酵素も同様にＮＡＤ、ＮＡＤＰ共
に作用する（生化学、ｖｏｌ．５２、ｐ８１９、１９８
０）。このうち、酵母、ロイコノストツク　　メセンテ
ロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅ
ｔｏｉｄｅｓ）由来の酵素は例えば、オリエンタル酵母
工業、ベーリンガーマンハイム社、シグマ社等より市販
されており、例えば、シグマ社より市販されているパン
酵母由来の酵素の補酵素に対する相対活性は４０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７．１）ではＮＡＤＰを用いた時を１０
０とすると、チオＮＡＤＰで６７％程度であり、ＮＡＤ
には全く作用しなかった。【００１７】また、（株）東洋紡より市販されているロ
イコノストツク　　メセンテロイデス由来のものについ
ては、同様にＮＡＤＰを用いた時を１００とすると、チ
オＮＡＤＰで２７％、ＮＡＤで１７６％、またチオＮＡ
Ｄでは４９％であった。さらに、東洋醸造（株）より市
販されているバチルス　　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）由来の酵素については、４０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）では、ＮＡＤＰを用いた時を１００％と
して、チオＮＡＤＰが４０％、ＮＡＤで７％、チオＮＡ
Ｄでは３４％であった。他の起源の酵素についても適宜
系に使用可能であり、使用する酵素の補酵素ＮＡＤ（Ｐ
）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する特異性は、基質であ
るＤ−グルコース−６−リン酸に対して反応性を有する
ものであればよく、そのような酵素の性質はこれら補酵
素と基質を用い確認できるものである。【００１８】又、Ａ１およびＢ２で示される補酵素は、
チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類
を示すが、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては
、例えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフエート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチドホスフエートおよびチオニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる
。【００１９】又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、
例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（アセチルＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエート、ニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエー
ト（デアミノＮＡＤＰ）；及びニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
ヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられ
る。【００２０】本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ
１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１およびＢ１の関係
において一つのチオ型補酵素を使用するものである。又
、定量に用いるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合は、上述
のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤＰ類
のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤＰ類及び
ＮＡＤＰ類より、また用いるグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類及び（チオ）ＮＡＤ
Ｐ類を共に補酵素にする場合は、上述のチオＮＡＤ類お
よびチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類
より適宜選択して用いればよい。【００２１】本発明の高感度定量法を用いれば、被検液
中にもともと含有されているＤ−グるコース−６−リン
酸を測定することができるが、又、これらの物質を遊離
、生成する酵素系における基質や、その酵素活性を測定
することもできる。更に、本発明の高感度定量法を用い
れば、上記のようなＤ−グルコース−６−リン酸を遊離
、または生成する酵素系と連結し得る、単一の、もしく
は複数の工程からなる酵素系における基質や、その酵素
活性をも測定することができる。これらの酵素系は、特
に限定されるものではないが、例えば以下に示す種々の
酵素の反応系が挙げられる。【００２２】（１）ＡＴＰ、Ｄ−グルコースとヘキソキ
ナーゼ（ＥＣ　　２．７．１．１）の酵素反応系によっ
て遊離、生成するＤ−グルコース−６−リン酸を定量す
るためのもので、ＡＴＰまたはＤ−グルコースに定量、
またはヘキソキナーゼの活性測定のための反応系。Ｄ−グルコース＋ＡＴＰ→Ｄ−グルコース−６−リン酸
＋ＡＤＰ【００２３】（２）Ｄ−フルクトース−６−リン酸とホ
スホグルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）の
酵素反応系によって遊離、精製するＤ−グルコース−６
−リン酸を定量するためのもの。Ｄ−フルクトース−６−リン酸→Ｄ−グルコース−６−
リン酸【００２４】（３）Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−
グルコース−１，６−ジリン酸とホスホグルコムターゼ
（ＥＣ　　２．７．５．１）の酵素反応系によって遊離
、生成するＤ−グルコース−６−リン酸を定量するため
のもの。Ｄ−グルコース−１−リン酸＋Ｄ−グルコース−１，６
−ジリン酸→Ｄ−グルコース−６−リン酸＋Ｄ−グルコ
ース−１，６−ジリン酸【００２５】（４）上記（２）の酵素反応系におけるＤ
−フルクトース−６−リン酸が、Ｄ−フルクトース−１
，６−ジリン酸、無機リンと６−ホスホフルクトキナー
ゼ（ＥＣ　　２．７．１．９０）の酵素反応系である場
合。Ｄ−フルクトース−１，６−ジリン酸＋無機リン→Ｄ−
フルクトース−６−リン酸＋ピロリン酸【００２６】（
５）上記（２）の酵素反応系におけるＤ−フルクトース
−６−リン酸が、Ｄ−フルクトースとフルクトキナーゼ
（ＥＣ　　２．７．１．４）またはヘキソキナーゼ（Ｅ
Ｃ　　２．７．１．１）の酵素反応系由来である場合。Ｄ−フルクトース＋ＡＴＰ→Ｄ−フルクトース−６−リ
ン酸＋ＡＤＰ【００２７】（６）上記（３）のＤ−グルコース−１−
リン酸がグリコーゲン、無機リンとグリコーゲンホスホ
リラーゼ（ＥＣ　　２．４．１．１）の酵素反応系由来
