KR100715924B1 - 1,5-안하이드로글루시톨의 정량 분석법 및 시약 - Google Patents

1,5-안하이드로글루시톨의 정량 분석법 및 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루코스를 함유한 샘플 내의 특이 성분, 예로써 1,5-안하이드로글루시톨 (1,5-AG)의 간단한 측정법 및 이러한 방법에 유용한 시약 및 시약 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하고 1,5-AG를 1,5-AG-6-포스페이트가 형성되도록 1,5-AG-6-포스페이트로 전환하는 효소 시스템을 샘플과 접촉시키고, 산화형 조효소 존재하에 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제의 작용에 의해 샘플 내의 1,5-AG-6-포스페이트를 탈수소화하고, 탈수소화 반응에 의해 형성된 환원형 조효소의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 유용한 시약 및 시약 키트 또한 제공된다.
Figure 111999016713480-pat00009
글루코스, 1,5-안하이드로글루시톨 측정법, 1,5-AG, 시약, 시약 키트.

Description

1,5-안하이드로글루시톨의 정량 분석법 및 시약{METHOD AND REAGENT FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF 1,5-ANHYDROGLUCITOL}
도 1은 1,5-AG 보정 곡선을 나타낸다. 횡축의 1,5-AG는 1,5-안하이드로글루시톨을 나타내며, 종축의 mAb는 밀리(milli)흡광도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법으로 측정된 1,5-AG 농도 (a: 종축)와 대조군 방법 (Lana 1,5-AG Auto)으로 측정된 1,5-AG 의 농도 (b: 횡축)의 관계를 나타낸다.
도 3은 1,5-AG 보정 곡선을 나타낸다.
본 발명은 효소 반응을 이용하여 샘플 내의 특이 성분, 예로써 1,5-안하이드로글루시톨 (이하, 1,5-AG로 명명)을 정량분석하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 샘플 내의 글루코스를 다른 물질로 전환하는 선처리를 수반한다. 본 발명은 또한, 이러한 방법에 유용한 시약 및 시약 키트에 관련된 것이다.
생물 샘플은, 종종 분석물에 비해 매우 고농도로, 분석물 검정(assay)의 정확도를 감소시킬 수 있는 글루코스를 포함한다. 이러한 경우, 분석물의 측정에 앞서, 샘플 내의 글루코스는 제거되거나, 분석물의 측정을 방해하지 않는 물질로 전 환되어진다.
샘플로부터 글루코스를 제거하는 이전의 방법은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 글루코스를 이온 교환으로 분리하는 방법을 포함한다 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 88/185397 및 89/6756 호). 샘플 내의 글루코스를 다른 물질로 전환하는 이전의 방법은, (1) 아데노신트리포스페이트 (ATP)의 존재하에, 글루코키나제 또는 헥소키나제와 같은 인산화된 효소의 작용을 이용하여, 글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 전환하는 방법 및 (2) 산소 존재하에, 글루코스 옥시다제, 피라노스 옥시다제 또는 소르보스 옥시다제와 같은 옥시다제의 작용을 이용하여, 글루코스를 글루코노락톤으로 전환하는 방법을 포함한다.
또한, 이러한 글루코스 전환 방법에 대하여 다양한 개선이 이루어져왔다. 예로써, 인산화된 효소를 이용하는 상기 방법 (1)의 변형은 다음을 포함한다: 평형 반응에 의해 글루코스-6-포스페이트가 글루코스로 재전환되는 것을 방지하기 위해 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제의 작용에 의해 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하는 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 93/76397 호); 산화형 조효소의 존재하에 글루코스-6-포스페이트-디하이드로게나제를 이용하는 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 89/320998, 91/27299 및 94/237794 호); 및, 글루코스의 제거를 감소시키는 ATP 의 농도 변화를 억제하고, ATP의 농도를 일정하게 유지하기 위해, 아데노신 다이포스페이트 (ADP) 의 존재하에 파이루베이트 키나제를 사용하는 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 90/104298 호). 옥시다제를 이용하는 상기 방법 (2)의 변형으로는, 글루코스 옥시다제를 이용한 반응을 수행한 후, 형성된 과산화수소를 카탈라제의 작용으로 제거하는 방법을 포함한다 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 88/185397 호).
그러나, 상기 방법은, 글루코스를 다른 물질로 전환하고자 사용한 물질 및 전환 시스템 내에서 형성된 물질, 그리고 이들의 농도에 따라 분석물의 측정을 위한 효소 반응 시스템이 영향을 입을 수 있다는 결점이 있다. 일례로, 글루코키나제 또는 헥소키나제를 사용하여 글루코스를 제거할 때 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 93/76397 호), 불리하게도 ADP가 과량 생성된다. 특히, 글루코스 완전 제거를 위해 ATP를 충분한 양으로 공급하면, ADP가 글루코스 농도의 두 배로 형성된다. 반응 시스템에서 ADP의 이러한 농도 효과는 무시할 수 없다.
1,5-AG는 뇌수액, 혈장, 혈청 및 소변 등의 생체액에 존재한다. 혈장 내 1,5-AG의 레벨은 특정 질병, 특히 당뇨병 환자의 경우 감소하여, 1,5-AG은 당뇨 진단 표지로 유용하다. 그러나, 1,5-AG의 측정은 매우 어려운데, 이는 1,5-AG가 글루코스와 매우 유사한 구조를 가지며, 글루코스에 비해 1,5-AG가 소량이기 때문이다.
