WO2011013464A1 - デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法および測定用キット - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample and a kit used therefor.
- NAD nicotinamide adenine dinucleotide
- NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
- dehydrase and substrate used in such a method includes lactate dehydrogenase and lactate, glutamate dehydrogenase and glutamate, alcohol dehydrogenase and alcohol, glycerol-3-phosphate dehydrogenase and glycerol-3-phosphate, glucose-6- Phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate are known.
- lactate dehydrogenase and lactate glutamate dehydrogenase and glutamate
- alcohol dehydrogenase and alcohol glycerol-3-phosphate dehydrogenase and glycerol-3-phosphate
- glucose-6- Phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate are known.
- the other one is used as a reagent together with the coenzyme.
- a specific dehydrogenase or a corresponding substrate is generated intermediately or finally by enzymatic reaction of the specific substance with a reagent, and the dehydrogenase or It is also widely performed to react a corresponding substrate with the above-mentioned coenzyme and consequently measure a specific substance.
- NAD or NADP is finally converted into reduced NADH or NADPH by a dehydrogenase reaction, and the resulting increase in absorbance in the ultraviolet wavelength region (usually 340 nm)
- the ultraviolet wavelength region usually 340 nm
- simple glass or plastic cannot be used as a measurement cell, expensive quartz must be used, and in addition, an ultraviolet light source or detection device must be used as an analyzer.
- the analysis apparatus tends to be large and expensive. As a result, it could not be applied to a device using a visible spectrophotometer that can be measured in the field of dry chemistry and small hospitals. Therefore, in order to be able to use in such a case, a method for measuring the aforementioned dehydrogenase or the corresponding substrate in the visible region is desired.
- Patent Document 1 discloses an enzyme cycling reaction using a combination of thio-NAD or thio-NADP and NADH or NADPH as a coenzyme when glucose-6-phosphate is reacted with glucose-6-phosphate dehydrogenase.
- a method has been proposed in which glucose-6-phosphate is measured using thioNADH or thioNADPH, which is a reduced enzyme produced, based on the absorbance in the visible region near 400 nm.
- this method uses an enzyme cycling reaction, and is not necessarily a simple measurement method, and cannot be said to be a measurement method suitable for measuring a high concentration measurement object. is there.
- the problem of the present invention is that it can be measured based on the absorbance in the visible region, can be applied to an apparatus using a visible spectrophotometer that can be measured in the field of dry chemistry and small hospitals, and exists in a sample at a high concentration. It is to provide a method for accurately measuring dehydrogenase or a corresponding substrate.
- Patent Document 1 the present inventors have used an enzyme reaction to convert a coenzyme thioNAD or thioNADP used for measuring a low concentration of dehydrogenase or a corresponding substrate by an enzyme cycling method. Paying attention to changing the absorbance in the visible region, we examined a method for measuring the measurement target present in the sample at a high concentration using the coenzyme. As a result, when thio-NAD or thio-NADP is used with a high-concentration measurement target as a coenzyme, linearity is difficult to maintain in the high-concentration region, and in addition, the blank may be high, and the measurement target cannot be measured accurately It has been found.
- the present inventor makes an enzyme reaction using NAD as a coenzyme, and then uses the sample from which the substance has been removed to use a dehydrogenase, a corresponding substrate and An attempt was made to measure dehydrogenase or its corresponding substrate in a sample by reacting thio-NAD and measuring the absorbance in the visible region.
- the dehydrogenase or the corresponding substrate contained in the sample by the absorbance in the visible region by using both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as a coenzyme, even if the measurement target is a high concentration region
- the linearity can be maintained and the blank of the calibration curve can be made small.
- the dehydrogenase or the corresponding substrate can be measured easily and accurately in a wide range of the concentration to be measured with a simple visible spectrophotometer.
- the present invention has been completed by finding that a method can be provided.
- the present invention relates to a method for measuring a dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample by reacting with a dehydrogenase, a corresponding substrate and a coenzyme, wherein thioNAD or thioNADP and NAD or NADP are used as a coenzyme.