である場合。（グリコーゲン）ｎ＋無機リン→Ｄ−グルコース−１−
リン酸＋（グリコーゲン）ｎ−１【００２８】（７）上記（３）のＤ−グルコース−１−
リン酸がシユクロース、無機リンとシユークロースホス
ホリラーゼ（ＥＣ　　２．４．１．７）の酵素反応系由
来である場合。シユークロース＋無機リン→Ｄ−グルコース−１−リン
酸＋Ｄ−フルクトース【００２９】（８）上記（１）の酵素反応系におけるＡ
ＴＰが、クレアチリン酸、ＡＤＰとクレアチンキナーゼ
（ＥＣ　　２．７．３．２）の酵素反応系由来である場
合。クレアチンリン酸＋ＡＤＰ→クレアチン＋ＡＴＰ【００
３０】（９）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが
、ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰとピルビン酸キナ
ーゼ（ＥＣ　　２．７．１．４０）の酵素反応系由来で
ある場合。ホスホエノールピルビン酸＋ＡＤＰ→ピルビン酸＋ＡＴ
Ｐ【００３１】（１０）上記（１）の酵素反応系における
ＡＴＰが、アセチルリン酸、ＡＤＰと酢酸キナーゼ（Ｅ
Ｃ　　２．７．２．１）の酵素反応系由来である場合。アセチル酸＋ＡＤＰ→酢酸＋ＡＴＰ【００３２】（１１）上記（５）の酵素反応系における
Ｄ−フルクトースが、Ｄ−ソルビトール、ＮＡＤとソル
ビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．１４
）の酵素反応系由来である場合。Ｄ−ソルビトール＋ＮＡＤ→Ｄ−フルクトース＋ＮＡＤ
Ｈ＋Ｈ＋　【００３３】（１２）上記（１）の酵素反応系における
Ｄ−グルコースが、β−ラクトースと、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ（ＥＣ　　３．２．１．２３）の酵素反応系
由来である場合。 β−ラクトース＋Ｈ２　Ｏ→Ｄ−ガラクトース＋Ｄ−グ
ルコース【００３４】Ａ１およびＢ１の量は被検体中のＤ−グル
コース−６−リン酸量に比較して過剰量であること、か
つグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＡ１及び
Ｂ１それぞれに対するＫｍ値に比較して過剰量であるこ
とが必要であり、特にＤ−グルコース−６−リン酸量も
２０〜１００００倍モルが好ましい。【００３５】本発明のＤ−グルコース−６−リン酸定量
用組成物においては、Ａ１およびＢ１の濃度は０．０２
〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの量は１〜１０
００ｕ／ｍｌ、特に２〜４００ｕ／ｍｌが好ましいが、
その量は被検体の種類等により適宜決定することができ
、これ以上の量を用いることもできる。【００３６】また本発明にはその変形例として、以下の
方法も包含するものである。即ち、本発明定量法は、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤ類およ
びＮＡＤＰ類を補酵素とする場合において、２つの補酵
素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組
み合わせ、またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮ
ＡＤＰ類との組み合わせを選んだときには、更に被検体
に（４）成分のＤ−グルコース−６−リン酸に作用せず
、Ｂ２からＢ１への反応を形成する第二のデヒドロゲナ
ーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作用せめる
ことにより、後記反応式（ＩＩ）のごとく、Ｂ１とＢ２
の間Ｂ１の再生のための反応系を付与せしめることによ
り当該サイクリング反応を形成せしめ得る。【００３７】この場合、第二のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＡ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、例えばＡ１を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組み合わせ、Ａ
１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲナーゼが実
質的にＡ１に作用しない条件を選択する組み合わせが例
示される。定量の際には反応により生成したＡ２の量を
測定する。【００３８】【化３】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはＮＡＤＰ類
のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反応はＢ２を
補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ１を生成す
る酵素反応を示す）。【００３９】上記の成分（４）を用いるＤ−グルコース
−６−リン酸定量用組成物において、Ａ１の濃度は０．
０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく
、Ｂ２または／及びＢ１の濃度は０．０５〜５０００μ
Ｍ、特に５〜５００μＭが好ましい。グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜１０００ｕ／ｍｌ
、特に２〜４００ｕ／ｍｌが好ましく、第二のデヒドロ
ゲナーゼはＢ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量
（ｕ／ｍｌ単位）以上になるように調製すればよく、例
えば１〜１００ｕ／ｍｌが好ましく、また第二のデヒド
ロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭ
が好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜決
定することができ、これ以上の量を用いることもできる
。【００４０】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。又、Ｂ１の代わりにＢ２あるいは
Ｂ１とＢ２の混合物を用いて反応を行つてもよい。この
場合、Ｂ１または／及びＢ２の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以下が
好ましい。【００４１】第二のデヒドロゲナーゼ及びその基質とし
ては、例えばＢ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１
．１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（
ＥＣ　　１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリ
セロール、Ｌ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ　　１．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）と
