JPS6349100A - 無機リンの測定法 - Google Patents
無機リンの測定法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影口を回避することができ、かつ自動分析器に容易
に通用可能な無機リンの測定法に関する。
等の影口を回避することができ、かつ自動分析器に容易
に通用可能な無機リンの測定法に関する。
(従来の技術)
従来、無機リン(Pi)の測定によく用いられている方
法としては、無機リン(Pi)でリンモリブデン酸を還
元しモリブデン青として測定するリンモリブデン酸法が
知られている。この方法は還元性物質の影響を強く受け
、しかも硫酸等の強い酸を使うため機器を傷めてしまい
、よい方法とは言えない。
法としては、無機リン(Pi)でリンモリブデン酸を還
元しモリブデン青として測定するリンモリブデン酸法が
知られている。この方法は還元性物質の影響を強く受け
、しかも硫酸等の強い酸を使うため機器を傷めてしまい
、よい方法とは言えない。
それに代わって、いくつかの酵素的測定法が開発されて
いる。例えば、ホスホリラーゼaを用い、具体的には次
に示すよう方法が知られている。
いる。例えば、ホスホリラーゼaを用い、具体的には次
に示すよう方法が知られている。
ホスホリラーゼa
グリコーゲン千Pi□G−1−リン酸
ホスホグルコムターゼ
G−1−リン酸□−G−6−リン酸
G−6−PDI!
G−6−リン酸+NAD)’−、=−
6ホスホグルコン酸+NADP
この方法は、グリコーゲンの分子量が一定でなく管理し
にくい欠点がある。
にくい欠点がある。
また、グリセリンアルデヒド−3−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼの反応を用いるものも知られている。しかし
、この方法はあまり使われていない。
ロゲナーゼの反応を用いるものも知られている。しかし
、この方法はあまり使われていない。
最近よ(使われる方法に、イノシンとプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼを加え、加リン酸分解によって生成す
るヒボキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより酸化
し、生成するH、02をペルオキシダーゼ発色系に共役
させて比色する方法がある。これは非常に簡便であるも
のの、生体中のビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロ
ビン等の還元性物質の影響を受け、また乳びのg) W
も受けるという欠点がある。
ドホスホリラーゼを加え、加リン酸分解によって生成す
るヒボキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより酸化
し、生成するH、02をペルオキシダーゼ発色系に共役
させて比色する方法がある。これは非常に簡便であるも
のの、生体中のビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロ
ビン等の還元性物質の影響を受け、また乳びのg) W
も受けるという欠点がある。
又、ご(最近では、ヌクレオシドとヌクレオシド−ホス
ホリラーゼの存在下で無機リン(Pi)を反応させて生
じた塩素またはリボース−1−ホスフェートを定量する
ことによって無機リン(Pi)を測定する方法が、特開
昭60−160898号公報に開示されている。
ホリラーゼの存在下で無機リン(Pi)を反応させて生
じた塩素またはリボース−1−ホスフェートを定量する
ことによって無機リン(Pi)を測定する方法が、特開
昭60−160898号公報に開示されている。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明者らは、上記した従来方法を改良すべ(研究を重
ねた結果、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影響を回避し、かつ自動分析器に容易に適用可能な
無機リンの測定法を発明したものである。
ねた結果、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影響を回避し、かつ自動分析器に容易に適用可能な
無機リンの測定法を発明したものである。
(問題を解決するための手段)
本発明の第一の要旨は、シュクロースホスホリラーゼを
介在させてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成
