JPS6349100A - 無機リンの測定法 - Google Patents

無機リンの測定法

Info

Publication number
JPS6349100A
JPS6349100A JP19127786A JP19127786A JPS6349100A JP S6349100 A JPS6349100 A JP S6349100A JP 19127786 A JP19127786 A JP 19127786A JP 19127786 A JP19127786 A JP 19127786A JP S6349100 A JPS6349100 A JP S6349100A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
phosphate
nad
inorganic phosphorus
glucose
sucrose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP19127786A
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshiaki Katayama
片山 善章
Jun Nishimura
順 西村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanko Junyaku Co Ltd
Original Assignee
Sanko Junyaku Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanko Junyaku Co Ltd filed Critical Sanko Junyaku Co Ltd
Priority to JP19127786A priority Critical patent/JPS6349100A/ja
Publication of JPS6349100A publication Critical patent/JPS6349100A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影口を回避することができ、かつ自動分析器に容易
に通用可能な無機リンの測定法に関する。
(従来の技術) 従来、無機リン(Pi)の測定によく用いられている方
法としては、無機リン(Pi)でリンモリブデン酸を還
元しモリブデン青として測定するリンモリブデン酸法が
知られている。この方法は還元性物質の影響を強く受け
、しかも硫酸等の強い酸を使うため機器を傷めてしまい
、よい方法とは言えない。
それに代わって、いくつかの酵素的測定法が開発されて
いる。例えば、ホスホリラーゼaを用い、具体的には次
に示すよう方法が知られている。
ホスホリラーゼa グリコーゲン千Pi□G−1−リン酸 ホスホグルコムターゼ G−1−リン酸□−G−6−リン酸 G−6−PDI! G−6−リン酸+NAD)’−、=− 6ホスホグルコン酸+NADP この方法は、グリコーゲンの分子量が一定でなく管理し
にくい欠点がある。
また、グリセリンアルデヒド−3−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼの反応を用いるものも知られている。しかし
、この方法はあまり使われていない。
最近よ(使われる方法に、イノシンとプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼを加え、加リン酸分解によって生成す
るヒボキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより酸化
し、生成するH、02をペルオキシダーゼ発色系に共役
させて比色する方法がある。これは非常に簡便であるも
のの、生体中のビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロ
ビン等の還元性物質の影響を受け、また乳びのg) W
も受けるという欠点がある。
又、ご(最近では、ヌクレオシドとヌクレオシド−ホス
ホリラーゼの存在下で無機リン(Pi)を反応させて生
じた塩素またはリボース−1−ホスフェートを定量する
ことによって無機リン(Pi)を測定する方法が、特開
昭60−160898号公報に開示されている。
(発明が解決しようとする問題点) 本発明者らは、上記した従来方法を改良すべ(研究を重
ねた結果、ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモグロビン
等の影響を回避し、かつ自動分析器に容易に適用可能な
無機リンの測定法を発明したものである。
(問題を解決するための手段) 本発明の第一の要旨は、シュクロースホスホリラーゼを
介在させてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成
したグルコース−1−リン酸にホスホグルコムターゼ及
びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを組み合わ
せNAD (P)からNAD (P)Hを生成させ、こ
の生成したNAD(P)Hの生成量を測定することによ
って無機リンを測定することを特徴とする無機リンの測
定法に存する。
本発明の第二の要旨は、シュクロースホスホリラーゼを
介在させてシュクロースと無機リンとを反応させ、生成
したグルコース−1−リン酸にホスホグルコムターゼ、
グルコース−6−リン酸ゾヒドロゲ犬−ゼ及び6−ホス
ホグルコネートデヒドロゲナーゼを組み合わeNA、D
(P)からNAD (P)Hを生成させ、この生成した
NAD (P)Hの生成量を11す定することによって
無機リンを測定することを特徴とする無機リンの測定法
に存する。
本発明方法は、シュクロースとシュクロースホスホリラ
ーゼを用いて無機リンとの反応によって最終的に生じた
NAD (P)Hを測定することにより、無機リン(P
i)を定量するものである。
次に本発明方法を反応式によって説明する。
シュクロースホスホリラーゼ シュクロース+Pi□□ →フラクトース+α−〇−グルコース−1−リン酸サラ
に、α−ホスホグルコムターゼ及びグルコース−6−リ
ン酸デヒドロゲナーゼを次のように組み合わせる。
α−D−グルコースー1− リン酸十〇−グルコース−
1,6α−ホスホグルコムターゼ 一ニリン酸□−□−□ 一シD−グルコース−6−リン酸十〇−グルコース−1
,6−二リン酸 以下余白 D−グルコース−6−リン酸□ グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼNAD (P
)        NAD (P)H−一6−ホスホ−
D−グルコン酸 NAD (P)からNAD(P)Hが生成する変化量を
測定することによって無機リン(Pi)を定量できる。
本発明方法を実施するにあたっては、血清又は尿中のビ
リルビンやヘモグロビン等の影響を避けるために初速変
法が好ましいが、勿論無機リン(Pi)を消費させる終
末法でも可能である。ここで、NADはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、NADPはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートである。
一方、無機リンの血清中の正常値3〜4.5■/aは低
く、そのため高感度の方法が望まれている。上記に示し
