CN100451656C - 无机磷的测定方法及其诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及测定无机磷的方法及其诊断试剂盒。利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶在血浆、血清等样品中的无机磷的激活下与甘油醛-3-磷酸作用,将氧化型辅酶反应成还原型辅酶,检测反应前后主波长340nm处吸光度的上升幅度,从而测算出样品中无机磷的含量。该方法特异性高,不受内、外源物质的污染,测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响,保持试剂的稳定性,便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测,不需要特殊或额外仪器,测试成本低廉,便于行业内推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及测定无机磷的方法,以及应用该方法配制而成的诊断试剂盒,属于医学检验测定技术领域。
背景技术
人体内部的磷元素约有87%存在于骨骼中,血液中的磷与骨骼中的磷保持动态平衡关系。另一方面,血液中钙和磷的浓度之间有一定关系,两者的乘积保持在一定范围之内,以毫克为单位,大约每100毫升血浆中钙和磷的含量之积为35~40。正常人血钙升高则血磷降低,反之亦然。当上述乘积大于40时,钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织;大于70时,可发生转移性钙化;小于35时,则将妨碍骨组织的钙化,甚至使骨盐再溶解,影响成骨作用,引起佝偻病或软骨病。一般地,可以通过维生素D、甲状旁腺激素、降钙素等来调节血浆中钙和磷的浓度。
目前,人体的含磷总量还不能直接测定,大多是检测血浆或血清中磷酸根离子浓度来反映。由于H2PO4 -在血液等自然条件下最能稳定存在,是无机磷的主要存在形式,因而测定H2PO4 -的浓度便能间接代表或推知无机磷的总量。常用的检测方法有:磷钼酸还原法/非还原法、染料结合法、酶法、同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法、流动注射分析法等等。其中,决定性的方法是同位素稀释质谱法,中等实验室推荐使用的常规方法是磷钼酸比色法。
磷钼酸还原法又分“无蛋白血滤液法”和“不去蛋白法”,前者需将血液先去蛋白,后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂的种类很多,性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、硫酸肼、米吐尔等,表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法又称“直接紫外法”,是在340nm或325nm波长直接测定磷钼酸杂聚化合物,方法简便,便于自动化。但黄疸、溶血、脂浊血清在340nm有吸收,必须做标本空白,否则结果偏高。
相比于其它检测方法,酶法以其选择性好、灵敏度高、可实现自动化分析等优点而备受人们青睐,用酶法测定无机磷含量既是目前人们的研究热点,也是将来的发展趋势。但是,采用不同的试剂和测试路线,检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大的差别,直接影响到该方法的使用与推广。
发明内容
本发明的目的是:提供一种酶法测定无机磷含量的方法,以及应用该方法配制而成的无机磷诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂,能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中无机磷的含量进行快速、准确测定,以便推广使用该检测方法和诊断试剂,使本领域内医学检验测试手段得到丰富和发展。
为实现本发明的目的,一种测定无机磷的方法,通过以下步骤进行:
首先,将血浆、血清等需要测定的样品与含有甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀,使之发生以下反应,
然后,将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm的吸光度的上升速度,进而测算出样品中无机磷的含量。
测定过程中,被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10~1∶500,反应温度控制在20℃~50℃,反应时间控制在2~30分钟,检测时设定副波长在405nm以上。
实现本发明方法测定血浆、血清等样品中无机磷含量的诊断试剂盒可以是单剂,由以下成分组成:
缓冲液 40~200mmol/l,
甘油醛-3-磷酸 1~20mmol/l,
氧化型辅酶 0.5~5mmol/l,
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 5000~50000U/l,
稳定剂/试剂总体积 10~80%。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合,配制成双剂,比如:
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列,其中试剂I的成分:甘油醛-3-磷酸、氧化型辅酶等可以放在试剂II,试剂II中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶也可以放到试剂I,如此可以形成多种配方,不再一一列举。
为使试剂更稳定,还可以配制成三剂,比如:
与双剂类似,三剂的配方也不仅仅限于上述配方,其中试剂I的氧化型辅酶可以放在试剂II或试剂III中,试剂II中的甘油醛-3-磷酸可以放在试剂I或试剂III中,试剂III中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶也可以放到试剂I或者试剂II中,如此可以形成多种配方,不再一一列举。
上述诊断试剂盒的成分当中,选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0~11.0范围之内,可以是:“三羟甲基氨基甲烷~盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑~盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸~柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠~盐酸缓冲液”、“硼酸~硼砂缓冲液”、“甘氨酸~氢氧化钠缓冲液”、“硼砂~氢氧化钠缓冲液”或者“碳酸钠~碳酸氢钠缓冲液”中的至少一种,但选择范围并不受这些列举所限制。
此外,为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性,以便长期储存,以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂,其用量约占所在试剂总体积的10~80%(或者浓度在10~50mmol/l范围之内)。
用作稳定剂的物质可以是:乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
上述无机磷诊断试剂盒的试剂成分当中,所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+;所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
研究表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是单剂、双剂还是三剂,如下配方成分关系的无机磷诊断试剂盒较为理想,也是本发明的优选方案:
缓冲液 80~120mmol/l,
甘油醛-3-磷酸 2~10mmol/l,
氧化型辅酶 1~4mmol/l,
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 10000~30000U/l,
稳定剂/试剂总体积 20~50%。
本发明利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶在血浆、血清等样品中的无机磷的激活下与甘油醛-3-磷酸作用,将氧化型辅酶反应成还原型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰,而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰,因此,测量反应前后340nm处吸光度的上升幅度,便能很好地反映出被测样品中无机磷的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在:
(1)本发明完全利用酶学方法,酶解反应具有特异性高的特点,通过将氧化型辅酶反应成还原型辅酶,定量反映出被测样品中无机磷的含量,测试结果准确;
