WO2011013464A1 - デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法および測定用キット - Google Patents

デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法および測定用キット Download PDF

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WO2011013464A1
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nad
thio
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健太 野田
善郎 佐藤
良 小島
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日東紡績株式会社
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    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/58—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample and a kit used therefor.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • dehydrase and substrate used in such a method includes lactate dehydrogenase and lactate, glutamate dehydrogenase and glutamate, alcohol dehydrogenase and alcohol, glycerol-3-phosphate dehydrogenase and glycerol-3-phosphate, glucose-6- Phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate are known.
  • lactate dehydrogenase and lactate glutamate dehydrogenase and glutamate
  • alcohol dehydrogenase and alcohol glycerol-3-phosphate dehydrogenase and glycerol-3-phosphate
  • glucose-6- Phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate are known.
  • the other one is used as a reagent together with the coenzyme.
  • a specific dehydrogenase or a corresponding substrate is generated intermediately or finally by enzymatic reaction of the specific substance with a reagent, and the dehydrogenase or It is also widely performed to react a corresponding substrate with the above-mentioned coenzyme and consequently measure a specific substance.
  • NAD or NADP is finally converted into reduced NADH or NADPH by a dehydrogenase reaction, and the resulting increase in absorbance in the ultraviolet wavelength region (usually 340 nm)
  • the ultraviolet wavelength region usually 340 nm
  • simple glass or plastic cannot be used as a measurement cell, expensive quartz must be used, and in addition, an ultraviolet light source or detection device must be used as an analyzer.
  • the analysis apparatus tends to be large and expensive. As a result, it could not be applied to a device using a visible spectrophotometer that can be measured in the field of dry chemistry and small hospitals. Therefore, in order to be able to use in such a case, a method for measuring the aforementioned dehydrogenase or the corresponding substrate in the visible region is desired.
  • Patent Document 1 discloses an enzyme cycling reaction using a combination of thio-NAD or thio-NADP and NADH or NADPH as a coenzyme when glucose-6-phosphate is reacted with glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • a method has been proposed in which glucose-6-phosphate is measured using thioNADH or thioNADPH, which is a reduced enzyme produced, based on the absorbance in the visible region near 400 nm.
  • this method uses an enzyme cycling reaction, and is not necessarily a simple measurement method, and cannot be said to be a measurement method suitable for measuring a high concentration measurement object. is there.
  • the problem of the present invention is that it can be measured based on the absorbance in the visible region, can be applied to an apparatus using a visible spectrophotometer that can be measured in the field of dry chemistry and small hospitals, and exists in a sample at a high concentration. It is to provide a method for accurately measuring dehydrogenase or a corresponding substrate.
  • Patent Document 1 the present inventors have used an enzyme reaction to convert a coenzyme thioNAD or thioNADP used for measuring a low concentration of dehydrogenase or a corresponding substrate by an enzyme cycling method. Paying attention to changing the absorbance in the visible region, we examined a method for measuring the measurement target present in the sample at a high concentration using the coenzyme. As a result, when thio-NAD or thio-NADP is used with a high-concentration measurement target as a coenzyme, linearity is difficult to maintain in the high-concentration region, and in addition, the blank may be high, and the measurement target cannot be measured accurately It has been found.
  • the present inventor makes an enzyme reaction using NAD as a coenzyme, and then uses the sample from which the substance has been removed to use a dehydrogenase, a corresponding substrate and An attempt was made to measure dehydrogenase or its corresponding substrate in a sample by reacting thio-NAD and measuring the absorbance in the visible region.
  • the dehydrogenase or the corresponding substrate contained in the sample by the absorbance in the visible region by using both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as a coenzyme, even if the measurement target is a high concentration region
  • the linearity can be maintained and the blank of the calibration curve can be made small.
  • the dehydrogenase or the corresponding substrate can be measured easily and accurately in a wide range of the concentration to be measured with a simple visible spectrophotometer.
  • the present invention has been completed by finding that a method can be provided.
  • the present invention relates to a method for measuring a dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample by reacting with a dehydrogenase, a corresponding substrate and a coenzyme, wherein thioNAD or thioNADP and NAD or NADP are used as a coenzyme.
  • the present invention relates to a measurement method for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample by measuring an increase in absorbance derived from thio-NADH or thio-NADPH produced by reaction.
  • the present invention provides a method in which a dehydrogenase or a corresponding substrate is generated intermediately or finally by enzymatic reaction of a specific substance in a sample, and the dehydrogenase or the corresponding substrate is subjected to the above-described measurement method, and the intermediate or final
  • the present invention relates to a measurement method for measuring a specific substance in a sample derived from the amount of dehydrogenase produced or a corresponding substrate.