Ｌ−グリセロール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ　　１．１．１１．３７）（ブタ心筋、ウシ
心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１２）（ウサギ骨
格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロア
ルデヒドリン酸とリン酸。【００４２】Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類の
ときは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．
１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸
、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．２．
１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｏｘａｌａｔ
ｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグル
コン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．４４）
（ラツト肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−ホ
スホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．２．１．１３）（植物葉緑
体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン
酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．
２．１．７）（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる
。【００４３】さらに、本発明定量法は、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を
共に補酵素とする場合において、２つの補酵素酵素にチ
オＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わ
せ、または、チオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤ
Ｐ類との組み合わせを選んだときには、更に被検体に（
５）成分のＤ−グルコース−６−リン酸に作用せず、Ａ
２からＡ１への反応をを形成する第三のデヒドロゲナー
ゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめる
ことにより、後記反応式（ＩＩＩ）のごとく、Ａ１とＡ
２の間にＡ１の再生のための反応系を付与せしめること
により、当該サイクリング反応を形成せしめ得る。【００４４】この場合、第三のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＢ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、例えばＢ１を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組み合わせ、Ｂ
１とＡ２の量的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実
質的にＢ１に作用しない条件を選択する組み合わせ等が
例示される。定量の際にはＢ１の消費量を測定する。【００４５】【化４】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
ときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１への反応はＡ２を
補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ１を生成す
る酵素反応を示す）【００４６】すなわち、第三のデヒドロゲナーゼはＡ１
の再生のために補助的に添加するものであり、これによ
ってＡ１の使用量を少なくすることが可能となり、特に
Ａ１が高価な場合には有効である。また、Ａ１の代わり
にＡ２あるいはＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行っ
てもよい。この場合、Ａ１または／及びＡ２の使用量は
特に限定されるものではないが、一般的にはＢ１の１／
１０モル以下が好ましい。【００４７】この成分（５）を用いるＤ−グルコース−
６−リン酸定量用組成物において、Ｂ１の濃度は０．０
２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、
Ａ２または／及びＡ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ
、特に５〜５００μＭが好ましい。グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜１０００ｕ／ｍｌ、
特に２〜４００ｕ／ｍｌが好ましく、第三のデヒドロゲ
ナーゼはＡ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（
ｕ／ｍｌ単位）以上になるように調製すればよく、例え
ば１〜１００ｕ／ｍｌが好ましく、また第三のデヒドロ
ゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが
好ましく、これらの量は被検体の種類等により適宜決定
することができ、これ以上の量を用いることもできる。【００４８】第三のデドロゲナーゼ及びその基質として
は、例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１
．１）とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ　　１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）
とジヒドロキシアセトン、Ｌ−グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．８）（ウサ
ギ筋肉由来）とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．３７）（ブタ
心筋、ウシ心筋由来）とオキザロ酢酸、グリセロアルデ
ヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．１
２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と
１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、Ａ１がＮＡＤＰ
類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グリセロアルデヒド
リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．２．１．１３）
（植物葉緑体由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリ
ン酸等が挙げられる。【００４９】反応液組成については、使用するグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相対
活性等を考慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後正
反応／逆反応の至適ｐＨ条件を酵素サイクリング反応が
効率よく進行するように設定すればよい。これら使用す
る酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上を組み合わせ
て用いてもよい。【００５０】斯くして、調製された本発明のＤ−グルコ
ース−６−リン酸定量用組成物によって、被検体中のＤ
−グルコース−６−リン酸を測定するには、上記成分（
１）〜（３）、（１）〜（４）、あるいは（１）〜（３
）及び（５）を含有する組成物に、被検体０．００１〜
０．５ｍｌを加え、約３７℃の温度にて反応させ、反応
開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば
３分後と４分後の１分間、または３分後と８分後の５分
間における生成されたＡ２の量または消費されたＢ１の
量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によつ
て測定すればよい。例えば、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ１
がＮＡＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付近の吸光
度の増加により測定するか、あるいはＢ１の消費を３４
０ｎｍ付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度のＤ
−グルコース−６−リン酸を用いて測定したときの値と
比較すれば、被検液中のＤ−グルコース−６−リン酸量
をリアルタイムで求めることができる。【００５１】また、本発明定量法は、被検体中のＤ−グ
ルコース−６−リン酸そのものを酵素サイクリング反応
に導くものであり、被検液中の共存物質の影響を受けに
くいため、被検液のブランク測定を省略することができ
、レイトアツセイによる簡便な測定を成し得る。尚、本
発明においてはＡ２またはＢ１の測定に当り、吸光度測
定の代わりに他の公知の測定法を使用して定量を行うこ
とができる。【００５２】【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、また
、酵素のサイクリング反応を組合せることによつて感度
を増大させることができるため、少量の検体で迅速かつ
正確に被検体中のＤ−グルコース−６−リン酸を定量す
ることができる。【００５３】【実施例】以下に本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例　　１　　　　Ｄ−グルコース−６−リン酸の定
量＜反応液＞５０　　ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１　
　ｍＭ　　チオＮＡＤＰ（シグマ社製）０．５　　ｍＭ
　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）５　　ｍＭ
　　ＥＤＴＡ３８ｕ／ｍｌ　　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（シグマ社製：パン酵母由来）【００５４】＜操作＞上記試薬１ｍｌをキユベツトにと
り、０、５、１０、１５、２０、２５μＭのＤ−グルコ
ース−６−リン酸溶液をそれぞれ５０μｌ添加し、３７
℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と５分目の
４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求めた
。その結果を図１に示した。図１から明らかなように、
Ｄ−グルコース−６−リン酸量に対する吸光度変化量は
良好な直線性を示した。【００５５】実施例　　２　　　　Ｄ−グルコース−６
−リン酸の定量＜反応液＞５０　　ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１　
　ｍＭ　　チオＮＡＤＰ（シグマ社製）２　　ｍＭ　　
還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）２　　ｍＭ　
　ＥＤＴＡ８４．４ｕ／ｍｌ　　グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（東洋紡社製：ロイコノストック　　メセンテ
ロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ）由来）【００５６】＜操作＞上記試薬１ｍｌをキユベツトにと
り、０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０μＭ
のＤ−グルコース−６−リン酸溶液をそれぞれ２０μｌ
　添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２
分目と４分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、
その差を求めた。実施例１と同様、その結果を図２に示
した。図２から明らかなように、Ｄ−グルコース−６−
リン酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した
。【００５７】実施例　　３　　　　Ｄ−グルコース−６
−リン酸の定量＜反応液＞５０　　ｍＭ　　ＭＥＳ酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．５
　　ｍＭ　　チオＮＡＤＰ（シグマ社製）２　　ｍＭ　
　還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）２　　ｍＭ
　　ＥＤＴＡ２４．８ｕ／ｍｌ　　グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（東洋醸造社製：バチルス　　エスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．）由来）【００５８】＜操作＞上記試薬１ｍｌをキユベツトにと
り、０、１０、２０、３０、４０、５０μＭのＤ−グル
コース−６−リン酸溶液をそれぞれ２０μｌ　添加し、
３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と４分
目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求
めた。その結果を図３に示した。図３から明らかなよう
に、Ｄ−グルコース−６−リン酸量に対する吸光度変化