소르보스 옥시다제, 피라노스 옥시다제, 헥소키나제, 글루코키나제 및 ADP-의존성 헥소키나제와 같은 효소가 1,5-AG에 작용함이 알려져 있으나, 이들 효소는 1,5-AG와 공존하는 글루코스와 같은 당류와도 또한 반응한다. 따라서, 글루코스와 같은 당류를 제거 또는 소거할 수 있는 과정을 실시하여야만 한다.
1,5-AG 측정에서 글루코스를 제거하는 단계를 포함하는 방법으로, 1,5-AG를 피라노스 옥시다제 또는 소르보스 옥시다제의 촉매작용으로 산화시키고, 형성된 과 산화수소를 측정하는 방법들이 알려져 있다.
이러한 방법의 예는 하기와 같다: (1) 샘플 내의 글루코스를 이온 크로마토그래피로 분리하고, 샘플을 피라노스 옥시다제와 접촉시켜 형성된 과산화수소를 측정하는 단계를 포함하는 1,5-AG의 측정 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 88/185307 및 89/6756 호); (2) 글루코키나제 또는 헥소키나제 및 글루코스-6-포스스페이트 디하이드로게나제의 작용에 의해, 샘플 내의 글루코스를 피라노스 옥시다제와 반응하지 않는 물질로 전환하고, 샘플을 피라노스 옥시다제와 접촉시켜 형성된 과산화수소를 측정하는 단계를 포함하는 1,5-AG의 측정 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 89/320998 및 91/27299 호); (3) 글루코키나제 또는 피루베이트키나제의 작용에 의해, 샘플 내의 글루코스를 피라노스 옥시다제와 반응하지 않는 물질로 전환하고, 샘플을 피라노스 옥시다제와 접촉시켜 형성된 과산화수소를 측정하는 단계를 포함하는 1,5-AG의 측정 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 90/104298); 및 (4) 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6--포스포프룩토키나제의 작용에 의해, 샘플 내의 글루코스를 피라노스 옥시다제와 반응하지 않는 물질로 전환하고, 샘플을 소르보스 옥시다제 또는 피라노스 옥시다제와 접촉시켜 형성된 과산화수소를 측정하는 단계를 포함하는 1,5-AG의 측정 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 93/76397호).
그러나, 컬럼을 사용하는 상기 방법 (1)은 준비가 복잡한 단점이 있고, 상기 방법 (2)-(4)는, 글루코스 제거 시스템에 사용되는 헥소키나제 또는 글루코키나제가 1,5-AG 에 또한 작용하여 1,5-AG-6-포스페이트를 형성하여 1,5-AG 검증의 정확 도를 감소시킨다는 단점이 있다.
또한, 1,5-AG 측정을 위한 글루코스 제거 단계를 포함하는 방법에서, 헥소키나제, 글루코키나제 또는 ADP-의존성 헥소키나제의 촉매 작용에 의해 1,5-AG를 인산화시키고 형성된 물질을 측정하는 다른 방법도 있다.
이러한 방법의 예는 하기와 같다: (5) 샘플 내의 글루코스를 이온 크로마토그래피로 분리하고, 샘플을 헥소키나제 및 글루코키나제와 접촉시켜, 형성된 ADP를 측정하는 단계를 포함하는 1,5-AG의 측정 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 96/107796 호); 및 (6) (a) 글루코스 옥시다제, 또는 글루코스 옥시다제 및 카탈라제, (b) 글루코스 디하이로게나제 또는 (c) 헥소키나제 또는 글루코키나제의 작용에 의해, 샘플 내의 글루코스를 ADP-의존성 헥소키나제와 반응하지 않는 물질로 전환하고, 샘플을 ADP-의존성 헥소키나제 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제와 접촉시켜, 형성된 환원 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (포스페이트) [NAD(P)H]를 측정하는 단계를 포함하는 1,5-AG의 측정 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 98/191998 호).
그러나, 이러한 방법들은 하기의 문제점을 가진다. 방법 (5)는 복잡한 조작을 필요로한다. 방법 (6)에서, (a)의 글루코스 옥시다제를 사용하는 경우, 샘플 내의 글루코스 농도가 높을 때는 산소 공급이 속도 결정 단계가 된다; 글루코스 디하이드로게나제를 사용하는 (b)의 경우에는, 글루코스로부터 형성되는 NAD(P)H 제거 시스템이 필요하고; 헥소키나제 또는 글루코키나제를 사용하는 (c)의 경우에는 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제가 글루코스로부터 형성된 글루코스-6-포스 페이트에 작용하여 분별 측정을 실행할 수 없고, 이러한 방법을 당뇨 환자와 같은 과량의 글루코스를 포함하는 샘플에 적용시에는 반응 시스템에서 과량의 ADP가 형성되어 1,5-AG 검정의 정확도에 악영향을 미친다.
이러한 상황하에서, 본 발명의 목적은 글루코스 함유 샘플 내의 특이 성분, 예로써 1,5-AG을 측정하는 간단한 방법을 제공하는 것으로서, 이러한 방법은 샘플 내의 특이 성분 측정에 있어서 샘플 내의 글루코스를 실질적으로 완전하게 제거하는 방법이며, 또한, 이러한 방법에 유용한 시약 및 키트를 제공한다.