したグルコース−1−リン酸にホスホグルコムターゼ及
びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを組み合わ
せNAD (P)からNAD (P)Hを生成させ、こ
の生成したNAD(P)Hの生成量を測定することによ
って無機リンを測定することを特徴とする無機リンの測
定法に存する。
介在させてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成
したグルコース−1−リン酸にホスホグルコムターゼ及
びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを組み合わ
せNAD (P)からNAD (P)Hを生成させ、こ
の生成したNAD(P)Hの生成量を測定することによ
って無機リンを測定することを特徴とする無機リンの測
定法に存する。
本発明の第二の要旨は、シュクロースホスホリラーゼを
介在させてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成
したグルコース−1−リン酸にホスホグルコムターゼ、
グルコース−6−リン酸ゾヒドロゲ犬−ゼ及び6−ホス
ホグルコネートデヒドロゲナーゼを組み合わeNA、D
(P)からNAD (P)Hを生成させ、この生成した
NAD (P)Hの生成量を11す定することによって
無機リンを測定することを特徴とする無機リンの測定法
に存する。
介在させてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成
したグルコース−1−リン酸にホスホグルコムターゼ、
グルコース−6−リン酸ゾヒドロゲ犬−ゼ及び6−ホス
ホグルコネートデヒドロゲナーゼを組み合わeNA、D
(P)からNAD (P)Hを生成させ、この生成した
NAD (P)Hの生成量を11す定することによって
無機リンを測定することを特徴とする無機リンの測定法
に存する。
本発明方法は、シュクロースとシュクロースホスホリラ
ーゼを用いて無機リンとの反応によって最終的に生じた
NAD (P)Hを測定することにより、無機リン(P
i)を定量するものである。
ーゼを用いて無機リンとの反応によって最終的に生じた
NAD (P)Hを測定することにより、無機リン(P
i)を定量するものである。
次に本発明方法を反応式によって説明する。
シュクロースホスホリラーゼ
シュクロース+Pi□□
→フラクトース+α−〇−グルコース−1−リン酸サラ
に、α−ホスホグルコムターゼ及びグルコース−6−リ
ン酸デヒドロゲナーゼを次のように組み合わせる。
に、α−ホスホグルコムターゼ及びグルコース−6−リ
ン酸デヒドロゲナーゼを次のように組み合わせる。
α−D−グルコースー1− リン酸十〇−グルコース−
1,6α−ホスホグルコムターゼ 一ニリン酸□−□−□ 一シD−グルコース−6−リン酸十〇−グルコース−1
,6−二リン酸 以下余白 D−グルコース−6−リン酸□ グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼNAD (P
) NAD (P)H−一6−ホスホ−
D−グルコン酸 NAD (P)からNAD(P)Hが生成する変化量を
測定することによって無機リン(Pi)を定量できる。
1,6α−ホスホグルコムターゼ 一ニリン酸□−□−□ 一シD−グルコース−6−リン酸十〇−グルコース−1
,6−二リン酸 以下余白 D−グルコース−6−リン酸□ グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼNAD (P
) NAD (P)H−一6−ホスホ−
D−グルコン酸 NAD (P)からNAD(P)Hが生成する変化量を
測定することによって無機リン(Pi)を定量できる。
本発明方法を実施するにあたっては、血清又は尿中のビ
リルビンやヘモグロビン等の影響を避けるために初速変
法が好ましいが、勿論無機リン(Pi)を消費させる終
末法でも可能である。ここで、NADはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、NADPはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートである。
リルビンやヘモグロビン等の影響を避けるために初速変
法が好ましいが、勿論無機リン(Pi)を消費させる終