- the present invention relates to a measurement method for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample by measuring an increase in absorbance derived from thio-NADH or thio-NADPH produced by reaction.
- the present invention provides a method in which a dehydrogenase or a corresponding substrate is generated intermediately or finally by enzymatic reaction of a specific substance in a sample, and the dehydrogenase or the corresponding substrate is subjected to the above-described measurement method, and the intermediate or final
- the present invention relates to a measurement method for measuring a specific substance in a sample derived from the amount of dehydrogenase produced or a corresponding substrate.
- the present invention is a measurement kit for measuring a dehydrogenase or a corresponding substrate, wherein a component other than a measurement target among the substrates corresponding to the dehydrogenase is an essential component, and thioNAD or thioNADP is used as a coenzyme. And a measurement kit containing NAD or NADP as essential components. Furthermore, the present invention is a measurement kit for measuring a specific substance, which is derived from a component for deriving from a specific substance to dehydrogenase or a corresponding substrate by an enzymatic reaction and a substrate corresponding to the dehydrogenase. The present invention relates to a measurement kit that contains other components as essential components and thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components as coenzymes.
- measurement is carried out by using both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as coenzymes, even though the dehydrogenase or corresponding substrate contained in the sample is measured by absorbance in the visible region.
- the linearity can be maintained even when the target is a high concentration region, and the blank of the calibration curve can be reduced.
- a simple visible spectrophotometer can easily and accurately measure in a wide range of concentration to be measured.
- FIG. 1 It is a figure which shows the result of having measured urea nitrogen by the method of Examples 1, 2, and 3 and the comparative example 1.
- FIG. 1 shows the result of having measured urea nitrogen by the method of Examples 1, 2, and 3 and the comparative example 1.
- the sample used in the present invention is preferably a biological sample such as serum, plasma, urine, or a model sample thereof.
- the measurement object of the present invention is a dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample, and a specific substance in a sample that can generate dehydrogenase or a corresponding substrate intermediately or finally by an enzymatic reaction.
- the reaction is carried out in the presence of both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as coenzymes.
- thio-NAD or thio-NADP any combination of thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP may be used, but a combination of thio-NAD and NAD or a combination of thio-NADP and NADP is preferred.
- thio NAD or thio NADP may be abbreviated as thio NAD (P).
- NAD or NADP may be abbreviated as NAD (P).
- thioNAD means thionicotinamide adenine dinucleotide
- thioNADP means thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
- NAD means nicotinamide adenine dinucleotide
- NADP means nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
- thio-NADH, thio-NADPH, NADH, and NADPH mean reduced forms of coenzymes, that is, reduced forms of thio-NAD, thio-NADP, NAD, and NADP, respectively.
- thioNADH or thioNADPH may be abbreviated as thioNAD (P) H.
- NADH or NADPH may be abbreviated as NAD (P) H.
- the amount of NAD (P) used is not particularly limited, but is preferably 0.5 times the number of moles of thio-NAD (P) used, more preferably 1.5 to 30 times the number of moles, Most preferred is 3.0 to 20 times the number of moles. If the amount of NAD (P) is too small, the linearity of the calibration curve may be difficult to maintain, and the blank reduction may be insufficient. On the other hand, if the amount of NAD (P) is too large, the slope of the straight line of the calibration curve may be small, and it may be difficult to accurately measure the measurement target.
- the dehydrogenase reaction is performed using both thio-NAD (P) and NAD (P) as coenzymes, and the increase in absorbance derived from the produced thio-NAD (P) H is measured.
- the wavelength for measuring the absorbance is preferably in the range of 395 to 415 nm and can be measured in the visible region, so that it can be measured with a simple visible spectrophotometer as the analyzer to be used.
- the dehydrogenase or the corresponding substrate includes, for example, a dehydrogenase that can be measured by a dehydrogenase enzymatic reaction using NAD (P) or thioNAD (P) as a coenzyme that is currently measured in the clinical laboratory industry.
- NAD NAD
- thioNAD thioNAD
- the dehydrogenase or the corresponding substrate may be a dehydrogenase or a corresponding substrate that is originally present in the sample.