본 발명은 글루코스를 함유한 샘플 내의 1,5-AG 측정법에 관련된 것으로, 이러한 측정법은 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하고 1,5-AG를 1,5-AG-6-포스페이트로 전환하여 1,5-AG-6-포스페이트를 형성하는 효소 시스템을 샘플과 접촉시키고, 산화형 조효소 존재하에 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제의 작용에 의해 샘플 내의 1,5-AG-6-포스페이트를 탈수소화하고, 탈수소화 반응에 의해 형성된 환원형 조효소의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 1,5-AG 측정을 위한, 하기를 포함한 시약에 관한 것이다; (a) 뉴클레오사이드 다이포스페이트 (이하 NDP로 언급), 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (이하 NTP로 언급), NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, 산화형 조효소, 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 또는 (b) NTP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 글루코키나제, NTP, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, 산화형 조효소 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제로 이루어진 군에서 선택된 하나.
본 발명은 또한, 1,5-AG 측정을 위한, 하기를 포함한 시약 키트에 관한 것이다; (a) NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제를 함유하는 시약 또는 (b) NTP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 글루코키나제, NTP, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군에서 선택된 하나를 포함하는 시약과, 산화형 조효소 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제를 포함하는 시약.
본 발명은 또 나아가, NDP 및 NTP 의 존재하에, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제의 작용에 의해 샘플 내의 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 글루코스 제거 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제를 포함하는, 글루코스 제거용 시약에 관한 것이다.
본 발명은 또한 글루코스를 함유한 샘플 내의 분석물 측정법에 관한 것으로, 이는 NDP 및 NTP 의 존재하에, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제의 작용에 의해 샘플 내의 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하고, 화학 또는 효소 반응에 의해 샘플 내 분석물을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 분석물 측정을 위한 시약에 관한 것으로, 이는 NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제를 포 함하고, 분석물과 작용하는 물질 또는 분석물에 작용하는 효소를 포함한다.
본 발명은 또한 분석물 측정을 위한 시약 키트에 관한 것으로, 이는 NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제를 포함하는 시약과, 분석물과 반응하는 물질 또는 분석물에 작용하는 효소를 포함하는 시약을 포함한다.
본 발명은, 일례로 혈액, 혈장, 혈청 및 소변과 같은 생물 샘플과 같은, 글루코스를 함유할 수 있는 임의의 샘플 검정에 적용된다.
본 발명에 따라, 샘플 내의 글루코스 제거는, 하기 반응식에 따라 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환함으로써 실행된다.
Figure 111999016713480-pat00010
글루코스를 글루코스-6-포스페이트만으로 전환하는 것은 글루코스 제거를 위해 충분치 않은데, 이는 전환 반응이 가역이어서, 형성된 글루코스-6-포스페이트가 글루코스로 재전환될 수 있기 때문이다. 상기 반응 시스템에서, 샘플 내 글루코스는, 글루코스로의 재전환이 방지되도록 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환시킴으로써 완전히 제거할 수 있다.
글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하는 효소 시스템은, 글루코스로부터 글루코스-6-포스페이트를 형성하는 효소 시스템 (이하 효소 시스템 1로 언급), 글루코스-6-포스페이트로부터 프룩토스-6-포스페이트를 형성하는 효소 시스템 (이하 효소 시스템 2로 언급), 프룩토스-6-포스페이트로부터 프룩토스-1,6-다이포스페이트 형성하는 효소 시스템 (이하 효소 시스템 3으로 언급)을 포함한다.
효소 시스템 1은 하기 두 가지의 시스템을 포함한다: (a) 효소는 NDP-의존성 헥소키나제이고, 조효소는 NMP로 전환되는 NDP, 및 (b) 효소는 NTP-의존성 헥소키나제 또는 NTP-의존성 글루코키나제이고, 조효소는 NDP로 전환되는 NTP. 효소 시스템 2 에서, 효소는 포스포헥소스 아이소머라제이다. 효소 시스템 3 에서, 효소는 6-포스포프룩토키나제이며 조효소는 NDP로 전환되는 NTP이다.
효소 시스템 1이, 효소는 NDP-의존성 헥소키나제이고, 조효소는 NMP로 전환되는 NDP인 시스템의 경우, NDP는 글루코스 농도에 따라 소비되나, 소비된만큼의 동량의 NDP가 6-포스포프룩토키나제의 작용에 의해 NTP로부터 형성되어, NDP 농도는 일정하게 유지된다. 따라서, 샘플 내의 글루코스 농도 변화에 따른, 반응 시스템 내 NDP 농도는 불변이다.
본 발명의 실시에서, 글루코스 포함 샘플에 하기를 가함으로써 글루코스를 제거한다; (a) NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제, 또는 (b) NTP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 글루코키나제, NTP, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제로 구성되는 군에서 선택되는 하나. 혼합물을, 필요하다면 수성 매질, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 아들 효소에 대한 기질, 조효소등의 존재하에, 10-50 ℃에서 1-30 분간, 바람직하게는 2-10 분간 반응시킨다.
NDP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 헥소키나제 및 NTP-의존성 글루코키나제의 농도는 바람직하게는 0.1-100 U/ml, 보다 바람직하게는 0.5-50 U/ml, 가장 바람직하게는 1-50 U/ml이다.
포스포헥소스 아이소머라제의 농도는 바람직하게는 0.1-100 U/ml, 보다 바람직하게는 0.5-50 U/ml, 가장 바람직하게는 5-50 U/ml이다.