末法でも可能である。ここで、NADはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、NADPはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートである。
一方、無機リンの血清中の正常値3〜4.5■/aは低
く、そのため高感度の方法が望まれている。上記に示し
た本発明の第一の方法でも十分使用に耐え得るが、さら
に6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを組み合わ
せれば、1モルの無機リン(Pi)に対して2モルのN
AD (P)!(を生成させることができるので、上述
した第一の方法よりも2倍の感度が得られる。この本発
明の第二の方法を反応式によって説明する。
く、そのため高感度の方法が望まれている。上記に示し
た本発明の第一の方法でも十分使用に耐え得るが、さら
に6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを組み合わ
せれば、1モルの無機リン(Pi)に対して2モルのN
AD (P)!(を生成させることができるので、上述
した第一の方法よりも2倍の感度が得られる。この本発
明の第二の方法を反応式によって説明する。
6−ホスホ−D−グルコン酸
6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ−÷D−リブ
ロースー5−リン酸+CO2以下余白 6−ホスホ−D−グルコン酸 6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼNAD (P
) NAD (P)H−−6−ホスホ−2−
ケトーD−グルコン酸この本発明の第二の方法によれば
、ビリルビンやヘモグロビン等有色物質及びグルコース
等の内因性物質の影ソを受けなくするため、サンプル量
を少なくすることができるという利点がある。
ロースー5−リン酸+CO2以下余白 6−ホスホ−D−グルコン酸 6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼNAD (P
) NAD (P)H−−6−ホスホ−2−
ケトーD−グルコン酸この本発明の第二の方法によれば
、ビリルビンやヘモグロビン等有色物質及びグルコース
等の内因性物質の影ソを受けなくするため、サンプル量
を少なくすることができるという利点がある。
緩衝液としては、無機リンが混入しないものを用いるこ
とは当然で、トリス、トリス・マレイン酸、トリス・酢
酸や、PIPES (Piperazine−N、N
’−bis (2−ethanesulfonic
acid ) 〕+MES (2−(N−Morpho
lino) ethanesulfonic acid
、monoliydrate) 、BES (N、N−
B15 (2−hydroxyethyl) −2−
aminoethanesulfonic acid
)、HEPES (N−2−Hydroxyeth
ylpiperazine−N’−2−ethanes
ulfonic acid ) 、TES (N−Tr
is (hydroxymethyl ) meth
yl−2−aminoethanesulfonic
acid )等のグツドバッファーと称されるものが用
いられる。これに限らず、無機リンが含まれておらずか
つ緩衝能力を維持できるものであれば、他の緩衝液を用
いることができることはいうまでもない。これらの緩衝
液の濃度は、20mM〜200mM、そしてpHは6.
5〜8.0で用いることができる。
とは当然で、トリス、トリス・マレイン酸、トリス・酢
酸や、PIPES (Piperazine−N、N
’−bis (2−ethanesulfonic
acid ) 〕+MES (2−(N−Morpho
lino) ethanesulfonic acid
、monoliydrate) 、BES (N、N−
B15 (2−hydroxyethyl) −2−
aminoethanesulfonic acid
)、HEPES (N−2−Hydroxyeth
ylpiperazine−N’−2−ethanes
ulfonic acid ) 、TES (N−Tr
is (hydroxymethyl ) meth
yl−2−aminoethanesulfonic
acid )等のグツドバッファーと称されるものが用
いられる。これに限らず、無機リンが含まれておらずか
つ緩衝能力を維持できるものであれば、他の緩衝液を用
いることができることはいうまでもない。これらの緩衝
液の濃度は、20mM〜200mM、そしてpHは6.