(2)参与酶偶联反应系统的反应成分都是外加的,不受内、外源物质的污染,测试过程精确度高;
(3)该方法简便、易操作,可快速得到检测结果,而且反应是在缓冲液条件下进行,不会污染环境;
(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上便可检测,不需要特殊或额外仪器,测试成本低廉,便于行业内推广应用;
(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂,主要用于测定人体和其它动物体内血磷的含量,也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中无机磷的含量;
(6)本发明提供的液态无机磷诊断试剂盒,稳定性好,存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整,很好地保证了应用测试效果。做成双剂或者三剂以后,能够进一步减少各种成分之间的交叉影响,提高试剂的稳定性,便于长期储存。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例,不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)
按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒:
双甘氨肽缓冲液 80mmol/l,
甘油醛-3-磷酸 2mmol/l,
thio-NAD+ 1mmol/l,
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 10000U/l,
乙二醇 50%(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定:温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上,被测样品与试剂的体积比例为1∶25,反应方向为正反应(吸光度上升,下同)。
加入血清样品和配成的单剂,两者在分析仪内部自动混匀,检测、记录340nm吸光度的上升情况。一共检测读点31次,大约每隔20秒记录一次数据,根据速率法、终点法等方法,对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程,测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂)
按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒:
试剂I——
咪唑~盐酸缓冲液 100mmol/l,
甘油醛-3-磷酸 6mmol/l,
NADP+ 2mmol/l,
甘油 20mmol/l
试剂II——
咪唑~盐酸缓冲液 100mmol/l,
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 20000U/l,
乙二醇 50%(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定:温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上,被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25,试剂I与试剂II的用量之比为4∶1,反应方向为正反应。
先加入血清样品和试剂I,5分钟之后加入试剂II,三者在分析仪内部自动混匀,检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法,对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程,测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(三剂)
按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒:
试剂I——
三乙醇胺缓冲液 120mmol/l,
thio-NADP+ 4mmol/l,
丙二醇 50%(占试剂I总体积);
试剂II——
三乙醇胺缓冲液 120mmol/l,
甘油醛-3-磷酸 10mmol/l,
丙二醇 50%(占试剂II总体积);
试剂III——
三乙醇胺缓冲液 120mmol/l,
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 30000U/l,
乙二醇 50%(占试剂III总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定:温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上,被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25,试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1,反应方向为正反应。
先加入血清样品和试剂I、试剂II,5分钟之后加入试剂III,它们在分析仪内部自动混匀,检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法,对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程,测试结果重复性好、精确度高。
实施例四(双剂优选例)
按以下成分和用量配制血磷诊断试剂盒:
试剂I——
Tris-HCl缓冲液 100mmol/l,
甘油醛-3-磷酸 2mmol/l,
NAD+ 2mmol/l,
甘油 50%(占试剂I总体积);
试剂II——
Tris-HCl缓冲液 100mmol/l,
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 10000U/l,
甘油 50%(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定:温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上,被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25,试剂I与试剂II的用量之比为4∶1,反应方向为正反应。
先加入血清样品和试剂I,5分钟之后加入试剂II,三者在分析仪内部自动混匀,发生以下原理性反应:
检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法,对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程,测试结果重复性好、精确度高。
总之,实验证明采用本发明的测定方法,完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器,测定出血浆、血清等样品中无机磷的含量,测试灵敏度高、精确度好,不受内、外源物质的污染。而且,本发明提供的无机磷诊断试剂盒,稳定性好,长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中的无机磷含量。
Claims (6)
1.一种无机磷诊断试剂盒,其特征在于它组成如下:
缓冲液 40~200mmol/l
甘油醛-3-磷酸 1~20mmol/l
氧化型辅酶 0.5~5mmol/l
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 5000~50000U/l
稳定剂/试剂总体积 10~80%。
2.根据权利要求1所述的无机磷诊断试剂盒,其特征在于所述缓冲液的pH范围是6.0~11.0。
3.根据权利要求1所述的无机磷诊断试剂盒,其特征在于所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷~盐酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑~盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、柠檬酸~柠檬酸钠缓冲液、巴比妥钠~盐酸缓冲液、硼酸~硼砂缓冲液、甘氨酸~氢氧化钠缓冲液、硼砂~氢氧化钠缓冲液或者碳酸钠~碳酸氢钠缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的无机磷诊断试剂盒,其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的无机磷诊断试剂盒,其特征在于所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+。
6.根据权利要求1-5中任意一项无机磷诊断试剂盒,其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
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