た本発明の第一の方法でも十分使用に耐え得るが、さら
に6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを組み合わ
せれば、1モルの無機リン(Pi)に対して2モルのN
AD (P)!(を生成させることができるので、上述
した第一の方法よりも2倍の感度が得られる。この本発
明の第二の方法を反応式によって説明する。
6−ホスホ−D−グルコン酸 6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ−÷D−リブ
ロースー5−リン酸+CO2以下余白 6−ホスホ−D−グルコン酸 6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼNAD (P
)      NAD (P)H−−6−ホスホ−2−
ケトーD−グルコン酸この本発明の第二の方法によれば
、ビリルビンやヘモグロビン等有色物質及びグルコース
等の内因性物質の影ソを受けなくするため、サンプル量
を少なくすることができるという利点がある。
緩衝液としては、無機リンが混入しないものを用いるこ
とは当然で、トリス、トリス・マレイン酸、トリス・酢
酸や、PIPES  (Piperazine−N、N
’−bis  (2−ethanesulfonic 
acid ) 〕+MES (2−(N−Morpho
lino) ethanesulfonic acid
、monoliydrate) 、BES (N、N−
B15  (2−hydroxyethyl) −2−
aminoethanesulfonic acid 
 )、HEPES  (N−2−Hydroxyeth
ylpiperazine−N’−2−ethanes
ulfonic acid ) 、TES (N−Tr
is (hydroxymethyl  ) meth
yl−2−aminoethanesulfonic 
acid )等のグツドバッファーと称されるものが用
いられる。これに限らず、無機リンが含まれておらずか
つ緩衝能力を維持できるものであれば、他の緩衝液を用
いることができることはいうまでもない。これらの緩衝
液の濃度は、20mM〜200mM、そしてpHは6.
5〜8.0で用いることができる。
シュクロースの濃度は、好ましくは10mM〜500m
Mの範囲で使用でき、さらに好ましくは80mM〜20
0mMが適当である。
グルコース−1,6−二リン酸は、α−ホスホグルコム
ターゼの活性化に必要なもので、好ましくは0.01〜
0.2mMの濃度で用いられる。
α−ホスホグルコムターゼの品質によっては、グルコー
ス−1,6−二リン酸を新たに加えな(でも、活性を発
現する場合がある。
グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ及び6−ホス
ホグルコネートデヒドロゲナーゼは、その由来によって
NAD依存性のものと、NADP依存性のものがあり、
NAD系で測定するか、又はN 、A D P系で測定
するかによって、酵素を選択しなければならない。
グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼは1〜IOU
/mJ、6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼは0
.1〜IU/mj!、シュクロースホスホリラーゼは0
.1〜IU/ml、α−ホスf ホグルコムターゼは1〜10mM、Mgは1〜10mM
のそれぞれの使用濃度で用いるのが好ましい。しかし、
条件によっては上記以外の濃度範囲でも使用できるもの
である。
上記の説明は、NAD (P)Hを測定する紫外線吸収
法を示したが、可視部での測定も可能である。即ち、N
AD (P)Hをニトロテトラゾリウムブルー(NTB
)や2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフ
ェニル)−5−フェニルテトラゾリウム(INT)等の
テトラゾリウム塩を使い、1−メトキシ−5−メチルツ
ェナジニウムスルフェート(1−メトキシPMS)やジ
アホラーゼ等の電子伝達体を組み合わせて発色させ測定
することができる。これは、用手法で多量処理する場合
に有用である。
(実施例) 以下に、実施例をあげて本発明方法をさらに具体的に説
明する。
実施例1 本実施例は本発明の第一の方法についてのものである。
パj11成 ピペスー−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−50m M 、  I) 87 、 0シユクロ
ース −−−−−−−−−−−・・−−−−−一−−−
−−−−−−−−−−−−・−・・−200mMα−ホ
スホグルコムターゼーー−−−−−−−−20/ m 
12グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−・−−
−−一一−−−・−5U/m11M g C’2 ”−
−−−−−’−’−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−3m MN A D  −m−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−3m MG−1,6
−二リン酸−−−−−−−−−−−−−−−−−0、0
5m Mシュクロースホスホリラーゼーー−−−0、4
U / m R上記組成の試薬2.5m1lを予め加温
し、検体量50μρを添加した後、340nmにおいて
、△E/minを測定し、直線性を取った。無機リン(
Pi)50■/〃以下で原点を通る直線性を示した。
実施例2 本実施例は本発明の第二の方法についてのものである。
試1皿爪 ピペスー−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
50m M 、  p H7、0シュクロース−・−・
−・・−−−−−−−−−−一−−−・−・−−−−−
−200m Mα−ホスホグルコムターゼー−一−−−
−−−−−−−−−〜2U/mJグルコース−6−リン
酸デヒドロゲナーゼ−−−−−−−−−−−−5U /
 m IM g C12−−−−・−・−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−3m M
N A D  −−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−3m MG
−1,6−二リン酸−−−−−−−−−−−−−−−0
、05m Mシュクロースホスホリラーゼ−・−0,4
U/me6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ−=
−・−−−0,2U/ml 上記組成の試薬2.5mlを予め加温し、検体量20μ
βを添加した後、340 nmにおいて、△E/min
を測定した。
直線性の検討 無機リン(Pi)100■/d1以下で原点を通る良好
な直線性を示した。
検体の測定 従来法(フィスクサバロー法)との測定値の比較を行い
、その結果を第1表に示す。
以下余白 第1表
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の実施例1の直線性を示す図面及び第2
図は本発明の実施例2の直線性を示す図面である。 鴛λ人ソリ号