5〜8.0で用いることができる。
シュクロースの濃度は、好ましくは10mM〜500m
Mの範囲で使用でき、さらに好ましくは80mM〜20
0mMが適当である。
Mの範囲で使用でき、さらに好ましくは80mM〜20
0mMが適当である。
グルコース−1,6−二リン酸は、α−ホスホグルコム
ターゼの活性化に必要なもので、好ましくは0.01〜
0.2mMの濃度で用いられる。
ターゼの活性化に必要なもので、好ましくは0.01〜
0.2mMの濃度で用いられる。
α−ホスホグルコムターゼの品質によっては、グルコー
ス−1,6−二リン酸を新たに加えな(でも、活性を発
現する場合がある。
ス−1,6−二リン酸を新たに加えな(でも、活性を発
現する場合がある。
グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ及び6−ホス
ホグルコネートデヒドロゲナーゼは、その由来によって
NAD依存性のものと、NADP依存性のものがあり、
NAD系で測定するか、又はN 、A D P系で測定
するかによって、酵素を選択しなければならない。
ホグルコネートデヒドロゲナーゼは、その由来によって
NAD依存性のものと、NADP依存性のものがあり、
NAD系で測定するか、又はN 、A D P系で測定
するかによって、酵素を選択しなければならない。
グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼは1〜IOU
/mJ、6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼは0
.1〜IU/mj!、シュクロースホスホリラーゼは0
.1〜IU/ml、α−ホスf ホグルコムターゼは1〜10mM、Mgは1〜10mM
のそれぞれの使用濃度で用いるのが好ましい。しかし、
条件によっては上記以外の濃度範囲でも使用できるもの
である。
/mJ、6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼは0
.1〜IU/mj!、シュクロースホスホリラーゼは0
.1〜IU/ml、α−ホスf ホグルコムターゼは1〜10mM、Mgは1〜10mM
のそれぞれの使用濃度で用いるのが好ましい。しかし、
条件によっては上記以外の濃度範囲でも使用できるもの
である。
上記の説明は、NAD (P)Hを測定する紫外線吸収
法を示したが、可視部での測定も可能である。即ち、N
AD (P)Hをニトロテトラゾリウムブルー(NTB
)や2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−フェニルテトラゾリウム(INT)等の
テトラゾリウム塩を使い、1−メトキシ−5−メチルツ
ェナジニウムスルフェート(1−メトキシPMS)やジ
アホラーゼ等の電子伝達体を組み合わせて発色させ測定
することができる。これは、用手法で多量処理する場合
に有用である。
法を示したが、可視部での測定も可能である。即ち、N
AD (P)Hをニトロテトラゾリウムブルー(NTB
)や2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−フェニルテトラゾリウム(INT)等の
テトラゾリウム塩を使い、1−メトキシ−5−メチルツ
ェナジニウムスルフェート(1−メトキシPMS)やジ
アホラーゼ等の電子伝達体を組み合わせて発色させ測定
することができる。これは、用手法で多量処理する場合
に有用である。
(実施例)
以下に、実施例をあげて本発明方法をさらに具体的に説
明する。
明する。
実施例1
本実施例は本発明の第一の方法についてのものである。
パj11成
ピペスー−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−50m M 、 I) 87 、 0シユクロ
ース −−−−−−−−−−−・・−−−−−一−−−
−−−−−−−−−−−−・−・・−200mMα−ホ
スホグルコムターゼーー−−−−−−−−20/ m
12グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−・−−
−−一一−−−・−5U/m11M g C’2 ”−
−−−−−’−’−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−3m MN A D −m−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−3m MG−1,6
−二リン酸−−−−−−−−−−−−−−−−−0、0
5m Mシュクロースホスホリラーゼーー−−−0、4
U / m R上記組成の試薬2.5m1lを予め加温
し、検体量50μρを添加した後、340nmにおいて
、△E/minを測定し、直線性を取った。無機リン(
Pi)50■/〃以下で原点を通る直線性を示した。
−−−50m M 、 I) 87 、 0シユクロ
ース −−−−−−−−−−−・・−−−−−一−−−
−−−−−−−−−−−−・−・・−200mMα−ホ
スホグルコムターゼーー−−−−−−−−20/ m
12グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−・−−
−−一一−−−・−5U/m11M g C’2 ”−
−−−−−’−’−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−3m MN A D −m−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−3m MG−1,6
−二リン酸−−−−−−−−−−−−−−−−−0、0
5m Mシュクロースホスホリラーゼーー−−−0、4
U / m R上記組成の試薬2.5m1lを予め加温
し、検体量50μρを添加した後、340nmにおいて
、△E/minを測定し、直線性を取った。無機リン(
Pi)50■/〃以下で原点を通る直線性を示した。
実施例2
本実施例は本発明の第二の方法についてのものである。
試1皿爪
ピペスー−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
50m M 、 p H7、0シュクロース−・−・
−・・−−−−−−−−−−一−−−・−・−−−−−
−200m Mα−ホスホグルコムターゼー−一−−−
−−−−−−−−−〜2U/mJグルコース−6−リン
酸デヒドロゲナーゼ−−−−−−−−−−−−5U /
m IM g C12−−−−・−・−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−3m M