  • the present invention is a measurement kit for measuring a dehydrogenase or a corresponding substrate, wherein a component other than a measurement target among the substrates corresponding to the dehydrogenase is an essential component, and thioNAD or thioNADP is used as a coenzyme. And a measurement kit containing NAD or NADP as essential components. Furthermore, the present invention is a measurement kit for measuring a specific substance, which is derived from a component for deriving from a specific substance to dehydrogenase or a corresponding substrate by an enzymatic reaction and a substrate corresponding to the dehydrogenase. The present invention relates to a measurement kit that contains other components as essential components and thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components as coenzymes.
  • measurement is carried out by using both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as coenzymes, even though the dehydrogenase or corresponding substrate contained in the sample is measured by absorbance in the visible region.
  • the linearity can be maintained even when the target is a high concentration region, and the blank of the calibration curve can be reduced.
  • a simple visible spectrophotometer can easily and accurately measure in a wide range of concentration to be measured.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result of having measured urea nitrogen by the method of Examples 1, 2, and 3 and the comparative example 1.
  • FIG. 1 shows the result of having measured urea nitrogen by the method of Examples 1, 2, and 3 and the comparative example 1.
  • the sample used in the present invention is preferably a biological sample such as serum, plasma, urine, or a model sample thereof.
  • the measurement object of the present invention is a dehydrogenase or a corresponding substrate in a sample, and a specific substance in a sample that can generate dehydrogenase or a corresponding substrate intermediately or finally by an enzymatic reaction.
  • the reaction is carried out in the presence of both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as coenzymes.
  • thio-NAD or thio-NADP any combination of thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP may be used, but a combination of thio-NAD and NAD or a combination of thio-NADP and NADP is preferred.
  • thio NAD or thio NADP may be abbreviated as thio NAD (P).
  • NAD or NADP may be abbreviated as NAD (P).
  • thioNAD means thionicotinamide adenine dinucleotide
  • thioNADP means thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
  • NAD means nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP means nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • thio-NADH, thio-NADPH, NADH, and NADPH mean reduced forms of coenzymes, that is, reduced forms of thio-NAD, thio-NADP, NAD, and NADP, respectively.
  • thioNADH or thioNADPH may be abbreviated as thioNAD (P) H.
  • NADH or NADPH may be abbreviated as NAD (P) H.
  • the amount of NAD (P) used is not particularly limited, but is preferably 0.5 times the number of moles of thio-NAD (P) used, more preferably 1.5 to 30 times the number of moles, Most preferred is 3.0 to 20 times the number of moles. If the amount of NAD (P) is too small, the linearity of the calibration curve may be difficult to maintain, and the blank reduction may be insufficient. On the other hand, if the amount of NAD (P) is too large, the slope of the straight line of the calibration curve may be small, and it may be difficult to accurately measure the measurement target.
  • the dehydrogenase reaction is performed using both thio-NAD (P) and NAD (P) as coenzymes, and the increase in absorbance derived from the produced thio-NAD (P) H is measured.
  • the wavelength for measuring the absorbance is preferably in the range of 395 to 415 nm and can be measured in the visible region, so that it can be measured with a simple visible spectrophotometer as the analyzer to be used.
  • the dehydrogenase or the corresponding substrate includes, for example, a dehydrogenase that can be measured by a dehydrogenase enzymatic reaction using NAD (P) or thioNAD (P) as a coenzyme that is currently measured in the clinical laboratory industry.
  • NAD NAD
  • thioNAD thioNAD
  • the dehydrogenase or the corresponding substrate may be a dehydrogenase or a corresponding substrate that is originally present in the sample.
  • It may also be a dehydrogenase or corresponding substrate generated intermediately or finally by enzymatic reaction of the specific substance to measure a specific substance in a sample, depending on the generated dehydrogenase or corresponding substrate. As a result, the specific substance can be measured.
  • Examples of combinations of dehydrogenase and substrate used in such a method include lactate dehydrogenase and lactic acid, glutamate dehydrogenase and glutamate, alcohol dehydrogenase and alcohol, glycerol-3-phosphate dehydrogenase and glycerol-3-phosphate, glucose- Examples thereof include 6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate.
  • the other one in order to measure either one of the combinations, the other one can be used as a reagent for causing a dehydrogenase enzyme reaction together with a coenzyme.
  • a measurement object that exists in a sample at a high concentration is suitable.