6-포스포프룩토키나제의 농도는 바람직하게는 0.1-100 U/ml, 보다 바람직하게는 0.5-50 U/ml, 가장 바람직하게는 5-50 U/ml이다.
모든 상기 효소는 시판 구입 및 용이 입수 가능하다. 일례로, 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) 및 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus) 에서 유도되는 NDP-의존성 헥소키나제는 Asahi Chemical Industry Co., Ltd.로부터 용이 입수 가능하고, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 바실러스 (Bascillus) 등의 속의 미생물로부터 유도된 NTP-의존성 헥소키나제는 Oriental Yeast Co., Ltd., Toyobo Co., Ltd., Boehringer Mannheim GmbH, Asahi Chemical Industry Co., Ltd., 등으로부터 용이 입수 가능하다. 자이모모나스 (Zymomonas), 바실러스 (Bascillus) 등 속의 미생물에서 유도된 NTP-의존성 글루코키나제는 Unitika Ltd. 등으로부터 용이 입수 가능하다. 바실러스 스테아로써모필러스 (Bascillus stearothermophilus)에서 유도된 포스포헥소스 아이소머라제는 Unitika Ltd. 로부터, 바실러스 스테아로써모필러스 (Bascillus stearothermophilus)로부터 유도된 6-포스포프룩토키나제 또한 Unitika Ltd. 로부터 용이 입수 가능하다.
NDP 및 NTP의 농도는 바람직하게는 0.01-100 mM, 보다 바람직하게는 0.1-50 mM, 가장 바람직하게는 1-10 mM이다. 활성화제는, 마그네슘 설페이트 및 마그네슘 클로라이드와 같은 무기 염을 포함한다. 무기 염의 농도는 바람직하게는 0.001-10 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.01-5 mg/ml, 가장 바람직하게는 0.1-2 mg/ml이다.
상기 방법에 의해 샘플 내 글루코스가 제거된후, 샘플 내 분석물 측정을 위해 필요한 시약의 존재하에 반응을 실행하고, 반응에 의해 형성 또는 소비된 기질의 양을 측정하여, 분석물을 측정한다. 측정에 필요한 시약에 대한 특별한 제한은 없으나, 분석물에 작용하는 효소, 또는 분석물과 반응하는 기질을 포함하는 시약, 바람직하게는 분석물에 작용하는 효소를 포함하는 시약을 사용하는 것이 적합하다.
분석물에 작용하는 효소가 글루코스에 또한 작용함으로써, 효소에 의해 촉매되는 반응이 NDP 농도에 의한 영향을 입는 경우, 효소는 NDP-의존성 헥소키나제이고, 조효소는 NMP로 전환되는 NDP인 상기 시스템 (a)에 의하여 글루코스를 제거하 는 것이 바람직하다
이러한 효소의 예는, 뉴클레오티다제, 6-포스포글루코네이트 다하이드로게나제, NDP 파이로포스파타제, NDP 글루코스 파이로포스포릴라제, NDP-의존성 헥소키나제 및 1,5-AG-6- 포스페이트 디하이드로게나제를 포함한다.
상기의 글루코스 제거를 위한 효소 시스템을 1,5-AG 측정에 적용할 때, 효소 시스템은 동시에 1,5-AG의 1,5-AG-6-포스페이트로의 전환을 촉진하여, 형성된 1,5-AG-6-포스페이트 양을 측정함으로써 샘플 내의 1,5-AG를 측정한다.
샘플 내 글루코스를 상기 방법에 의해 제거한 후 1,5-AG 측정을 위해서, 산화형 조효소의 존재하에 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제를 샘플내로 가하여, 필요하다면 수성 매질, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 아들 효소에 대한 기질, 조효소등의 존재하에, 10-50 ℃에서 1-30 분간, 바람직하게는 2-10 분간 반응을 실시한다. 1,5-AG의 농도는 반응에 의해 형성된, 환원형 조효소 양을 직접 측정함으로써, 예로써 340nm에서의 흡광도 측정, 또는 환원형 조효소를 다른 기질로 전환하여 기질의 양을 측정함으로써, 측정가능하다.
산화형 조효소, 또는 1,5-AG의 측정에 사용된 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 모두 글루코스 제거 단계에서 존재할 수 있는데, 이는 글루코스 제거 반응에 영향을 미치지 않기 때문이다.
NDP-의존성 헥소키나제의 경우, 글루코스를 기질로하며 NDP를 소비하면서 글루코스-6-포스페이트와 NMP를 형성하는 반응을 촉매하고, 또한 1,5-AG을 기질로 하 며 NDP를 소비하면서 1,5-AG-6-포스페이트와 NMP의 형성 반응을 촉매하는 어떤 효소도 사용 가능하다. 적합한 효소의 예로는, 초고온균 (hyperthermophile)으로서, 파이로코커스 퓨리오서스 DSM 3638 (Pyrococcus furiosus; 일본 공개 미심사 특허출원 97/234098)에서 유도되는 효소 및 써모코커스 리토랄리스 (TLHK; Thermococcus litoralis)에서 유도되는 효소가 있는데, 이들은 모두 Asahi Chemical Industry Co., Ltd.로부터 입수할 수 있다.
NTP-의존성 헥소키나제 또는 NTP-의존성 글루코키나제로는, 글루코스를 기질로하여 글루코스-6-포스페이트와 NDP를 형성하고 NTP를 소비하는 반응을 촉매하면서, 또한 1,5-AG을 기질로 하여 1,5-AG-6-포스페이트와 NDP의 형성반응을 촉매하고 NTP의 소비를 촉진하는 어떤 효소도 사용 가능하다. 적합한 효소의 예는 상기에 기술하였다.