N A D −−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−3m MG
−1,6−二リン酸−−−−−−−−−−−−−−−0
、05m Mシュクロースホスホリラーゼ−・−0,4
U/me6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ−=
−・−−−0,2U/ml 上記組成の試薬2.5mlを予め加温し、検体量20μ
βを添加した後、340 nmにおいて、△E/min
を測定した。
50m M 、 p H7、0シュクロース−・−・
−・・−−−−−−−−−−一−−−・−・−−−−−
−200m Mα−ホスホグルコムターゼー−一−−−
−−−−−−−−−〜2U/mJグルコース−6−リン
酸デヒドロゲナーゼ−−−−−−−−−−−−5U /
m IM g C12−−−−・−・−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−3m M
N A D −−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−3m MG
−1,6−二リン酸−−−−−−−−−−−−−−−0
、05m Mシュクロースホスホリラーゼ−・−0,4
U/me6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ−=
−・−−−0,2U/ml 上記組成の試薬2.5mlを予め加温し、検体量20μ
βを添加した後、340 nmにおいて、△E/min
を測定した。
直線性の検討
無機リン(Pi)100■/d1以下で原点を通る良好
な直線性を示した。
な直線性を示した。
検体の測定
従来法(フィスクサバロー法)との測定値の比較を行い
、その結果を第1表に示す。
、その結果を第1表に示す。
以下余白
第1表
第1図は本発明の実施例1の直線性を示す図面及び第2
図は本発明の実施例2の直線性を示す図面である。 鴛λ人ソリ号
図は本発明の実施例2の直線性を示す図面である。 鴛λ人ソリ号
Claims (2)
- (1)シュクロースホスホリラーゼを介在させてシュク
ロースと無機リンとを反応させ、生成したグルコース−
1−リン酸にホスホグルコムターゼ及びグルコース−6
−リン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせNAD(P)か
らNAD(P)Hを生成させ、この生成したNAD(P
)Hの生成量を測定することによって無機リンを測定す
ることを特徴とする無機リンの測定法。 - (2)シュクロースホスホリラーゼを介在させてシュク
ロースと無機リンとを反応させ、生成したグルコース−
1−リン酸にホスホグルコムターゼ、グルコース−6−
リン酸デヒドロゲナーゼ及び6−ホスホグルコネートデ
ヒドロゲナーゼを組み合わせNAD(P)からNAD(
P)Hを生成させ、この生成したNAD(P)Hの生成
量を測定することによって無機リンを測定することを特
徴とする無機リンの測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19127786A JPS6349100A (ja) | 1986-08-14 | 1986-08-14 | 無機リンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19127786A JPS6349100A (ja) | 1986-08-14 | 1986-08-14 | 無機リンの測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6349100A true JPS6349100A (ja) | 1988-03-01 |
Family
ID=16271876
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19127786A Pending JPS6349100A (ja) | 1986-08-14 | 1986-08-14 | 無機リンの測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6349100A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7267986B2 (en) | 2002-03-19 | 2007-09-11 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphate and nucleic acid, and method of typing SNP sequence of DNA |
CN100451656C (zh) * | 2004-11-23 | 2009-01-14 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 无机磷的测定方法及其诊断试剂盒 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5527800A (en) * | 1978-08-17 | 1980-02-28 | Siemens Ag | Digitalltooanalog converter |
-
1986
- 1986-08-14 JP JP19127786A patent/JPS6349100A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5527800A (en) * | 1978-08-17 | 1980-02-28 | Siemens Ag | Digitalltooanalog converter |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7267986B2 (en) | 2002-03-19 | 2007-09-11 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphate and nucleic acid, and method of typing SNP sequence of DNA |
CN100451656C (zh) * | 2004-11-23 | 2009-01-14 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 无机磷的测定方法及其诊断试剂盒 |
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