  • the dehydrogenase is glucose
  • a dehydrogenase or a corresponding substrate generated intermediately or finally by enzymatic reaction of a specific substance in a sample to measure a specific substance in a sample is used as the dehydrogenase or corresponding substrate
  • the dehydrogenase is glucose
  • -6-phosphate dehydrogenase and the corresponding substrate is glucose-6-phosphate.
  • urea can be measured as the specific substance (note that urea may be conventionally obtained as urea nitrogen).
  • ADP as a first enzyme reaction, ADP, magnesium ion, potassium ion, hydrogen carbonate ion and urea amide lyase are reacted with urea in the sample to generate ADP, and then the second As an enzymatic reaction of the above, the reagent-derived hexokinase is allowed to act on the ADP to generate glucose-6-phosphate, and then the resulting glucose-6-phosphate (corresponding substrate) is converted to glucose-6-phosphate.
  • dehydrogenase dehydrogenase
  • thio-NAD P
  • NAD NAD
  • glucose-6 produced from the increase in absorbance depending on the amount of thio-NAD (P) H produced.
  • -Phosphoric acid corresponding substrate
  • ADP-dependent hexokinase is preferable as the hexokinase. This example is shown in the reaction formula as follows.
  • a component other than the measurement target among the substrate corresponding to the dehydrogenase is an essential component, and in addition to that, if necessary, a buffer, Those containing other components such as a surfactant can be used.
  • a surfactant thio-NAD (P) and NAD (P) are essential components, and in addition, buffers, surfactants, etc. Those containing other components can be used.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase is an essential component as a dehydrogenase as a first reagent
  • thio-NAD ( P) and NAD (P) are essential components
  • other components such as a buffering agent and a surfactant can be included in the first reagent and the second reagent.
  • the mixed solution and the second reagent are mixed, the enzyme reaction is performed for 0.5 to 15 minutes, and the absorbance of the obtained reaction solution is measured at 405 nm with a visible spectrophotometer.
  • the concentration of the measurement target in the sample can be measured by comparing the measured value with a calibration curve prepared in advance.
  • the first reagent and the second reagent can be mixed to form one measurement reagent, and the measurement reagent and the sample can be mixed.
  • An enzymatic reaction can also be carried out by performing a partial reaction.
  • the first reagent when measuring a specific substance as a measurement target, for example, includes, as essential components, a component for deriving dehydrogenase or a corresponding substrate from the specific substance by an enzymatic reaction, and a substrate corresponding to the dehydrogenase.
  • the second reagent contains thio-NAD (P) and NAD (P).
  • other components such as a buffer and a surfactant can be included.
  • urea as a specific substance to be specifically measured, for example, as a first reagent, urea (ie, a specific substance) is induced to glucose-6-phosphate (ie, a corresponding substrate) by an enzymatic reaction.
  • a first enzyme reaction-inducing component for producing ADP from urea ie, urea amide lyase, ATP, Mg 2+ , K + , HCO 3 ⁇
  • ADP to glucose-6-phosphate ie, corresponding
  • a second enzyme reaction-inducing component ie, glucose, hexokinase
  • a reagent component containing glucose-6-phosphate dehydrogenase as a dehydrogenase can be used.
  • the second reagent contains both thio-NAD (P) and NAD (P) as essential components.
  • the first reagent and the second reagent may include those containing other components such as a buffer and a surfactant.
  • a specific substance is measured as an object to be measured
  • the first reagent is mixed with a sample, and after 0 to 15 minutes, the resultant mixed liquid is then obtained.
  • the second reagent are mixed, the enzyme reaction is carried out for 0.5 to 15 minutes, and the absorbance of the resulting reaction solution is measured at 405 nm with a visible spectrophotometer.
  • the concentration of the measurement target in the sample can be measured by comparing the measured value with a calibration curve prepared in advance.
  • the first reagent and the second reagent can be mixed to form one measuring reagent, and the measuring reagent and the sample can be mixed.
  • An enzymatic reaction can also be carried out by reacting for 15 minutes.
  • a measurement kit for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate wherein a component other than the measurement target among the substrate corresponding to dehydrogenase is an essential component
  • a measurement kit containing thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components can be used.
  • a measurement kit for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate in order to measure dehydrogenase or a corresponding substrate, it is a measurement kit for measuring dehydrogenase or a corresponding substrate, and includes components other than the measurement target among the substrates corresponding to dehydrogenase as essential components
  • a measurement kit containing a first reagent and a second reagent containing thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components can be used.