1,5-AG-6-디하이드로게나제로는, C6H11O8P1으로 표시되는 화합물과, 1,5-AG-6-포스페이트로부터 환원형 조효소 및 산화형 조효소의 형성 반응을 촉매하는 어떤 효소도 사용가능하다.
Figure 111999016713480-pat00002
상기 반응을 촉진하는 효소인 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제의 예로는 에스쳐리치아 콜라이 DH1 (Escherichia coli; ATCC 33849)에서 유도된 효소가 있다. 이 효소는, 일례로 일본 공개 미심사 특허출원 98/84953 호 기재의 방법에 따라 제조할 수 있다.
반응 혼합물 내의 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 농도는 바람직하게는 0.5-100 U/ml, 보다 바람직하게는 1-50 U/ml, 가장 바람직하게는 2-40 U/ml이다. 반응 혼합물 내의 산화형 조효소의 농도는 바람직하게는 0.1-100 mM, 보다 바람직하게는 1-50 mM, 가장 바람직하게는 2-20 mM이다.
반응 혼합물 내의 NDP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 글루코키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, NDP 및 NTP의 농도는, 글루코스 제거 반응에 대한 상기의 기술과 같다.
산화형 조효소의 예는, 산화된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (NAD), 산화된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트 (NADP), 티오 NAD 및 티오-NADP를 포함한다.
NTP의 예로는, 아데노신 트라이포스페이트, 구아노신 트라이포스페이트, 사이티딘 트라이포스페이트, 티아민 트라이포스페이트, 유리딘 트라이포스페이트, 및 이노신 트라이포스페이트를 포함한다. 바람직한 것은 아데노신 트라이포스페이트이다.
NDP의 예로는, 아데노신 다이포스페이트, 구아노신 다이포스페이트, 사이티딘 다이포스페이트, 티아민 다이포스페이트, 유리딘 다이포스페이트, 및 이노신 다이포스페이트를 포함한다. 바람직한 것은 아데노신 다이포스페이트이다.
형성된 환원형 조효소는 다른 물질로 전환되어, 고감도로 측정될 수 있다. 일례로, 하기 식과 같이, 환원형 조효소는 테트라졸리움 염 존재하에 전자 수용체에 의해 반응되어, 형성된 포르마잔 색소는 색상검정에 의해 측정되어진다.
Figure 111999016713480-pat00003
이러한 방법에서 유용한 테트라졸리움 염은, 인도니트로 테트라졸리움 (INT), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-다이설포닐)-2H-테트라졸리움 모노소듐 염 (이하에서는 WST-1으로 언급), 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-다이니트로페닐)-5-(2,4-다이설페닐)-2H-테트라졸리움 모노소듐 염 (이하에서는 WST-3으로 언급), 3,3'-[3,3'-다이메톡시-(1,1'-바이페닐)-4,4'-다이일]-비스[2-(4-나이트로페닐)-5-페닐-2H 테트라졸리움 클로라이드] (NTB) 및 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-페닐)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움 염 (MTS)을 포함한다.
크로모겐으로 사용되는 테트라졸리움 염 역시 사용 가능하다. 감응도 제고를 위해 사용되는 테트라졸리움 염으로는, 분자 흡광 계수 (molecular extinction coefficient)가 높은 것이 좋다. 또한, 이러한 방법이 임상 검증에 보통 적용됨을 고려할 때, 환원 후 수용성 포르마잔 색소로 전환되는 것이 바람직하다. 특히, WST-1 및 WST-3가 바람직하게 사용된다. 임상용 테트라졸리움 염의 양은 바람직하게는 0.01-50mM이다.
반응 혼합물 내의 테트라졸리움 염의 초기 농도는 0.01-50mM, 바람직하게는 0.05-10mM이다.
전자 수용체로는, 페나진 메토설페이트, 1-메톡시-5-메틸페나진 메토설페이트, 멜돌라스 블루 (Meldola's Blue), 디아포라제 등을 사용할 수 있다. 디아포라제의 예로는, 바실러스 메가테리움 (Bascillus megaterium)에서 유도된 효소가 있는데, 이는 Asahi Chemical Industry Co., Ltd. 및 Toyobo Co., Ltd.에서 구할 수 있다.
반응 혼합물 내의 전자 수용체의 초기 농도는 0.01-50mM, 바람직하게는 0.05-10mM이다.
반응은 10-50 ℃에서 1-30 분간, 바람직하게는 2-10 분간 반응을 실시한다. 반응은, 환원형 조효소 형성을 위한 상기 반응 종결후에 실시할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 반응과 동시에 실시한다.
형성된 환원형 조효소를 다른 물질로 전환시켜 측정하는 다른 방법을 아래에 기재하였다. 이 방법에서, 하기 식에서 나타난 바와 같이, 크로모겐 존재하에서 퍼옥시다제 및 환원형 조효소 옥시다제에 의하여 환원형 조효소가 활성화되고, 형성된 색소는 색상 검정으로 측정되어진다. 크로모겐으로서는, 4-아미노안티피린 등과 조합된 크로모겐을 사용할 수 있으나, 단독으로 사용되어도 색소를 생산할 수 있는 것이 바람직하다.
