JPS63146800A - 無機リンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影響を回避することができ、かつ自動分析器に容易
に適用可能な無機リンの測定法に関する。

（従来の技術） 従来、無機リン（Ｐｉ）の測定によく用いられている方
法としては、無機リン（Ｐｉ）でリンモリブデン酸を還
元しモリブデン青として測定するリンモリブデン酸法が
知られている。この方法は還元性物質の影響を１強く受
け、しかも硫酸等の強い酸を使うため機器を傷めてしま
い、よい方法とは言えない。

それに代わって、いくつかの酵素的測定法が開発されて
いる。例えば、ホスホリラーゼａを用い、具体的には次
に示すよう方法が知られている。

ホスホリラーゼａ グリコーゲン＋Ｐｉ　　　　　　　　　Ｇ−１−リン酸
ホスホグルコムクーゼ Ｇ−１−リン酸　　　　　　　　　　　　Ｇ−６−リン
酸Ｇ−６−ＰＣＩ＋ Ｇ−６−リン酸十ＮＡＤ□ ６−ホスホグルコン酸＋ＮＡＤＩ＋ この方法は、グリコーゲンの分子量が一定でなく管理し
にくい欠点がある。

また、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼの反応を用いるものも知られている。しかし
、この方法はあまり使われていない。

最近よく使われる方法に、イノシンとプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼを加え、加リン酸分解によって生成す
るヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより酸化
し、生成するＨよ０２をペルオキシダーゼ発色系に共役
させて比色する方法がある。これは非常に簡便であるも
のの、生体中のビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロ
ビン等の還元性物質の影響を受け、また乳びの影響も受
けるという欠点がある。

又、ごく最近では、ヌクレオシドとヌクレオシド−ホス
ホリラーゼの存在下で無機リン（Ｐ　ｉ）を反応させて
生じた塩素またはリボース−１−ホスフェートを定量す
ることによって無機リン（Ｐｉ）を測定する方法が、特
開昭６０−１６０８９８号公報に開示されている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、上記した従来方法を改良すべく研究ヲ重
ねた結果、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影響を回避し、かつ自動分析器に容易に適用可能な
無機リンの測定法を発明したものである。

（問題を解決するための手段） 本発明の要旨は、シュクロースホスホリラーゼを介在さ
せてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成したフ
ラクトースを測定することによって無機リンを測定する
ことを特徴とする無機リンのべ１１定法に存する。

さらに、具体的に言えば、該生成したフラクトースに脱
水素酵素を反応させ、ＮＡＤ　（Ｐ）からＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈを、又はＮＡＤ　（Ｐ）ＨからＮＡＤ　（Ｐ）を生
成させることによって無機リンを測定するものである。

本発明で用いられる脱水素酵素としては、マンニットデ
ヒドロゲナーゼ、フラクトースデヒドロゲナーゼ、ソル
ビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−Ｉｄｉｔｏｌ　　ｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　、ガラシトールデヒドロゲナ
ーゼ等が用いられる。

シュクロースホスホリラーゼを用いてシュクロースと無
機リンとを反応させるとき、フラクトースとグルコース
−１−リン酸を生じる。この方法で無機リンを測ろうと
する際、グルコース−１−リン酸を測定する系とフラク
トースを測定する系とが考えられる。前者については、
本特許出願人がすでに特願昭６１−１９１２７７号とし
て提案しである。

本発明は、さらに簡便に測定できるようにフラクトース
をもって無機リンを測定する系を提案せんとするもので
ある。

本発明方法をもう少し具体的に示すと、シュクロースホ
スホリラーゼ シュクロース＋Ｐｉ□ →フラクトース＋α−Ｄ−グルコース−１−リン酸フラ
クトースに脱水素酵素の存在下で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又は
ＮＡＤ　（Ｐ）を反応させると、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮ
ＡＤ　（Ｐ）を、ＮＡＤ　（Ｐ）からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
生成する。

本発明方法を実施するにあたっては、血清又は尿中のビ
リルビンやヘモグロビン等の影響を避けるために初速変
法が好ましいが、勿論無機リン（Ｐｉ）を消費させる終
末法でも可能である。ここで、ＮＡＤはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＰはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートである。

緩衝液としては、無機リンが混入しないものを用いるこ
とは当然で、トリス、トリス・マレイン酸、トリス・酢
酸や、ＰＩＰＥＳ　　ＣＰｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ、Ｎ
’−ｂｉｓ　　（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　
ａｃｉｄ）　）　、ＭＥＳ　（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏ
ｌｉｎｏ）　ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ
、ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）　、ＢＥＳ　（Ｎ、Ｎ−Ｂ
１５　　（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）　−２−ａ
ｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　３
　、ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ｔｌｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙ
ｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｊ、ｈａｎｅｓ
ｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　）　、ＴＥＳ　（Ｎ−Ｔｒ
ｉｓ　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　）　ｍｅｔｈｙ
ｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａ
ｃｒｄ　）等のグソドハノファーと称されるものが用い
られる。これに限らず、無機リンが含まれておらずかつ
緩衝能力を維持できるものであれば、他のＤ　ｆｉｉ液
を用いることができることはいうまでもない。これらの
緩衝液の濃度は、２０ｍ　Ｍ　〜２００　ｒｎ　Ｍ　％
そしてｐＨは６．５〜８．０で用いることができる。

ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの濃度は、１２〜２ｍＭ、シュクロー
スホスホリラーゼは０．１〜２Ｕ／ｍβ、マンニットデ
ヒドロゲナーゼ又はフラクト−スデヒドロゲナーゼは、
１０〜６０　Ｕ　／　ｍ　１２が適当である。

（実施例） 以下に、実施例をあげて本発明方法をさらに具体的に説
明する。

実施例１ 氏１徂底 ビベスーーー−−−−・−−−−−−−−−−−−−５
０ｍ　Ｍ　、　　ｐ　Ｈ７、０シユクロース・−・・−
・・−・・−一−−−−・−ｍ−−−−・・・・・−・
−・・・−・２００ｍＭシュクロースホスホリラーゼ−
−−−−０、４Ｕ／ｍ　１マンニツトデヒドロゲナーゼ
・−・−・−・−・３　Ｑ　Ｕ　／　ｍ　ＲＮ　Ａ　Ｄ
　Ｈ−−−−−−一・・・−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−１、８ｍ　Ｍ上記組成の試
薬２．５ｍｆｆ１を予め加温し、検体量５０μβを添加
した後、３４０ｎｍにおいて、△Ｅ　／　ｍ　ｉ　ｎを
測定した。その結果、無機リン（Ｐ　ｉ）　５０ｍｇ１
ｄｉ以下で原点を通る直線性を示した。

また、検体について、従来法（フィスクサバーロー法）
との相関を求めた結果、良好な相関をえた。ｒ−０，９
８、ｙ−１，０３ｘ−０，２（ｘ：フィスクサバロー法
、ｙ：本発明）と良好な相関が得られた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュクロースホスホリラーゼを介在させてシュク
   ロースと無機リンとを反応させ、生成したフラクトース
   を測定することによって無機リンを測定することを特徴
   とする無機リンの測定法。
2. （２）該生成したフラクトースに脱水素酵素を反応させ
   、ＮＡＤ（Ｐ）からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、又はＮＡＤ（Ｐ
   ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）を生成させることによって無機リ
   ンを測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の無機リンの測定法。