- It may also be a dehydrogenase or corresponding substrate generated intermediately or finally by enzymatic reaction of the specific substance to measure a specific substance in a sample, depending on the generated dehydrogenase or corresponding substrate. As a result, the specific substance can be measured.
- Examples of combinations of dehydrogenase and substrate used in such a method include lactate dehydrogenase and lactic acid, glutamate dehydrogenase and glutamate, alcohol dehydrogenase and alcohol, glycerol-3-phosphate dehydrogenase and glycerol-3-phosphate, glucose- Examples thereof include 6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate.
- the other one in order to measure either one of the combinations, the other one can be used as a reagent for causing a dehydrogenase enzyme reaction together with a coenzyme.
- a measurement object that exists in a sample at a high concentration is suitable.
- the dehydrogenase is glucose
- a dehydrogenase or a corresponding substrate generated intermediately or finally by enzymatic reaction of a specific substance in a sample to measure a specific substance in a sample is used as the dehydrogenase or corresponding substrate
- the dehydrogenase is glucose
- -6-phosphate dehydrogenase and the corresponding substrate is glucose-6-phosphate.
- urea can be measured as the specific substance (note that urea may be conventionally obtained as urea nitrogen).
- ADP as a first enzyme reaction, ADP, magnesium ion, potassium ion, hydrogen carbonate ion and urea amide lyase are reacted with urea in the sample to generate ADP, and then the second As an enzymatic reaction of the above, the reagent-derived hexokinase is allowed to act on the ADP to generate glucose-6-phosphate, and then the resulting glucose-6-phosphate (corresponding substrate) is converted to glucose-6-phosphate.
- dehydrogenase dehydrogenase
- thio-NAD P
- NAD NAD
- glucose-6 produced from the increase in absorbance depending on the amount of thio-NAD (P) H produced.
- -Phosphoric acid corresponding substrate
- ADP-dependent hexokinase is preferable as the hexokinase. This example is shown in the reaction formula as follows.
- a component other than the measurement target among the substrate corresponding to the dehydrogenase is an essential component, and in addition to that, if necessary, a buffer, Those containing other components such as a surfactant can be used.
- a surfactant thio-NAD (P) and NAD (P) are essential components, and in addition, buffers, surfactants, etc. Those containing other components can be used.
- glucose-6-phosphate dehydrogenase is an essential component as a dehydrogenase as a first reagent
- thio-NAD ( P) and NAD (P) are essential components
- other components such as a buffering agent and a surfactant can be included in the first reagent and the second reagent.
- the mixed solution and the second reagent are mixed, the enzyme reaction is performed for 0.5 to 15 minutes, and the absorbance of the obtained reaction solution is measured at 405 nm with a visible spectrophotometer.
- the concentration of the measurement target in the sample can be measured by comparing the measured value with a calibration curve prepared in advance.
- the first reagent and the second reagent can be mixed to form one measurement reagent, and the measurement reagent and the sample can be mixed.
- An enzymatic reaction can also be carried out by performing a partial reaction.
- the first reagent when measuring a specific substance as a measurement target, for example, includes, as essential components, a component for deriving dehydrogenase or a corresponding substrate from the specific substance by an enzymatic reaction, and a substrate corresponding to the dehydrogenase.
- the second reagent contains thio-NAD (P) and NAD (P).
- other components such as a buffer and a surfactant can be included.
- urea as a specific substance to be specifically measured, for example, as a first reagent, urea (ie, a specific substance) is induced to glucose-6-phosphate (ie, a corresponding substrate) by an enzymatic reaction.
- a first enzyme reaction-inducing component for producing ADP from urea ie, urea amide lyase, ATP, Mg 2+ , K + , HCO 3 ⁇
- ADP to glucose-6-phosphate ie, corresponding
- a second enzyme reaction-inducing component ie, glucose, hexokinase
- a reagent component containing glucose-6-phosphate dehydrogenase as a dehydrogenase can be used.
- the second reagent contains both thio-NAD (P) and NAD (P) as essential components.