Figure 111999016713480-pat00004
단독으로 사용되어질 수 있는 크로모겐의 예는, 비스[3-비스(4-클로로페닐)-메틸-4-다이메틸아미노페닐]아민 (BCMA), 비스[3-비스(4-클로로페닐)-메틸-4-카르복시에틸아미노페닐]아민, 10-N-메틸카르바모일-3,7-다이메틸아미노-10H-페노티아진 (MCDP) 및 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-다이메틸아미노-10H-페노티아진 (CCAP)이다.
4-아미노안티피린과 조합으로 사용되는 크로모겐의 예는, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌다이아민 (EMSE), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘 (TOOS), 및 N,N-비스(4-설포부틸)-m-톨루이딘 다이소듐 염이 있다.
반응은 10-50 ℃에서 1-30 분간, 바람직하게는 2-10 분간 반응을 실시한다. 반응은, 환원형 조효소 형성을 위한 상기 반응 종결후에 실시할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 반응과 동시에 실시한다.
수성 매질로는, 완충액 및 생리 식염수와 같은 수-함유 액체가 사용된다. 바람직하게는 완충액을 사용한다.
완충액의 예로는, 락테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 프탈레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 트리에탄올아민 완충액, 다이에탄올아민 완충액, 라이신 완충액, 바비탈 완충액, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충액, 이미다졸 완충액, 말레이트 완충액, 옥살레이트 완충액, 글라이신 완충액, 보레이트 완충액, 카르보네이트 완충액 및 굳 완충액 (Good's buffer)이다.
효소 활성 조절제의 예로는, 1,10-페난트롤린과 같은 금속 킬레이트화제, 만 니톨 및 글리세롤과 같은 당 알콜, 마그네슘, 망간, 아연 및 구리와 같은 금속 이온, 요오드아세트산 및 요오드아세트아미드와 같은 SH-차단제가 있다.
효소 안정제의 예로는, 에틸렌다이아민테트라아세트산과 같은 금속 킬레이트화제, 가용성 전분 및 그의 유도체와 같은 폴리사카라이드, 알부민 및 글로불린과 같은 단백질, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 고분자량 화합물, 및 포스핀과 시스테인과 같은 SH-기 함유 화합물이 있다.
계면활성제의 예로는, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르 (Nonion HS-210, Kao Corporation), 3-[(3-클로르아마이드프로필)다이메틸아미노]프로판설폰산, Triton X-100 및 소듐 도데실 설페이트이다.
보존제의 예로는 소듐아자이드이다.
부가의 효소로, 산화형 조효소 옥시다제, 퍼옥시다제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 1,5-AG 측정을 위한 시약은 하기를 포함하고; (a) NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, 산화형 조효소, 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 또는 (b) NTP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 글루코키나제, NTP, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, 산화형 조효소 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제로 이루어진 군에서 선택된 하나와, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 부가적으로 포함할 수 있다.
1,5-AG 측정을 위한 상기 시약은 하기를 포함한 키트일 수 있다; 1) (a) NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, 또는 (b) NTP-의존성 헥소키나제, NTP-의존성 글루코키나제, NTP, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군에서 선택된 하나와, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 포함하는 일차시약 및, 2) 산화형 조효소 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제를 포함하고, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 포함하는 이차 시약. 또한, 이차 시약은 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 및 산화형 조효소 중의 하나를 함유하고, 일차시약은 나머지 하나를 함유하도록 제조하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 글루코스 제거를 위한 시약은, NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제 및, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 포함한다.
본 발명에 따른 분석물 측정을 위한 시약은, NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제 및, 분석물에 작용하는 효소 또는 분석물과 반응하는 기질, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 포함한다.
상기 시약은 하기를 포함한 키트일 수 있다; 1) NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제 및, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 포함하는 일차 시약, 2) 분석물에 작용하는 효소 또는 분석물과 반응하는 물질, 필요하다면 상기 완충제, 효소 활성 조절제, 활성제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 크로모겐, 전자 수용체, 테트라졸리움 염, 부가 효소, 이들 효소에 대한 기질, 조효소 등을 포함하는 이차 시약.
본 발명에 따른 각 시약은 동결 건조 제제 또는 물과 같은 수성 매질 내의 용액 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예를 하기 실시예에 기술하였다.
실시예 1
하기 조성을 소지한 글루코스 제거용 시약을 제조한다.
Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 50mM
마그네슘 클로라이드 1mg/ml
ADP-의존성 헥소키나제 10 U/ml
(Thermococcus litoralis로부터 유도됨;Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)
포스포헥소스 아이소머라제 40 U/ml
(Bascillus stearothermophilus로부터 유도됨; Unitika Ltd.)
6-포스포프룩토키나제 30 U/ml
(Bascillus stearothermophilus로부터 유도됨; Unitika Ltd.)
ADP (Oriental Yeast Co., Ltd.) 3 mM
ATP (Sigma Chemical Co.) 10 mM
실시예 2
1,5-AG 측정을 위한 하기 조성물을 가지는 시약을 제조한다.
시약 1
트리스-HCl 완충액 (pH 8.5) 50 mM
마그네슘 클로라이드 1 mg/ml
NADP (Sigma Chemical Co.) 4 mM
ADP (Oriental Yeast Co., LTD) 3 mM
ATP (Sigma Chemical Co.) 10 mM
포스포헥소스 아이소머라제 40 U/ml
(Bascillus stearothermophilus로부터 유도됨; Unitika Ltd.)