  • a measurement kit for measuring a specific substance in order to measure a specific substance, the component for deriving from the specific substance to dehydrogenase or a corresponding substrate by an enzymatic reaction, and the dehydrogenase A kit for measurement containing components other than those derived from the corresponding substrate as essential components and thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components as coenzymes can be used.
  • a second reagent containing thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as essential components can be used.
  • the first reagent and the second reagent in these measurement kits can contain other components such as a buffer and a surfactant as necessary as described above.
  • urea nitrogen measurement system using urea amidolyase, hexokinase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, a measurement system in which thio-NAD and NAD are mixed as coenzymes (Examples 1, 2 and 3), and thio-NAD
  • the measurement system (Comparative Example 1) used alone was compared.
  • urea was quantified as the amount of urea nitrogen.
  • Samples and reagents are as follows. Sample : The urea solution was prepared so that it might become 75 mg / dL as urea nitrogen, and it diluted suitably with the physiological saline to each density
  • First reagent The components were adjusted so that the first reagent had the following concentration. 20 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) pH 9.0 10 mM D-glucose 10 mM magnesium acetate tetrahydrate 10 mM potassium hydrogen carbonate 10 mM ATP ⁇ 2Na (adenosine triphosphate ⁇ disodium) 1% Surfactant 6KU / L Hexokinase 2KU / L Ureaamide lyase 2KU / L Glucose-6-phosphate dehydrogenase Second reagent : The components of Tris and surfactant as the second reagent were adjusted to the following concentrations. 200 mM Tris pH 7.2 xmM Thio NAD ymM NAD 1% surfactant
  • thio NAD and NAD as the second reagent are shown in Table 1.
  • thio-NAD alone was used except for NAD from the second reagent composition.
  • Measuring method The measurement was performed as follows. Using a visible part measuring apparatus, 3.0 ⁇ L of the sample and 100 ⁇ L of the first reagent are mixed at 37 ° C. for 5 minutes, and then 100 ⁇ L of the second reagent is added and reacted at the same temperature for 5 minutes. The absorbance after the color reaction was measured at a main wavelength of 405 nm and a sub wavelength of 505 nm by the one-point end method of the model.
  • a dehydrogenase or a corresponding substrate contained in a sample is measured by an enzymatic reaction, it is measured by the absorbance in the visible region by using both thio-NAD or thio-NADP and NAD or NADP as a coenzyme. It is possible to maintain linearity even when the measurement target is a high concentration region, and the calibration curve blank can be reduced. As a result, a simple visible spectrophotometer can easily and accurately measure in a wide range of concentration to be measured.

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Abstract

　試料中に含まれるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する方法において、補酵素として、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰの両方を用いることにより、可視部での吸光度に基づく測定が可能で、かつ、高濃度で試料中に存在するデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を正確に測定することができる。

Description

デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法および測定用キット