- the first reagent and the second reagent may include those containing other components such as a buffer and a surfactant.
- a specific substance is measured as an object to be measured
- the first reagent is mixed with a sample, and after 0 to 15 minutes, the resultant mixed liquid is then obtained.
- the second reagent are mixed, the enzyme reaction is carried out for 0.5 to 15 minutes, and the absorbance of the resulting reaction solution is measured at 405 nm with a visible spectrophotometer.
- the concentration of the measurement target in the sample can be measured by comparing the measured value with a calibration curve prepared in advance.
- the first reagent and the second reagent can be mixed to form one measuring reagent, and the measuring reagent and the sample can be mixed.
- An enzymatic reaction can also be carried out by reacting for 15 minutes.
- a measurement kit for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate wherein a component other than the measurement target among the substrate corresponding to dehydrogenase is an essential component
- a measurement kit containing thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components can be used.
- a measurement kit for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate in order to measure dehydrogenase or a corresponding substrate, it is a measurement kit for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate, and includes components other than the measurement target among the substrates corresponding to dehydrogenase as essential components
- a measurement kit containing a first reagent and a second reagent containing thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components can be used.
- a measurement kit for measuring a specific substance in order to measure a specific substance, the component for deriving from the specific substance to dehydrogenase or a corresponding substrate by an enzymatic reaction, and the dehydrogenase A kit for measurement containing components other than those derived from the corresponding substrate as essential components and thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components as coenzymes can be used.
- a second reagent containing thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components can be used.
- the first reagent and the second reagent in these measurement kits can contain other components such as a buffer and a surfactant as necessary as described above.
- urea nitrogen measurement system using urea amidolyase, hexokinase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, a measurement system in which thio-NAD and NAD are mixed as coenzymes (Examples 1, 2 and 3), and thio-NAD
- the measurement system (Comparative Example 1) used alone was compared.
- urea was quantified as the amount of urea nitrogen.
- Samples and reagents are as follows. Sample : The urea solution was prepared so that it might become 75 mg / dL as urea nitrogen, and it diluted suitably with the physiological saline to each density
- First reagent The components were adjusted so that the first reagent had the following concentration. 20 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) pH 9.0 10 mM D-glucose 10 mM magnesium acetate tetrahydrate 10 mM potassium hydrogen carbonate 10 mM ATP ⁇ 2Na (adenosine triphosphate ⁇ disodium) 1% Surfactant 6KU / L Hexokinase 2KU / L Ureaamide lyase 2KU / L Glucose-6-phosphate dehydrogenase Second reagent : The components of Tris and surfactant as the second reagent were adjusted to the following concentrations. 200 mM Tris pH 7.2 xmM Thio NAD ymM NAD 1% surfactant
- thio NAD and NAD as the second reagent are shown in Table 1.
- thio-NAD alone was used except for NAD from the second reagent composition.
- Measuring method The measurement was performed as follows. Using a visible part measuring apparatus, 3.0 ⁇ L of the sample and 100 ⁇ L of the first reagent are mixed at 37 ° C. for 5 minutes, and then 100 ⁇ L of the second reagent is added and reacted at the same temperature for 5 minutes. The absorbance after the color reaction was measured at a main wavelength of 405 nm and a sub wavelength of 505 nm by the one-point end method of the model.
- a dehydrogenase or a corresponding substrate contained in a sample is measured by an enzymatic reaction, it is measured by the absorbance in the visible region by using both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as a coenzyme. It is possible to maintain linearity even when the measurement target is a high concentration region, and the calibration curve blank can be reduced. As a result, a simple visible spectrophotometer can easily and accurately measure in a wide range of concentration to be measured.