6-포스포프룩토키나제 30 U/ml
(Bascillus stearothermophilus로부터 유도됨; Unitika Ltd.)
디아포라제 10 U/ml
(Bascillus megaterium 으로부터 유도됨; Asahi Chemical Industry Co.Ltd.)
ADP-의존성 헥소키나제 10 U/ml
(Thermococcus litoralis로부터 유도됨; Asahi Chemical Industry Co.Ltd.)
시약 2
글라이신-NaOH 완충액 (pH 10) 200 mM
WST-1 (Dojindo 연구소) 0.5 mM
1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 20 U/ml
(E.coli DH1 (ATCC 33849)로부터 유도됨; Asahi Chemical Industry Co.Ltd.)
실시예 3
1,5-AG 표준 용액 (25㎍/ml)을 희석하여, 농도가 상이한 5 가지 용액을 준비한다. 각 용액 0.075ml과 정제수에, 2.25ml의 실시예 2 에서 제조한 시약 1을 가하고, 37 ℃에서 5분간 방치한다. 실시예 2 에서 제조한 0.75ml 시약 2를 각 혼합물에 가한 후, 반응을 5분간 실시하여, 438nm에서 흡광도를 측정한다. 수득한 보정 곡선을 도 1에 개시하였다.
실시예 4
본 발명에 따른 방법의 유용성을 증명하기 위하여, 하기의 글루코스 제거 실험을 실시하였다. 시험관 당 2.25ml로, 실시예 2에서 제조한 시약 1을 붓는다. 각 시험관마다, 0.075ml 각각의 (a) 정제수, (b) 25㎍/ml 1,5-AG를 함유하는 시험 용액, (c) 2000mg/dl 글루코스 함유 시험 용액, 및 (d) 25㎍/ml 1,5-AG 및 2000mg/dl 글루코스 함유 시험용액을 가하고, 37 ℃에서 5분간 방치한다. 실시예 2 에서 제조한 0.75ml 시약 2를 각 혼합물에 가한 후, 반응을 5분간 실시하여, 438nm에서 흡광도를 측정한다. 결과를 표 1에 개시하였다.
테스트 용액 측정 결과
(a) 정제수 (블랭크) 0.096 Abs
(b) 1,5-AG 25㎍/㎖ 0.230 Abs
(c) 글루코스 2000 mg/dl 0.096 Abs
(d) 1,5-AG + 글루코스 0.226 Abs
표 1에서 보이는 바와 같이, (c) 값은, (a) 값과 정확히 일치하며, 이는 시험 용액 (c)에 함유된 2000mg/dl 글루코스가 본 발명의 방법에 의해 완전 제거 되었음을 나타낸다. 또한, (b) 값은 (d) 값과 매우 근접하다. 본 발명에 따른 방법의 유용성이 증명되었다.
실시예 5
1,5-AG의 측정을 50 개의 혈청 샘플에 대해 실시하여, 본 발명의 방법과 공지 방법의 상관관계를 검사하였다.
(a) 2.25ml의 실시예 2에서 제조한 시약 1에, 0.075ml 각각의 샘플을 가하고, 37 ℃에서 5분간 방치한다. 실시예 2 에서 제조한 0.75ml 시약 2를 혼합물에 가한 후, 반응을 5분간 실시하여, 438nm에서 흡광도를 측정한다. 샘플 내의 1,5-AG 농도를 도 1에 개시된, 실시예 1의 보정 곡선으로부터 수득한 식으로부터 계산한다.
(b) 측정은, 50 개의 혈청 샘플에 대해, 생체외 진단용으로 인정된 시약 (Lana 1,5-AG AutoII; Nipppon Kayaku Co., Ltd., Approval No. (08AM) 0112)과 이의 "측정 방법"으로 실시하고, 1,5-AG 농도는 "1,5-AG 농도 계산법"에 따라 계산한다.
(a)에서 측정한 1,5-AG 농도를 종축으로, (b)의 측정치는 횡축으로하여 플러 팅 (plotting) 한다. 결과는 도 2 이다.
도 2의 결과는, 데이타의 양호한 상관관계를 나타내는데, 상관계수 r=0.9966이며, 변이 식 y=0.9839x + 0.0576 이다.
실시예 6
실시예 2와 동일한 방식으로 시약을 준비하되, 1차 시약의 ADP 농도를 표 2와 같이 변화시키고, 시약 2의 조성물 내에 Triton X-100을 0.4% 농도로 가한다.
25㎍/ml 1,5-AG 및 표 2에 기재된 글루코스 농도를 함유하는 시험 용액을 제조한다.
1,5-AG 측정은 실시예 3과 동일한 방식으로 시험 용액에 대해 실시한다. 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 111999016713480-pat00008
샘플 내의 1,5-AG를, 시약 내의 ADP 농도와 샘플 내의 글루코스 농도와 무관하게, ADP-의존성 헥소키나제를 이용한 글루코스제거의 상기 방법을 이용하여 정확하게 측정할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7
하기 조성을 포함하는 1,5-AG 측정 시약을 제조한다.
시약 1
트리스-HCl 완충액 (pH 8.0) 50 mM
마그네슘 클로라이드 1 mg/ml
NADP (Sigma Chemical Co.) 4 mM
ATP (Sigma Chemical Co.) 10 mM
포스포헥소스 아이소머라제 40 U/ml
(Bascillus stearothermophilus로부터 유도됨; Unitika Ltd.)