　本発明は、試料中のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する方法およびそれに用いるキットに関する。
　血清、血漿等の試料中には、高濃度のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質が存在する。臨床化学診断においては、それらを測定するため、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）を用いることが一般的である。このような方法に用いられるデヒドゲナーゼと基質との組み合わせとしては、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルタミン酸、アルコールデヒドロゲナーゼとアルコール、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼとグリセロール－３－リン酸、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼとグルコース－６－リン酸等が知られている。この場合、その組み合わせのいずれか一方を測定するため、他の一方を、補酵素とともに試薬として用いる。また、それと同様に、試料中の尿素等の特定物質を測定するため、特定物質を試薬により酵素反応させることにより、特定のデヒドロゲナーゼ又は対応する基質を中間的または最終的に発生させ、そのデヒドロゲナーゼ又は対応する基質を上記補酵素とともに反応させ、結果的に特定物質を測定することも幅広く行われている。
　これらの測定方法においては、最終的にはＮＡＤまたはＮＡＤＰがデヒドロゲナーゼ反応により、還元型であるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換され、その結果生ずる紫外線波長域（通常、３４０ｎｍ）における吸光度の上昇に基づいてデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する方法を採用することが一般的である。しかし、この場合、紫外線領域で測定するため、測定セルとして簡便なガラスやプラスチックは使えず、高価な石英を用いる必要があり、加えて分析装置として紫外線光源や検出装置を使う必要があり、そのため、分析装置が大型で高価になりやすいという傾向があった。その結果、ドライケミストリーの分野や小さい病院でも測定できる可視分光光度計を用いた装置には適用できなかった。よって、そのような場合に使用できるようにするためには、可視部で、前記したデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する方法が望まれている。
　他方、特許文献１には、グルコース－６－リン酸にグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼを反応させる際に、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとの組み合わせを用いて、酵素サイクリング反応を行わせ、生成する還元型酵素であるチオＮＡＤＨまたはチオＮＡＤＰＨを４００ｎｍ付近の可視部の吸光度に基いて、グルコース－６－リン酸を測定する方法が提案されている。しかしながら、この方法は酵素サイクリング反応を用いるものであって、必ずも簡便な測定方法とは言えないものであり、また高濃度の測定対象物を測定するのに適した測定方法とも言えないものである。
特開平４－３３５８９８号公報
　本発明の課題は、可視部での吸光度に基く測定が可能で、ドライケミストリーの分野や小さい病院でも測定できる可視分光光度計を用いた装置に適用でき、かつ、高濃度で試料中に存在するデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を正確に測定する方法を提供することにある。
　本発明者らは、例えば特許文献１に記載されているように、酵素サイクリング法により低濃度のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するために用いられている補酵素チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰが酵素反応により可視部の吸光度を変化させるのに注目し、その補酵素を用いて、試料中に高濃度で存在する測定対象を測定する方法について検討した。その結果、高濃度の測定対象を補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰを用いた場合、高濃度領域で直線性が維持されにくく、加えてブランクも高くなることがあり、測定対象を正確に測定できないことが判明した。
　本発明者は、試料中のある種の物質をある酵素で除去するため、補酵素としてＮＡＤを用いて酵素反応をさせ、次に、その物質を除去した試料を用いてデヒドロゲナーゼ、対応する基質およびチオＮＡＤを反応させて可視部領域の吸光度を測定することにより、試料中のデヒドロゲナーゼまたはその対応する基質を測定しようと試みた。ところが、ＮＡＤとチオＮＡＤの添加の順番にかかわらず、試料にデヒドロゲナーゼ、対応する基質、チオＮＡＤおよびＮＡＤを共存させた単純な構成で可視部領域の吸光度を測定することにより、驚くべきことに、反応ブランクが減少し、検量線の傾きが小さくなり、試料中のデヒドロゲナーゼまたはその対応する基質を正確に測定できることを発見した。その結果、このような構成により、上記の問題が解決され、高濃度領域でもデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を正確に測定できることが判明した。
　従って、試料中に含まれるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を可視部の吸光度で測定する方法において、補酵素として、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰの両方を用いることにより、測定対象が高濃度領域でも直線性を維持でき、かつ、検量線のブランクを小さくすることができ、その結果、簡便な可視分光光度計にて測定対象濃度の広い領域で、簡単かつ正確にデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する方法を提供できることを見出し、本発明を完成した。
　従って、本発明は、デヒドロゲナーゼ、対応する基質および補酵素を用いて反応させて試料中の該デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する測定方法において、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰおよびＮＡＤまたはＮＡＤＰとを用いて反応させ、生成するチオＮＡＤＨまたはチオＮＡＤＰＨに由来する吸光度の増加を測定することにより、その試料中のデヒドロゲナーゼ又は対応する基質を測定する測定方法に関する。
　更に、本発明は、試料中の特定物質を酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を中間的または最終的に発生させ、そのデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を、上記の測定方法に付し、中間的または最終的に生成したデヒドロゲナーゼまたは対応する基質の量に由来して、試料中の特定物質を測定する測定方法に関する。
　更に、本発明は、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分とし、かつ、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとを必須成分として含む測定用キットに関する。