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Abstract
Description
本発明者は、試料中のある種の物質をある酵素で除去するため、補酵素としてNADを用いて酵素反応をさせ、次に、その物質を除去した試料を用いてデヒドロゲナーゼ、対応する基質およびチオNADを反応させて可視部領域の吸光度を測定することにより、試料中のデヒドロゲナーゼまたはその対応する基質を測定しようと試みた。ところが、NADとチオNADの添加の順番にかかわらず、試料にデヒドロゲナーゼ、対応する基質、チオNADおよびNADを共存させた単純な構成で可視部領域の吸光度を測定することにより、驚くべきことに、反応ブランクが減少し、検量線の傾きが小さくなり、試料中のデヒドロゲナーゼまたはその対応する基質を正確に測定できることを発見した。その結果、このような構成により、上記の問題が解決され、高濃度領域でもデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を正確に測定できることが判明した。
従って、試料中に含まれるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を可視部の吸光度で測定する方法において、補酵素として、チオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPの両方を用いることにより、測定対象が高濃度領域でも直線性を維持でき、かつ、検量線のブランクを小さくすることができ、その結果、簡便な可視分光光度計にて測定対象濃度の広い領域で、簡単かつ正確にデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する方法を提供できることを見出し、本発明を完成した。
更に、本発明は、試料中の特定物質を酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を中間的または最終的に発生させ、そのデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を、上記の測定方法に付し、中間的または最終的に生成したデヒドロゲナーゼまたは対応する基質の量に由来して、試料中の特定物質を測定する測定方法に関する。
更に、本発明は、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分とし、かつ、補酵素としてチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPとを必須成分として含む測定用キットに関する。
更に、本発明は、特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分とそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分とを必須成分として含み、かつ、補酵素としてチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPとを必須成分として含む測定用キットに関する。
本発明の測定対象は、試料中のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質であり、また、酵素反応により中間的または最終的にデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を発生させることができる試料中の特定物質である。
本発明においては、デヒドロゲナーゼ酵素反応を行う際、補酵素としてチオNADまたはチオNADPおよびNADまたはNADPの両方を存在させて反応させる。チオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPとの組み合せはいずれでもよいが、チオNADとNADとの組み合せ、あるいはチオNADPとNADPとの組み合せが好ましい。
以下、チオNADまたはチオNADPを、チオNAD(P)と略記することがある。また、NADまたはNADPを、NAD(P)と略記することがある。
本発明においては、チオNADとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオNADPとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。また、NADとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、NADPとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本明細書において、チオNADH、チオNADPH、NADH、NADPHとは、補酵素の還元型、すなわち、それぞれ、チオNAD、チオNADP、NAD、NADPの還元型を意味する。以下、チオNADHまたはチオNADPHを、チオNAD(P)Hと略記することがある。また、NADHまたはNADPHを、NAD(P)Hと略記することがある。
本発明においては、補酵素としてチオNAD(P)およびNAD(P)の両方を用いてデヒドロゲナーゼ反応させ、生成するチオNAD(P)Hに由来する吸光度の増加を測定する。吸光度を測定するための波長は、395~415nmの範囲が好ましく、可視部領域で測定できるため、用いる分析装置として簡易な可視分光光度計で測定できる。
本発明において、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質としては、例えば、現在、臨床検査業界で測定対象となっている補酵素としてNAD(P)やチオNAD(P)を用いてデヒドロゲナーゼ酵素反応により測定できるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質であれば特に限定されない。この場合、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質は、試料中に当初から存在しているデヒドロゲナーゼまたは対応する基質でもよい。また、試料中の特定物質を測定するためその特定物質を酵素反応させることにより中間的または最終的に発生されたデヒドロゲナーゼまたは対応する基質でもよく、この場合、発生されたデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に依存して、結果的に、特定物質を測定することができる。