量は良好な直線性を示した。【００５９】実施例　　４　　　　Ｄ−フルクトースの
定量＜反応液（Ｉ）＞５０　　ｍＭ　　ＭＥＳ酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５
　　ｍＭ　　チオＮＡＤＰ（シグマ社製）２　　ｍＭ　
　塩化マグネシウム０．５　　ｍＭ　　ＡＴＰ１　　ｕ／ｍｌ　　ヘキソースキナーゼ（酵母由来、オ
リエンタル酵母工業社製）３．６　　ｕ／ｍｌ　　ホスホグルコースイソメラーゼ
（酵母由来、ベーリンガーマンハイム社製）２４．８　　ｕ／ｍｌ　　グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（東洋醸造社製：バチルス　　エスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．）由来）【００６０】＜反応液（ＩＩ）＞５０　　ｍＭ　　ＭＥＳ酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０　
　ｍＭ　　還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業社製
）５０　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ【００６１】＜操作＞上記反応液（Ｉ）０．９ｍｌをキ
ユベツトにとり、０、１０、２０、３０、４０、５０μ
ＭのＤ−フルクトース溶液をそれぞれ２０μｌ　添加し
、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後５分後に、
反応液（ＩＩ）を０．１ｍｌ加え、酵素サイクリング反
応を開始させた。反応液（ＩＩ）添加後２分目と４分目
の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図４に示した。図４から明らかなように
、Ｄ−フルクトース量に対する吸光度変化量は良好な直
線性を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量曲線である
。

【図２】Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量曲線である
。

【図３】Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量曲線である
。

【図４】Ｄ−フルクトースの定量曲線である。

【化２】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　被検体に、（１）チオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下、チオＮ
ＡＤＰ類という）およびチオニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ類という）からなる
群より選ばれる一つと、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフエート類（以下、ＮＡＤＰ類という）お
よびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、
ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる一つとを補酵
素とし、少なくともＤ−グルコース−６−リン酸を基質
としてＤ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸を生成
する可逆反応をなすグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作
用せしめて、次の反応式【化１】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を測定することを特徴とするＤ−グルコース−６−リ
ン酸の高感度定量法。
【請求項２】　　チオＮＡＤＰ類がチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエート（チオＮＡＤＰ）
またはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドホスフエートである請求項１記載の高感度定量法。
【請求項３】　　チオＮＡＤ類がチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチ
ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項１
記載の高感度定量法。
【請求項４】　　ＮＡＤＰ類がニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフエート（ＮＡＤＰ類）、アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフエート（アセチ
ルＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフエートおよびニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチドホスフエート（デアミノＮＡＤＰ）
からなる群より選ばれた補酵素である請求項１記載の高
感度定量法。
【請求項５】　　ＮＡＤ類がニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒ
ポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる
群より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感度定量
法。
【請求項６】　　次の成分（１）〜（３）（１）チオＮ
ＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれた一
つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれ
る一つとを補酵素とし、少なくともＤ−グルコース−６
−リン酸を基質としてＤ−グルコノ−δ−ラクトン−６
−リン酸を生成する可逆反応をなすグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、（式
中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類
またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示
し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類の
ときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ１
がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ
Ｐ類または還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有すること
を特徴とするＤ−グルコース−６−リン酸の定量用組成
物。