　更に、本発明は、特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分とそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分とを必須成分として含み、かつ、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとを必須成分として含む測定用キットに関する。
　本発明によれば、試料中に含まれるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を可視部の吸光度で測定するにもかかわらず、補酵素として、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰの両方を用いることにより、測定対象が高濃度領域でも直線性を維持でき、かつ、検量線のブランクを小さくすることができる。その結果、簡便な可視分光光度計にて測定対象濃度の広い領域で、簡単かつ正確に測定できる。
実施例１、２および３並びに比較例１の方法で尿素窒素を測定した結果を示す図である。
　本発明に用いられる試料としては、血清、血漿、尿等の生体試料、またはそれらのモデルサンプルが好ましい。
　本発明の測定対象は、試料中のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質であり、また、酵素反応により中間的または最終的にデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を発生させることができる試料中の特定物質である。
　本発明においては、デヒドロゲナーゼ酵素反応を行う際、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰおよびＮＡＤまたはＮＡＤＰの両方を存在させて反応させる。チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとの組み合せはいずれでもよいが、チオＮＡＤとＮＡＤとの組み合せ、あるいはチオＮＡＤＰとＮＡＤＰとの組み合せが好ましい。
　以下、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰを、チオＮＡＤ（Ｐ）と略記することがある。また、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを、ＮＡＤ（Ｐ）と略記することがある。
　本発明においては、チオＮＡＤとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオＮＡＤＰとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。また、ＮＡＤとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、ＮＡＤＰとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
　本明細書において、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨとは、補酵素の還元型、すなわち、それぞれ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰの還元型を意味する。以下、チオＮＡＤＨまたはチオＮＡＤＰＨを、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略記することがある。また、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略記することがある。
　本発明においては、用いるＮＡＤ（Ｐ）の量は、特に限定しないが、用いるチオＮＡＤ（Ｐ）の量の０．５倍モル数以上が好ましく、１．５～３０倍モル数がさらに好ましく、３．０～２０倍モル数が最も好ましい。ＮＡＤ（Ｐ）の量が少なすぎると検量線の直線性が維持しにくいこともあり、また、ブランク低下が不十分なときもある。一方、ＮＡＤ（Ｐ）の量が大きすぎると検量線の直線の傾きが小さくなることがあり、正確に測定対象を測定できにくいことがある。
　本発明においては、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）の両方を用いてデヒドロゲナーゼ反応させ、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する吸光度の増加を測定する。吸光度を測定するための波長は、３９５～４１５ｎｍの範囲が好ましく、可視部領域で測定できるため、用いる分析装置として簡易な可視分光光度計で測定できる。
　本発明において、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質としては、例えば、現在、臨床検査業界で測定対象となっている補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）やチオＮＡＤ（Ｐ）を用いてデヒドロゲナーゼ酵素反応により測定できるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質であれば特に限定されない。この場合、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質は、試料中に当初から存在しているデヒドロゲナーゼまたは対応する基質でもよい。また、試料中の特定物質を測定するためその特定物質を酵素反応させることにより中間的または最終的に発生されたデヒドロゲナーゼまたは対応する基質でもよく、この場合、発生されたデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に依存して、結果的に、特定物質を測定することができる。
　このような方法に用いられるデヒドロゲナーゼと基質との組み合わせとしては、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルタミン酸、アルコールデヒドロゲナーゼとアルコール、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼとグリセロール－３－リン酸、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼとグルコース－６－リン酸等を例示できる。この場合、その組み合わせのいずれか一方を測定するため、他の一方を、補酵素とともにデヒドロゲナーゼ酵素反応をさせるための試薬として用いることができる。本発明においては、試料に高濃度で存在する測定対象が好適である。
　デヒドロゲナーゼまたは対応する基質として、試料中の特定物質を測定するため試料中の特定物質を酵素反応させることにより中間的または最終的に発生されたデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を用いる場合、例えば、デヒドロゲナーゼがグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼであり、対応する基質がグルコース－６－リン酸である場合を例示できる。その場合、例えば、特定物質として尿素（なお、尿素は慣習的に尿素窒素として求めても良い）を測定することができる。この場合、例えば、第一の酵素反応として、試料中の尿素に、試薬由来のＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼとを作用させてＡＤＰを発生させ、次いで、第二の酵素反応として、そのＡＤＰに、試薬由来のヘキソキナーゼを作用させてグルコース－６－リン酸を発生させ、次いで、生成するグルコース－６－リン酸（対応する基質）に、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（デヒドロゲナーゼ）とチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）とを作用させデヒドロゲナーゼ酵素反応をさせることにより、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に依存した吸光度の上昇から、生成するグルコース－６－リン酸（対応する基質）を測定することができ、それに基づいて結果的に、試料中の特定物質として尿素を測定することができる。このとき、ヘキソキナーゼとしては、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが好ましい。