デヒドロゲナーゼまたは対応する基質として、試料中の特定物質を測定するため試料中の特定物質を酵素反応させることにより中間的または最終的に発生されたデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を用いる場合、例えば、デヒドロゲナーゼがグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼであり、対応する基質がグルコース-6-リン酸である場合を例示できる。その場合、例えば、特定物質として尿素(なお、尿素は慣習的に尿素窒素として求めても良い)を測定することができる。この場合、例えば、第一の酵素反応として、試料中の尿素に、試薬由来のATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼとを作用させてADPを発生させ、次いで、第二の酵素反応として、そのADPに、試薬由来のヘキソキナーゼを作用させてグルコース-6-リン酸を発生させ、次いで、生成するグルコース-6-リン酸(対応する基質)に、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(デヒドロゲナーゼ)とチオNAD(P)とNAD(P)とを作用させデヒドロゲナーゼ酵素反応をさせることにより、生成するチオNAD(P)Hの量に依存した吸光度の上昇から、生成するグルコース-6-リン酸(対応する基質)を測定することができ、それに基づいて結果的に、試料中の特定物質として尿素を測定することができる。このとき、ヘキソキナーゼとしては、ADP依存性ヘキソキナーゼが好ましい。
この例を反応式で示すと以下のようになる。
この場合、具体的な測定対象として、グルコース-6-リン酸を測定するときは、例えば、第一試薬として、デヒドロゲナーゼとしてグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを必須成分とし、第二試薬としてチオNAD(P)とNAD(P)を必須成分とし、その他として、第一試薬及び第二試薬には、緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませることができる。
このような第一試薬と第二試薬とを用い、測定対象として、デヒドロゲナーゼ又は対応する基質を測定するときは、例えば、試料と第一試薬を混合させ0~15分の後、次いで、得られる混合液と第二試薬を混合させ、0.5~15分酵素反応を行い、可視分光光度計で、得られる反応液の吸光度を405nmで測定する。あらかじめ作成した検量線との測定値との比較により、試料中の測定対象の濃度を測定できる。またこの場合の試料と試薬の混合においては、まず、第一試薬と第二試薬を混合して一つの測定試薬にし、その測定試薬と試料を混合することができ、さらに、0.5~15分反応することによっても酵素反応をすることができる。
この場合、具体的な測定対象の特定物質として尿素を測定するときは、例えば、第一試薬として、尿素(すなわち特定物質)から酵素反応によりグルコース-6-リン酸(すなわち対応する基質)に誘導する成分として、尿素からADPを生成するための第一酵素反応誘導成分(すなわち、ウレアアミドリアーゼ、ATP、 Mg2+、K+、HCO3 -)、ADPからグルコース-6-リン酸(すなわち対応する基質)を生成するための第二酵素反応誘導成分(すなわち、グルコース、ヘキソキナーゼ)、試薬成分のデヒドロゲナーゼとしてグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含んでいるものを用いることができる。第二試薬は、チオNAD(P)とNAD(P)の両方を必須成分とする。それ以外に、第一試薬および第二試薬には、緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませたものを用いることができる。
このような第一試薬と第二試薬とを用い、測定対象として、特定物質を測定するときは、例えば、試料とに第一試薬を混合させ0~15分の後、次いで、得られる混合液と第二試薬を混合させ、0.5~15分酵素反応を行い、可視分光光度計で、得られる反応液の吸光度を405nmで測定する。あらかじめ作成した検量線との測定値との比較により、試料中の測定対象の濃度を測定できる。またこの場合の試料と試薬の混合においては、まず、第一試薬と第二試薬を混合して一つの測定試薬にし、その測定試薬と試料を混合することができ、さらにそれを0.5~15分反応することによっても酵素反応をすることができる。
この場合、例えば、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するために、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分として含む第一試薬、およびチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPを必須成分として含む第二試薬を含有する測定用キットを用いることができる。
また、本発明においては、特定物質を測定するために、特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分とそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分とを必須成分として含み、かつ、補酵素としてチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPとを必須成分として含む測定用キットを用いることができる。
この場合、例えば、特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分およびそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分を必須成分として含む第一試薬、およびチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPを必須成分として含む第二試薬を含有する測定用キットを用いることができる。