6-포스포프룩토키나제 30 U/ml
(Bascillus stearothermophilus로부터 유도됨; Unitika Ltd.)
디아포라제 10 U/ml
(Bascillus megaterium 으로부터 유도됨; Asahi Chemical Industry Co.Ltd.)
ATP-의존성 헥소키나제 100 U/ml
(효모로부터 유도됨; Oriental Yeast Co.Ltd.)
시약 2
글라이신-NaOH 완충액 (pH 10.0) 200 mM
WST-1 (Dojindo 연구소) 0.5 mM
1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제 20 U/ml
(E.coli DH1 (ATCC 33849)로부터 유도됨; Asahi Chemical Industry Co.Ltd.)
실시예 8
50, 100, 150, 200 및 250 ㎍/ml 1,5-AG를 함유하는 표준 용액을 제조한다. 0.075ml의 표준 용액 및 정제수 각각에, 실시예 7 에서 제조한 2.25ml 시약 1을 가한 후, 37 ℃에서 5분간 방치한다. 실시예 7에서 제조한 0.75ml 시약 2를 각 혼합물에 가한 후, 반응을 5분간 실시하여, 438nm에서 흡광도를 측정한다. 수득한 보정 곡선을 도 3에 개시하였다.
실시예 9
본 발명에 따른 방법의 유용성을 증명하기 위하여, 하기의 글루코스 제거 실험을 실시하였다. 시험관 당 2.25ml로, 실시예 7에서 제조한 시약 1을 붓는다. 각 시험관마다, 0.075ml 각각의 (a) 정제수, (b) 250㎍/ml 1,5-AG를 함유하는 시험 용액, (c) 100mg/dl 글루코스 함유 시험 용액, 및 (d) 250㎍/ml 1,5-AG 및 100mg/dl 글루코스 함유 시험용액을 가하고, 37 ℃에서 5분간 방치한다. 실시예 7 에서 제조한 0.75ml 시약 2를 각 혼합물에 가한 후, 반응을 5분간 실시하여, 438nm에서 흡광도를 측정한다. 결과를 표 3에 개시하였다.
테스트 용액 측정 결과
(a) 정제수 (블랭크) 0.280 Abs
(b) 1,5-AG 250㎍/㎖ 0.440 Abs
(c) 글루코스 100 mg/dl 0.279 Abs
(d) 1,5-AG + 글루코스 0.441 Abs
표 3에서 보이는 바와 같이, (c) 값은, (a) 값과 매우 유사하며, 이는 시험 용액 (c)에 함유된 100mg/dl 글루코스가 본 발명의 방법에 의해 완전 제거 되었음 을 나타낸다. 또한, (b) 값은 (d) 값과 매우 근접하다. 본 발명에 따른 방법의 유용성이 증명되었다.
본 발명의 측정법 및 시약 및 시약 키트에 의해, 글루코스를 함유한 샘플 내의 특이 성분, 예로써 1,5-안하이드로글루시톨 (1,5-AG)의 간단한 측정이 가능하다.

Claims (14)

  1. 글루코스를 함유한 샘플 내의 1,5-안하이드로글루시톨 (1,5-AG) 측정방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    수성 매질 내에서 뉴클레오사이드 다이포스페이트 (NDP) 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP)의 존재 하에, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제에 의해 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하고, NDP-의존성 헥소키나제에 의해 1,5-AG 를 1,5-AG-6-포스페이트로 전환하는 단계,
    산화형 조효소 존재하에 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제에 의해 1,5-AG-6-포스페이트를 탈수소화하는 단계, 및
    탈수소화 반응에 의해 형성된 환원형 조효소의 양을 측정하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기의 환원형 조효소 양의 측정을 테트라졸리움 염으로부터 형성된 색소의 색상분석에 의해 실시하는 방법.
  4. NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제, 산화형 조효소, 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제를 포함하는, 1,5-AG 측정용 시약.
  5. 제 4 항에 있어서, 테트라졸리움 염과 전자 수용체를 추가로 함유하는 시약.
  6. NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제를 함유하는 시약, 및 산화형 조효소 및 1,5-AG-6-포스페이트 디하이드로게나제를 함유하는 시약을 포함하는, 1,5-AG 측정용 시약 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 글루코스를 함유한 샘플 내 분석물 측정방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    NDP 및 NTP의 존재 하에, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제의 작용에 의해 샘플 내의 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하는 단계, 및
    화학 또는 효소 반응을 사용하여 샘플 내 분석물을 측정하는 단계.
  10. NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제, 6-포스포프룩토키나제 및, 분석물과 반응하는 물질 또는 분석물에 작용하는 효소를 포함하는, 분석물 측정용 시약.
  11. NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제를 함유하는 시약과, 분석물과 반응하는 물질 또는 분석물에 작용하는 효소를 함유하는 시약을 포함하는, 분석물 측정용 시약 키트.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 NDP-의존성 헥소키나제가 ADP-의존성 헥소키나제인 방법.
  13. NDP 및 NTP 의 존재하에, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제의 작용에 의해, 샘플 내의 글루코스를 프룩토스-1,6-다이포스페이트로 전환하는 것을 포함하는, 샘플 내의 글루코스 제거 방법.
  14. NDP, NTP, NDP-의존성 헥소키나제, 포스포헥소스 아이소머라제 및 6-포스포프룩토키나제를 포함하는, 글루코스 제거용 시약.
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