この例を反応式で示すと以下のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明において、測定対象としてデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するときには、例えば、第一試薬として、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分とし、それ以外に、必要により緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませたものを用いることができ、第二試薬として、チオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を必須成分とし、それ以外に、緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませたものを用いることができる。
　この場合、具体的な測定対象として、グルコース－６－リン酸を測定するときは、例えば、第一試薬として、デヒドロゲナーゼとしてグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼを必須成分とし、第二試薬としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を必須成分とし、その他として、第一試薬及び第二試薬には、緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませることができる。
　このような第一試薬と第二試薬とを用い、測定対象として、デヒドロゲナーゼ又は対応する基質を測定するときは、例えば、試料と第一試薬を混合させ０～１５分の後、次いで、得られる混合液と第二試薬を混合させ、０．５～１５分酵素反応を行い、可視分光光度計で、得られる反応液の吸光度を４０５ｎｍで測定する。あらかじめ作成した検量線との測定値との比較により、試料中の測定対象の濃度を測定できる。またこの場合の試料と試薬の混合においては、まず、第一試薬と第二試薬を混合して一つの測定試薬にし、その測定試薬と試料を混合することができ、さらに、０．５～１５分反応することによっても酵素反応をすることができる。
　本発明において、測定対象として特定物質を測定するときには、例えば、第一試薬には、必須成分として特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分、及びそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されたもの以外の成分を含ませ、それ以外に、必要により緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませ、第二試薬は、チオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を必須成分とし、それ以外に、緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませることができる。
　この場合、具体的な測定対象の特定物質として尿素を測定するときは、例えば、第一試薬として、尿素（すなわち特定物質）から酵素反応によりグルコース－６－リン酸（すなわち対応する基質）に誘導する成分として、尿素からＡＤＰを生成するための第一酵素反応誘導成分（すなわち、ウレアアミドリアーゼ、ＡＴＰ、　Ｍｇ２＋、Ｋ＋、ＨＣＯ３ －）、ＡＤＰからグルコース－６－リン酸（すなわち対応する基質）を生成するための第二酵素反応誘導成分（すなわち、グルコース、ヘキソキナーゼ）、試薬成分のデヒドロゲナーゼとしてグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼを含んでいるものを用いることができる。第二試薬は、チオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）の両方を必須成分とする。それ以外に、第一試薬および第二試薬には、緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を含ませたものを用いることができる。
　このような第一試薬と第二試薬とを用い、測定対象として、特定物質を測定するときは、例えば、試料とに第一試薬を混合させ０～１５分の後、次いで、得られる混合液と第二試薬を混合させ、０．５～１５分酵素反応を行い、可視分光光度計で、得られる反応液の吸光度を４０５ｎｍで測定する。あらかじめ作成した検量線との測定値との比較により、試料中の測定対象の濃度を測定できる。またこの場合の試料と試薬の混合においては、まず、第一試薬と第二試薬を混合して一つの測定試薬にし、その測定試薬と試料を混合することができ、さらにそれを０．５～１５分反応することによっても酵素反応をすることができる。
　以上の説明から明らかなように、本発明においては、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分とし、かつ、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとを必須成分として含む測定用キットを用いることができる。
　この場合、例えば、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するために、デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分として含む第一試薬、およびチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰを必須成分として含む第二試薬を含有する測定用キットを用いることができる。
　また、本発明においては、特定物質を測定するために、特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分とそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分とを必須成分として含み、かつ、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとを必須成分として含む測定用キットを用いることができる。
　この場合、例えば、特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分およびそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分を必須成分として含む第一試薬、およびチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰを必須成分として含む第二試薬を含有する測定用キットを用いることができる。
　これらの測定用キットにおける第一試薬および第二試薬には、上記したように緩衝剤、界面活性剤等の他の成分を必要に応じて含ませることができる。