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)シュクロースホスホリラーゼを介在させてシュク
    ロースと無機リンとを反応させ、生成したグルコース−
    1−リン酸にホスホグルコムターゼ及びグルコース−6
    −リン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせNAD(P)か
    らNAD(P)Hを生成させ、この生成したNAD(P
    )Hの生成量を測定することによって無機リンを測定す
    ることを特徴とする無機リンの測定法。
  2. (2)シュクロースホスホリラーゼを介在させてシュク
    ロースと無機リンとを反応させ、生成したグルコース−
    1−リン酸にホスホグルコムターゼ、グルコース−6−
    リン酸デヒドロゲナーゼ及び6−ホスホグルコネートデ
    ヒドロゲナーゼを組み合わせNAD(P)からNAD(
    P)Hを生成させ、この生成したNAD(P)Hの生成
    量を測定することによって無機リンを測定することを特
    徴とする無機リンの測定法。
JP19127786A 1986-08-14 1986-08-14 無機リンの測定法 Pending JPS6349100A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP19127786A JPS6349100A (ja) 1986-08-14 1986-08-14 無機リンの測定法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP19127786A JPS6349100A (ja) 1986-08-14 1986-08-14 無機リンの測定法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS6349100A true JPS6349100A (ja) 1988-03-01

Family

ID=16271876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP19127786A Pending JPS6349100A (ja) 1986-08-14 1986-08-14 無機リンの測定法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPS6349100A (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7267986B2 (en) 2002-03-19 2007-09-11 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphate and nucleic acid, and method of typing SNP sequence of DNA
CN100451656C (zh) * 2004-11-23 2009-01-14 苏州艾杰生物科技有限公司 无机磷的测定方法及其诊断试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5527800A (en) * 1978-08-17 1980-02-28 Siemens Ag Digitalltooanalog converter

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5527800A (en) * 1978-08-17 1980-02-28 Siemens Ag Digitalltooanalog converter

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7267986B2 (en) 2002-03-19 2007-09-11 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphate and nucleic acid, and method of typing SNP sequence of DNA
CN100451656C (zh) * 2004-11-23 2009-01-14 苏州艾杰生物科技有限公司 无机磷的测定方法及其诊断试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112159833B (zh) 一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法
US6309852B1 (en) Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol
JPH0739397A (ja) 塩素イオンの定量方法
CN112255219A (zh) 一种1,5-脱水山梨醇的测定试剂盒及其制备方法和应用
EP0639646B1 (en) High precision determination of d-glucose-6-phosphate and composition therefor
JP3170377B2 (ja) 物質の測定法
JPS6349100A (ja) 無機リンの測定法
JPH02104298A (ja) 1,5−アンヒドログルシトールの定量法
JPH08280399A (ja) トレハロースまたは無機リンの定量法
JPS63146800A (ja) 無機リンの測定法
JP3170320B2 (ja) 物質の測定法
JP2818696B2 (ja) Nadhキナーゼを用いる高感度定量法
JP3760250B2 (ja) 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット
JP4412780B2 (ja) 1,5−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬
JP3901860B2 (ja) 複数の酵素を反応させる物質の定量方法及び酵素組成物
CN114354524B (zh) 一种稳定的液体检测试剂盒
JP2761768B2 (ja) Nadhの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定量法
JP3034984B2 (ja) D−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物
JP3566976B2 (ja) 生体成分中の測定対象の測定方法
JP3522307B2 (ja) 無機リン測定用液状試薬組成物
JPH05304997A (ja) 1,5−アンヒドログルシトールの定量法
JP4104393B2 (ja) 生体試料中の特定成分の定量方法及び定量用試薬
KR100715924B1 (ko) 1,5-안하이드로글루시톨의 정량 분석법 및 시약
JPS6112299A (ja) シアル酸の測定方法
JP2002186497A (ja) 1,5−アンヒドログルシトールの定量方法