これらの測定用キットにおける第一試薬および第二試薬には、上記したように緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を必要に応じて含ませることができる。
実施例1、2および3並びに比較例1
尿素窒素の可視部測定装置を使用した測定
試料中の特定物質としての尿素窒素を測定するために、第一の酵素反応として、試料中の尿素窒素に、試薬由来のATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼとを作用させてADPを発生させ、次いで、第二の酵素反応として、そのADPに、試薬由来のヘキソキナーゼを作用させてグルコース-6-リン酸を発生させ、次いで、生成するグルコース-6-リン酸(対応する基質)に、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(デヒドロゲナーゼ)とチオNADとNADとを作用させて、生成するチオNADHの量に依存した吸光度の上昇から、生成するグルコース-6-リン酸(対応する基質)を測定することにより、試料中の特定物質としての尿素窒素を測定した。また、比較対照として、チオNADを単独で用いて同様の測定も行った。
ウレアアミドリアーゼ、ヘキソキナーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを用いた尿素窒素測定系において、補酵素としてチオNADとNADを混合した測定系(実施例1、2および3)、およびチオNADを単独として用いた測定系(比較例1)を比較した。この場合、尿素は、尿素窒素量として定量した。試料、および試薬は以下の通りである。
試料:
尿素窒素として75mg/dLとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。
第一試薬が、以下のような濃度になるように成分を調整した。
20mM Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)
pH9.0
10mM D-グルコース
10mM 酢酸マグネシウム・四水和物
10mM 炭酸水素カリウム
10mM ATP・2Na(アデノシン三リン酸・二ナトリウム)
1% 界面活性剤
6KU/L ヘキソキナーゼ
2KU/L ウレアアミドリアーゼ
2KU/L グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
第二試薬:
第二試薬のTris、界面活性剤は以下のような濃度になるように成分調整した。
200mM Tris
pH7.2
xmM チオNAD
ymM NAD
1% 界面活性剤
測定は以下のように行った。可視部測定装置を用い、試料3.0μLと第一試薬100μLとを37℃、5分間混合した後、第二試薬100μLを加え同温度で5分間反応させる。発色反応後の吸光度を当該機種の1ポイントエンド法により主波長405nm、副波長505nmで測定した。
得られた結果を図1に示す。図1の結果から、チオNADに加えてNADを添加した場合、測定ブランクが低く、傾きも小さくなることが判明した。チオNADとNADとの混合で用いた組成では実施例1では50mg/dLまで、実施例2、3では、75mg/dLまで測定可能であった。
一方、比較例1としてチオNADを単独で用いた組成では、直線性が尿素窒素25mg/dL以上では測定可能な吸光度をオーバーしてしまうため、測定不可能であった。
Claims (8)
- デヒドロゲナーゼ、対応する基質および補酵素を用いて反応させて試料中の該デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する測定方法において、補酵素としてチオNADまたはチオNADPおよびNADまたはNADPを用いて反応させ、生成するチオNADHまたはチオNADPHに由来する吸光度の増加を測定することにより、その試料中のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する測定方法。
- 用いるNADまたはNADPが、チオNADまたはチオNADPの0.5倍モル数以上である、請求項1記載の測定方法。
- 試料中の特定物質を酵素反応によりデヒドロゲナーゼ又は対応する基質を中間的または最終的に発生させ、そのデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を、請求項1または2に記載の測定方法に付し、中間的または最終的に生成したデヒドロゲナーゼまたは対応する基質の量に由来して、試料中の特定物質を測定する測定方法。
- デヒドロゲナーゼがグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼであり、対応する基質がグルコース-6-リン酸である、請求項1から3のいずれかに記載の測定方法。
- 酵素反応が複数の酵素反応である、請求項4に記載の測定方法。
- デヒドロゲナーゼがグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼであり、対応する基質がグルコース-6-リン酸であり、特定物質が尿素であり、第一の酵素反応が、試料中の尿素に、試薬由来のATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼとを作用させてADPを中間的に発生させる反応であり、かつ、第二の酵素反応がそのADPに、試薬由来のヘキソキナーゼを作用させてグルコース-6-リン酸を発生させる反応である、請求項5に記載の測定方法。
- デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分とし、かつ、補酵素としてチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPとを必須成分として含む測定用キット。
- 特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分とそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分とを必須成分として含み、かつ、補酵素としてチオNADまたはチオNADPとNADまたはNADPとを必須成分として含む測定用キット。
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