　以下、本発明を実施例および比較例を用いて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
実施例１、２および３並びに比較例１
尿素窒素の可視部測定装置を使用した測定
　試料中の特定物質としての尿素窒素を測定するために、第一の酵素反応として、試料中の尿素窒素に、試薬由来のＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼとを作用させてＡＤＰを発生させ、次いで、第二の酵素反応として、そのＡＤＰに、試薬由来のヘキソキナーゼを作用させてグルコース－６－リン酸を発生させ、次いで、生成するグルコース－６－リン酸（対応する基質）に、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（デヒドロゲナーゼ）とチオＮＡＤとＮＡＤとを作用させて、生成するチオＮＡＤＨの量に依存した吸光度の上昇から、生成するグルコース－６－リン酸（対応する基質）を測定することにより、試料中の特定物質としての尿素窒素を測定した。また、比較対照として、チオＮＡＤを単独で用いて同様の測定も行った。
１．方法
　ウレアアミドリアーゼ、ヘキソキナーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼを用いた尿素窒素測定系において、補酵素としてチオＮＡＤとＮＡＤを混合した測定系（実施例１、２および３）、およびチオＮＡＤを単独として用いた測定系（比較例１）を比較した。この場合、尿素は、尿素窒素量として定量した。試料、および試薬は以下の通りである。
試料：
　尿素窒素として７５ｍｇ／ｄＬとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。
第一試薬：
　第一試薬が、以下のような濃度になるように成分を調整した。
　２０ｍＭ　　　　　Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）
　　　　　　　　　　ｐＨ９．０
　１０ｍＭ　　　　　Ｄ－グルコース
　１０ｍＭ　　　　　酢酸マグネシウム・四水和物
　１０ｍＭ　　　　　炭酸水素カリウム
　１０ｍＭ　　　　　ＡＴＰ・２Ｎａ（アデノシン三リン酸・二ナトリウム）
　１％　　　　　　　界面活性剤
　６ＫＵ／Ｌ　　　　ヘキソキナーゼ
　２ＫＵ／Ｌ　　　　ウレアアミドリアーゼ
　２ＫＵ／Ｌ　　　　グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ
第二試薬：
　第二試薬のＴｒｉｓ、界面活性剤は以下のような濃度になるように成分調整した。
　２００ｍＭ　　　　Ｔｒｉｓ
　　　　　　　　　　ｐＨ７．２
　ｘｍＭ　　　　　　チオＮＡＤ
　ｙｍＭ　　　　　　ＮＡＤ
　１％　　　　　　　界面活性剤
　第二試薬のチオＮＡＤとＮＡＤの添加量は表１に示す。また、比較例１では上記の第二試薬組成からＮＡＤを除きチオＮＡＤ単独で用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
測定方法：
　測定は以下のように行った。可視部測定装置を用い、試料３．０μＬと第一試薬１００μＬとを３７℃、５分間混合した後、第二試薬１００μＬを加え同温度で５分間反応させる。発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により主波長４０５ｎｍ、副波長５０５ｎｍで測定した。
２．結果
　得られた結果を図１に示す。図１の結果から、チオＮＡＤに加えてＮＡＤを添加した場合、測定ブランクが低く、傾きも小さくなることが判明した。チオＮＡＤとＮＡＤとの混合で用いた組成では実施例１では５０ｍｇ／ｄＬまで、実施例２、３では、７５ｍｇ／ｄＬまで測定可能であった。
　一方、比較例１としてチオＮＡＤを単独で用いた組成では、直線性が尿素窒素２５ｍｇ／ｄＬ以上では測定可能な吸光度をオーバーしてしまうため、測定不可能であった。
　本発明においては、試料中に含まれるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を酵素反応により測定する際に、補酵素として、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰの両方を用いることにより、可視部の吸光度により測定することが可能となり、測定対象が高濃度領域でも直線性を維持でき、かつ、検量線のブランクを小さくすることができる。その結果、簡便な可視分光光度計にて測定対象濃度の広い領域で、簡単かつ正確に測定できる。

Claims (8)

  1. 　デヒドロゲナーゼ、対応する基質および補酵素を用いて反応させて試料中の該デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する測定方法において、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰおよびＮＡＤまたはＮＡＤＰを用いて反応させ、生成するチオＮＡＤＨまたはチオＮＡＤＰＨに由来する吸光度の増加を測定することにより、その試料中のデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定する測定方法。
  2. 　用いるＮＡＤまたはＮＡＤＰが、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰの０．５倍モル数以上である、請求項１記載の測定方法。
  3. 　試料中の特定物質を酵素反応によりデヒドロゲナーゼ又は対応する基質を中間的または最終的に発生させ、そのデヒドロゲナーゼまたは対応する基質を、請求項１または２に記載の測定方法に付し、中間的または最終的に生成したデヒドロゲナーゼまたは対応する基質の量に由来して、試料中の特定物質を測定する測定方法。
  4. 　デヒドロゲナーゼがグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼであり、対応する基質がグルコース－６－リン酸である、請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
  5. 　酵素反応が複数の酵素反応である、請求項４に記載の測定方法。
  6. 　デヒドロゲナーゼがグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼであり、対応する基質がグルコース－６－リン酸であり、特定物質が尿素であり、第一の酵素反応が、試料中の尿素に、試薬由来のＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼとを作用させてＡＤＰを中間的に発生させる反応であり、かつ、第二の酵素反応がそのＡＤＰに、試薬由来のヘキソキナーゼを作用させてグルコース－６－リン酸を発生させる反応である、請求項５に記載の測定方法。
  7. 　デヒドロゲナーゼまたは対応する基質を測定するための測定用キットであって、デヒドロゲナーゼと対応する基質のうち測定対象以外の成分を必須成分とし、かつ、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとを必須成分として含む測定用キット。
  8. 　特定物質を測定するための測定用キットであって、特定物質から酵素反応によりデヒドロゲナーゼまたは対応する基質に誘導するための成分とそのデヒドロゲナーゼと対応する基質のうち誘導されるもの以外の成分とを必須成分として含み、かつ、補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとＮＡＤまたはＮＡＤＰとを必須成分として含む測定用キット。
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